Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

Resumen

En este trabajo, describimos un protocolo modificado para probar el flujo del sustrato respiratorio mitocondrial utilizando perfringolisina O recombinante en combinación con respirometría basada en microplacas. Con este protocolo, mostramos cómo la metformina afecta la respiración mitocondrial de dos líneas celulares tumorales diferentes.

Resumen

El flujo de sustrato mitocondrial es una característica distintiva de cada tipo de célula, y los cambios en sus componentes, como transportadores, canales o enzimas, están involucrados en la patogénesis de varias enfermedades. El flujo de sustrato mitocondrial se puede estudiar utilizando células intactas, células permeabilizadas o mitocondrias aisladas. La investigación de células intactas encuentra varios problemas debido a la oxidación simultánea de diferentes sustratos. Además, varios tipos de células contienen almacenes internos de diferentes sustratos que complican la interpretación de los resultados. Métodos como el aislamiento mitocondrial o el uso de agentes permeabilizantes no son fácilmente reproducibles. Aislar mitocondrias puras con membranas intactas en cantidades suficientes a partir de muestras pequeñas es problemático. El uso de permeabilizadores no selectivos causa varios grados de daño inevitable de la membrana mitocondrial. La perfringolisina O recombinante (rPFO) se ofreció como un permeabilizante más apropiado, gracias a su capacidad para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática sin afectar la integridad mitocondrial. Cuando se usa en combinación con la respirometría de microplacas, permite probar el flujo de varios sustratos mitocondriales con suficientes réplicas dentro de un experimento mientras se usa un número mínimo de células. En este trabajo, el protocolo describe un método para comparar el flujo de sustrato mitocondrial de dos fenotipos o genotipos celulares diferentes y se puede personalizar para probar varios sustratos o inhibidores mitocondriales.

Introducción

La respirometría basada en microplacas ha revolucionado la investigación mitocondrial al permitir el estudio de la respiración celular de un tamaño de muestra pequeño¹. La respiración celular generalmente se considera como un indicador de la función mitocondrial o "disfunción", a pesar del hecho de que el rango mitocondrial de funciones se extiende más allá de la producción de energía². En condiciones aeróbicas, las mitocondrias extraen la energía almacenada en diferentes sustratos descomponiendo y convirtiendo estos sustratos en intermedios metabólicos que pueden alimentar el ciclo del ácido cítrico³

Protocolo

1. Un día antes del ensayo

1. Preparación de reactivos y sustratos.
   1. Solución de ensayo mitocondrial (MAS): Preparar soluciones madre de todos los reactivos como se describe en la Tabla 1. Caliente las existencias de manitol y sacarosa a 37 °C para disolverlas por completo. Mezcle los reactivos para preparar 2x MAS, luego caliente la mezcla a 37 ° C. Ajuste el pH con 5N KOH a 7.4 (~ 7 mL), luego agregue agua para llevar el volumen hasta 1 L. Filtre-esterilice y almacene las alícuotas a -20 ° C hasta el día de la medición.
   2. Albúmina sérica bovina (5% BSA): Disolver 5 g de BSA en 90 ml de agua estéril precalentada en un agitador....

Resultados

Comience por normalizar los resultados a la segunda medición de la respiración basal para mostrar los valores como porcentaje de tasa de consumo de oxígeno (OCR%). Los resultados del ensayo se muestran en las Figuras 5,Figura 6, Figura 7 y Figura 8. Es importante asignar los pozos de fondo adecuados para cada grupo e inactivar los pozos de fondo de otros grupos.

Discusión

Este protocolo es una modificación de los estudios publicados previamente^7,8,9,10 y la guía del usuario del producto. En contraste con el protocolo del fabricante, se utiliza 2x MAS en lugar de 3x MAS, ya que 2× MAS es más fácil de disolver y no forma precipitaciones después de la congelación. Las alícuotas MAS congeladas 2x se pueden almacenar hasta seis meses y muestran resultados consistente.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Adenosina 5′ -difosfato sal monopotásica dihidratado	Merck	A5285	almacenar a -20 ° C
Antimicina A	Merck	A8674	tienda a -20 ° C
Albúmina sérica bovina	Merck	A3803	tienda en 2 - 8 ° C
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona	Merck	C2920	almacenado a -20 & grados; C
Dimetilsulfóxido Merck		D8418	tienda en RT
D-Manitol	Tienda Merck	63559	en RT
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Gibco	14190-144	en RT
Etilenglicol-bis(2-aminoetiloéter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético	Merck	03777	en RT
HEPES	Merck	H7523	tienda en RT
L(-)Sal disódica de ácido málico	Merck	M9138	tienda en RT
Ácido L-glutámico sodio sal hidratado	Merck	G5889	tienda en RT
Cloruro de magnesio hexahidratado	Merck	M2670	tienda en RT
Oligomicina	Merck	O4876	tienda en -20 & deg; C
Cloruro de palmitoil-DL-carnitina	Merck	P4509	tienda a -20 ° C
Hidróxido de potasio Tienda Merck		484016	en RT
Fosfato de potasio monobásico	Merck	P5655	tienda en RT
Rotenona	Tienda Merck	R8875	en -20 ° C
Seahorse Wave Software de escritorio Tecnologías	Agilent Descargar		desde www.agilent.com
Analizador Seahorse XFe96 Tecnologías			Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Tecnologías Agilent	102416-100	Cartuchos de sensor XFe96 y microplacas de cultivo celular XF96
Piruvato de sodio	Merck	P2256	tienda en 2 - 8 & deg; C
Succinato de sodio dibásico hexahidratado	Merck	S2378	tienda en RT
Sacarosa	Merck	S7903	en RT
Water	Tienda Merck	W3500	en RT
XF calibrador	Agilent technologies	100840-000	tienda en RT
XF Perpermeabilizante de membrana plasmática	Agilent technologies	102504-100	Perfringolisina O recombinante (rPFO) - Alícuota y almacenar a -20 ° C

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