Summary
大鼠原位肾移植模型有助于研究肾同种异体移植排斥的机制。目前的模型使用肾脏植入的端到端吻合术和输尿管 - 膀胱吻合术的端到端“隧道”方法，在不干扰血液供应和下半身静脉反流的情况下增加了受者的生存率。
Abstract
肾同种异体移植排斥反应限制了肾移植后患者的长期生存。大鼠原位肾移植是临床前研究中研究肾同种异体移植排斥机制的基本模型，有助于开发提高肾同种异体移植物长期生存率的新方法。大鼠原位肾移植中的供体肾植入通常通过对受者的主动脉和下腔静脉进行端到端吻合。在该模型中，使用端到端吻合口将供体的肾脏植入接受者的肾动脉和肾静脉。供体的输尿管以端到端的“隧道”方法吻合受者的膀胱。该模型有助于更好地愈合输尿管 - 膀胱吻合口，并通过避免干扰血液供应和下半身静脉反流来提高接受者的生存率。该模型可用于研究急性和慢性免疫和肾脏同种异体移植物的病理排斥的机制。在这里，该研究描述了大鼠之间这种原位肾移植的详细方案。
Introduction
肾移植已成为终末期肾功能衰竭患者最有效的治疗方法。然而，T细胞介导的急性排斥反应和同种抗体介导的体液免疫排斥反应导致肾同种异体移植物的病理性损伤，并限制了肾移植后患者的短期和长期生存1，2，3。不幸的是，仍然缺乏防止肾脏同种异体移植物排斥反应的有效药物，因为肾同种异体移植物的免疫和病理排斥反应的确切机制尚不清楚。因此，阐明肾同种异体移植物的免疫和病理排斥机制的临床前研究有助于寻找新的靶点并开发相关的有效药物，以防止肾脏同种异体移植物的排斥反应并最终延长患者的生存期。
最近在原位肾移植的大鼠模型研究中提出了肾同种异体移植排斥反应的许多潜在免疫学和病理生理学机制4，5，6，7，8。这些发现提出了几种新的靶点和相关干扰方法，作为抑制肾脏同种异体排斥反应的有希望的治疗方法，例如补体调节因子和抗CD59抗体6，免疫蛋白酶体和环氧酮抑制剂7，8。因此，大鼠原位肾移植是研究肾移植后肾同种体移植物免疫排斥和病理损伤机制的理想临床前模型。
大鼠肾移植已逐渐从供体肾脏9 的异位植入转向使用血管的端到端吻合术或使用袖带方法的输尿管的端到端吻合术的原位肾植入10，11，12。本研究描述了大鼠间对受者肾动脉和肾静脉进行端到端吻合术的大鼠正位肾移植的详细方案，以及输尿管-膀胱吻合术的端到端“隧道”方法，避免了下半身缺血和下腔静脉血栓形成，减少了术后漏尿和输尿管扭曲。
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Protocol
商业上获得的近交8-10周龄雄性F344和Lewis大鼠（200g至250g）。同种异体左肾移植在雄性F344和Lewis大鼠之间进行。F344大鼠被用作供体和同源受体，Lewis大鼠用作同种异体受体。所有动物处理程序均按照NIH发布的《实验动物护理和使用指南》进行，所有动物实验方案均获得重庆大学肿瘤医院动物护理使用委员会的批准。手术期间使用的所有用品，包括手术器械和溶液，都是无菌的。该协议的原理图如图 1所示。
1. 捐赠程序
- 使用诱导室通过5%异氟醚吸入在大鼠中诱导全身麻醉。然后，皮下注射0.1mg/ kg的丁丙诺啡，同时进行先发性镇痛。
- 将大鼠放在背部，并使用鼻子和嘴巴上的口罩吸入2%异氟醚维持麻醉。将眼部润滑剂涂抹在眼睛上，以避免角膜干燥。呼吸频率和节律缓慢，角膜反射消失以及对脚趾捏合缺乏反应表明麻醉的有效性。
- 用电动剃须刀剃掉腹部毛发，用0.5%的碘和70%的酒精对皮肤进行消毒。
- 皮下注射0.5%利多卡因，从耻骨联合到尾部以下的中线，用于局部镇痛药，然后切开腹部并使用牵开器拉开切口。
- 从切口右侧取出肠道，并用湿润的纱布包裹起来，以防止它们变干。然后，暴露左肾。
- 使用棉签将脂肪组织与左肾和输尿管分离，然后在放大倍率为20倍的手术显微镜下使用微镊子解离左肾动脉和静脉。如有必要，使用电凝术凝固任何出血。
- 使用 4-0 聚酰胺单丝缝合线对左肾动脉上方约 5 mm 处的主动脉进行结扎。然后，将左肾静脉远端的左肾静脉横切至左生殖器静脉和肾上腺静脉的结合处。
- 使用24 G头皮针从左肾动脉下方的主动脉用冰冷的UW溶液补充肝素（100 U / mL）冲洗肾脏，直到血液褪色。温缺血时间平均为5分钟。
- 在主动脉旁边约2mm处切除左肾动脉后，在微镊子的帮助下解离肾脏和输尿管（保留外周结缔组织以确保输尿管的血液供应）。然后，将膀胱旁边的输尿管切除，并将供体左肾保存在冰冷的UW溶液中。
- 通过切开主动脉并随后将其放入CO2 盒中以确保死亡，在输血的情况下牺牲供体大鼠。
2. 收件人程序
- 对受体大鼠重复步骤1.1-1.5中描述的过程。
- 在具有20倍放大的手术显微镜下，使用棉签和微镊子分离接受大鼠的左肾和输尿管以及左肾动脉和肾静脉。
- 通过无创微血管钳夹夹住左肾动脉和肾静脉根部。将左输尿管放在肾脏下方约2-3厘米处，8-0聚酰胺单丝缝合线并在结扎时将其横切。
- 通过切除远离微血管钳夹的左肾动脉，并将肾静脉近端切除到左生殖器静脉和肾上腺静脉的结合处，切除受者的天然左肾。如有必要，使用电凝术凝固肾上腺静脉。
- 将供体肾脏植入受体大鼠的左肾窝中，并在植入的供体肾脏周围放置冰块。在手术显微镜下，使用10-0聚酰胺单丝缝合线，以45倍放大率将供体的肾动脉和肾静脉以端到端模式吻合到接受者的肾动脉和肾静脉，如下所示。
- 用中断缝合线吻合肾动脉。
- 将停留缝合线分别放在吻合口的12点钟和6点钟位置。使用10-0聚酰胺单丝缝合线，用2-3针在两个停留缝合线之间的吻合口的一侧等距缝合。
- 翻转留置缝合线，同样用2-3针缝合两个留置缝线之间的吻合口的另一侧缝合。
- 用连续缝合线吻合肾静脉。
- 将停留缝合线分别放在吻合口的6点钟和12点钟位置。使用运行缝线从12点钟位置缝合吻合口的一侧，使用运行缝线进行4-5针，然后使用10-0聚酰胺单丝缝合线将运行缝合线连接到6点钟位置的停留缝合线。
- 从6点钟位置翻转留线和类似地缝合吻合口的另一侧，最后将运行缝合线绑在12点钟位置的留线上。
- 首先通过释放肾静脉的无创微血管钳夹来重新灌注供体肾脏;然后，确定出血部位并进行额外的缝合。
- 释放肾动脉的无创微血管钳，识别出血部位并进行额外的缝合。冷缺血时间平均为45分钟。
- 用4-0聚酰胺单丝缝合线缝合供体输尿管的末端作为牵引，在具有20倍放大倍率的手术显微镜下将末端拖过受体膀胱的“隧道”。之后，用接受者膀胱外的缝合线切开供体输尿管的末端。让供体输尿管收缩回受者的膀胱。
- 通过将供体输尿管的外膜与受体膀胱的肌肉层缝合在四个等距位置，使用8-0将供体输尿管与受者膀胱的外侧缝合来固定供体输尿管聚酰胺单丝缝合线在手术显微镜下，放大倍率为45倍。
- 将肠道放回腹腔，首先在肌肉层中用连续缝合线关闭腹部切口，然后用4-0聚酰胺单丝缝合线关闭皮肤层。
- 将受体大鼠放在干燥干净的笼子中37°C的加热垫上。等到大鼠从麻醉中恢复过来。
- 皮下注射丁丙诺啡（0.05mg / kg）到受体大鼠中，每6小时一次，持续48小时，用于术后镇痛。肌内注射青霉素（50，000 U / kg）到受体大鼠中，每天一次，持续3天，以预防感染。通过将受体大鼠放入CO2 盒中以观察移植10周后肾同种体移植物的慢性排斥反应来处死受体大鼠。
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Representative Results
在该大鼠原位肾移植模型中，受体大鼠在手术后正常移动。为了观察肾同种异体移植的慢性排斥反应，移植后将受体大鼠饲养10周，此时受者大鼠的总存活率约为90%。死亡的主要原因是术后出血和漏尿。其他主要并发症包括手术期间出血、肾血管血栓形成和肾积水，其发病率分别约为 15%、25% 和 20%。手术过程中的大部分出血可以停止，并且不影响受体大鼠的存活。应从后续检查中排除血管栓塞和肾盂积水的肾移植。
在该模型中，F344大鼠属于大鼠MHC（RT1）单倍型RT1lv1 ，Lewis大鼠属于单倍型RT1l。这两种菌株在MHC类Ib位点C / E / M13上有所不同，其不引起急性T细胞介导的排斥反应，但导致随后的慢性抗体介导的排斥反应4，5。慢性同种异体移植肾病的特征是肾小球硬化、间质纤维化、肾小管萎缩和间质性动脉硬化14。移植后 10 周，苏木精和曙红 （HE） 染色以及周期性酸-希夫 （PAS） 染色显示肾小球硬化、间质纤维化和肾小管萎缩（图 2A 和 2B）以及肾同种异体移植物中的间质动脉硬化（图 2C），与等移植物肾形成鲜明对比。作为肾同种异体移植物中慢性肾小球病的另一个特征，银染色显示同种异体移植肾与异位肾相比，同种异体肾小球基底膜增厚（图2D），表明本大鼠原位肾移植模型的成功。
图1：大鼠原位肾移植模型示意图。 （A）切除供体肾脏。将主动脉绑在左肾动脉上方，并将左肾静脉横切至生殖器静脉和肾上腺静脉连接处的远端。用冰冷的UW溶液灌注后，通过横切主动脉约2mm的左肾动脉并切除膀胱旁边的输尿管，然后切除供体的左肾。（二）切除受者肾脏。在夹紧左肾动脉和根部肾静脉后，结扎后输尿管被横切。然后通过从微血管钳夹横切左肾动脉2mm并将肾静脉近端切除至左生殖器静脉和肾上腺静脉的结合处来切除受者的左肾。（C）植入供体的肾脏。供体肾动脉和肾静脉分别通过中断缝合和连续缝合以端到端模式吻合到受体的肾动脉和肾静脉。然后使用端到端的“隧道”方法将供体输尿管吻合到接受者的膀胱。 请点击此处查看此图的大图。
图2：肾脏移植物的病理染色。 慢性移植物肾病的特征是肾小球硬化，间质纤维化，肾小管萎缩和间质性动脉硬化，如从F344供体到Lewis大鼠接受者肾移植10周后肾移植。（A，B）肾同种异体移植物中的肾小球硬化、间质纤维化和肾小管萎缩以及 （C） 间质动脉硬化表现为苏木精和曙红染色以及周期性酸-希夫染色。比例尺：50 μm.（D）通过银染色显示肾同种异体移植物中肾小球基底膜（GBM）与肾异植相比增厚。虚线正方形勾勒出 GBM 的放大倍率较高的图像。比例尺：50 μm 。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
大鼠肾移植是一项具有挑战性的工作，需要高水平的显微手术技术，并且操作技术已经过多次优化。从一开始，Gonzalez等人将供体肾脏植入受体的颈部，并将供体输尿管吻合到皮肤9。然而，由于泌尿管感染和供体输尿管狭窄的高发生率，该手术在短时间内被放弃。随后，通过供体肾动脉和肾静脉与受体主动脉和下腔静脉15的吻合，或通过供体肾动脉和肾静脉与受体肾动脉和下腔静脉11的吻合，改善了供体右肾的植入手术。然而，右肾动脉和肾静脉又薄又短，增加了手术的难度和失败率。此外，该手术需要阻断受体的主动脉和下腔静脉。因此，下半身缺血和下腔静脉血栓形成导致受者大鼠致残和死亡的高发生率。其它改进的种植体手术包括使用袖带方法16将供体主动脉和肾静脉吻合到受体肾动脉和肾静脉。还有一些人使用袖带方法12吻合输尿管。然而，肾动脉和输尿管的薄增加了产生袖带和吻合口的难度，从而限制了这些植入手术的应用。
目前，常用的大鼠原位肾移植模型是在左肾上通过左供体肾动脉和肾静脉的吻合术到受体主动脉和下腔静脉进行，并将供体膀胱贴片吻合到受体膀胱10。左肾动脉和肾静脉足够长，便于吻合口。然而，对受体主动脉和下腔静脉的吻合仍然无法避免下半身缺血和下腔静脉血栓形成，因此需要高水平的显微手术经验来缩短手术时间。目前的大鼠原位肾移植模型由Reuter S.等人17 通过 左供体肾动脉和肾静脉的端到端吻合术到受体肾动脉和肾静脉进行修改，并使用“隧道”方法将供体输尿管吻合到受体的膀胱。在该模型中，无需夹住受体主动脉和下腔静脉，使受体大鼠的生理体循环不中断，提高存活率而不致残（90%以上）。而且，供体输尿管对受者膀胱的吻合术的“隧道”方法易于操作，通过缝合供体膀胱贴片来降低术后漏尿的发生率。
但是，此模型中的一些细节仍然需要注意。首先，应通过用湿润的纱布覆盖肠道来保持肠道在室外湿润。否则，接受者将在手术后死于肠坏死。其次，不应完全切除供体输尿管的结缔组织，以确保其血液供应。第三，应给予供体和受体大鼠相似权重的供体和受体大鼠，以确保供体和受体血管具有相同的口径。明显不同口径的供体和受体血管会增加吻合术后的出血或血栓形成。第四，应保持吻合血管的适当长度，特别是对于静脉，通过从生殖器静脉和肾上腺静脉的结合处横切除供体肾静脉远端的供体肾静脉，并将受体肾静脉近端切除到生殖器静脉和肾上腺静脉的连接处。吻合血管过长或过短可能导致血管扭曲、血流不良和漏血。第五，由于肾动脉和肾静脉薄壁，吻合术应在高倍率场下进行，例如x45倍。分解不良的磁场会导致血管壁的错误缝合。第六，为了减少手术后的血栓形成，在吻合过程中必须将肝素溶液（100 U / mL）滴在吻合血管上。第七，将供体输尿管的整个层固定在接受者的膀胱上时不应缝合，因为输尿管狭窄和肾盂积水会增加。
该模型的局限性在于对显微手术技能的要求高，并发症的概率有一定，包括出血、漏尿、血栓形成、肾盂积水等。大鼠不同原位肾移植技术的主要术后并发症相似，包括输尿管吻合口狭窄引起的出血、漏尿、血栓形成和肾盂积水。然而，与供体肾动脉和肾静脉对受体肾动脉和下腔静脉11的吻合术相反，目前的技术由于吻合口的薄而轻度增加了肾血管中的血栓形成，但避免了对下肢循环的干扰。与使用袖带方法16的肾动脉和肾静脉的吻合口相反，目前的技术减少了血管的扭曲。与使用袖带方法12的输尿管端到端吻合术相比，目前的技术轻度增加了输尿管吻合口的狭窄，但降低了操作难度。通过连续实践对显微手术技术的改进可以减少并发症，提高受体大鼠的存活率，并在后续实验中提高模型的利用率。目前的模型为研究肾移植的科学家提供了参考。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（81870304）对李俊的支持，以及Else Kröner-Fresenius-Stiftung（Nr. 2017_A28）对Marcus Groettrup的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | G0090781 | |
| 4-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | C1048451 | |
| 8-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | C2090880 | |
| Buprenorphine | US Biological life Sciences | 352004 | |
| Electrocoagulator | Electrocoagulator | ZJ1099 | |
| F344 and Lewis rats | Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China) | NA | |
| Gauze | Henan piaoan group Co., LTD | 10210402 | |
| Heating pad | Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD | DK0032 | |
| Heparin | North China Pharmaceutical Co., LTD | 2101131-2 | |
| Injection syringe (1 ml and 10 ml) | Shandong weigao group medical polymer Co., LTD | 20211001 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., LTD | 21070201 | |
| Penicillin G Sodium | Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd | 69-57-8 | |
| Scalp needle (24 G) | Hongyu Medical Group | 20183150210 | |
| Shaver | Beyotime | FS600 | |
| Small animal anesthesia machine | RWD Life Science | R500 | |
| Small Animal Surgery Kit | Beyotime | FS500 | |
| Sodium chloride injection | Southwest pharmaceutical Co., LTD | H50021610 | |
| Surgical operation microscope | Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China | SZX-6745 | |
| Swab | Yubei Medical Materials Co., LTD | 21080274 | |
| Tape | Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD | 1911N68 | |
| UW solution | Bristol-Myers Squibb Company | 17HB0002 |
References
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