Summary
在这项工作中，我们描述了一种改进的方案，以使用重组产气溶酶O与基于微孔板的呼吸测定法一起测试线粒体呼吸底物通量。通过该协议，我们展示了二甲双胍如何影响两种不同肿瘤细胞系的线粒体呼吸。
Abstract
线粒体底物通量是每种细胞类型的显着特征，其成分（如转运蛋白，通道或酶）的变化与几种疾病的发病机制有关。线粒体底物通量可以使用完整细胞、透化细胞或分离的线粒体进行研究。研究完整的细胞由于同时氧化不同的底物而遇到几个问题。此外，几种细胞类型包含不同底物的内部存储，使结果解释复杂化。线粒体分离或使用透化剂等方法不易重复。从小样品中分离出具有完整膜的纯线粒体是有问题的。使用非选择性透化剂会导致不同程度的不可避免的线粒体膜损伤。重组透气溶酶O（rPFO）作为更合适的透气剂提供，因为它能够选择性地透化质膜而不影响线粒体完整性。当与微孔板呼吸法结合使用时，它允许在一个实验中使用最少数量的细胞，在一个实验中用足够的重复来测试几种线粒体底物的通量。在这项工作中，该协议描述了一种比较两种不同细胞表型或基因型的线粒体底物通量的方法，并且可以定制以测试各种线粒体底物或抑制剂。
Introduction
基于微孔板的呼吸测定法通过能够研究小样本量1的细胞呼吸，彻底改变了线粒体研究。细胞呼吸通常被认为是线粒体功能或"功能障碍"的指标，尽管线粒体功能范围超出了能量产生2。在有氧条件下，线粒体通过分解并将这些底物转化为可以为柠檬酸循环3 提供燃料的代谢中间体来提取储存在不同底物中的能量（图1）。底物的连续通量对于柠檬酸循环的流动至关重要，以产生高能"电子供体"，其将电子传递到电子传递链，该传递链产生穿过线粒体内膜的质子梯度，使ATP合成酶能够将ADP磷酸化为ATP4。因此，测定线粒体呼吸的实验设计必须包括样品性质（完整细胞，透化细胞或分离的线粒体）和线粒体底物。
细胞储存着本土底物5，线粒体同时氧化几种类型的底物6，这使得对在完整细胞上进行实验的结果的解释变得复杂。研究线粒体氧化所选底物能力的常用方法是分离线粒体或透化所研究的细胞5。虽然分离的线粒体是定量研究的理想选择，但分离过程很费力。它面临着技术难题，例如需要大样本量，纯度产量和该技术的再现性5。透化细胞为线粒体分离的缺点提供了解决方案;然而，洗涤剂性质的常规通透性剂不是特异性的，并且可能损害线粒体膜5。
重组鼓气溶酶O（rPFO）作为选择性质膜透化剂7提供，并在7，8，9，10的几项研究中成功地与细胞外通量分析仪结合使用。我们使用rPFO修改了使用XFe96细胞外通量分析仪筛选线粒体底物通量的方案。在该协议中，比较了两种细胞表型中的四种不同的底物氧化途径，同时对每种测试材料具有足够的重复和适当的控制。
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Protocol
1. 化验前一天
- 试剂和底物的制备。
- 线粒体测定溶液（MAS）：按 表1所述制备所有试剂的储备溶液。将甘露醇和蔗糖的储备加热至37°C以完全溶解。混合试剂以制备2x MAS，然后将混合物加热至37°C。 用5N KOH调节pH至7.4（〜7 mL），然后加水使体积达到1 L.过滤灭菌并将等分试样储存在-20°C直至测量日。
- 牛血清白蛋白（5%BSA）：将5克BSA溶解在磁力搅拌器上，加入90毫升预热无菌水中，避免摇晃。用5 N KOH将pH值调节至7.4，然后加水使体积达到100 mL。过滤灭菌并将等分试样储存在-20°C直至测量日。
- 线粒体底物：在无菌水中制备1M琥珀酸钠，丙酮酸钠和谷氨酸钠的储备溶液。在无菌水中制备100mM苹果酸钠储备溶液，并使用预热的无菌水制备10mM棕榈酰肉碱储备溶液。将每种溶液的pH值调节至7.4×5 N KOH并进行过滤灭菌。将基质储存在2-8°C。 使用时，将棕榈酰肉碱加热至37°C以溶解任何沉淀物。为了以后使用，将除丙酮酸以外的所有底物的等分试样储存在-20°C。
- 线粒体抑制剂：使用二甲基亚砜（DMSO）制备25mM寡霉素，50mM羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），20mM鱼藤酮和20mM抗霉素A的储备溶液。将等分试样储存在-20°C。
- 接种和处理细胞：如图2所示，在第 2-11列中接种细胞。列 1 和 12 必须留空才能用作背景孔。在这项工作中，使用了HepG2和A549细胞。
- 以每孔20，000个细胞的密度接种细胞。使用50-80μL细胞培养基进行接种。
- 用等体积的细胞培养基填充空白孔，并将细胞在37°C下在具有5%CO2的加湿培养箱中孵育。让细胞附着3-4小时，然后将100μL细胞培养基加入所有孔中。
- 用最后的培养基添加，在列7-11中施用处理。在这项工作中，实验组用1mM盐酸二甲双胍处理16小时，对照组用等体积的无菌蒸馏水作为载体对照处理。
- 为传感器补水：将每孔200μL无菌水移入公用设施板中，然后在将传感器浸入水中时小心地返回传感器盒。将墨盒在37°C的无CO2培养箱中孵育至第二天。
- 测定方案模板：打开分析仪（见 材料表）和控制器单元。启动仪器控制和数据采集软件，并按 表2所述设计测定方案。在 组定义下，创建四种注入策略，其中端口A根据注入的基板而不同（图3）。在基质或其缩写之后命名策略。
- 对于端口 B、C 和 D，分别分配化合物寡霉素、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A。创建八个组并命名它们，如图 4所示。在 "板图 "下，将组分配给相应的孔，然后将协议另存为即用型模板。保持分析仪打开，让温度在一夜之间稳定下来。将分析仪保存在温度稳定的地方，以避免温度突然变化。
2. 测定当天
- 用校准剂代替水：将公用设施板中的水倒出，并将每孔200μL预热校准剂移入公用设施板中。将墨盒返回到无 CO2培养箱，直到测定时间。为避免校准剂快速蒸发，请保持培养箱内的湿度源，并关闭或将风扇速度降至最低。
- 准备工作溶液：首先将2x MAS，5%BSA和无菌水加热至37°C。 同时，让抑制剂储备达到室温。使用温的2x MAS和无菌蒸馏水制备5mL底物和抑制剂的工作浓度，如 表3所述。
- 加载注射口：如图 3所示，将20μL底物加载到端口A中.将琥珀酸盐/鱼藤酮混合物加载到A行A和B的端口A中.将丙酮酸/苹果酸盐混合物加载到C行和D的端口A中.将谷氨酸盐/苹果酸盐混合物加载到E行和F的端口A中。将棕榈酰肉碱/苹果酸盐混合物加载到G行和H的端口A中。对于整个板，将端口B与22μL寡霉素制剂，端口C与25μLFCCP制剂，端口D与27μL鱼藤酮/抗霉素A混合物。
- 开始校准步骤：在 "运行检测 "选项卡下，单击" 开始运行" 以启动检测。插入加载的传感器盒并开始校准步骤。等待校准完成，然后再继续下一步。
- 测定培养基（MAS-BSA-rPFO）的制备：要制备20毫升测定培养基，请在50毫升管中混合10毫升2x MAS，9.2毫升无菌水和0.8毫升5%BSA。加入2μL10μM rPFO以达到1nM的浓度，并通过温和移液重悬混合物。避免摇晃，不要使用涡流混合器进行混合。将管在37°C孵育直至使用时。
- 洗涤细胞：使用多通道移液器用预热的无钙和无镁磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞和空的空白孔两次。避免重复使用相同的吸头丢弃细胞培养基并添加PBS。在层流外执行此步骤，以保护细胞不被气流干燥。
- 测定培养基中的细胞通透化：使用多通道移液器，丢弃PBS并用180μL预热测定培养基（MAS-BSA-rPFO）代替。
- 开始测量：在通透后，立即将校准的传感器盒的实用程序板替换为细胞板并开始测量。
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Representative Results
首先将结果归一化为基线呼吸的第二次测量值，以将值显示为耗氧率百分比 （OCR%）。测定结果如图5、图6、图7和图8所示。必须为每个组分配适当的背景孔，并停用其他组的背景孔。图5显示，治疗组具有较高的琥珀酸盐诱导呼吸率。A549细胞对二甲双胍治疗的反应（图5A）高于HepG2细胞（图5B）。背景控制井仅来自被比较组的同一行，在本例中为井 A1、B1、A12 和 B12。图6显示了丙酮酸/苹果酸盐诱导呼吸的变化。图7显示了谷氨酸/苹果酸盐诱导呼吸的变化，图8显示了棕榈酰肉碱/苹果酸盐诱导呼吸的变化。
图1：柠檬酸循环示意图。 用于测试线粒体底物通量的底物为红色。苹果酸盐不是单独使用，而是与丙酮酸、棕榈酰肉碱和谷氨酸盐联合使用。苹果酸盐在丙酮酸/苹果酸盐和棕榈酰肉碱/苹果酸盐诱导的呼吸中的作用是通过苹果酸脱氢酶的作用提供草酰乙酸。在谷氨酸/苹果酸盐诱导的呼吸中，苹果酸盐参与苹果酸盐-天冬氨酸盐穿梭。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：细胞培养微孔板中细胞接种计划的图示。 第 1 列和第 12 列中的空白孔必须留空，不带单元格。第7-11列用于处理实验组。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：注入策略图示。 A排和B排的端口A装有琥珀酸盐/鱼藤酮混合物。C排和D排的端口A装有丙酮酸/苹果酸盐混合物。E行和F的端口A装有谷氨酸/苹果酸盐混合物。G和H行的端口A装有棕榈酰肉碱/苹果酸盐混合物。对于整个板，端口B，C和D分别装载寡霉素，FCCP和鱼藤酮/抗霉素A。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：组名称和板图。 每个组根据表型（对照或处理）和用于诱导呼吸的底物命名。（S），琥珀酸盐诱导的呼吸。（P / M），丙酮酸/苹果酸诱导的呼吸。（G / M），谷氨酸/苹果酸盐诱导的呼吸。（CP / M），棕榈酰肉碱/苹果酸盐诱导的呼吸。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：琥珀酸盐诱导的呼吸。 （A） A549 和 （B） HepG2。测试组用1mM盐酸二甲双胍处理16小时。只有背景井 A1、B1、A12 和 B12 用于校正。结果显示为 SD ±平均 OCR%。图形和板网格由分析设计，数据分析和文件管理软件创建并导出为图像文件。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：丙酮酸/苹果酸诱导的呼吸（A）A549和（B）HepG2。测试组用1mM盐酸二甲双胍处理16小时。只有背景井 C1、D1、C12 和 D12 用于校正。结果显示为 SD ±平均 OCR%。图形和板网格由分析设计，数据分析和文件管理软件创建并导出为图像文件。请点击此处查看此图的放大版本。
图7：谷氨酸/苹果酸盐诱导的呼吸（A）A549和（B）HepG2。测试组用1mM盐酸二甲双胍处理16小时。只有背景井 E1、F1、E12 和 F12 用于校正。结果显示为 SD ±平均 OCR%。图形和板网格由分析设计，数据分析和文件管理软件创建并导出为图像文件。请点击此处查看此图的放大版本。
图8：棕榈酰肉碱/苹果酸盐诱导的呼吸。（A）A549和（B）HepG2。测试组用1mM盐酸二甲双胍处理16小时。只有背景井 G1、H1、G12 和 H12 用于校正。结果显示为 SD ±平均 OCR%。图形和板网格由分析设计，数据分析和文件管理软件创建并导出为图像文件。请点击此处查看此图的放大版本。
| 线粒体测定培养基 | ||||
| 库存（百万） | 每升库存体积 （mL） | 2 倍 MAS （mM） | MAS （mM） | |
| 蔗糖 | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| 甘露醇 | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| 氯化镁2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| 异丙酮 | 200 | 20 | 4 | 2 |
| 埃格塔 | 200 | 10 | 2 | 1 |
| 断续器 | 200 | 20 | 4 | 2 |
表1：线粒体测定溶液。混合每种成分储备溶液的指示体积以制备（2x MAS）。将溶液加热至37°C，然后用5 N KOH调节pH至7.4。加入蒸馏水以使体积达到1 L.过滤灭菌，然后将等分试样储存在-20°C。 使用2x MAS制备线粒体底物和抑制剂的测定培养基和工作溶液。
| 命令 | 期间 | 注射化合物 |
| 校准 | 默认 | |
| 平衡 | 是的 | |
| 基线 | ||
| 2 周期 | ||
| 混合 | 30 秒 | |
| 等 | 30 秒 | |
| 量 | 2 分钟 | |
| 注入端口 A | 基质 | |
| 2 周期 | ||
| 混合 | 30 秒 | |
| 等 | 30 秒 | |
| 量 | 2 分钟 | |
| 注入端口 B | 寡霉素 | |
| 2 周期 | ||
| 混合 | 30 秒 | |
| 等 | 30 秒 | |
| 量 | 2 分钟 | |
| 注入端口 C | 断续器 | |
| 2 周期 | ||
| 混合 | 30 秒 | |
| 等 | 30 秒 | |
| 量 | 2 分钟 | |
| 注入端口 D | 鱼藤酮 + 抗霉素 A | |
| 2 周期 | ||
| 混合 | 30 秒 | |
| 等 | 30 秒 | |
| 量 | 2 分钟 |
表2：测定方案的命令。
| 5 mL 中的容积 | ||||||
| 基质 | 库存调配 | 工作环境 | 股票 | 2 倍 MAS | dH2O | 最后的结局。 |
| 琥珀酸盐/鱼藤酮 | 1 米/20 米米 | 100 毫米/10 微米 | 500 μL/ 2.5 μL | 2.5 毫升 | 1997.5 μL | 10 毫米/1 微米 |
| 丙酮酸/苹果酸盐 | 1 米/100 米米 | 100 毫米 /10 毫米 | 500 μL/500 μL | 2.5 毫升 | 1500 μL | 10 毫米 /1 毫米 |
| 谷氨酸盐/苹果酸盐 | 1 米/100 米米 | 100 毫米 /10 毫米 | 500 μL/500 μL | 2.5 毫升 | 1500 μL | 10 毫米 /1 毫米 |
| 棕榈酰肉碱/苹果酸盐 | 10 毫米/100 毫米 | 400 微米 /10 微米 | 200 μL/500 μL | 2.5 毫升 | 1800 μL | 40 微米/1 微米 |
| 抑制剂 | ||||||
| 寡霉素 | 25 毫米 | 15 微米 | 3 μL | 2.5 毫升 | 2497 μL | 1.5 微米 |
| 断续器 | 50 毫米 | 40 微米 | 4 μL | 2.5 毫升 | 2496 μL | 4 微米 |
| 鱼藤酮/抗真菌药 A | 20 毫米/20 毫米 | 10 微米/ 10 微米 | 2.5 微升/2.5 微升 | 2.5 毫升 | 2495 μL | 1 微米/ 1 微米 |
表3：如图 3前面讨论的那样，要加载到传感器盒注射端口中的线粒体底物和抑制剂的列表。 混合来自储备溶液，2x MAS和蒸馏水的指示体积，以制备每个底物或抑制剂混合物的工作浓度的5mL。最终浓度在注入过程后在孔中达到。
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Discussion
该协议是对先前发表的研究7、8、9、10和产品用户指南的修改。与制造商的协议相比，使用2x MAS代替3x MAS，因为2× MAS更容易溶解，并且在冷冻后不会形成沉淀。冷冻的 2 倍 MAS 等分试样可储存长达 6 个月，并显示一致的结果。另一个区别是将ADP包含在2x MAS的组分中，并从公式中省略BSA。含有BSA的解决方案更难注入，并导致更大的错误和异常值的可能性。然而，BSA的存在对于减少实现适当透化所需的rPFO量至关重要。因此，BSA仅添加到细胞洗涤后用于透化步骤的测定培养基（MAS-BSA-rPFO）中。
为了从细胞培养基中洗涤细胞，该协议使用PBS而不是MAS。PBS是等渗的，不会引起细胞形状的任何变化，与富含钾并且可以改变细胞形态的无钠MAS相反。另一个主要区别是在测定方案中保持平衡步骤。平衡步骤持续12分钟，等于2个测量周期。保持平衡步骤的目的是稳定仪器内部的温度，同时允许细胞氧化任何可能的内部可氧化储存，这通过测定介质中ADP的存在而增强。
应考虑一些有关细胞培养技术的因素。在这项工作中，检查的细胞在测定前一天接种。然而，一些细胞需要更长的培养或处理时间。如果研究设计包括分化细胞，新鲜分离或非贴壁细胞，则需要适当的涂层将细胞固定到细胞培养微孔板中。该协议不适用于悬浮细胞，建议使用细胞和组织粘合剂。该协议的另一个局限性是该方法不适合得出定量数据的结论。换句话说，在测量之前，这种方法不可能估计每个孔中线粒体蛋白的实际量。因此，该方法可快速筛选线粒体底物通量，但未提供磷酸盐/氧比（P/O比）的准确估计值5。但是，可以使用该方案对小样品进行定量研究11。为此，有必要获得新鲜分离的线粒体，并使用细胞和组织粘合剂将线粒体固定到细胞培养微孔板上。
为了从使用该方案获得最佳可重复的结果，请注意所用试剂的浓度。所用溶液、培养箱和仪器的温度应稳定。确保所有溶液和底物的pH值均经过调整。如前所述，不建议在计划注射的解决方案中包括BSA。如果结果显示较大的误差范围，请以井格式而不是组格式显示结果，以查找和删除可能的异常值。
在这项工作中，我们试图最大限度地利用单个测量，通过适当的背景控制在相对较短的时间内同时筛选多个线粒体底物通量和足够的重复。如结果所示，该方法可用于比较通过用一种浓度的药物治疗一组而产生的两种表型。它可用于比较不同的细胞系或基因工程细胞。该协议是通用的，不同的底物或抑制剂可用于筛选任何细胞模型中线粒体底物通量的适应性。
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Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
作者感谢Hradec Králové医学院生理学系和第三医学院病理生理学系的工作人员在化学品和样品制备方面的帮助。这项工作得到了查理大学拨款计划PROGRES Q40/02，捷克卫生部拨款NU21-01-00259，捷克科学基金会拨款18-10144和INOMED项目CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046的支持，该项目由捷克共和国教育，青年和体育部和欧盟资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
