Summary
Este artigo foca no uso de espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria de titulação isotérmica para sondar e quantificar a termodinâmica de(II) vinculando-se a peptídeos e proteínas.
Abstract
O cobre(II) é um metal essencial em sistemas biológicos, conferindo propriedades químicas únicas às biomoléculas com as quais interage. Foi relatado para se ligar diretamente a uma variedade de peptídeos e desempenhar papéis necessários e patológicos que vão desde a estrutura mediadora até propriedades de transferência de elétrons até a função catalítica de transmissão. Quantificar a afinidade vinculante e a termodinâmica desses complexos(II)-peptídeos in vitro fornece insights sobre a força motriz termodinâmica de vinculação, competições potenciais entre diferentes íons metálicos para o peptídeo ou entre peptídeos diferentes para(II), e a prevalência do complexo(II)-peptídeo in vivo. No entanto, quantificar a termodinâmica de ligação pode ser desafiador devido a uma miríade de fatores, incluindo a contabilização de todos os equilíbrios concorrentes dentro de um experimento de titulação, especialmente nos casos em que há falta de alças espectroscópicas discretas representando o peptídeo, o íon metálico d-block e suas interações.
Aqui, um conjunto robusto de experimentos é fornecido para a quantificação precisa da termodinâmica(II)-peptídeo. Este artigo foca no uso da espectroscopia de absorção eletrônica na presença e ausência de ligantes cromofóricos para fornecer a alça espectroscópica necessária em(II) e o uso de calorimetria isotérmica isotermal livre de rótulos. Em ambas as técnicas experimentais, um processo é descrito como responsável por todo o equilíbrio concorrente. Embora o foco deste artigo esteja em(II), o conjunto descrito de experimentos pode ser aplicado além das interações(II)-peptídeos, e fornecer uma estrutura para quantificação precisa de outros sistemas de metal-peptídeos em condições fisiologicamente relevantes.
Introduction
A biologia evoluiu para utilizar a diversificada química dos íons metálicos necessários para que a vida se adapte e sobreviva em seu ambiente circundante. Estima-se que 25%-50% das proteínas usam íons metálicos para estrutura e função1. O papel particular e o estado redox do íon metálico estão diretamente relacionados com a composição e geometria dos ligantes biológicos que o coordenam. Além disso, íons metálicos ativos de redox, como(II), devem ser fortemente regulados para que não interajam com agentes oxidantes através da química fenton para formar espécies reativas de oxigênio (ROS)2,3,4. Compreender os modos de ligação e afinidade que impulsionam sua bioquímica deve ajudar a elucidar o papel biológico do íon metálico.
Muitas técnicas são utilizadas para estudar as interações vinculantes de metais e peptídeos. Estas são principalmente técnicas espectroscópicas, mas também incluem simulações de computador usando dinâmica molecular, como visto através de interações(II) com um fragmento de beta amiloide (Aβ)5. Uma técnica espectroscópica amplamente utilizada que é acessível a muitas universidades é a ressonância magnética nuclear (RMN). Usando a natureza paramagnética de(II), Gaggelli et al. foram capazes de mostrar onde o íon metálico se liga a um petide através do relaxamento dos núcleospróximos 6. A ressonância paramagnética eletrônica (EPR) também pode ser utilizada para sondar a localização e o modo da ligação de íon metálico paramagnético7. Outras técnicas espectroscópicas, como o dicromaísmo circular (CD) podem descrever a coordenação sobre(II) em sistemas como sistemas tripeptídeos8, e espectrometria de massa pode mostrar estequiometria e para que resíduos o íon metálico seja coordenado através de padrões de fragmentação 9,10.
Algumas dessas técnicas, como a RMN, são livres de rótulos, mas exigem grandes concentrações de peptídeos, colocando desafios para o estudo. Outra técnica comum chamada espectroscopia de fluorescência tem sido utilizada para relacionar a posição de uma tirasina ou triptofano com a sacieçação de um(II)11,12. Da mesma forma, esta técnica pode apresentar alterações estruturais como resultado da ligação(II) 13. No entanto, os desafios com esses estudos de ligação metal-peptídeo são que eles sondam aminoácidos cromofóricos, como a tyrosina que nem todos os sistemas têm, que o íon metálico se liga sob um modelo clássico, e que a técnica pode não ser propícia em condições fisiológicas. De fato, existem vários peptídeos que não contêm tais aminoácidos cromofóricos ou se ligam sob modelos clássicos, impedindo o uso dessas técnicas14,15. Este artigo detalha abordagens para avaliar propriedades vinculantes nesses cenários em condições fisiologicamente relevantes.
Ligantes biológicos podem adotar diferentes estados de protonação que podem afetar a ligação de íons metálicos, como o anel de imidazol na histidina. Se o pH não for mantido de forma consistente, os resultados podem ser complicados ou conflitantes. Por essa razão, os buffers são um componente essencial no estudo das interações metal-proteína/peptídeo. No entanto, muitos buffers têm sido mostrados para interagir favoravelmente com íons metálicos16,17. Além de competir com a molécula biológica de interesse, o tampão pode ter átomos coordenados semelhantes que podem ser difíceis de distinguir dos átomos coordenadores do peptídeo ou proteína. Neste estudo, o foco está na espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria isotemal de titulação (ITC) como duas técnicas complementares para o estudo das interações(II)-peptídeos, com considerações especiais sobre a escolha do tampão.
A espectroscopia de absorção eletrônica é uma técnica rápida e amplamente acessível para estudar interações de ligação metálica. A irradiação com luz no comprimento de onda ultravioleta (UV) ou visível pode levar à absorção de bandas d-d centradas no metal, que fornecem informações valiosas sobre classificação de ligantes, geometrias metálicas e afinidades de ligação aparente18,19. Para esses complexos, as titulações diretas de íons metálicos em soluções de proteína ou peptídeo podem quantificar estoquitometrias vinculantes e afinidades aparentes de ligação. Em alguns casos, como configurações de5 oud 10 elétrons, o complexo não absorve luz (ou seja, é espectroscopicamente silencioso). Nestes complexos metálicos de transição espectroscópicamente silenciosos, essas limitações podem ser contornadas usando um ligante concorrente que, ao coordenar para o íon metálico, produz faixas detectáveis de transferência de carga. Em ambos os casos, esta abordagem limita-se a quantificar apenas a estequiometria e a afinidade de ligação aparente, e nenhuma percepção sobre a entalpia vinculante é fornecida sem aproximações.
Complementando informações obtidas a partir da espectroscopia de absorção eletrônica, o ITC é uma técnica atraente para quantificação direta e rigorosa da ligaçãoenthalpy 20. O ITC mede diretamente o calor liberado ou consumido durante um evento de ligação e, uma vez que a titulação ocorre em pressão constante, o calor medido é a entalpia de todo o equilíbrio (ΔHITC). Além disso, quantificam-se a estequiometria do evento de ligação (n) e a aparente afinidade de ligação (KITC). A partir desses parâmetros, a energia livre (ΔGITC) e a entropia (ΔSITC) são determinadas, fornecendo um instantâneo termodinâmico do evento de ligação. Como não depende da absorção de luz, o ITC é uma técnica ideal para espécies espectroscopicamente silenciosas, por exemplo, d5 ou d10 peles de íons metálicos. No entanto, uma vez que a calorimetria mede o calor, qualquer sistema tampão incomparável e equilíbrio não contabilizado pode afetar negativamente a análise para determinar com precisão a termodinâmica de ligação de íons metálicos, e muito cuidado deve ser tomado para lidar com esses fatores20. Se realizado com o rigor adequado, o ITC é uma técnica robusta para determinar a termodinâmica dos complexos metal-proteína/peptídeo.
Aqui, um peptídeo de ligação de cobre cromoohoricamente silencioso, C-peptídeo, é usado para demonstrar o uso complementar das duas técnicas. C-peptídeo é um produto de decote de resíduos (EAEDLQVGQGQGGGGGLQPLALEGSLQ) formado durante a maturação da insulina; não possui resíduos cromofóricos, mas tem se mostrado que liga(II) com afinidade fisiologicamente relevante14,15. O sítio de ligação(II) consiste nas cadeias laterais de um glutamato e um aspartato, bem como o N-terminus do peptídeo 14,15. Estes átomos coordenadores se assemelham muito aos de muitos sistemas tamponados comumente usados. Aqui, é mostrado o uso tandem das bandas d-d e transferência de carga em espectroscopia de absorção eletrônica e ITC na quantificação da termodinâmica de ligação(II) para C-peptídeo. A abordagem do estudo(II) vinculativo ao C-peptídeo pode ser aplicada a outros íons metálicos e sistemas de proteína/peptídeo.
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Protocol
1. Espectroscopia de absorção eletrônica: titulação direta com competição de buffer
- Preparação da amostra
- Prepare uma solução tamponada de 50 mM 2-[bis(2-hidroxitila)amino]-2-(hidroximetila)propano-1,3-diol (bisTris) em pH 7.4 usando água ultrapura (resistência >18 MΩ). Remova íons metálicos de traço incubando com uma resina de alta afinidade por pelo menos 2 h com filtragem subsequente.
- Dissolva ou dilua uma quantidade conhecida do peptídeo no buffer sem metal.
NOTA: Ao monitorar bandas d-d com pequenos coeficientes de extinção21, devem ser utilizadas concentrações mais elevadas de peptídeos. Aqui, a concentração final de C-peptídeo na solução tamponada foi de 300 μM (o volume depende do tamanho do cuvette). O c-peptídeo foi sintetizado pela síntese de peptídeos em fase sólida e é detalhado em outros lugares da literatura14. - Dissolva uma massa conhecida de CuCl2 em água ultrauso para fazer uma solução a 10-15 mM.
NOTA: É importante dissolver inicialmente o sal metálico em água não aferida para evitar a precipitação. Outros sais(II) podem ser usados, mas deve-se tomar cuidado para garantir que o ânion esteja fracamente coordenando.
- Executando o experimento
- Ligue o espectrômetro de absorção eletrônica e deixe aquecer por ~15-20 minutos antes de usar. Inicie o software espectrômetro e configure os parâmetros como faixa de digitalização (200-900 nm), taxa de varredura (200 nm/s) e linha de base de feixe duplo corrigida (mais parâmetros estão listados no Arquivo Suplementar).
- Colete uma linha de base sem cuvetas ou amostras nos caminhos do feixe.
- Utilizando duas cuvetas combinadas no espectrofotômetro de feixe duplo, carregue um cuvette com 115 μL de água ultrapura e o outro cuvette com 115 μL da amostra de peptídeo. Certifique-se de que não há bolhas de ar nas cuvetas, pois estas interferirão com o sinal.
- Coloque a cuvette com água ultrapura no feixe de referência e a cuvette com peptídeo no feixe de amostra.
- Colete o espectro de absorção do peptídeo livre de metal (apo).
- Adicione uma quantidade subsetoquiométrica (0,5 equivalentes, 150 μM) da solução(II) na cuvette com a amostra de peptídeo. Certifique-se de que o volume de(II) adicionado seja inferior a 3 μL e regise o volume para análise posteriormente.
- Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar a solução, evitando a geração de bolhas de ar. Que a solução reaja e equilibre por 5 minutos e regise o espectro de absorção.
- Repita a adição de alíquotas de(II) como na etapa 1.2.6 na solução de peptídeo para os seguintes equivalentes: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 e 5.0 (ou um total de 300, 450, 600, 900 e 1.500 μM). Certifique-se de registrar o volume total de(II) adicionado e o volume total do cuvette.
NOTA: Se houver mais resolução, reduza o espaçamento entre os equivalentes. - Remova a colher de sopa de amostra e limpe completamente de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicione a solução tamponada sem peptídeo e registe o espectro de absorção. Repita a adição de alíquotas de(II) como nas etapas 1.2.5-1.2.8, registrando o espectro de absorção para cada equivalente(II).
- Exporte todos os espectros como arquivos csv para processamento. Limpe completamente as cuvetas de acordo com as instruções do fabricante e desça o espectrômetro.
- Processamento dos dados
- Carregue todos os espectros em um programa de planilha.
- Subtraia o espectro somente tampão (0 μM(II) de todos os outros espectros para remover quaisquer recursos de absorção do próprio buffer.
- Normalize cada espectro para explicar a diluição resultante da adição da solução(II) (etapa 1.2.6). Consulte o Arquivo Suplementar, Eq (1)14 para um exemplo da normalização onde vinicial é o volume (115 μL) de peptídeo adicionado ao cuvette, v(II) é o volume da solução(II) adicionado na etapa 1.2.6, eespectro subtraído abs tampão são os dados obtidos na etapa 1.2.7.
- Gráfico de todos os espectros juntos para identificar regiões de mudança.
NOTA: Bandas d-d típicas dos complexos cu(II) variam de 500 a 750 nm. Esta titulação espectrofotométrica pode ser desafiadora devido ao pequeno coeficiente de extinção das bandas D-D, que são transições proibidas por Laporte na geometria octadral21. Se a absorvância for muito fraca, uma abordagem alternativa é utilizar ligantes cromofóricos que resultam em bandas de transferência de carga ao vincular-se a(II) (ver seção 2).
2. Espectroscopia de absorção eletrônica: competição de peptídeos com ligante cromofórico
- Preparação da amostra
- Dissolver 1,10-phenanthrolina (fen) em água ultrauso para obter uma concentração final de ~1 mM.
- Além da preparação da amostra descrita na seção 1.1 para o peptídeo (etapa 1.1.2) e(II) (etapa 1.1.3), prepare uma solução de 10 μM(II) e 40 μM de fen em tampão ([(phen)3]2+). Certifique-se de que o volume preencha o cuvette.
- Executando o experimento
- Inicie o espectrofotômetro de absorção eletrônica como nas etapas 1.2.1 e 1.2.2, mas defina a faixa de digitalização para 200-400 nm.
- Em duas cuvetas combinadas, carregue uma cuvette com 115 μL de água ultrapura e a outra cuvette com 115 μL da solução [(phen)3]2+ . Coloque a cuvette com água no feixe de referência e a cuvette com solução [(phen)3]2+ no feixe de amostra.
- Colete o espectro de absorção do complexo metal-ligante.
- Adicione uma quantidade estequiométrica (≈1 equivalentes, ≈10 μM) de peptídeo à solução [(phen)3]2+ . Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar completamente, mas tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar. Registo o volume de peptídeo adicionado para análise futura.
NOTA: O uso de cuvetas que possuem 115 μL, adicionando 3,83 μL de peptídeo de 300 μM produz uma concentração final de peptídeo de 9,7 μM. - Incubar a solução por 5 minutos para alcançar o equilíbrio. Regisso espectro de absorção.
NOTA: Se a afinidade de ligação do metal-peptídeo e metal-ligante for semelhante, a concentração de peptídeo adicionado precisará estar em grande excesso. Certifique-se de explicar o volume total de peptídeo adicionado para normalização. - Repita a adição de alíquotas de peptídeos na solução [(phen)3]2+ para os seguintes equivalentes aproximados: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 e 26. Registo o volume de peptídeo adicionado para que a concentração diluída possa ser determinada.
- Remova a amostra e limpe bem a cuvette de acordo com as instruções do fabricante. Colete um espectro do buffer. Colete um espectro de 50 μM peptídeo no buffer.
- Exporte todos os dados como arquivos csv para processamento e limpe as cuvetas de acordo com as instruções do fabricante.
- Processamento dos dados
- Carregue o espectro em um programa de planilha e subtraia o espectro tampão do outro espectro.
- Normalize o espectro seguindo arquivo suplementar, Eq (2)14.
- Utilizando o coeficiente de extinção para [(phen)3]2+ a 265 nm (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22, determine a concentração de [(phen)3]2+ com cada adição do peptídeo.
- Para cada adição do peptídeo, determine a concentração do complexo(II)-peptídeo subtraindo a concentração restante de [(phen)3]2+, conforme determinado na etapa 2.3.2, a partir da concentração inicial de [(phen)3]2+ (a 0 μM peptídeo).
- Calcule a concentração de ligante defenal livre pela equação em Arquivo Suplementar, Eq (3)14.
- Calcule a concentração de peptídeo livre usando Arquivo Suplementar, Eq (4)14, onde o estoque [peptídeo]representa o peptídeo não diluído titulado no cuvette, V1 representa o volume de peptídeo adicionado, V2 é o volume total da cuvette, e [2+-peptídeo] é determinado na etapa 2.3.4.
- Calcule a afinidade de ligação experimental (Kex) usando Eq (5) no Arquivo Suplementar23.
- Relacionar a constante de dissociação de(II)-peptídeo a Kex por Eq (6)23 em Arquivo Suplementar, onde Kd,(II)-phen = 1,0 × 10-9 (ver 22). Determine o desvio médio e padrão de todas as constantes de dissociação determinadas.
NOTA: Sob uma proporção de 4:1 de feno:Cu(II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(fen)2]2+, e [Cu(phen)]2+ existem na solução, e o peptídeo se afastará cu(II) da espécie ([Cu(phen)]2+) com a ligação mais fraca22.
3. Calorimetria de titulação isotérmica
- Preparação da amostra
- Prepare uma solução tamponada de 15 mM 3-morpholinopropano-1-sulfônico ácido (MOPS) em pH 7.4 usando água ultrapura (resistência > 18 MΩ). Remova íons metálicos de traço incubando com uma resina de alta afinidade por pelo menos 2 h com filtragem subsequente de vácuo através de uma membrana de 0,45 μm de garrafa.
- Dissolva uma massa conhecida de CuCl2 em água ultrauso para preparar uma solução de ≈50-100 mM. Diluir esta solução(II) em tampão para obter uma solução de 1,0 mL com concentração final de 1,4 mM(II). Regisso o volume exato da solução CuCl2 utilizada.
- Dissolva ou dilua a solução de peptídeo no buffer para fazer 450 μL de uma solução de peptídeo de 154 μM. Certifique-se de que a mesma proporção de água ultrauso adicional da etapa 3.1.2 seja adicionada à solução de peptídeo, que reduzirá o calor da diluição e aumentará o sinal-ruído.
- Após a preparação das amostras, certifique-se de que as soluções estejam no mesmo pH e, se necessário, ajuste em conformidade.
- Passo opcional: Degas as soluções para minimizar microbolhas carregadas no ITC.
- Executando o experimento
- Ligue o ITC. Inicie o software ITC para executar o instrumento. Aguarde a primeira inicialização, que pedirá para reabrigar o buret; em seguida, siga as instruções na tela.
- Remova a tampa da célula de referência. Remova qualquer água da célula de referência e enxágue três vezes com 450 μL de água ultrapura desgaseada.
- Desenhe lentamente água ultrauso para a marca de 450 μL de uma seringa de carregamento, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na seringa. Insira a seringa de carregamento na célula de referência até que esteja ≈1 mm a partir da parte inferior, e injete lentamente parte da solução até que 150 μL permaneça na seringa de carregamento. Mova o êmbolo de seringa de carga rapidamente para cima e para baixo ≈25 μL várias vezes para desalojar quaisquer bolhas na superfície da célula. Injete lentamente até que o êmbolo atinja a marca de 100 μL na seringa de carregamento, dispensando assim um total de 350 μL de água ultrapura na célula de referência e substitua a tampa da célula de referência.
- Remova qualquer solução residual da célula amostral e carregue com 450 μL de ácido 10 mM etilenodiaminetetraacético (EDTA) usando uma seringa de carregamento. Mergulhe por 10 minutos para garantir que os íons metálicos de traço sejam removidos porque o EDTA ligará metais de traço.
- Remova a solução EDTA (com íons metálicos de traço ligado) e enxágue completamente a seringa de carregamento com quantidades abundantes de água ultrapura.
- Limpe o ITC de acordo com as instruções do fabricante, enxaguando a célula amostral com água ultrapura.
- Condicionar a célula amostral enxaguando com 450 μL de tampão pelo menos três vezes.
- Remova o tampão que está condicionando a célula amostral. Carregue a solução de peptídeo na célula amostral usando a seringa de carregamento (siga o passo 3.2.3).
- Enxágüe a seringa de titulação com 200 μL de solução tamponada. Para isso, remova o êmbolo e use uma micropipette para pipetar o tampão através do orifício na parte superior da seringa de titulação de vidro, através da seringa, e para fora da agulha abaixo.
- Insira totalmente o êmbolo na seringa de titulação.
- Mergulhe a ponta da agulha de seringa de titulação na solução metálica e puxe lentamente o êmbolo para cima, fazendo com que a solução metálica encha a seringa e resulte em um volume vazio na parte superior da parte de vidro da seringa de titulação. Remova a maior parte do volume vazio girando a seringa de titulação paralela ao chão, remova o êmbolo e incline ligeiramente a parte do vidro em direção ao chão. Dê à seringa titulação um aperto suave para que a solução se mova para a extremidade da parte de vidro da seringa de titulação e preencha a maior parte do volume vazio, mas certifique-se de que 2-3 μL de volume vazio permaneça. Mantendo a seringa paralela ao chão, reinserir o êmbolo.
- Segure a seringa de titulação ereto, mergulhe a ponta da agulha de volta na solução metálica e empurre o êmbolo para baixo até que o ar deixe de sair da agulha. Carregue a seringa de titulação puxando lentamente o êmbolo para pouco acima da marca de 50 μL, mantendo a ponta da agulha na solução.
- Insira cuidadosamente a parte de vidro da seringa de titulação no arroto e enrosque até que esteja bem apertado. Quando uma pequena quantidade de solução sair da seringa de titulação devido à compressão do êmbolo, use um limpador delicado leve para absorver cuidadosamente a solução sem tocar na ponta da agulha.
- Insira o buret com a seringa de titulação na célula amostral e fixe-a com segurança.
- Configure os parâmetros no software ITC. A partir do Controle de Instrumentos, defina a taxa de agitação (taxas típicas de agitação variam de 150 a 350 RPM) e a temperatura na qual o experimento será realizado (tipicamente 25 °C). Digite as concentrações de seringas e células em unidades mililitros em Detalhes de Experimento.
- Na seção Método de experimento , selecione Titulação Incremental. Clique em Configurar e especifique 20 injeções de 2,5 μL. Se for necessário mais resolução para observar o evento de ligação, aumente o número de injeções e diminua o volume por injeção. Insira o espaçamento de tempo entre cada injeção para que seja longo o suficiente para que o sinal se equilibre e retorne à linha de base, tipicamente 300 s.
- Clique no botão executar para iniciar o experimento e especifique onde os dados são salvos.
- Após a conclusão do experimento, limpe a célula amostral e a seringa de titulação.
- Execute todos os experimentos em pelo menos triplicado para garantir a coleta precisa de dados.
- Execute um experimento de controle onde a solução metálica é titulada na solução tamponada (na ausência de peptídeo) para garantir que o calor da diluição do íon metálico seja pequeno e que não haja equilíbrio não contabilizado. Se o calor da diluição for grande, considere um sistema tampão diferente, se possível.
- Processamento dos dados
- Inicie o software de análise ITC e carregue o arquivo de dados para análise.
- Navegue até a guia Linha de Base e inspecione o termograma. Note que qualquer calor exógeno evoluiu ou absorveu de bolhas de ar ou outros artefatos no termograma. Procure por picos que não são devido à injeção da solução metálica.
- Certifique-se de que a linha de base gerada pelo software de análise segue a parte dos dados após a injeção e o equilíbrio. Se ele se desviar, use pontos de pivô de linha de base para ajustar a linha de base. Certifique-se de que as Regiões de Integração incluam o pico gerado a partir da injeção do metal, mas ocluam quaisquer bolhas de ar ou artefatos no termograma encontrado na etapa 2. Subtraia a linha de base do termograma.
NOTA: Este tipo de manipulação é recomendada somente após a coleta de múltiplos termogramas, para que o experimentador saiba o que são dados reais e o que é um artefato, pois o ajuste da linha de base e das Regiões de Integração pode afetar drasticamente os dados. - Navegue até a janela Modelagem para começar a encaixar os dados onde o software de análise mostrará os dados integrados e normalizados de concentração para cada injeção.
- Clique esquerdo no datum da primeira injeção para removê-lo do algoritmo de montagem.
NOTA: Isso é comum, uma vez que haverá uma pequena mistura entre a solução de células de titante e amostra que levar à dispensação inexata do molar da primeira injeção. - Na seção Modelos , selecione Blank (constante) no menu dropdown Style , que é baseado na incontegnição de injeção final e será subtraído de todos os pontos de dados, contabilizando o calor da diluição. Além disso, selecione Independente (ou o melhor modelo para o sistema) no segundo menu de dropdown Style para se adequar aos dados.
NOTA: Para interações de ligação padrão 1:1, o modelo mais comum é Independente. - Encaixe os dados usando os dois modelos pressionando o botão de reprodução verde com um Σ.
NOTA: Outro software para processar dados ITC é o SEDPHAT24. - Conta de todo o equilíbrio concorrente na análise pós-hoc relatada anteriormente por Grossoehme et al. Dia 20.
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Representative Results
O objetivo foi quantificar e corroborar a termodinâmica de(II) vinculando-se ao C-peptídeo utilizando as técnicas complementares de espectroscopia de absorção eletrônica e ITC. Devido à natureza robusta da espectroscopia de absorção eletrônica, foi realizada uma titulação direta de(II) em 300 μM C-peptídeo (Figura 1). A adição de 150 μM de(II) causou um aumento imediato na banda em 600 nm, atribuída à banda d-d de(II), e continuou a aumentar até 300 μM(II) foi adicionado. Além disso, acima de 300 μM(II) não aumentou a absorção da banda d-d, indicando saturação e que(II) se liga ao C-peptídeo em um complexo de 1:1. Além disso, devido à afinidade relativamente alta de bis-Tris para vinculação a(II) (log K = 5,27)16, a afinidade(II)/C-peptídeo deve ter um limite menor na faixa de micromolar (log K > 6) para quilatar o íon metálico longe do buffer. Neste sistema, a quantificação precisa das bandas de absorção é desafiadora devido ao pequeno coeficiente de extinção.
Para contornar o pequeno coeficiente de extinção da banda D-D, um ligante cromofórico, o fen, foi usado como descrito acima. C-peptídeo foi titulado em ≈10 μM [(phen)3]2+ (Figura 2A), e a absorção da banda de transferência de carga a 265 nm diminuiu (Figura 2B), indicando que c-peptídeo foi capaz de chelatar(II) do ligante de phen. Após uma inspeção mais minuciosa, foi necessária uma grande concentração de C-peptídeo (até 140 μM) para modestamente superar o ligante de fenómeno (Tabela 1). Isso não é surpreendente, dado as grandes constantes de formação sequencial para [(phen)3]2+ (9.0, 15.7 e 20.8 para log K1, β2 e β3, respectivamente)22. A análise dos espectros mostra que a afinidade de ligação(II)/C-peptídeo está na faixa de log K = 7,4-7.8 (Tabela 1).
O padrão ouro de medir a termodinâmica completa de uma interação vinculante é o ITC. A Figura 3 fornece um termograma representativo de(II) titulado em C-peptídeo em 15 mM MOPS, pH 7.4, que fornece a competição para o(II). Aqui, o buffer MOPS foi usado em vez de tampão bis-Tris porque K(II)-MOPS < K(II)-bis-Tris16,25, e forneceria menos concorrência para que o ITC possa medir com precisão a afinidade (ver discussão). Através da medição do calor consumido ou evoluído entre todos os equilíbrios, o termograma fornece uma forma sigmoidal. As injeções iniciais de(II) antes do peptídeo ser saturado resultam em grandes quantidades de calor em comparação com o calor da diluição. A diferença nestes valores de calor são ΔHITC. O ponto de inflexão descreve duas informações úteis. A primeira é a estequiometria de ligação da espécie na seringa em comparação com a espécie na célula (ou seja,(II):C-peptídeo é 1:1). Em segundo lugar, a inclinação do ajuste no ponto de inflexão é diretamente proporcional ao KITC. Após a coleta de dados em triplicados e em buffers múltiplos, foi realizada uma análise pós-hoc20 onde todos os equilíbrios concorrentes são contabilizados (Tabela 2), e a termodinâmica independente do buffer é determinada. Para(II) vinculação ao C-peptídeo, K(II)/C-peptídeo = 1 (± 1) x 108 e ΔH(II)/C-peptídeo = -8 (± 4) kJ mol-1. A partir destes, outros parâmetros termodinâmicos de ligação são determinados onde ΔG°(II)/C-peptídeo = -46 (± 4) kJ mol-1 e ΔS(II)/C-peptídeo = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (ver 15).
Figura 1: Monitoramento da banda D-D(II) após a adição de 150, 300, 450, 600, 900 e 1.500 μM(II) a 300 μM C-peptídeo em 50 mM bis-Tris, pH 7.4. A banda d-d de(II) aumenta em 600 nm até que um complexo(II):C-peptídeo seja formado. Anteriormente, Magyar e Godwin relataram que a afinidade(II)-bis-Tris é log K = 5,2716. Esta titulação mostra que o C-peptídeo pode superar o tampão para ligar(II) e indica uma afinidade(II)/C-peptídeo na faixa micromolar. Este valor é reimpresso com permissão de Stevenson et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Formação de [(phen)3]2+ e espectros de absorção eletrônica representativa monitorando a diminuição da faixa de transferência de carga após a adição de C-peptídeo. (A) O esquema de reação mostrando a formação de [(phen)3]2+ e sua faixa de transferência de carga centrada em 265 nm (ε° ≈ 90.000 M-1 cm-1)22. As constantes de formação são 9,0, 15,7 e 20,8 para log K1, β2 e β3, respectivamente22. (B) Espectro de absorção eletrônica representativo monitorando a diminuição da faixa de transferência de carga de [(phen)3]2+ como C-peptídeo chelates(II). A titulação foi realizada em 50 mM bis-Tris, pH 7.4. A análise dos dados está mostrada na Tabela 1. Este valor é reimpresso com permissão de Stevenson et al.14. Abreviação: MLCT = transferência de carga de metal para ligante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Termogramas representativos de(II) titulados em C-peptídeo e tampão. (A) Este termograma representativo mostra a titulação de 1,4 mM(II) em 154 μM C-peptídeo em 15 mM MOPS, pH 7.4. Os dados estão aptos a um modelo de um único local com os seguintes parâmetros: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3,4 ± 0,2 kJ mol-1. (B) Uma titulação de controle representativa de 1,4 mM(II) em 15 mM MOPS, pH 7.4, na ausência de C-peptídeo não mostrando termograma de ligação que é visto no painel A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| [C-peptídeo] | Um265 | [(fen)3] 2+ | [phen] livre | [C-peptídeo] livre | [(II)/C-peptídeo] | Kex (x108) | Kd(II)/C-peptídeo | log Kd(II)/C-peptídeo | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | Nd | Nd | Nd | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1.84E-08 | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2.73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3.23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3.26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3.48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3.63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3.47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3.43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3.40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3.19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2.93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2.69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2.58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2.29E-08 | 7.64 | |
| Gama | 7.4-7.8 | ||||||||
Tabela 1: Cálculos representativos para as concentrações de espécies em solução da Figura 2B. Todas as concentrações estão em micromolar. Esta tabela é reimpressa com permissão de Stevenson et al.14.
| Equlibria | n | ΔH (kJ mol-1) | n × ΔH (kJ mol-1) |
| (II)-MOPS →(II) + MOPS | 1 | 5.4 | 5.44 |
| MOPS + H+ → MOPS-H+ | 0.097 | −21.0 | −2.04 |
| (II) + C-peptídeo-H+ →(II)/C-peptídeo + H+ | 1 | X | X |
| ΔHITC = Χ + 3,40 | |||
| Χ = ΔHITC − 3,40 | |||
| Χ = ΔH(II)/C-peptídeo = −6,8 kJ mol-1 |
Tabela 2: Análise pós-hoc para determinar ΔH(II)/C-peptídeo. Como mostrado na Figura 3,1,4 mM(II) foi titulado em 154 μM C-peptídeo em MOPS de 15 mM, pH 7.4, em triplicado. Depois de contabilizar todo o equilíbrio concorrente mostrado na tabela, ΔH(II)/C-peptídeo é encontrado como −8,66 kJ mol-1. O número de prótons deslocados de C-peptídeo por(II) é determinado a partir da inclinação de (ΔHITC + ΔH(II)-Buffer) vs ΔHBuffer-H , onde os dados são coletados em vários buffers. Todos os valores de entalpia são encontrados no NIST25 ou determinados em outros lugares da literatura15. Todos os equilíbrios concorrentes são contabilizados conforme descrito por Grossoehme et al.20 Este número é reimpresso com permissão de Stevenson et al.15.
Arquivo Suplementar: Equações relevantes utilizadas na seção de protocolo e parâmetros adicionais para especttômetro de absorção eletrônica e configuração de ITC. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Este artigo fornece um método robusto para quantificar a afinidade e termodinâmica de(II) vinculando-se aos peptídeos. Complexos com(II) são idealmente adequados para monitorar a banda de absorção d-d no local do metal devido à sua configuração de elétrons d9 . Embora o coeficiente de extinção seja pequeno, exigindo concentrações maiores do complexo para produzir um sinal confiável, as titulações de(II) em peptídeo podem rapidamente fornecer uma visão da estoquiometria vinculante e afinidade aproximada de ligação. No entanto, pode ser desafiador discernir uma diferença de espectros se o metal é coordenado por átomos e geometrias semelhantes tanto do tampão quanto do peptídeo. Para determinar a afinidade de ligação quantitativamente, ligantes cromofóricos como o fenão são frequentemente usados devido às suas transferências de carga permitidas por simetria com íons metálicos21. Através da criação de uma competição entre um ligante cromofórico e um peptídeo não-oideórico e conhecendo a afinidade do metal com o ligante, a afinidade metal-peptídeo pode ser diretamente determinada. Uma análise termodinâmica adicional usando espectroscopia de absorção eletrônica é desafiadora. Para quantificar a entalpia de ligação usando uma técnica como espectroscopia UV-Vis, a afinidade de ligação deve ser determinada a múltiplas temperaturas e uma análise van't Hoff realizada. Esta análise pressupõe que o calor específico da ligação é zero, o que raramente é verdadeiro e, portanto, só fornece uma estimativa da centhalpy20 vinculante.
A calorimetria de titulação isotérmica é mais adequada para elucidar uma visão geral mais completa da termodinâmica das interações metal-peptídeos. Nesta técnica, um íon metálico é titulado na solução de peptídeo e o calor de vários equilíbrios são diretamente medidos. Uma vez que o experimento é conduzido em pressão constante, o calor medido pelo ITC é igual ao enthalpy. O ITC pode superar algumas das limitações da espectroscopia de absorção eletrônica, como estudar íons metálicos espectroscopicamente silenciosos e não precisar fazer as suposições como feito na análise van't Hoff. No entanto, às vezes, as reações que ocorrem no ITC geram pouco ou nenhum calor e, portanto, não são observadas. Isso pode ser contornado através do aumento das concentrações de metal e peptídeos ou usando um tampão diferente com uma entalpia diferente de protonação. Este último é especialmente útil se o íon metálico deslocar vários prótons ao se ligar ao peptídeo. No entanto, ambas as técnicas - ITC e espectroscopia de absorção eletrônica - fornecem métodos ortogonais para estudar o mesmo sistema e complementar-se bem.
Há muitos aspectos desafiadores em ambas as técnicas ao estudar íons metálicos que se ligam aos peptídeos. Muitos íons metálicos são insolúveis ou solúveis em água. Isso é ainda mais exacerbado pela precipitação do íon metálico quando adicionado ao buffer. No ITC, isso pode ser manifestado por uma mudança lenta e gradual na linha de base e grandes quantidades de calor geradas quando o metal é injetado. Isso indica grandes valores de calor de diluição mesmo após o peptídeo estar saturado por íon metálico. Na espectroscopia de absorção eletrônica, a precipitação de íons metálicos manifesta-se através do aumento da absorção em comprimentos de onda mais baixos e se assemelha a um amplo pico centrado na região uv. Em ambas as técnicas, o experimentador deve garantir que o íon metálico seja solúvel nas condições de escolha (por exemplo, tampão, pH, temperatura, concentração). Outra limitação para ambos os métodos pode mostrar-se através do conceito de ordem de adição. Em alguns casos, um complexo metálico formado pode ser labile, enquanto adicionar os mesmos reagentes em uma ordem diferente tornaria outra espécie intermediária inerte. Esta ilustração do controle cinético versus termodinâmico dificulta a análise precisa de todo o equilíbrio concorrente.
Tanto a espectroscopia de itc quanto a eletrônica dependem de competições entre o peptídeo e tampão ou ligante para a ligação do íon metálico. Aqui, o valor c é introduzido, o que ajuda a identificar se oK ITC pode ser determinado com precisão pelo algoritmo de montagem. O valor c é definido em Arquivo Suplementar, Eq (7)20, onde n é estequiometria, KITC é a afinidade de ligação aparente, e [célula amostral] é a concentração da espécie na célula amostra. Quando o valor c está entre 1 e 1.000, oTIC K determinado é preciso. No entanto, os valores c abaixo de 1 só podem fornecer um limite superior aoTIC K, enquanto os valores c acima de 1.000 só podem fornecer um limite menorde 20. Esse é o valor da coleta de dados a partir de técnicas complementares: se algo é perdido em uma técnica devido às suas limitações, pode ser pego em sua técnica complementar. Nesses experimentos, se a competição for muito favorecida a uma espécie (ou seja, a afinidade de íons metálicos do peptídeo é muito maior do que a afinidade do tampão), o equilíbrio será deslocado, dificultando a interpretação. Isso também é mostrado em detalhes por Kocyla et al.23. Para contornar este desafio, a introdução ou substituição por um ligante concorrente diferente, ou a escolha de um buffer diferente é frequentemente usada para aumentar a competição entre ligante e peptídeo para quantificação precisa. Isso porque a diferença de tampão metálico (ou metal-ligante) e afinidades metal-peptídeos permitiria que o valor c caísse dentro da janela de 1 a 1.000. Deve-se notar, no entanto, que o uso de um ligante concorrente ou outro tampão para análise quantitativa exige que os parâmetros termodinâmicos do complexo metal-ligante ou metal-tampão sejam conhecidos ou possam ser determinados por outros meios.
Finalmente, quantificar com precisão a concentração de peptídeos pode ser um desafio. Algumas maneiras comuns de quantificar as concentrações de peptídeos são medir aminoácidos específicos e relacionar a quantidade desses aminoácidos à sequência do peptídeo. Por exemplo, a espectroscopia de absorção eletrônica pode medir resíduos aromáticos como a tyrosina, o reagente de Ellman pode quantificar o número de thiols gratuitos26, e os ensaios de Bradford fornecem uma indicação de quantos resíduos estão presentes27. Infelizmente, peptídeos como o utilizado neste estudo não têm resíduos aromáticos ou thiols livres, e os ensaios de Bradford representam desafios ao comparar padrões de proteínas massivas com o pequeno peptídeo de interesse. Em vez disso, a concentração de peptídeos foi determinada por massa seca. Embora não sejam ideais e propensas a concentrações que são pequenas superestimações de concentração de peptídeos (uma vez que as medidas de massa aparente são provavelmente maiores do que as massas de peptídeos reais devido à presença de sais), todas as alíquotas para medição foram tratadas da mesma forma, o que permite comparações mais precisas. Nos estudos espectroscópicos, se a concentração de peptídeo livre for menor do que o previsto, a afinidade de ligação calculada representa um limite menor (Arquivo Suplementar, Eq (5) e Eq (6)). Há desafios associados a ambas as técnicas mostradas, mas com a literatura como guia, muitos podem ser superados.
A abordagem experimental detalhada aqui permite quantificação precisa da termodinâmica de ligação metal-peptídeo. Tanto a especificação de absorção eletrônica quanto a espectroscopia de absorção eletrônica são ortogonais e fornecem insights sobre a afinidade vinculante, mas o ITC permite quantificação direta de entalpia. Uma vez que essas termodinâmicas são quantificadas, pode ser inferida se esses complexos metal-peptídeos podem se formar sob condições fisiológicas. À medida que a compreensão do fluxo de íons metálicos fisiológicos cresce, a previsão se a afinidade vinculante é forte o suficiente para a formação complexa in vivo pode ser feita. Além disso, o pesquisador pode fazer previsões sobre competições entre íons metálicos múltiplos para o mesmo peptídeo ou peptídeos múltiplos para o mesmo íon metálico. Olhando para essas competições entre íons metálicos e peptídeos, o pesquisador pode começar a entender o que contribui para a afinidade vinculante do complexo metal-peptídeo, analisando a energia livre em contribuições de entalpia e entropia. A termodinâmica é parte integrante da apreciação da interação dinâmica entre íons metálicos e peptídeos, e a espectroscopia de itc e de absorção eletrônica estão fornecendo alças para interrogar esses sistemas. Os métodos descritos aqui podem ser expandidos e usados para estudar outras interações de ligação de íons metálicos com macromoléculas, e podem ter implicações em processos fisiológicos, design de drogas e muito mais.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
SC agradece a Whitehead Summer Research Fellowship. O MJS agradece aos Fundos de Startup e ao Fundo de Desenvolvimento do Corpo docente da Universidade de São Francisco. O MCH reconhece financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH MIRA 5R35GM133684-02) e da Fundação Nacional de Ciência (NSF CAREER 2048265).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
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