Summary
Bu çalışmada, mikro plaka bazlı respirometri ile birlikte rekombinant perfringolysin O kullanarak mitokondriyal solunum substrat akısını test etmek için değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol ile metforminin iki farklı tümör hücre hattının mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini gösteriyoruz.
Abstract
Mitokondriyal substrat akısı her hücre tipinin ayırt edici bir özelliğidir ve taşıyıcılar, kanallar veya enzimler gibi bileşenlerindeki değişiklikler birkaç hastalığın patogenezinde rol oynar. Mitokondriyal substrat akısı bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondri kullanılarak incelenebilir. Sağlam hücrelerin araştırılması, farklı substratların eşzamanlı oksidasyonu nedeniyle çeşitli sorunlarla karşılaşır. Ayrıca, birkaç hücre türü, sonuç yorumlamayı zorlaştıran farklı substratların iç depolarını içerir. Mitokondriyal izolasyon veya permeabilize edici ajanlar kullanma gibi yöntemler kolayca tekrarlanamaz. Saf mitokondrilerin küçük örneklerden yeterli miktarda bozulmamış zarlarla izole edilmesi sorunludur. Seçici olmayan permeabilizatörlerin kullanılması, çeşitli derecelerde kaçınılmaz mitokondriyal membran hasarına neden olur. Rekombinant perfringolysin O (rPFO), mitokondriyal bütünlüğü etkilemeden plazma membranını seçici olarak permeabilize etme yeteneği sayesinde daha uygun bir permeabilizatör olarak sunuldu. Mikro plaka respirometrisi ile birlikte kullanıldığında, birkaç mitokondriyal substratın akısının en az sayıda hücre kullanırken bir deneyde yeterli çoğaltma ile testine izin verir. Bu çalışmada, protokol iki farklı hücresel fenotip veya genotipin mitokondriyal substrat akısını karşılaştırmak için bir yöntem açıklar ve çeşitli mitokondriyal substratları veya inhibitörleri test etmek için özelleştirilebilir.
Introduction
Mikro plaka bazlı respirometri, küçük bir örneklem boyutunun hücresel solunumunun incelenmesini sağlayarak mitokondriyal araştırmalarda devrim yaptı1. Hücresel solunum genellikle mitokondriyal fonksiyonun veya 'işlev bozukluğunun' bir göstergesi olarak kabul edilir, ancak mitokondriyal fonksiyon aralığı enerji üretiminin ötesine uzanır2. Aerobik koşullarda mitokondriler, bu substratları parçalayarak ve sitrik asit döngüsünü körükleyebilecek metabolik ara parçalara dönüştürerek farklı substratlarda depolanan enerjiyi çıkarır3 (Şekil 1). Substratların sürekli akışı, sitrik asit döngüsünün akışının, iç mitokondriyal membran boyunca proton gradyanı üreten elektron taşıma zincirine elektronlar sağlayan ve ATP-synthase'in ADP'yi ATP4'efosforilasyon yapmasını sağlayan yüksek enerjili 'elektron donörleri' üretmesi için gereklidir. Bu nedenle, mitokondriyal solunumu test etmek için deneysel bir tasarım, örnek doğayı (bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondriler) ve mitokondriyal substratları içermelidir.
Hücreler yerli substratların bir deposu tutar5ve mitokondri aynı anda çeşitli substrat türlerini oksitler6, bu da sağlam hücreler üzerinde yapılan deneylerden elde edilen sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Seçilen bir substratı oksitlemek için mitokondriyal yeteneği araştırmak için yaygın bir yaklaşım mitokondri izole etmek veya araştırılan hücrelerin dengesini sağlamaktır5. İzole mitokondri nicel çalışmalar için ideal olsa da izolasyon süreci zahmetlidir. Büyük numune boyutu ihtiyacı, verimin saflığı ve tekniğin tekrarlanabilirliği gibi teknik zorluklarla karşıkarşıyadır 5. Permeabilize hücreler mitokondriyal izolasyonun dezavantajları için bir çözüm sunar; bununla birlikte, deterjan doğasının rutin permeabilize edici ajanları spesifik değildir ve mitokondriyal membranlara zarar verebilir5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) seçici plazma membran permeabilizasyon ajanı7olarak sunuldu ve çeşitli çalışmalarda hücre dışı bir akı analizörü ile birlikte başarıyla kullanıldı 7,8,9,10. XFe96 hücre dışı akı çözümleyicisi kullanarak mitokondriyal substrat akısını taramak için rPFO kullanarak bir protokol değiştirdik. Bu protokolde, iki hücresel fenotipte dört farklı substrat oksitleyici yol, test edilen her malzeme için yeterli çoğaltma ve uygun kontrole sahipken karşılaştırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Testden bir gün önce
- Reaktiflerin ve substratların hazırlanması.
- Mitokondriyal test çözümü (MAS): Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm reaktiflerin stok çözümlerini hazırlayın. Mannitol ve sakkaroz stoklarını tamamen çözünmesi için 37 °C'ye ısıtın. 2x MAS hazırlamak için reaktifleri karıştırın, ardından karışımı 37 ° C'ye ısıtın. pH'ı 5N KOH ile 7,4 (~7 mL) olarak ayarlayın, ardından hacmi 1 L'ye kadar getirmek için su ekleyin.
- Sığır serum albümini (%5 BSA): 5 g BSA'yı 90 mL önceden ısıtılmış steril suda manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün ve titremekten kaçının. 5 N KOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ardından hacmi 100 mL'ye çıkarmak için su ekleyin. Aliquotları ölçüm gününe kadar -20 °C'de filtreleyin ve saklayın.
- Mitokondriyal substratlar: Steril suda sodyum süksinat, sodyum piruvat ve sodyum glutamat 1 M stok çözeltileri hazırlayın. Steril suda 100 mM sodyum malat stok çözeltisi hazırlayın ve palmitoil karnitin 10 mM stok çözeltisi hazırlamak için önceden ısıtilmiş steril su kullanın. Her çözeltinin pH'ını 7,4'e 5 N KOH'a ayarlayın ve filtre sterilize edin. Substratları 2-8 °C'de saklayın. Kullanım sırasında, herhangi bir çökeltmeyi çözmek için 37 ° C'ye ılık palmitoil karnitin. Daha sonra kullanmak için, piruvat hariç tüm substratların aliquotlarını -20 °C'de saklayın.
- Mitokondriyal inhibitörler: 25 mM oligomisin, 50 mM karbonil siyanür 4-(trifluoromethoxy) fenilhidrozon (FCCP), 20 mM rotenon ve 20 mM antimisin A stok çözeltileri hazırlamak için dimetil sülfit (DMSO) kullanın.
- Hücrelerin tohumlama ve tedavi: Şekil 2'degösterildiği gibi, hücreleri sütun 2-11'de tohumlama. Arka plan kuyuları olarak hizmet vermek için sütun 1 ve 12 boş bırakılmalıdır. Bu çalışmada HepG2 ve A549 hücreleri kullanılmıştır.
- Hücreleri kuyu başına 20.000 hücre yoğunluğunda tohumla. Tohumlama için 50-80 μL hücre kültürü ortamı kullanın.
- Boş kuyuları eşit hacimli hücre kültürü ortamıyla doldurun ve hücreleri% 5 CO2ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın. Hücrelerin 3-4 saat boyunca bağlanmasına izin verin ve ardından tüm kuyulara 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin.
- Bu son orta ilave ile tedaviyi 7-11 kolonlarında uygulayın. Bu çalışmada deney grubuna 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür, kontrol grubuna ise araç kontrolü olarak eşit hacimde steril damıtılmış su arıtılmış.
- Sensörlerin nemlendirilmesi: Pipet 200 μL kuyu başına steril su şebeke plakasına, ardından sensörleri suya batırırken sensör kartuşunu dikkatlice geri verin. Kartuşu ertesi güne kadar 37 °C'de CO2içermeyen bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
- Tahlil protokolü şablonu: Çözümleyiciyi (bkz. Malzeme Tablosu)ve denetleyici ünitesini açma. Cihaz kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın ve tablo 2'deaçıklandığı gibi test protokolünü tasarlayın. Grup Tanımlarıaltında, A Bağlantı Noktasının enjekte edilen substrata göre farklılık gösterdiği dört enjeksiyon stratejisi oluşturun (Şekil 3). Stratejileri alt tabakalardan veya kısaltmalarından sonra adlandırın.
- B, C ve D bağlantı noktalarına sırasıyla oligomisinin, FCCP'nin ve rotenon/antimisinin A bileşiklerini atayın. Sekiz grup oluşturun ve şekil 4'tegösterildiği gibi adlandırın. Plaka Haritası altında grupları ilgili kuyulara atayın, ardından protokolü kullanıma hazır şablon olarak kaydedin. Sıcaklığın gece boyunca dengelenmesi için analizörü açık bırakın. Ani sıcaklık değişikliklerini önlemek için analizörü sabit bir sıcaklığa sahip bir yerde tutun.
2. Tahlil günü
- Suyun kalibrantla değiştirilmesi: Suyu şebeke plakasından ve pipetten 200 μL önceden uyarılmış kalibrantın kuyu başına yardımcı plakaya atın. Kartuşu test zamanına kadar CO2içermeyen inkübatöre geri verin. Kalibratörün hızlı buharlaşmasını önlemek için, inkübatörün içinde bir nem kaynağı sağlayın ve fan hızını kapatın veya minimuma küçümseyin.
- Çalışma çözümlerinin hazırlanması: 2x MAS, %5 BSA ve steril suyu 37 °C'ye ısıtarak başlayın. Bu arada, inhibitör stoklarının oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Tablo 3'teaçıklandığı gibi substratların ve inhibitörlerin çalışma konsantrasyonunun 5 mL'sini hazırlamak için ılık 2x MAS ve steril damıtılmış su kullanın.
- Enjeksiyon portlarının yüklenmesi: Şekil 3'tegösterildiği gibi, substratların 20 μL'sini A limanına yükleyin. Tüm plaka için, 22 μL oligomicin preparatı ile B portu, 25 μL FCCP hazırlığı ile C limanı ve 27 μL rotenon / antimisicin A karışımı ile D bağlantı noktası yükleyin.
- Kalibrasyon adımını başlatma: Test Çalıştır sekmesi altında, tahlilleri başlatmak için Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Yüklü sensör kartuşunu takın ve kalibrasyon adımını başlatın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin.
- Tahlil ortamının hazırlanması (MAS-BSA-rPFO): Test ortamının 20 mL'sini hazırlamak için, 50 mL'lik bir tüpte 10 mL 2x MAS, 9,2 mL steril su ve %5 BSA'nın 0,8 mL'sini karıştırın. 1 nM konsantrasyon elde etmek için 2 μL 10 μM rPFO ekleyin ve karışımı hafif pipetleme ile yeniden dürt. Titremekten kaçının ve karıştırmak için bir girdap karıştırıcı kullanmayın. Tüpü kullanım zamanına kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Hücrelerin yıkanması: Hücreleri ve boş boş kuyuları çok kanallı pipet kullanarak önceden ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. Hücre kültürü ortamını atmak ve PBS eklemek için aynı ipuçlarını yeniden kullanmaktan kaçının. Hücrelerin hava akımı tarafından kurumasını korumak için laminar akışının dışında bu adımı gerçekleştirin.
- Test ortamında hücre permeabilizasyonu: Çok kanallı pipet kullanarak PBS'yi atın ve önceden ısınmış test ortamının (MAS-BSA-rPFO) 180 μL ile değiştirin.
- Ölçüme başlama: Permeabilizasyondan hemen sonra, kalibre edilmiş sensör kartuşunun ana plakasını hücre plakasıyla değiştirin ve ölçüme başlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Değerleri oksijen tüketim oranı yüzdesi (OCR%) olarak göstermek için sonuçları ikinci taban çizgisi solunum ölçümüne normalleştirerek başlayın. Tahlil sonuçları Şekil 5, Şekil6 , Şekil 7ve Şekil 8 'de gösterilmiştir. Her grup için uygun arka plan kuyularını atamak ve diğer grupların arka plan kuyularını devre dışı bırakmak önemlidir. Şekil 5, tedavi edilen grubun süksinada indüklenen solunum oranının daha yüksek olduğunu göstermektedir. A549 hücrelerinin metformin tedavisine yanıtı (Şekil 5A) HepG2 hücrelerinden daha yüksekti (Şekil 5B). Arka plan kontrol kuyuları yalnızca karşılaştırılan grubun aynı sıralarından gelen kuyulardı, bu durumda A1, B1, A12 ve B12 kuyuları. Şekil 6'da piruvat/malat kaynaklı solunumdaki değişiklikler gösterlenmiş. Şekil 7 glutamat/malat kaynaklı solunumdaki değişiklikleri, Şekil 8 ise palmitoil karnitin/malat kaynaklı solunumdaki değişiklikleri göstermektedir.
Şekil 1: Sitrik asit döngüsünün şematik bir gösterimi. Mitokondriyal substrat akısını test etmek için kullanılan substratlar kırmızı rencidedir. Malat tek başına kullanılmaz, ancak piruvat, palmitoil karnitin ve glutamat ile birlikte kullanılır. Pyruvate/malat ve palmitoyl karnitin/malat kaynaklı solunumda malatın rolü, malat dehidrojenaz enziminin etkisiyle oksaloasetat sağlamaktır. Glutamat/malat kaynaklı solunumda, malat malat-aspartat mekiğinde yer alır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücre kültürü mikro plakasındaki hücre tohumlama planının çizimi. 1 ve 12 sütunlarındaki boş kuyular hücresiz boş bırakılmalıdır. 7-11. sütunlar deney grubunu tedavi etmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Enjeksiyon stratejisinin çizimi. A ve B satırlarının A portu süksinit/rotenon karışımı ile yüklenir. C ve D satırlarının A portu piruvat/malat karışımı ile yüklenir. E ve F satırlarının A portları glutamat/malat karışımı ile yüklenir. G ve H sıralarının A portları palmitoil karnitin/malat karışımı ile yüklenir. Tüm plaka için B, C ve D portları sırasıyla oligomisin, FCCP ve rotenon/antimisin A ile yüklenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Grup adları ve plaka haritası. Her grup fenotipe (kontrol veya tedavi) ve solunumu teşvik etmek için kullanılan substrata göre adlandırılır. (S), süksinit kaynaklı solunum. (P/M), piruvat/malat kaynaklı solunum. (G/M), glutamat/malat kaynaklı solunum. (CP/M), palmitoil karnitin/malat kaynaklı solunum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Süksinit kaynaklı solunum. (A) A549 ve (B) HepG2. Test edilen gruba 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür uygulandı. Düzeltme için yalnızca arka plan kuyuları A1, B1, A12 ve B12 kullanılır. Sonuçlar SD'± ortalama OCR% olarak gösterilir. Grafik ve plaka ızgarası, test tasarımı, veri analizi ve dosya yönetimi yazılımı tarafından görüntü dosyaları olarak oluşturulmuş ve dışa aktarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Pyruvate/malate bağlı solunum. ( A )A549ve (B) HepG2. Test edilen gruba 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür uygulandı. Düzeltme için yalnızca arka plan kuyuları C1, D1, C12 ve D12 kullanılır. Sonuçlar SD'± ortalama OCR% olarak gösterilir. Grafik ve plaka ızgarası, test tasarımı, veri analizi ve dosya yönetimi yazılımı tarafından görüntü dosyaları olarak oluşturulmuş ve dışa aktarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Glutamat/malat kaynaklı solunum. ( A )A549ve (B) HepG2. Test edilen gruba 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür uygulandı. Düzeltme için yalnızca arka plan kuyuları E1, F1, E12 ve F12 kullanılır. Sonuçlar SD'± ortalama OCR% olarak gösterilir. Grafik ve plaka ızgarası, test tasarımı, veri analizi ve dosya yönetimi yazılımı tarafından görüntü dosyaları olarak oluşturulmuş ve dışa aktarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Palmitoyl karnitin/malat kaynaklı solunum. ( A )A549ve (B) HepG2. Test edilen gruba 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür uygulandı. Düzeltme için yalnızca arka plan kuyuları G1, H1, G12 ve H12 kullanılır. Sonuçlar SD'± ortalama OCR% olarak gösterilir. Grafik ve plaka ızgarası, test tasarımı, veri analizi ve dosya yönetimi yazılımı tarafından görüntü dosyaları olarak oluşturulmuş ve dışa aktarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Mitokondriyal tahlil ortamı | ||||
| Stok (mM) | Litre başına stoktan hacim (mL) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| Sakaroz | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| Mannitol | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| HEPES | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
Tablo 1: Mitokondriyal test çözümü. Hazırlamak için her bileşen stok çözeltisinin belirtilen hacmini karıştırın (2x MAS). Çözeltiyi 37 °C'ye ısıtın, ardından 5 N KOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Hacmi 1 L'ye kadar getirmek için damıtılmış su ekleyin filtreleyin ve ardından aliquotları -20 °C'de saklayın. 2x MAS kullanarak mitokondriyal substratların ve inhibitörlerin tahlil orta ve çalışma çözümlerini hazırlayın.
| Komut | Süre | Enjekte edilmiş bileşik |
| Kalibrasyon | varsayılan olarak | |
| Denge | Evet | |
| Taban çizgisi | ||
| 2 Döngüler | ||
| Karışım | 30 sn | |
| Beklemek | 30 sn | |
| Ölçmek | 2 dk | |
| Bağlantı Noktası A'ya Ekleme | Substrat | |
| 2 Döngüler | ||
| Karışım | 30 sn | |
| Beklemek | 30 sn | |
| Ölçmek | 2 dk | |
| B Bağlantı Noktasını Ekleme | Oligomycin | |
| 2 Döngüler | ||
| Karışım | 30 sn | |
| Beklemek | 30 sn | |
| Ölçmek | 2 dk | |
| C Bağlantı Noktasını Ekleme | FCCP | |
| 2 Döngüler | ||
| Karışım | 30 sn | |
| Beklemek | 30 sn | |
| Ölçmek | 2 dk | |
| D Bağlantı Noktasını Ekleme | Rotenon + Antimycin A | |
| 2 Döngüler | ||
| Karışım | 30 sn | |
| Beklemek | 30 sn | |
| Ölçmek | 2 dk |
Tablo 2: Test protokolünün komutları.
| 5 mL'de hacim | ||||||
| Substrat | Hisse senedi conc. | Çalışma conc. | Stok | 2x MAS | dH2O | Son conc. |
| Succinate/rotenone | 1 M/20 mM | 100 mM/10 μM | 500 μL/ 2,5 μL | 2,5 mL | 1997.5 μL | 10 mM/1 μM |
| Pyruvate/malat | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Glutamat/malat | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Palmitoil karnitin/malat | 10 mM/100 mM | 400 μM /10 mM | 200 μL/500 μL | 2,5 mL | 1800 μL | 40 μM /1 mM |
| Inhibitör -leri | ||||||
| Oligomycin | 25 mM | 15 μM | 3 μL | 2,5 mL | 2497 μL | 1,5 μM |
| FCCP | 50 mM | 40 μM | 4 μL | 2,5 mL | 2496 μL | 4 μM |
| Rotenon/antimycine A | 20 mM/20 mM | 10 μM/ 10 μM | 2,5 μL/2,5 μL | 2,5 mL | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
Tablo 3: Daha önce Şekil 3'teanlatıldığı gibi sensör kartuşlarının enjeksiyon portlarına yüklenecek mitokondriyal substratların ve inhibitörlerin listesi. Her bir substratın veya inhibitör karışımının çalışma konsantrasyonunun 5 mL'lik kısmını hazırlamak için stok çözeltilerinden, 2x MAS'tan ve damıtılmış sudan belirtilen hacimleri karıştırın. Enjeksiyon işleminden sonra kuyularda son konsantrasyon elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, daha önce yayınlanan7,8,9,10 çalışmalarının ve ürün kullanım kılavuzunun bir modifikasyonudur. Üreticinin protokolünün aksine, 3x MAS yerine 2x MAS kullanılır, çünkü 2× MAS'ın çözülmesi daha kolaydır ve donma sonrasında yağış oluşturmaz. Dondurulmuş 2x MAS aliquots altı aya kadar saklanabilir ve tutarlı sonuçlar gösterebilir. Diğer bir fark, ADP'yi 2x MAS bileşenlerine dahil etmek ve BSA'yı formülden atlatır. BSA içeren çözümlerin enjekte etmesi daha zordur ve daha büyük bir hata ve aykırılık olasılığına neden olur. Bununla birlikte, BSA'nın varlığı, uygun permeabilizasyonu elde etmek için rPFO'nun gerekli miktarını azaltmak için gereklidir. Bu nedenle, BSA sadece hücre yıkamadan sonra permeabilizasyon adımında kullanılan tahlil ortamına (MAS-BSA-rPFO) eklenir.
Hücreleri hücre kültürü ortamından yıkamak için, bu iletişim kuralı MAS yerine PBS kullanır. PBS izotoniktir ve potasyum bakımından zengin olan ve hücresel morfolojiyi değiştirebilen sodyum içermeyen MAS'ın aksine hücresel şekilde herhangi bir değişikliğe neden olmaz. Bir diğer büyük fark ise test protokolünde denklik adımını korumaktır. Denge adımı 12 dakika sürer ve bu da 2 ölçüm döngüsüne eşittir. Denge adımını korumanın amacı, cihazın içindeki sıcaklığı stabilize etmek ve aynı zamanda hücrelerin tahlil ortamında ADP varlığı ile geliştirilmiş olası iç oksitlenebilir depoları oksitlemesine izin vermektir.
Hücre kültürü teknikleri ile ilgili bazı hususlar verilmelidir. Bu çalışmada, incelenen hücreler tahlilden bir gün önce tohumlanmıştır. Bununla birlikte, bazı hücreler daha uzun kültür veya tedavi süresi gerektirir. Çalışma tasarımı farklılaştırılmış hücreler, taze izole edilmiş veya yapışmayan hücreler içeriyorsa, hücreleri hücre kültürü mikro plakasına sabitlemek için uygun bir kaplama gereklidir. Bu protokol süspansiyondaki hücreler için uygun değildir ve hücre ve doku yapıştırıcısı kullanılması önerilir. Bu protokolün bir başka sınırlaması, bu yöntemin nicel verileri sonuçlandırmak için uygun olmamasıdır. Başka bir deyişle, ölçümden önce her bir kuyuda gerçek mitokondriyal protein miktarını tahmin etmek bu yöntemle mümkün değildir. Bu nedenle, bu yöntem fosfat / oksijen oranının (P / O oranı)5doğru bir tahminini sağlamadan mitokondriyal substrat akısının hızlı bir taramasını oluşturur. Ancak, bu protokolü küçük numuneler üzerinde nicel çalışmalar için kullanmak mümkündür11. Bu amaçla, taze izole mitokondri elde etmek ve mitokondriyi hücre kültürü mikro plakasına sabitlemek için hücre ve doku yapıştırıcısı kullanmak gerekir.
Bu protokolü kullanarak tekrarlanabilir en iyi sonuçları elde etmek için, kullanılan reaktiflerin konsantrasyonuna dikkat edin. Kullanılan çözeltilerin, inkübatörlerin ve aletin sıcaklığı sabit olmalıdır. Tüm çözümlerin ve yüzeylerin ayarlanmış bir pH'a sahip olduğundan emin olun. Daha önce de belirtildiği gibi, enjekte edilmesi planlanan çözümlere BSA'nın dahil edilmesi önerilmez. Sonuçlar geniş bir hata aralığı gösteriyorsa, olası aykırılıkları aramak ve silmek için sonuçları grup biçimi yerine kuyu biçiminde görüntüleyin.
Bu çalışmada, birden fazla mitokondriyal substrat akısını uygun arka plan kontrolü ve nispeten kısa sürede yeterli çoğaltma ile aynı anda taramak için tek bir ölçümün maksimum kullanımını sağlamaya çalıştık. Sonuçlarda gösterildiği gibi, yöntem bir grubun bir ilaç konsantrasyonu ile tedavi ederek oluşturulan iki fenotipin karşılaştırılmasında yararlıdır. Farklı hücre çizgilerini veya genetik olarak tasarlanmış hücreleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Protokol çok yönlü ve farklı substratlardır veya inhibitörler herhangi bir hücresel modelde mitokondriyal substrat akısının ekran uyarlaması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Hradec Králové Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü ve Üçüncü Tıp Fakültesi Patofizyoloji Bölümü personeline kimyasallar ve numunelerin hazırlanması konusundaki yardımlarından dolayı teşekkür ediyor. Bu çalışma Charles Üniversitesi hibe programları PROGRES Q40/02 tarafından desteklenmiştir, Çek Sağlık Bakanlığı hibe NU21-01-00259, Çek bilim vakfı hibe 18-10144 ve INOMED projesi CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı ve Avrupa Birliği tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
