Summary
In dit werk beschrijven we een aangepast protocol om mitochondriale respiratoire substraatflux te testen met behulp van recombinant perfringolysine O in combinatie met respirometrie op basis van microplaten. Met dit protocol laten we zien hoe metformine de mitochondriale ademhaling van twee verschillende tumorcellijnen beïnvloedt.
Abstract
Mitochondriale substraatflux is een onderscheidend kenmerk van elk celtype en veranderingen in de componenten ervan, zoals transporters, kanalen of enzymen, zijn betrokken bij de pathogenese van verschillende ziekten. Mitochondriale substraatflux kan worden bestudeerd met behulp van intacte cellen, gepermeabiliseerde cellen of geïsoleerde mitochondriën. Het onderzoeken van intacte cellen stuit op verschillende problemen als gevolg van gelijktijdige oxidatie van verschillende substraten. Bovendien bevatten verschillende celtypen interne opslagplaatsen van verschillende substraten die de interpretatie van resultaten bemoeilijken. Methoden zoals mitochondriale isolatie of het gebruik van permeabiliseermiddelen zijn niet gemakkelijk reproduceerbaar. Het isoleren van zuivere mitochondriën met intacte membranen in voldoende hoeveelheden uit kleine monsters is problematisch. Het gebruik van niet-selectieve permeabilizers veroorzaakt verschillende gradaties van onvermijdelijke mitochondriale membraanschade. Recombinant perfringolysine O (rPFO) werd aangeboden als een meer geschikte permeabilisator, dankzij het vermogen om selectief het plasmamembraan te permeabiliseren zonder de mitochondriale integriteit te beïnvloeden. Bij gebruik in combinatie met microplaat respirometrie maakt het het mogelijk om de flux van verschillende mitochondriale substraten te testen met voldoende replicaties binnen één experiment terwijl een minimaal aantal cellen wordt gebruikt. In dit werk beschrijft het protocol een methode om mitochondriale substraatflux van twee verschillende cellulaire fenotypes of genotypen te vergelijken en kan worden aangepast om verschillende mitochondriale substraten of remmers te testen.
Introduction
Microplate-gebaseerde respirometrie heeft een revolutie teweeggebracht in mitochondriaal onderzoek door de studie van cellulaire ademhaling van een kleine steekproefgrootte mogelijk te maken1. Cellulaire ademhaling wordt over het algemeen beschouwd als een indicator van mitochondriale functie of 'disfunctie', ondanks het feit dat het mitochondriale scala aan functies verder reikt danenergieproductie 2. In aerobe omstandigheden extraheren mitochondriën de energie die is opgeslagen in verschillende substraten door deze substraten af te breken en om te zetten in metabole tussenproducten die de citroenzuurcyclus kunnen voeden3 (Figuur 1). De continue flux van substraten is essentieel voor de stroom van de citroenzuurcyclus om hoogenergetische 'elektronendonoren' te genereren, die elektronen leveren aan de elektronentransportketen die een protongradiënt over het binnenste mitochondriale membraan genereert, waardoor ATP-synthase ADP tot ATP kan fosforyleren4. Daarom moet een experimenteel ontwerp om mitochondriale ademhaling te testen de monsternatuur (intacte cellen, gepermeabiliseerde cellen of geïsoleerde mitochondriën) en mitochondriale substraten omvatten.
Cellen houden een opslag van inheemse substraten5, en mitochondriën oxideren verschillende soorten substraten tegelijkertijd6, wat de interpretatie van resultaten verkregen uit experimenten uitgevoerd op intacte cellen bemoeilijkt. Een veel voorkomende aanpak om mitochondriaal vermogen om een geselecteerd substraat te oxideren te onderzoeken, is om mitochondriën te isoleren of de onderzochte cellen te permeabiliseren5. Hoewel geïsoleerde mitochondriën ideaal zijn voor kwantitatieve studies, is het isolatieproces arbeidsintensief. Het wordt geconfronteerd met technische problemen zoals de noodzaak van een grote steekproefomvang, zuiverheid van de opbrengst en reproduceerbaarheid van de techniek5. Gepermeabiliseerde cellen bieden een oplossing voor de nadelen van mitochondriale isolatie; routinematige permeabiliseermiddelen van detergent aard zijn echter niet specifiek en kunnen mitochondriale membranen beschadigen5.
Recombinant perfringolysine O (rPFO) werd aangeboden als een selectief plasmamembraanpermeabiliserend middel7en werd met succes gebruikt in combinatie met een extracellulaire fluxanalysator in verschillende studies7,8,9,10. We hebben een protocol aangepast met behulp van rPFO om mitochondriale substraatflux te screenen met behulp van XFe96 extracellulaire fluxanalysator. In dit protocol worden vier verschillende substraatoxiderende routes in twee cellulaire fenotypen vergeleken met voldoende replicaties en de juiste controle voor elk getest materiaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Een dag voor de test
- Bereiding van reagentia en substraten.
- Mitochondriale assayoplossing (MAS): Bereid stamoplossingen van alle reagentia zoals beschreven in tabel 1. Verwarm de voorraden mannitol en sucrose tot 37 °C om volledig op te lossen. Meng de reagentia om 2x MAS te bereiden en verwarm het mengsel tot 37 °C. Stel de pH met 5N KOH in op 7,4 (~ 7 ml) en voeg vervolgens water toe om het volume op 1 l te brengen. Filter-steriliseer en bewaar de aliquots bij -20 °C tot de meetdag.
- Runderserumalbumine (5% BSA): Los 5 g BSA op in 90 ml voorverwarmd steriel water op een magneetroerder en vermijd schudden. Stel de pH in op 7,4 met 5 N KOH en voeg vervolgens water toe om het volume op 100 ml te brengen. Filter-steriliseer en bewaar de aliquots bij -20 °C tot de meetdag.
- Mitochondriale substraten: Bereid 1 M stamoplossingen van natriumsuccinaat, natriumpyruvaat en natriumglutamaat in steriel water. Bereid 100 mM bouillonoplossing van natriummalaat in steriel water en gebruik voorverwarmd steriel water om een 10 mM bouillonoplossing van palmitoyl carnitine te bereiden. Stel de pH van elke oplossing in op 7,4 bij 5 N KOH en filtersteriliseer. Bewaar de substraten bij 2-8 °C. Op het moment van gebruik, warm palmitoyl carnitine tot 37 °C om eventuele neerslag op te lossen. Bewaar voor later gebruik aliquots van alle substraten behalve pyruvaat bij -20 °C.
- Mitochondriale remmers: Gebruik dimethylsulfoxide (DMSO) om stamoplossingen van 25 mM oligomycine, 50 mM carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP), 20 mM rotenon en 20 mM antimycine A te bereiden.
- Zaaien en behandelen van de cellen: Zoals weergegeven in figuur 2, zaai de cellen in de kolommen 2-11. Kolommen 1 en 12 moeten leeg worden gelaten om als achtergrondputten te dienen. In dit werk werden HepG2- en A549-cellen gebruikt.
- Zaai de cellen met een dichtheid van 20.000 cellen per put. Gebruik 50-80 μL celkweekmedium voor het zaaien.
- Vul de lege putten met een gelijk volume celkweekmedium en incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Laat de cellen zich 3-4 uur hechten en voeg vervolgens 100 μL celkweekmedium toe aan alle putten.
- Met die laatste mediumtoevoeging past u de behandeling toe in de kolommen 7-11. In dit werk werd de experimentele groep gedurende 16 uur behandeld met 1 mM metforminehydrochloride en de controlegroep werd behandeld met een gelijk volume steriel gedestilleerd water als voertuigcontrole.
- Hydratatie van de sensoren: Pipetteer 200 μL steriel water per put in de nutsplaat en geef de sensorcartridge voorzichtig terug terwijl u de sensoren in water dompelt. Incubeer de patroon in een CO2-vrijeincubator bij 37 °C tot de volgende dag.
- De testprotocolsjabloon: Schakel de analyzer (zie Tabel met materialen) en de controllereenheid in. Start de software voor instrumentbesturing en gegevensverzameling en ontwerp het testprotocol zoals beschreven in tabel 2. Maak onder Groepsdefinitiesvier injectiestrategieën waarbij Poort A verschilt afhankelijk van het geïnjecteerde substraat(figuur 3). Noem de strategieën naar de substraten of hun afkortingen.
- Wijs aan poort B, C en D respectievelijk de verbindingen oligomycine, FCCP en rotenon/antimycine A toe. Maak acht groepen en geef ze een naam zoals weergegeven in figuur 4. Wijs onder Plaattoewijzing de groepen toe aan de bijbehorende putten en sla het protocol vervolgens op als een kant-en-klare sjabloon. Laat de analysator ingeschakeld om de temperatuur 's nachts te laten stabiliseren. Houd de analyzer op een plaats met een stabiele temperatuur om plotselinge temperatuurveranderingen te voorkomen.
2. De dag van de test
- Water vervangen door het kalibrant: Gooi het water van de nutsplaat weg en pipetteer 200 μL voorgewarmd kalibrant per put in de nutsplaat. Breng de patroon terug naar de CO2-vrijeincubator tot het moment van de test. Om snelle verdamping van het kalibrant te voorkomen, handhaaft u een vochtbron in de incubator en schakelt u de ventilatorsnelheid uit of verlaagt u deze tot een minimum.
- Voorbereiding van de werkoplossingen: Begin met het verwarmen van 2x MAS, 5% BSA en steriel water tot 37 °C. Laat ondertussen de remmervoorraden op kamertemperatuur komen. Gebruik warm 2x MAS en steriel gedestilleerd water om 5 ml van de werkconcentratie van de substraten en remmers te bereiden zoals beschreven in tabel 3.
- Laden van de injectiepoorten: Zoals weergegeven in figuur 3, laad 20 μL van de substraten in poort A. Laad succinaat/rotenonmengsel in poort A van de rijen A en B. Laad pyruvaat/malaatmengsel in poort A van de rijen C en D. Laad glutamaat/malaatmengsel in poort A van de rijen E en F. Laad palmitoyl carnitine/malaatmengsel in poort A van de rijen G en H. Laad voor de hele plaat poort B met 22 μL oligomycinepreparaat, poort C met 25 μL FCCP-preparaat en poort D met 27 μL mengsel rotenon/antimycine A.
- De kalibratiestap starten: Klik onder het tabblad Test uitvoeren op Uitvoeren starten om de test te starten. Plaats de geladen sensorcartridge en start de kalibratiestap. Wacht tot de kalibratie is voltooid voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Bereiding van het testmedium (MAS-BSA-rPFO): Om 20 ml van het testmedium te bereiden, mengt u 10 ml 2x MAS, 9,2 ml steriel water en 0,8 ml 5% BSA in een buis van 50 ml. Voeg 2 μL van 10 μM rPFO toe om een concentratie van 1 nM te bereiken en resuspend het mengsel met voorzichtig pipetteren. Vermijd schudden en gebruik geen vortexmixer voor het mengen. Incubeer de buis bij 37 °C tot het moment van gebruik.
- De cellen wassen: Was de cellen en de lege putjes twee keer met voorverwarmde calcium- en magnesiumvrije fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een meerkanaalspion. Vermijd het hergebruiken van dezelfde tips om het celkweekmedium weg te gooien en PBS toe te voegen. Voer deze stap uit buiten de laminaire stroom om de cellen te beschermen tegen uitdroging door de luchtstroom.
- Celpermeabilisatie in assaymedium: Gooi met behulp van een meerkanaalspion de PBS weg en vervang deze door 180 μL van het voorgewarmde assaymedium (MAS-BSA-rPFO).
- De meting starten: Vervang onmiddellijk na de permeabilisatie de gebruiksplaat van de gekalibreerde sensorcartridge door de celplaat en start de meting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begin met het normaliseren van de resultaten naar de tweede meting van de basisademhaling om waarden weer te geven als zuurstofverbruikspercentage (OCR%). De resultaten van de test zijn weergegeven in figuur 5, figuur 6,figuur 7 en figuur 8. Het is belangrijk om de juiste achtergrondputten voor elke groep toe te wijzen en de achtergrondputten van andere groepen te inactiveren. Figuur 5 laat zien dat de behandelde groep een hogere mate van door succinaat geïnduceerde ademhaling heeft. De respons van A549-cellen op behandeling met metformine (figuur 5A) was hoger dan hepg2-cellen (figuur 5B). De achtergrondcontroleputten waren alleen die uit dezelfde rijen van de vergeleken groep, in dit geval putten A1, B1, A12 en B12. Figuur 6 toont de veranderingen in pyruvaat/malaat-geïnduceerde ademhaling. Figuur 7 toont de veranderingen in glutamaat/malaat-geïnduceerde ademhaling en figuur 8 toont de veranderingen in palmitoyl carnitine/malaat-geïnduceerde ademhaling.
Figuur 1: Een schematische weergave van de citroenzuurcyclus. De gebruikte substraten om mitochondriale substraatflux te testen zijn in het rood. Malaat wordt niet alleen gebruikt, maar in combinatie met pyruvaat, palmitoyl carnitine en glutamaat. De rol van malaat in pyruvaat/malaat- en palmitoyl carnitine/malaat-geïnduceerde ademhaling is het leveren van oxaalacetaat door de werking van het malaat dehydrogenase enzym. Bij glutamaat/malaat-geïnduceerde ademhaling neemt malaat deel aan de malaat-aspartaat shuttle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie van het celzaaiplan in de celkweekmicroplaat. Lege putjes in de kolommen 1 en 12 moeten leeg worden gelaten zonder cellen. Kolommen 7-11 worden gebruikt om de experimentele groep te behandelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Illustratie van de injectiestrategie. Poort A van de rijen A en B zijn geladen met een mengsel van succinaat en rotenon. Poort A van de rijen C en D zijn geladen met een pyruvaat/malaatmengsel. Poort A van de rijen E en F zijn geladen met een mengsel van glutamaat en malaat. Poort A van de rijen G en H zijn geladen met palmitoyl carnitine/malaat mengsel. Voor de hele plaat zijn poorten B, C en D geladen met respectievelijk oligomycine, FCCP en rotenon / antimycine A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Groepsnamen en plaatkaart. Elke groep wordt genoemd op basis van het fenotype (controle of behandeld) en het substraat dat wordt gebruikt om ademhaling te induceren. (S), succinaat-geïnduceerde ademhaling. (P/M), pyruvaat/malaat-geïnduceerde ademhaling. (G/M), glutamaat/malaat-geïnduceerde ademhaling. (CP/M), palmitoyl carnitine/malaat-geïnduceerde ademhaling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Door succinaat geïnduceerde ademhaling. (A) A549 en (B) HepG2. De geteste groep werd gedurende 16 uur behandeld met 1 mM metforminehydrochloride. Alleen de achtergrondputten A1, B1, A12 en B12 worden gebruikt voor correctie. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde OCR% ± SD. De grafiek en het platenraster werden gemaakt en geëxporteerd als afbeeldingsbestanden door de software voor testontwerp, gegevensanalyse en bestandsbeheer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Pyruvaat/malaat-geïnduceerde ademhaling. (A) A549 en (B) HepG2. De geteste groep werd gedurende 16 uur behandeld met 1 mM metforminehydrochloride. Alleen de achtergrondputten C1, D1, C12 en D12 worden gebruikt voor correctie. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde OCR% ± SD. De grafiek en het platenraster werden gemaakt en geëxporteerd als afbeeldingsbestanden door de software voor testontwerp, gegevensanalyse en bestandsbeheer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Glutamaat/door malaat geïnduceerde ademhaling. (A) A549 en (B) HepG2. De geteste groep werd gedurende 16 uur behandeld met 1 mM metforminehydrochloride. Alleen de achtergrondputten E1, F1, E12 en F12 worden gebruikt voor correctie. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde OCR% ± SD. De grafiek en het platenraster werden gemaakt en geëxporteerd als afbeeldingsbestanden door de software voor testontwerp, gegevensanalyse en bestandsbeheer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Palmitoyl carnitine/malaat-geïnduceerde ademhaling. (A) A549 en (B) HepG2. De geteste groep werd gedurende 16 uur behandeld met 1 mM metforminehydrochloride. Alleen de achtergrondputten G1, H1, G12 en H12 worden gebruikt voor correctie. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde OCR% ± SD. De grafiek en het platenraster werden gemaakt en geëxporteerd als afbeeldingsbestanden door de software voor testontwerp, gegevensanalyse en bestandsbeheer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Mitochondriaal assay medium | ||||
| Voorraad (mM) | Volume uit voorraad per liter (ml) | 2x MAS (mM) | Mas (mM) | |
| Sacharose | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| Mannitol · | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| Hepes | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
Tabel 1: Mitochondriale testoplossing. Meng het aangegeven volume van elke ingrediëntenvoorraadoplossing om te bereiden (2x MAS). Verwarm de oplossing tot 37 °C en stel vervolgens de pH met 5 N KOH in op 7,4. Voeg gedestilleerd water toe om het volume op 1 L te brengen. Filter-steriliseer en bewaar aliquots bij -20 °C. Bereid het testmedium en de werkoplossingen van mitochondriale substraten en remmers voor met behulp van 2x MAS.
| Bevelen | Duur | Geïnjecteerde verbinding |
| Calibratie | standaard | |
| Evenwicht | Ja | |
| Basislijn | ||
| 2 Cycli | ||
| Mengen | 30 s | |
| Wachten | 30 s | |
| Meten | 2 min. | |
| Injecteer poort A | Substraten | |
| 2 Cycli | ||
| Mengen | 30 s | |
| Wachten | 30 s | |
| Meten | 2 min. | |
| Injecteer poort B | Oligomycine | |
| 2 Cycli | ||
| Mengen | 30 s | |
| Wachten | 30 s | |
| Meten | 2 min. | |
| Injecteer poort C | Fccp | |
| 2 Cycli | ||
| Mengen | 30 s | |
| Wachten | 30 s | |
| Meten | 2 min. | |
| Injecteer poort D | Rotenon + Antimycine A | |
| 2 Cycli | ||
| Mengen | 30 s | |
| Wachten | 30 s | |
| Meten | 2 min. |
Tabel 2: Commando's van het testprotocol.
| Volume in 5 ml | ||||||
| Substraten | Voorraad conc. | Werkconc. | Voorraad | 2x MAS | dH2O | Slotconc. |
| Succinaat/rotenon | 1 m/20 mm | 100 mM/10 μM | 500 μL/ 2,5 μL | 2,5 ml | 1997,5 μL | 10mm/1 μm |
| Pyruvaat/malaat | 1 m/100 mmin | 100mm /10m | 500 μL/500 μL | 2,5 ml | 1500 μL | 10mm /1mm |
| Glutamaat/malaat | 1 m/100 mmin | 100mm /10m | 500 μL/500 μL | 2,5 ml | 1500 μL | 10mm /1mm |
| Palmitoyl carnitine/malaat | 10mm/100mm | 400 μM /10m | 200 μL/500 μL | 2,5 ml | 1800 μL | 40 μM /1m |
| Remmers | ||||||
| Oligomycine | 25 meter | 15 μM | 3 μL | 2,5 ml | 2497 μL | 1,5 μM |
| Fccp | 50 meter | 40 μM | 4 μl | 2,5 ml | 2496 μl | 4 μM |
| Rotenon/antimycine A | 20mm/20mm | 10 μM/ 10 μM | 2,5 μL/2,5 μL | 2,5 ml | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
Tabel 3: Lijst van mitochondriale substraten en remmers die in injectiepoorten van de sensorpatronen moeten worden geladen, zoals eerder besproken in figuur 3. Meng de aangegeven volumes van voorraadoplossingen, 2x MAS en gedestilleerd water om de 5 ml van de werkconcentratie van elk substraat of inhibitormengsel te bereiden. De uiteindelijke concentratie wordt bereikt in de putten na het injectieproces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is een wijziging van eerder gepubliceerde studies7,8,9,10 en de gebruikershandleiding van het product. In tegenstelling tot het protocol van de fabrikant wordt 2x MAS gebruikt in plaats van 3x MAS, omdat 2× MAS gemakkelijker op te lossen is en geen neerslag vormt na bevriezing. Bevroren 2x MAS aliquots kunnen tot zes maanden worden bewaard en laten consistente resultaten zien. Een ander verschil is het opnemen van ADP in de componenten van 2x MAS en het weglaten van BSA uit de formule. Oplossingen die BSA bevatten zijn moeilijker te injecteren en veroorzaken een grotere kans op fouten en uitschieters. De aanwezigheid van BSA is echter essentieel om de hoeveelheid rPFO te verminderen die nodig is om een goede permeabilisatie te bereiken. Daarom wordt BSA alleen toegevoegd aan het testmedium (MAS-BSA-rPFO) dat wordt gebruikt in de permeabilisatiestap na het wassen van de cel.
Om de cellen van celkweekmedium te wassen, gebruikt dit protocol PBS in plaats van MAS. PBS is isotoon en veroorzaakt geen verandering in cellulaire vorm, in tegenstelling tot het natriumvrije MAS dat rijk is aan kalium en de cellulaire morfologie kan veranderen. Een ander groot verschil is het behouden van de equilibratiestap in het testprotocol. De equilibratiestap duurt 12 minuten, wat gelijk is aan 2 meetcycli. Het doel van het houden van de equilibratiestap is om de temperatuur in het instrument te stabiliseren en tegelijkertijd de cellen in staat te stellen alle mogelijke interne oxideerbare winkels te oxideren, wat wordt versterkt door de aanwezigheid van ADP in het testmedium.
Er moeten enkele overwegingen met betrekking tot celkweektechnieken worden gegeven. In dit werk werden de onderzochte cellen gezaaid op de dag voor de test. Sommige cellen vereisen echter een langere kweek- of behandelingstijd. Als de onderzoeksopzet gedifferentieerde cellen, vers geïsoleerde of niet-hechtende cellen omvat, is een goede coating vereist om cellen in de celkweekmicroplaat te fixeren. Dit protocol is niet geschikt voor cellen in suspensie en het gebruik van cel- en weefsellijm wordt aanbevolen. Een andere beperking van dit protocol is dat deze methode niet geschikt is om kwantitatieve gegevens te concluderen. Met andere woorden, het is met deze methode niet mogelijk om de werkelijke hoeveelheid mitochondriaal eiwit in elk ruim voor de meting te schatten. Daarom genereert deze methode een snelle screening van mitochondriale substraatflux zonder een nauwkeurige schatting te geven van de fosfaat/ zuurstofverhouding (P / O-verhouding)5. Het is echter mogelijk om dit protocol te gebruiken voor kwantitatieve studies op kleine monsters11. Voor dit doel is het noodzakelijk om vers geïsoleerde mitochondriën te verkrijgen en cel- en weefsellijm te gebruiken om mitochondriën aan de celkweekmicroplaat te bevestigen.
Voor het verkrijgen van de best reproduceerbare resultaten van het gebruik van dit protocol, let op de concentratie van de gebruikte reagentia. De temperatuur van de gebruikte oplossingen, incubators en instrument moet stabiel zijn. Zorg ervoor dat alle oplossingen en substraten een aangepaste pH hebben. Zoals eerder vermeld, wordt het niet aanbevolen om BSA op te nemen in de oplossingen die gepland zijn om te worden geïnjecteerd. Als de resultaten een breed foutenbereik laten zien, geeft u de resultaten weer in de putindeling in plaats van in de groepsindeling om mogelijke uitschieters te zoeken en te verwijderen.
In dit werk hebben we geprobeerd om maximaal gebruik te maken van een enkele meting om tegelijkertijd meerdere mitochondriale substraatfluxen te screenen met de juiste achtergrondcontrole en voldoende replicaties in een relatief korte tijd. Zoals te zien is in de resultaten, is de methode nuttig bij het vergelijken van twee fenotypen die zijn gemaakt door één groep met één concentratie van een medicijn te behandelen. Het kan worden gebruikt om verschillende cellijnen of genetisch gemanipuleerde cellen te vergelijken. Het protocol is veelzijdig en verschillende substraten, of remmers kunnen worden gebruikt om aanpassing van mitochondriale substraatflux in elk cellulair model te screenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de medewerkers van de afdeling Fysiologie van de faculteit Geneeskunde in Hradec Králové en de afdeling Pathofysiologie van de Derde Faculteit Geneeskunde voor de hulp bij de voorbereiding van chemicaliën en monsters. Dit werk werd ondersteund door Charles University subsidieprogramma's PROGRES Q40/02, Tsjechische ministerie van Volksgezondheid subsidie NU21-01-00259, Tsjechische wetenschap stichting subsidie 18-10144 en INOMED project CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 gefinancierd door het ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek en door de Europese Unie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
