Summary
ラット同所性腎移植モデルは、腎同種移植片拒絶反応のメカニズムの解明に寄与する。現在のモデルは、腎臓移植のエンドツーエンド吻合および尿管 - 膀胱吻合術のエンドツーサイド「トンネル」法を使用して、血液供給および下半身の静脈逆流を妨げることなくレシピエントの生存を増加させる。
Abstract
腎同種移植片拒絶反応は、腎移植後の患者の長期生存を制限する。ラット同所性腎移植は、前臨床試験における腎同種移植片拒絶反応のメカニズムを調査するために不可欠なモデルであり、腎同種移植片の長期生存を改善するための新規アプローチの開発に役立つ可能性がある。ラット同所性腎移植におけるドナー腎臓移植は、レシピエントの大動脈および下大静脈へのエンドツーサイド吻合によって一般的に行われる。このモデルでは、ドナーの腎臓をレシピエントの腎動脈および腎静脈にエンドツーエンドの吻合を用いて移植した。ドナーの尿管は、エンドツーサイドの「トンネル」法でレシピエントの膀胱に吻合された。このモデルは、尿管 - 膀胱吻合のより良い治癒に寄与し、血液供給および下半身の静脈逆流との干渉を避けることによってレシピエントの生存を増加させる。このモデルは、腎同種移植片の急性および慢性免疫および病理学的拒絶反応のメカニズムを調査するために使用することができる。ここで、本研究は、ラット間のこの同所性腎移植の詳細なプロトコールを記載する。
Introduction
腎移植は、末期腎機能不全の患者にとって最も効果的な治療アプローチとなっている。しかしながら、T細胞媒介性急性拒絶反応および同種抗体媒介性液性免疫拒絶反応は、腎同種移植片の病理学的傷害をもたらし、腎臓移植後の患者の短期および長期生存を制限する1,2,3。残念なことに、腎同種移植片の免疫学的拒絶反応および病理学的拒絶反応の正確なメカニズムは明らかではないため、腎同種移植片の拒絶反応を防止する効果的な医薬品はまだ欠けている。したがって、腎同種移植片の免疫および病理学的拒絶反応のメカニズムを解明する前臨床試験は、腎同種移植片の拒絶反応を予防し、最終的に患者の生存を延長するための新規標的の発見および関連する有効な医薬品の開発に寄与する。
腎同種移植片拒絶反応の多くの潜在的な免疫学的および病態生理学的機序が、同所性腎移植のラットモデル研究において最近提案されている4、5、6、7、8。これらの知見は、補体調節因子および抗CD59抗体6、免疫プロテアソーム、エポキシケトン阻害剤7、8など、腎同種移植片拒絶反応を抑制する有望な治療法として、いくつかの新規標的および関連する干渉アプローチを提案する。したがって、ラット同所性腎移植は、腎臓移植後の腎同種移植片の免疫拒絶および病理学的傷害のメカニズムを調査するための理想的な前臨床モデルである。
ラット腎臓移植は、ドナー腎臓9の異所性移植から、血管のエンドツーサイド吻合またはカフ法10、11、12を用いた尿管のエンドツーエンド吻合を用いた同所性腎移植に徐々に移行している。本研究は、レシピエントの腎動脈および腎静脈へのエンドツーエンド吻合を用いたラット間の同所性腎移植の詳細なプロトコールと、下半身の虚血および下大静脈の血栓症を回避し、術後の尿漏れおよび尿管のねじれを減少させる尿管 - 膀胱吻合術のエンドツーサイド「トンネル」法について記載する。
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Protocol
8〜10週齢の雄F344およびルイスラットの近交系(200g〜250g)を商業的に入手した。同種異系左腎臓移植は、雄F344とルイスラットとの間で行った。F344ラットをドナーおよび同系レシピエントとして使用し、ルイスラットを同種異系レシピエントとして使用した。すべての動物の取り扱い手順は、NIHが発行した実験動物のケアと使用に関するガイドラインに準拠して実施され、すべての動物実験プロトコルは重慶大学がん病院の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。手術器具や溶液など、手術中に使用されるすべての消耗品は無菌です。プロトコルの概略を 図1に示します。
1. ドナーの手続き
- 誘導チャンバーを用いて5%イソフルラン吸入によりラットに全身麻酔を誘導する。その後、ブプレノルフィンを0.1mg/kgで皮下注射し、同時予防鎮痛を行う。
- ラットを背中に置き、鼻と口の上にフェイスマスクを使用して2%イソフルラン吸入で麻酔を維持します。角膜の乾燥を避けるために、目の潤滑剤を目に塗布してください。遅い呼吸数およびリズム、角膜反射の消失、およびつま先ピンチに対する応答の欠如は、麻酔の有効性を示す。
- 電気カミソリで腹毛を剃り、ヨウ素0.5%とアルコール70%で皮膚を殺菌します。
- 局所鎮痛薬については、交感神経恥骨から亜キシフォイドへの正中線に沿って0.5%リドカインを皮下注射し、腹部を切開し、リトラクターを用いて切開部を引っ張る。
- 切開部の右側から腸を取り出し、湿らせたガーゼで包み込んで乾燥を防ぎます。次に、左腎臓を露出させます。
- 綿棒を用いて左腎臓と尿管から脂肪組織を分離し、その後、20倍の倍率で操作顕微鏡下でマイクロ鉗子を用いて左腎動脈と静脈を解離させる。必要に応じて電気凝固を用いて出血を凝固させる。
- 左腎動脈から約5mm上の大動脈の結紮を4-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸で行う。次いで、左腎静脈遠位を左生殖器静脈と副腎静脈との結合に移管する。
- ヘパリン(100U/mL)を添加した氷冷UW溶液で腎臓を洗い流し、左腎動脈の下の大動脈から24Gの頭皮針を用いて、血液の色が消えるまで洗い流す。温かい虚血時間は平均して5分である。
- 大動脈の隣に約2mmの左腎動脈をトランスジェクトした後、マイクロ鉗子の助けを借りて腎臓と尿管を解離させる(尿管への血液供給を確実にするために末梢結合組織を保存する)。次に、膀胱の隣にある尿管をトランセクトし、ドナーの左腎臓を氷冷UW溶液で保存する。
- 大動脈をトランスセクトし、続いて死を確実にするためにCO2 ボックスに入れることによって、血液の損失でドナーラットを犠牲にする。
2. 受取手続き
- レシピエントラットについて、手順1.1~1.5で説明した手順を繰り返します。
- 左腎臓と尿管、ならびにレシピエントラットの左腎動脈と腎静脈を、綿棒とマイクロ鉗子を用いて、倍率20倍の手術顕微鏡下で解離させる。
- 左腎動脈と根元の腎静脈を非侵襲的な微小血管クランプでクリップします。腎臓の約2〜3cm下の左尿管を8-0でリゲートするポリアミドモノフィラメント縫合糸およびライゲーション時にそれをトランセクトする。
- 微小血管クランプから2mm離れた左腎動脈をトランスセクトし、近位の腎静脈を左生殖器静脈と副腎静脈の結合にトランステクトすることによって、レシピエントのネイティブ左腎臓を切除する。必要に応じて電気凝固を用いて副腎静脈を凝固させる。
- レシピエントラットの左腎窩にドナー腎臓を移植し、移植したドナー腎臓の周りに氷を入れる。ドナーの腎動脈および腎静脈をエンドツーエンドパターンでレシピエントの腎動脈および腎静脈にアナストモースし、以下のように45倍の倍率で操作顕微鏡下で10−0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用する。
- 中断された縫合糸で腎動脈をアナストモーゼする。
- 滞在縫合糸を吻合の12時位置と6時位置にそれぞれ置きます。10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を用いて2-3ステッチで2つのステイ縫合糸の間の吻合の片側を等距離に縫合する。
- ステイ縫合糸を裏返し、同様に2つのステイ縫合糸の間の吻合の反対側を2〜3ステッチで縫合する。
- アナストモーゼは、連続縫合糸で腎静脈を縫合する。
- 滞在縫合糸を吻合の6時位置と12時位置にそれぞれ置きます。ランニング縫合糸を用いて12時位置から吻合の片側を4〜5ステッチで縫合し、次いでランニング縫合糸を10−0ポリアミドモノフィラメント縫合糸で6時位置のステイ縫合糸に結び付ける。
- ステイ縫合糸を裏返し、同様に6時位置から吻合の反対側を縫合し、最後にランニング縫合糸を12時位置のステイ縫合糸に結び付ける。
- 最初に腎静脈の非侵襲的な微小血管クランプを解放することによってドナー腎臓を再灌流する;次に、出血部位を特定し、追加のステッチを作成します。
- 腎動脈の非侵襲的な微小血管クランプを解除し、出血部位を特定し、追加のステッチを作る。冷虚血時間は平均して45分である。
- ドナー尿管の端部を4-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸で牽引として縫合し、20倍の倍率で操作顕微鏡下でレシピエントの膀胱の「トンネル」を通って端をドラッグする。その後、ドナー尿管の端部をレシピエントの膀胱の外側の縫合糸でトランセクトする。ドナーの尿管をレシピエントの膀胱に収縮させてください。
- ドナー尿管の外側をレシピエントの膀胱の筋肉層で4つの等距離位置でステッチすることによって、ドナー尿管をレシピエントの膀胱で固定する 8-0ポリアミドモノフィラメントは、45倍の倍率で操作顕微鏡下で縫合する。
- 腸を腹腔に戻し、最初に筋肉層に連続縫合糸で腹部切開部を閉じ、次に4-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸で皮膚層を閉じる。
- レシピエントラットを乾燥した清潔なケージ内の37°Cの加熱パッドの上に置きます。ラットが麻酔から回復するまで待ちます。
- 術後鎮痛のために、6時間ごとにレシピエントラットにブプレノルフィン(0.05mg / kg)を皮下注射し、48時間投与する。レシピエントラットにペニシリン(50,000U/kg)を1日1回、3日間筋肉内注射し、感染予防に努める。レシピエントラットをCO2 ボックスに入れて屠殺し、移植の10週間後の腎同種移植片の慢性拒絶反応を観察した。
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Representative Results
このラット同所性腎移植モデルでは、レシピエントラットは手術後に正常に動く。腎同種移植片の慢性拒絶反応を観察するために、レシピエントラットを移植後10週間飼育し、この時点でのレシピエントラットの総生存率は約90%である。主な死因は、手術後の出血と尿漏れです。他の主要な合併症には、手術中の出血、腎血管の血栓症、および水腎症が含まれ、それぞれの発生率は約15%、25%、および20%である。手術中の出血のほとんどは停止することができ、レシピエントラットの生存に影響を及ぼさない。血管の塞栓術および水腎症を伴う腎移植片は、その後の研究から除外されるべきである。
このモデルにおいて、F344ラットは、ラットMHC(RT1)ハプロタイプRT1lv1のものであり、ルイスラットは、ハプロタイプRT1lのものである。これら2つの株はMHCクラスIb遺伝子座C/E/M13において異なり、急性T細胞媒介性拒絶反応を引き起こさないが、その後の慢性抗体媒介性拒絶反応をもたらす4,5。慢性同種移植性腎症は、糸球体硬化症、間質性線維症、尿細管萎縮症、および間質性動脈硬化症を特徴とする14。移植後10週間で、ヘマトキシリンおよびエオジン(HE)染色および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色は、アイソグラフト腎臓とは対照的に、腎同種移植片における糸球体硬化症、間質性線維症、および尿細管萎縮(図2Aおよび2B)、ならびに間質性動脈硬化(図2C)を明らかにする。また、腎同種移植片における慢性糸球体症の別の特徴として、銀染色は、同種移植片腎臓と比較した場合の同種移植腎臓における糸球体基底膜の肥厚を示し(図2D)、本ラット同所性腎移植モデルの成功を示す。
図1:ラット同所性腎移植モデルの模式図。左腎動脈の上の大動脈をリゲートし、左腎静脈遠位を生殖器静脈と副腎静脈の結合にトランスクトする。氷冷UW溶液による灌流後、ドナーの左腎臓は、大動脈の隣に約2mmの左腎動脈をトランスジェクトし、膀胱の隣に尿管をトランステクトすることによって切除される。(B)レシピエントの腎臓の切除。左腎動脈および腎静脈の根部のクランプに続いて、結紮後に尿管がトランステクトされる。レシピエントの左腎臓は、次に、微小血管クランプから2mmの左腎動脈をトランステクトし、近位の腎静脈を左生殖器静脈と副腎静脈の結合にトランスフェクトすることによって切除される。(c)ドナーの腎臓の移植。ドナー腎動脈および腎静脈は、それぞれ、中断された縫合および連続縫合によって、エンドツーエンドパターンでレシピエント腎動脈および腎静脈に吻合される。次いで、ドナー尿管を、エンドツーサイドの「トンネル」法を用いてレシピエントの膀胱に吻合する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腎移植片の病理学的染色。 F344ドナーからルイスラットレシピエントへの腎臓移植の10週間後の腎同種移植片に示される糸球体硬化症、間質性線維症、尿細管萎縮、および間質性動脈硬化症を特徴とする慢性移植片腎症。(A,B)腎同種移植片における糸球体硬化症、間質性線維症、および尿細管萎縮ならびに(C)間質性動脈硬化症は、ヘマトキシリンおよびエオジン染色および過ヨウ素酸シッフ染色によって示される。(D)腎同種移植片における糸球体基底膜(GBM)の腎アイソグラフトと比較した肥厚は、銀染色によって示される。破線の四角は、GBM の高倍率画像を示しています。スケール バー: 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ラットへの腎移植は、高度な微小手術技術を必要とする困難な作業であり、手術技術は数回最適化されている。当初から、Gonzalezらはドナー腎臓をレシピエントの首に移植し、ドナー尿管を皮膚9に吻合した。しかし、尿路感染症の発生率が高く、ドナー尿管の狭窄症のため、手術は短時間で中止された。続いて、ドナー右腎臓のインプラント操作は、レシピエント大動脈及び下大静脈15へのドナー腎動脈及び腎静脈の吻合により、又はレシピエント腎動脈及び下大静脈11へのドナー腎動脈及び腎静脈の吻合により改善された。それにもかかわらず、右腎動脈および腎静脈は薄くて短く、手術の困難および失敗率を増加させる。さらに、この操作は、レシピエントの大動脈および下大静脈の遮断を必要とした。したがって、下半身の虚血および下大静脈の血栓症は、レシピエントラットの無効化および死亡の発生率が高い結果となった。他の改善されたインプラント操作には、カフ法16を用いたレシピエント腎動脈および腎静脈へのドナー大動脈および腎静脈の吻合が含まれる。さらに他の者は、カフ法12を用いて尿管を吻合する。しかし、腎動脈および尿管の薄さは、袖口および吻合部の産生の困難さを増大させ、それによってこれらのインプラント手術の適用を制限する。
現在、一般的に用いられているラット同所性腎移植モデルは、レシピエント大動脈及び下大静脈への左ドナー腎動脈及び腎静脈の吻合により左腎臓において行われ、レシピエント膀胱10へのドナー膀胱パッチの吻合が行われる。左腎動脈と腎静脈は、吻合を促進するのに十分な長さです。それにもかかわらず、レシピエント大動脈および下大静脈への吻合は、依然として下半身の虚血および下大静脈の血栓症を避けることができず、したがって、手術時間を短縮するために高いレベルの微小手術経験を必要とする。現在のラット同所性腎移植モデルは、レシピエント腎動脈および腎静脈への左ドナー腎動脈および腎静脈のエンドツーエンド吻合、ならびに「トンネル」法を用いてレシピエントの膀胱へのドナー尿管の吻合を介してReuter S. et al.17から改変されている。このモデルでは、レシピエントラットの生理学的全身循環が中断されないようにレシピエント大動脈および下大静脈をクリップする必要がなく、生存率が壊滅することなく改善される(90%以上)。さらに、ドナー尿管をレシピエントの膀胱に吻合する「トンネル」方法は、操作が容易であり、ドナー膀胱パッチを縫合することによって手術後の尿漏れの発生率を低下させる。
ただし、このモデルのいくつかの詳細に注意する必要があります。まず、腸は湿らせたガーゼで覆うことによって外側を湿らせておくべきです。さもなければ、レシピエントは手術後に腸壊死で死亡するであろう。第二に、ドナー尿管の結合組織は、それへの血液供給を確実にするために完全に除去されるべきではない。第三に、ドナーとレシピエントのラットの同様の重量が、ドナーとレシピエントの船舶が同じ口径であることを保証するために付与されるべきである。ドナー血管とレシピエント血管の口径が有意に異なると、吻合後の出血または血栓症が増加するであろう。第四に、生殖器静脈と副腎静脈の結合から遠位側のドナー腎静脈をトランスフェクトし、レシピエント腎静脈を近位から生殖器静脈と副腎静脈のコンジャンクションにトランステクトすることによって、吻合された血管の適切な長さが保たれるべきである。吻合された血管が長すぎたり短すぎたりすると、血管のねじれ、血流不良、血液漏出を引き起こす可能性があります。第五に、吻合プロセスは、腎動脈および腎静脈の薄い壁のために、x45倍などの高倍率フィールド下で実施されるべきである。分解不良のフィールドは、血管壁の誤った縫合糸を引き起こす。第六に、手術後の血栓症を軽減するために、吻合プロセス中に吻合容器にヘパリン溶液(100U / mL)を滴下しなければならない。第七に、ドナー尿管の全層は、尿管の狭窄および水腎症が増加するので、レシピエントの膀胱に固定するときに縫合されるべきではない。
このモデルの限界は、微小手術スキルの高い要件と、出血、尿漏れ、血栓症、および水腎症を含む合併症の一定の確率である。主要な術後合併症は、ラットにおける異なる同所性腎移植技術間で類似しており、出血、尿漏れ、血栓症、および尿管吻合狭窄に起因する水腎症が含まれる。しかしながら、レシピエント腎動脈及び下大静脈11に対するドナー腎動脈及び腎静脈の吻合とは対照的に、現在の技術は、吻合の薄さのために腎血管における血栓症を軽度に増加させるが、下肢循環との干渉を回避している。カフ法16を用いた腎動脈および腎静脈の吻合とは対照的に、現在の技術は、血管のねじれを減少させる。カフ法12を用いた尿管のエンドツーエンド吻合と比較して、現在の技術は、尿管吻合の狭窄を軽度に増加させるが、操作の困難さを軽減する。継続的な実践によるマイクロ手術技術の改善は、合併症を軽減し、レシピエントラットの生存率を高め、その後の実験におけるモデルの利用率を高めることができる。現在のモデルは、腎移植を研究する科学者への参照を提供します。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(81870304)から李淳に、エルゼ・クレーナー・フレゼニウス財団(2017_A28)がマーカス・グロエットラップに支援した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | G0090781 | |
| 4-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | C1048451 | |
| 8-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | C2090880 | |
| Buprenorphine | US Biological life Sciences | 352004 | |
| Electrocoagulator | Electrocoagulator | ZJ1099 | |
| F344 and Lewis rats | Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China) | NA | |
| Gauze | Henan piaoan group Co., LTD | 10210402 | |
| Heating pad | Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD | DK0032 | |
| Heparin | North China Pharmaceutical Co., LTD | 2101131-2 | |
| Injection syringe (1 ml and 10 ml) | Shandong weigao group medical polymer Co., LTD | 20211001 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., LTD | 21070201 | |
| Penicillin G Sodium | Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd | 69-57-8 | |
| Scalp needle (24 G) | Hongyu Medical Group | 20183150210 | |
| Shaver | Beyotime | FS600 | |
| Small animal anesthesia machine | RWD Life Science | R500 | |
| Small Animal Surgery Kit | Beyotime | FS500 | |
| Sodium chloride injection | Southwest pharmaceutical Co., LTD | H50021610 | |
| Surgical operation microscope | Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China | SZX-6745 | |
| Swab | Yubei Medical Materials Co., LTD | 21080274 | |
| Tape | Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD | 1911N68 | |
| UW solution | Bristol-Myers Squibb Company | 17HB0002 |
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