Summary
В этой работе мы описываем модифицированный протокол для тестирования потока митохондриального дыхательного субстрата с использованием рекомбинантного перфринголизина O в сочетании с микропластинчатой респирометрией. С помощью этого протокола мы показываем, как метформин влияет на митохондриальное дыхание двух разных линий опухолевых клеток.
Abstract
Поток митохондриального субстрата является отличительной характеристикой каждого типа клеток, и изменения в его компонентах, таких как транспортеры, каналы или ферменты, участвуют в патогенезе нескольких заболеваний. Поток митохондриального субстрата может быть изучен с использованием интактных клеток, пермеабилизированных клеток или изолированных митохондрий. Исследование интактных клеток сталкивается с несколькими проблемами из-за одновременного окисления различных субстратов. Кроме того, несколько типов клеток содержат внутренние хранилища различных субстратов, что затрудняет интерпретацию результатов. Такие методы, как изоляция митохондрий или использование пермеабилизирующих агентов, нелегко воспроизвести. Выделение чистых митохондрий с интактными мембранами в достаточном количестве из небольших образцов проблематично. Использование неселективных пермеабилизаторов вызывает различные степени неизбежного повреждения митохондриальной мембраны. Рекомбинантный перфринголизин O (rPFO) был предложен в качестве более подходящего пермеабилизатора, благодаря его способности избирательно проникать плазматической мембраной, не влияя на целостность митохондрий. При использовании в сочетании с микропластинчатой респирометрией он позволяет тестировать поток нескольких митохондриальных субстратов с достаточным количеством реплик в рамках одного эксперимента при использовании минимального количества клеток. В этой работе протокол описывает метод сравнения потока митохондриального субстрата двух разных клеточных фенотипов или генотипов и может быть настроен для тестирования различных митохондриальных субстратов или ингибиторов.
Introduction
Микропластичная респирометрия произвела революцию в митохондриальных исследованиях, позволив изучать клеточное дыхание небольшого размера выборки1. Клеточное дыхание обычно рассматривается как показатель митохондриальной функции или «дисфункции», несмотря на то, что диапазон функций митохондрий простирается за пределы производства энергии2. В аэробных условиях митохондрии извлекают энергию, хранящуюся в различных субстратах, разрушая и превращая эти субстраты в метаболические промежуточные продукты, которые могут подпитывать цикл лимонной кислоты3 (рисунок 1). Непрерывный поток субстратов необходим для потока цикла лимонной кислоты для генерации высокоэнергетических «доноров электронов», которые доставляют электроны в цепочку переноса электронов, которая генерирует протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану, позволяя АТФ-синтазе фосфорилировать АДФ к АТФ4. Поэтому экспериментальная конструкция для анализа митохондриального дыхания должна включать природу образца (интактные клетки, пермеабилизированные клетки или изолированные митохондрии) и митохондриальные субстраты.
Клетки хранят запас местных субстратов5,а митохондрии окисляют несколько типов субстратов одновременно6,что усложняет интерпретацию результатов, полученных в результате экспериментов, проведенных на интактных клетках. Распространенным подходом к исследованию способности митохондрий окислять выбранный субстрат является выделение митохондрий или пермеабилизация исследуемых клеток5. Хотя изолированные митохондрии идеально подходят для количественных исследований, процесс выделения трудоемкий. Он сталкивается с техническими трудностями, такими как необходимость большого размера выборки, чистота выхода и воспроизводимость метода5. Пермеабилизированные клетки предлагают решение для недостатков митохондриальной изоляции; однако обычные пермеабилизирующие агенты моющей природы не являются специфическими и могут повредить митохондриальные мембраны5.
Рекомбинантный перфринголизин O (rPFO) предлагали в качестве селективного проницателя плазматической мембраны7,и он успешно применялся в комбинации с внеклеточным анализатором флюса в нескольких исследованиях7,8,9,10. Мы модифицировали протокол с использованием rPFO для скрининга потока митохондриальной субстраты с помощью анализатора внеклеточного потока XFe96. В этом протоколе сравниваются четыре различных пути окисления субстрата в двух клеточных фенотипах, имея достаточные реплики и надлежащий контроль для каждого тестируемого материала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. За день до анализа
- Подготовка реагентов и субстратов.
- Раствор для митохондриального анализа (MAS): Подготовьте исходные растворы всех реагентов, как описано в таблице 1. Разогрейте запасы маннитола и сахарозы до 37 °C, чтобы полностью раствориться. Смешайте реагенты для приготовления 2x MAS, затем нагрейте смесь до 37 °C. Отрегулируйте pH с 5N KOH до 7,4 (~ 7 мл), затем добавьте воду, чтобы довести объем до 1 л. Фильтр-стерилизуйте и храните аликвоты при -20 °C до дня измерения.
- Сывороточный альбумин крупного рогатого скота (5% BSA): Растворите 5 г BSA в 90 мл предварительно расплавленной стерильной воды на магнитной мешалке и избегайте встряхивания. Отрегулируйте рН до 7,4 с 5 Н КОН, а затем добавьте воду, чтобы довести объем до 100 мл. Фильтруют-стерилизуют и хранят аликвоты при -20 °C до дня измерения.
- Митохондриальные субстраты: Приготовьте 1 млн растворов сукцината натрия, пирувата натрия и глутамата натрия в стерильной воде. Приготовьте 100 мМ запасного раствора малата натрия в стерильной воде и используйте предварительно приготовленную стерильную воду для приготовления 10 мМ запасного раствора пальмитоилкарнитина. Отрегулируйте рН каждого раствора до 7,4 на 5 Н КОН и фильтруйте-стерилизуйте. Хранить субстраты при температуре 2-8 °C. Во время применения нагревают пальмитоилкарнитин до 37 °C для растворения любых осадков. Для последующего использования храните аликвоты всех субстратов, кроме пирувата, при -20 °C.
- Митохондриальные ингибиторы: Используют диметилсульфоксид (ДМСО) для приготовления исходных растворов 25 мМ олигомицина, 50 мМ карбонилцианида 4-(трифторметокси) фенилгидразона (FCCP), 20 мМ ротенона и 20 мМ антимицина А. Хранят аликвоты при -20 °C.
- Посев и обработка клеток: Как показано на рисунке 2,засейте клетки в колонки 2-11. Колонки 1 и 12 должны быть оставлены пустыми, чтобы служить фоновыми колодцами. В этой работе были использованы ячейки HepG2 и A549.
- Засейте клетки с плотностью 20 000 клеток на лунку. Используйте 50-80 мкл клеточной питательной среды для посева.
- Заполните пустые лунки равным объемом клеточной культуральной среды и инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Дайте клеткам прикрепиться в течение 3-4 часов, а затем добавьте 100 мкл клеточной культуральной среды во все колодцы.
- С добавлением этой последней среды применяйте обработку в колонках 7–11. В этой работе экспериментальную группу обрабатывали 1 мМ метформина гидрохлоридом в течение 16 часов, а контрольную группу обрабатывали равным объемом стерильной дистиллированной воды в качестве органа управления транспортным средством.
- Гидратация датчиков: Пипетка 200 мкл стерильной воды на скважину в полезную пластину, затем осторожно верните картридж датчика, погружая датчики в воду. Инкубируйте картридж в инкубаторе безCO2при 37 °C до следующего дня.
- Шаблон протокола анализа: Включите анализатор (см. Таблицу материалов)и блок контроллера. Запустите программное обеспечение для управления прибором и сбора данных и разработайте протокол анализа, как описано в таблице 2. В разделе Определения групп создайте четыре стратегии впрыска,где порт A отличается в зависимости от инжектируемой субстрата(рисунок 3). Назовите стратегии в честь субстратов или их аббревиатур.
- Портам B, C и D назначают соединения олигомицин, FCCP и ротенон/антимицин А соответственно. Создайте восемь групп и назовите их, как показано на рисунке 4. В разделе Карта пластин назначьте группы соответствующим скважинам, затем сохраните протокол как готовый к использованию шаблон. Оставьте анализатор включенным, чтобы температура стабилизировалась в течение ночи. Держите анализатор в месте со стабильной температурой, чтобы избежать резких перепадов температуры.
2. День анализа
- Замена воды калибрантом: Выбросьте воду из опорной плиты и пипетки 200 мкл предварительно выровненного калибранта на скважину в опорную плиту. Верните картридж в инкубатор безCO2до момента анализа. Чтобы избежать быстрого испарения калибранта, поддерживайте источник влажности внутри инкубатора и выключите или уменьшите скорость вращения вентилятора до минимума.
- Приготовление рабочих растворов: Начните с нагревания 2x MAS, 5% BSA и стерильной воды до 37 °C. Между тем, позвольте запасам ингибитора достичь комнатной температуры. Используйте теплые 2x MAS и стерильную дистиллированную воду для получения 5 мл рабочей концентрации субстратов и ингибиторов, как описано в таблице 3.
- Загрузка инжекционных отверстий: Как показано на рисунке 3,загрузите 20 мкл подложек в порт A. Загрузите сукцинат/ротеноновую смесь в порт A рядов A и B. Загрузите пируватно-малатную смесь в порт A рядов C и D. Загрузите смесь глутамата/малата в порт A рядов E и F. Загрузите смесь пальмитоилкарнитин/малат в порт A рядов G и H. Для всей пластины загрузите порт B 22 мкл препарата олигомицина, порт C с 25 мкл препарата FCCP и порт D с 27 мкл смеси ротенона/антимицина A.
- Начало этапа калибровки: на вкладке «Запустить анализ» нажмите «Начать запуск», чтобы начать анализ. Вставьте заряженный картридж датчика и начните этап калибровки. Дождитесь завершения калибровки, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Приготовление пробирной среды (MAS-BSA-rPFO): Чтобы приготовить 20 мл пробирной среды, смешайте 10 мл 2x MAS, 9,2 мл стерильной воды и 0,8 мл 5% BSA в 50 мл пробирке. Добавьте 2 мкл 10 мкМ rPFO для достижения концентрации 1 нМ и повторно суспендируйте смесь с мягким пипетированием. Избегайте встряхивания и не используйте вихревой смеситель для смешивания. Инкубировать пробирку при температуре 37 °C до момента использования.
- Промывка клеток: Промывайте клетки и пустые пустые колодцы два раза с помощью предварительного расплавленного буферного физиологического раствора без фосфата кальция и магния (PBS) с использованием многоканальной пипетки. Избегайте повторного использования одних и тех же советов, чтобы отбросить среду клеточной культуры и добавить PBS. Выполните этот шаг вне ламинарного потока, чтобы защитить клетки от высыхания воздушным потоком.
- Проницаемость клеток в пробирной среде: используя многоканальную пипетку, отбросьте PBS и замените его 180 мкл предварительной пробирной среды (MAS-BSA-rPFO).
- Начало измерения: Сразу после пермеабилизации замените полезную пластину калиброванного картриджа датчика на пластину ячейки и начните измерение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Начните с нормализации результатов до второго измерения исходного дыхания, чтобы показать значения в процентах коэффициента потребления кислорода (OCR%). Результаты анализа показаны на рисунках 5, 6, 7 и 8. Важно назначить правильные фоновые колодцы для каждой группы и инактивировать фоновые колодцы других групп. Рисунок 5 показывает, что обработанная группа имеет более высокую частоту сукцинат-индуцированного дыхания. Реакция клеток A549 на лечение метформином(рисунок 5A)была выше, чем у клеток HepG2(рисунок 5B). Фоновые контрольные скважины были только из тех же рядов сравниваемой группы, в данном случае скважины A1, B1, A12 и B12. На рисунке 6 показаны изменения в пируватном/малат-индуцированном дыхании. На рисунке 7 показаны изменения в дыхании, вызванном глутаматом/малатом, а на рисунке 8 показаны изменения в дыхании, вызванном пальмитоилкарнитином/малатом.
Рисунок 1:Схематическое изображение цикла лимонной кислоты. Используемые субстраты для проверки потока митохондриального субстрата окрашены в красный цвет. Малат не используется отдельно, а используется в сочетании с пируватом, пальмитоилкарнитином и глутаматом. Роль малата в пируватном/малат- и пальмитоилкарнитине/малат-индуцированном дыхании заключается в обеспечении оксалоацетата за счет действия фермента малатдегидрогеназы. При дыхании, вызванном глутаматом/малатом, малат принимает участие в челноке малат-аспартат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Иллюстрация плана посева клеток в микропластине клеточной культуры. Пустые скважины в колонках 1 и 12 должны быть оставлены пустыми без ячеек. Колонки 7-11 используются для лечения экспериментальной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Иллюстрация стратегии инъекций. Порт А рядов А и В загружен смесью сукцината/ротенона. Порт A рядов C и D загружен пируватно-малатовой смесью. Порт A рядов E и F загружен смесью глутамата/малата. Порт А рядов G и H загружен смесью пальмитоилкарнитин/малат. Для всей пластины порты B, C и D загружены олигомицином, FCCP и ротеноном/антимицином A соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Названия групп и карта табличек. Каждая группа называется в соответствии с фенотипом (контрольным или обработанным) и субстратом, используемым для индуцирования дыхания. (S), сукцинат-индуцированное дыхание. (P/M), пируват/малат-индуцированное дыхание. (Г/М), глутамат/малат-индуцированное дыхание. (CP/M), пальмитоилкарнитин/малат-индуцированное дыхание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Сукцинат-индуцированное дыхание. (A)A549 и(B)HepG2. Испытуемую группу обрабатывали 1 мМ гидрохлоридом метформина в течение 16 часов. Для коррекции используются только фоновые скважины A1, B1, A12 и B12. Результаты показаны в виде среднего OCR% ± SD. Граф и сетка пластин были созданы и экспортированы в виде файлов изображений с помощью программного обеспечения для проектирования анализов, анализа данных и управления файлами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Пируват/малат-индуцированное дыхание. (A) A549 и (B) HepG2. Испытуемую группу обрабатывали 1 мМ гидрохлоридом метформина в течение 16 часов. Для коррекции используются только фоновые скважины C1, D1, C12 и D12. Результаты показаны в виде среднего OCR% ± SD. Граф и сетка пластин были созданы и экспортированы в виде файлов изображений с помощью программного обеспечения для проектирования анализов, анализа данных и управления файлами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Глутамат/малат-индуцированное дыхание. (A) A549 и (B) HepG2. Испытуемую группу обрабатывали 1 мМ гидрохлоридом метформина в течение 16 часов. Для коррекции используются только фоновые колодцы E1, F1, E12 и F12. Результаты показаны в виде среднего OCR% ± SD. Граф и сетка пластин были созданы и экспортированы в виде файлов изображений с помощью программного обеспечения для проектирования анализов, анализа данных и управления файлами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:Пальмитоилкарнитин/малат-индуцированное дыхание. (A)A549 и(B)HepG2. Испытуемую группу обрабатывали 1 мМ гидрохлоридом метформина в течение 16 часов. Для коррекции используются только фоновые колодцы G1, H1, G12 и H12. Результаты показаны в виде среднего OCR% ± SD. Граф и сетка пластин были созданы и экспортированы в виде файлов изображений с помощью программного обеспечения для проектирования анализов, анализа данных и управления файлами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Митохондриальная среда анализа | ||||
| Запас (мМ) | Объем со склада на литр (мл) | 2x MAS (мМ) | МАС (мМ) | |
| Сахароза | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| Маннитол | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| МгКл2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| ХЕПЕС | 200 | 20 | 4 | 2 |
| ЭГТА | 200 | 10 | 2 | 1 |
| АДП | 200 | 20 | 4 | 2 |
Таблица 1: Раствор для митохондриального анализа. Смешайте указанный объем каждого ингредиента для приготовления исходного раствора (2x MAS). Нагрейте раствор до 37 °C, затем отрегулируйте pH с 5 N KOH до 7,4. Добавьте дистиллированную воду, чтобы довести объем до 1 л. Фильтруйте-стерилизуйте, а затем храните аликвоты при -20 °C. Готовят пробирную среду и рабочие растворы митохондриальных субстратов и ингибиторов с использованием 2x MAS.
| Команда | Длительность | Инъекционное соединение |
| Калибровка | по умолчанию | |
| Равновесие | Да | |
| Базис | ||
| 2 Цикла | ||
| Смешивать | 30 с | |
| Ждать | 30 с | |
| Измерять | 2 мин | |
| Инжекционный порт A | Субстратов | |
| 2 Цикла | ||
| Смешивать | 30 с | |
| Ждать | 30 с | |
| Измерять | 2 мин | |
| Инжекторный порт B | Олигомицин | |
| 2 Цикла | ||
| Смешивать | 30 с | |
| Ждать | 30 с | |
| Измерять | 2 мин | |
| Инжекторный порт C | ФКИП | |
| 2 Цикла | ||
| Смешивать | 30 с | |
| Ждать | 30 с | |
| Измерять | 2 мин | |
| Впрыскное отверстие D | Ротенон + Антимицин А | |
| 2 Цикла | ||
| Смешивать | 30 с | |
| Ждать | 30 с | |
| Измерять | 2 мин |
Таблица 2: Команды протокола анализа.
| Объем в 5 мл | ||||||
| Субстратов | Стоковый конс. | Рабочий конк. | Запас | 2x МАС | dH2O | Окончательный конспект. |
| Сукцинат/ротенон | 1 М/20 мМ | 100 мМ/10 мкМ | 500 мкл/ 2,5 мкл | 2,5 мл | 1997.5 мкл | 10 мМ/1 мкМ |
| Пируват/малат | 1 М/100 мМ | 100 мМ /10 мМ | 500 мкл/500 мкл | 2,5 мл | 1500 мкл | 10 мМ /1 мМ |
| Глутамат/малат | 1 М/100 мМ | 100 мМ /10 мМ | 500 мкл/500 мкл | 2,5 мл | 1500 мкл | 10 мМ /1 мМ |
| Пальмитоилкарнитин/малат | 10 мМ/100 мМ | 400 мкМ /10 мМ | 200 мкл/500 мкл | 2,5 мл | 1800 мкл | 40 мкМ /1 мМ |
| Ингибиторы | ||||||
| Олигомицин | 25 мМ | 15 мкМ | 3 мкл | 2,5 мл | 2497 мкл | 1,5 мкМ |
| ФКИП | 50 мМ | 40 мкМ | 4 мкл | 2,5 мл | 2496 мкл | 4 мкМ |
| Ротенон/антимицин А | 20 мМ/20 мМ | 10 мкМ/ 10 мкМ | 2,5 мкл/2,5 мкл | 2,5 мл | 2495 мкл | 1 мкМ/ 1 мкМ |
Таблица 3: Список митохондриальных субстратов и ингибиторов, которые должны быть загружены в инъекционные порты сенсорных картриджей, как обсуждалось ранее на рисунке 3. Смешайте указанные объемы из исходных растворов, 2x MAS и дистиллированной воды для получения 5 мл рабочей концентрации каждого субстрата или смеси ингибиторов. Конечная концентрация достигается в скважинах после процесса закачки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данный протокол является модификацией ранее опубликованных исследований7,8,9,10 и руководства пользователя продукта. В отличие от протокола производителя, вместо 3x MAS используется 2x MAS, так как 2×x MAS легче растворяется и не образует осадков после замерзания. Замороженные 2x MAS аликвоты могут храниться до шести месяцев и показывать стабильные результаты. Другим отличием является включение ADP в компоненты 2x MAS и исключение BSA из формулы. Растворы, содержащие BSA, труднее вводить и вызывают большую вероятность ошибок и выбросов. Тем не менее, наличие BSA имеет важное значение для уменьшения количества, необходимого rPFO для достижения надлежащей пермеабилизации. Поэтому BSA добавляют только в пробирную среду (MAS-BSA-rPFO), которая используется на стадии пермеабилизации после промывки клеток.
Для промывки клеток из клеточной культуральной среды этот протокол использует PBS вместо MAS. PBS является изотоническим и не вызывает каких-либо изменений в клеточной форме, в отличие от МАС без натрия, который богат калием и может изменять клеточную морфологию. Другим важным отличием является сохранение шага равновесия в протоколе анализа. Шаг уравновешивания длится 12 минут, что равно 2 циклам измерения. Целью поддержания стадии равновесия является стабилизация температуры внутри прибора и, в то же время, позволяет клеткам окислять любые возможные внутренние окисляемые запасы, что усиливается присутствием АДФ в пробирной среде.
Следует учесть некоторые соображения, касающиеся методов культивирования клеток. В этой работе исследуемые клетки были посеяны за день до анализа. Однако некоторые клетки требуют более длительного времени культивирования или лечения. Если дизайн исследования включает дифференцированные клетки, свежеизолированные или неадгезивные клетки, требуется надлежащее покрытие для фиксации клеток в микропластине клеточной культуры. Этот протокол не подходит для клеток в суспензии, и рекомендуется использование клеточного и тканевого клея. Другим ограничением этого протокола является то, что этот метод не подходит для вывода количественных данных. Другими словами, с помощью этого метода невозможно оценить фактическое количество митохондриального белка в каждой скважине до измерения. Таким образом, этот метод генерирует быстрый скрининг потока митохондриального субстрата без обеспечения точной оценки соотношения фосфат/кислород (отношение P/O)5. Однако можно использовать этот протокол для количественных исследований на небольших выборках11. Для этого необходимо получить свежеизолированные митохондрии и использовать клеточный и тканевой адгезив для фиксации митохондрий к микропластине клеточной культуры.
Для получения наилучших воспроизводимых результатов от использования данного протокола обратите внимание на концентрацию используемых реагентов. Температура используемых растворов, инкубаторов и инструмента должна быть стабильной. Убедитесь, что все растворы и подложки имеют скорректированный рН. Как упоминалось ранее, не рекомендуется включать BSA в растворы, которые планируется вводить. Если результаты показывают широкий диапазон ошибок, отобразите результаты в формате скважины, а не в формате группы, чтобы найти и удалить возможные выбросы.
В этой работе мы попытались добиться максимального использования одного измерения для одновременного скрининга нескольких потоков митохондриальной подложки с надлежащим фоновым контролем и достаточным количеством реплик за относительно короткое время. Как показано в результатах, метод полезен при сравнении двух фенотипов, созданных при лечении одной группы одной концентрацией лекарственного средства. Его можно использовать для сравнения различных клеточных линий или генетически модифицированных клеток. Протокол является универсальным и различные субстраты или ингибиторы могут быть использованы для экранизации адаптации потока митохондриального субстрата в любой клеточной модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Acknowledgments
Авторы благодарят сотрудников кафедры физиологии медицинского факультета в Градце Кралове и кафедры патофизиологии третьего медицинского факультета за помощь в подготовке химических веществ и образцов. Эта работа была поддержана грантовыми программами Карлова университета PROGRES Q40/02, грантом Министерства здравоохранения Чехии NU21-01-00259, грантом Чешского научного фонда 18-10144 и проектом INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046, финансируемым Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики и Европейским союзом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
