Summary
Denna artikel fokuserar på användningen av elektronisk absorptionsspektroskopi och isotermisk titreringskalorimetri för att undersöka och kvantifiera termodynamiken för Cu (II) bindning till peptider och proteiner.
Abstract
Koppar (II) är en väsentlig metall i biologiska system, vilket ger unika kemiska egenskaper till de biomolekyler som den interagerar med. Det har rapporterats att direkt binda till en mängd olika peptider och spela både nödvändiga och patologiska roller som sträcker sig från förmedlande struktur till elektronöverföringsegenskaper till att ge katalytisk funktion. Kvantifiering av bindningsaffiniteten och termodynamiken hos dessa Cu(II)-peptidkomplex in vitro ger insikt i den termodynamiska drivkraften för bindning, potentiella tävlingar mellan olika metalljoner för peptiden eller mellan olika peptider för Cu(II), och förekomsten av Cu(II)-peptidkomplexet in vivo. Kvantifiering av bindningstermodynamiken kan dock vara utmanande på grund av en myriad av faktorer, inklusive redovisning av alla konkurrerande jämvikter inom ett titreringsexperiment, särskilt i fall där det saknas diskreta spektroskopiska handtag som representerar peptiden, d-blockmetalljonen och deras interaktioner.
Här tillhandahålls en robust uppsättning experiment för exakt kvantifiering av Cu (II) -peptidtermodynamik. Denna artikel fokuserar på användningen av elektronisk absorptionsspektroskopi i närvaro och frånvaro av kromoforiska ligander för att ge det nödvändiga spektroskopiska handtaget på Cu (II) och användningen av etikettfri isotermisk titreringskalorimetri. I båda experimentella teknikerna beskrivs en process för att redogöra för alla konkurrerande jämvikter. Medan fokus för denna artikel ligger på Cu (II), kan den beskrivna uppsättningen experiment tillämpas bortom Cu (II) -peptidinteraktioner och ge ett ramverk för exakt kvantifiering av andra metallpeptidsystem under fysiologiskt relevanta förhållanden.
Introduction
Biologin har utvecklats för att utnyttja den olika kemin hos metalljoner som behövs för att livet ska kunna anpassa sig och överleva i sin omgivande miljö. Uppskattningsvis 25%-50% av proteinerna använder metalljoner för struktur och funktion1. Metalljonens speciella roll och redoxtillstånd är direkt relaterat till sammansättningen och geometrin hos de biologiska liganderna som samordnar den. Dessutom måste redoxaktiva metalljoner såsom Cu (II) regleras tätt så att de inte interagerar med oxidationsmedel via Fenton-liknande kemi för att bilda reaktiva syrearter (ROS)2,3,4. Att förstå bindningslägena och affiniteten som driver dess biokemi bör hjälpa till att belysa metalljonens biologiska roll.
Många tekniker används för att studera bindningsinteraktionerna mellan metaller och peptider. Dessa är mestadels spektroskopiska tekniker men inkluderar även datorsimuleringar med molekylär dynamik, sett genom Cu(II)-interaktioner med ett fragment av amyloid beta (Aβ)5. En allmänt använd spektroskopisk teknik som är tillgänglig för många universitet är kärnmagnetisk resonans (NMR). Genom att använda den paramagnetiska naturen hos Cu(II) kunde Gaggelli m.fl. visa var metalljonen binder på en petid genom avslappning av närliggande kärnor6. Elektronparamagnetisk resonans (EPR) kan också användas för att undersöka platsen och läget för den paramagnetiska metalljonbindningen7. Andra spektroskopiska tekniker som cirkulär dikroism (CD) kan beskriva koordinationen kring Cu(II) i system som tripeptidsystem8, och masspektrometri kan visa stökiometri och till vilka rester metalljonen koordineras genom fragmenteringsmönster 9,10.
Några av dessa tekniker, såsom NMR, är etikettfria men kräver stora koncentrationer av peptid, vilket innebär utmaningar för studier. En annan vanlig teknik som kallas fluorescensspektroskopi har använts för att relatera positionen för en tyrosin eller tryptofan med släckning från en Cu (II) 11,12. På samma sätt kan denna teknik visa strukturella förändringar som ett resultat av Cu (II) bindning13. Utmaningar med dessa metall-peptidbindningsstudier är dock att de undersöker kromoforiska aminosyror som tyrosin som inte alla system har, att metalljonen binder under en klassisk modell och att tekniken kanske inte är gynnsam under fysiologiska förhållanden. Faktum är att flera peptider dyker upp som inte innehåller sådana kromoforiska aminosyror eller binder under klassiska modeller, vilket utesluter användningen av dessa tekniker14,15. Den här artikeln beskriver metoder för att utvärdera bindningsegenskaper i dessa scenarier under fysiologiskt relevanta förhållanden.
Biologiska ligander kan anta olika protoneringstillstånd som kan påverka metalljonbindningen, såsom imidazolringen på histidin. Om pH inte upprätthålls konsekvent kan resultaten vara invecklade eller motstridiga. Av denna anledning är buffertar en viktig komponent i studien av metall-protein / peptidinteraktioner. Många buffertar har dock visat sig positivt interagera med metalljoner16,17. Förutom att konkurrera med den biologiska molekylen av intresse kan bufferten ha liknande samordnande atomer som kan vara svåra att skilja från peptidens eller proteinets koordinerande atomer. I denna studie ligger fokus på elektronisk absorptionsspektroskopi och isotermisk titreringskalorimetri (ITC) som två komplementära tekniker för att studera Cu(II)-peptidinteraktioner, med särskilda överväganden avseende buffertval.
Elektronisk absorptionsspektroskopi är en snabb, allmänt tillgänglig teknik för att studera metallbindande interaktioner. Bestrålning med ljus i ultraviolett (UV) eller synliga våglängder kan leda till absorption av metallcentrerade d-d-band, vilket ger värdefull information om ligandklassificering, metallgeometrier och uppenbara bindningsaffiniteter18,19. För dessa komplex kan direkta titreringar av metalljoner till protein- eller peptidlösningar kvantifiera bindande stoichiometrier och uppenbara bindningsaffiniteter. I vissa fall, såsom d5 eller d10 elektronkonfigurationer, absorberar komplexet inte ljus (dvs är spektroskopiskt tyst). I dessa spektroskopiskt tysta övergångsmetallkomplex kan dessa begränsningar kringgås genom att använda en konkurrerande ligand som, vid samordning till metalljonen, ger detekterbara laddningsöverföringsband. I båda fallen är detta tillvägagångssätt begränsat till att kvantifiera endast stökiometri och uppenbar bindningsaffinitet, och ingen insikt i bindande entalpi ges utan approximationer.
ITC kompletterar information som erhållits från elektronisk absorptionsspektroskopi och är en attraktiv teknik för direkt och rigorös kvantifiering av bindningsentalpi20. ITC mäter direkt den värme som frigörs eller förbrukas under en bindningshändelse och eftersom titreringen sker vid konstant tryck är den uppmätta värmen entalpi för alla jämvikter (ΔHITC). Dessutom kvantifieras stökiometrin för bindningshändelsen (n) och den skenbara bindningsaffiniteten (KITC). Från dessa parametrar bestäms den fria energin (ΔGITC) och entropin (ΔSITC), vilket ger en termodynamisk ögonblicksbild av bindningshändelsen. Eftersom det inte är beroende av ljusabsorption är ITC en idealisk teknik för spektroskopiskt tysta arter, till exempel d5 eller d10 metalljonkomplex. Eftersom kalorimetri mäter värme kan emellertid alla oöverträffade buffertsystem och oräknade jämvikter påverka analysen negativt för att exakt bestämma metalljonbindande termodynamik, och stor försiktighet måste vidtas för att ta itu med dessa faktorer20. Om ITC utförs med lämplig noggrannhet är det en robust teknik för att bestämma termodynamiken hos metallprotein / peptidkomplex.
Här används en kromoforiskt tyst kopparbindande peptid, C-peptid, för att demonstrera den komplementära användningen av de två teknikerna. C-peptid är en 31 restklyvningsprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) bildad under insulinmognad; Den saknar kromoforiska rester men har visat sig binda Cu(II) med fysiologiskt relevant affinitet14,15. Cu(II)-bindningsstället består av sidokedjorna av ett glutamat och ett aspartat samt N-änden av peptiden14,15. Dessa koordinerande atomer liknar dem hos många vanliga buffrade system. Här visas tandemanvändningen av d-d- och laddningsöverföringsbanden i elektronisk absorptionsspektroskopi och ITC för att kvantifiera Cu (II) bindande termodynamik till C-peptid. Tillvägagångssättet från att studera Cu(II)-bindning till C-peptid kan tillämpas på andra metalljoner och protein/peptidsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektronisk absorptionsspektroskopi: direkt titrering med buffertkonkurrens
- Beredning av prov
- Bered en buffrad lösning av 50 mM 2-[bis(2-hydroxietyl)amino]-2-(hydroximetyl)propan-1,3-diol (bisTris) vid pH 7,4 med användning av ultrarent vatten (>18 MΩ resistans). Avlägsna spårmetalljoner genom att inkubera med ett harts med hög affinitet i minst 2 timmar med efterföljande filtrering.
- Lös upp eller späd en känd mängd av peptiden i den metallfria bufferten.
OBS: Vid övervakning av d-d-band med små extinktionskoefficienter21 måste högre koncentrationer av peptid användas. Här var den slutliga koncentrationen av C-peptid i buffrad lösning 300 μM (volymen beror på kyvettens storlek). C-peptid syntetiserades genom fastfaspeptidsyntes och beskrivs på andra ställen i litteratur14. - Lös upp en känd massa CuCl2 i ultrarent vatten för att göra en lösning vid 10-15 mM.
OBS: Det är viktigt att initialt lösa upp metallsaltet i obuffrat vatten för att förhindra utfällning. Andra Cu(II)-salter kan användas, men man måste se till att anjonen är svagt koordinerande.
- Köra experimentet
- Slå på den elektroniska absorptionsspektrofotometern och låt den värmas upp i ~15-20 min före användning. Starta spektrofotometerprogramvaran och konfigurera parametrar som skanningsområde (200-900 nm), skanningshastighet (200 nm / s) och dubbelstrålebaslinjekorrigerad (fler parametrar listas i tilläggsfilen).
- Samla in en baslinje utan kuvetter eller prover i strålbanorna.
- Använd två matchade kuvetter i dubbelstrålens spektrofotometer, ladda en kyvett med 115 μL ultrarent vatten och den andra kyvetten med 115 μL av peptidprovet. Se till att det inte finns några luftbubblor i cuvetterna eftersom dessa kommer att störa signalen.
- Placera kyvetten med ultrarent vatten i referensstrålen och kyvetten med peptid i provstrålen.
- Samla absorptionsspektrumet för den metallfria (apo) peptiden.
- Lägg till en sub-stökiometrisk mängd (0,5 ekvivalenter, 150 μM) av Cu(II)-lösningen i kyvetten med peptidprovet. Se till att den tillsatta volymen Cu(II) är mindre än 3 μl och registrera volymen för analys senare.
- Pipettera försiktigt upp och ner för att blanda lösningen samtidigt som du undviker generering av luftbubblor. Låt lösningen reagera och balansera i 5 minuter och registrera absorptionsspektrumet.
- Upprepa tillsatsen av Cu(II)-alikvoter enligt steg 1.2.6 i peptidlösningen för följande ekvivalenter: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 och 5,0 (eller totalt 300, 450, 600, 900 och 1 500 μM). Se till att registrera den totala volymen Cu (II) som lagts till och den totala volymen av kyvetten.
OBS: Om mer upplösning önskas, minska avståndet mellan ekvivalenter. - Ta bort provkuvetten och rengör noggrant enligt tillverkarens anvisningar.
- Tillsätt den buffrade lösningen utan peptid och registrera absorptionsspektrumet. Upprepa tillsatsen av Cu(II)-alikvoter som i steg 1.2.5-1.2.8 och registrera absorptionsspektrumet för varje Cu(II)-ekvivalent.
- Exportera alla spektra som csv-filer för bearbetning. Rengör cuvetterna noggrant enligt tillverkarens instruktioner och stäng av spektrofotometern.
- Behandling av uppgifterna
- Ladda alla spektra på ett kalkylprogram.
- Subtrahera endast buffertspektrumet (0 μM Cu (II)) från alla andra spektrum för att ta bort eventuella absorbansfunktioner från själva bufferten.
- Normalisera varje spektrum för att ta hänsyn till utspädningen till följd av tillsatsen av Cu(II)-lösningen (steg 1.2.6). Se tilläggsfilen, Eq (1) 14 för ett exempel på normaliseringen där vinitial är volymen (115 μL) peptid tillsatt till kyvetten, vCu (II) är volymen cu (II) lösning tillsatt i steg 1.2.6 och Absbuffer subtraherat spektrum är de data som erhållits i steg 1.2.7.
- Rita alla spektra tillsammans för att identifiera förändringsregioner.
OBS: Typiska d-d-band från Cu (II) -komplex sträcker sig från 500 till 750 nm. Denna spektrofotometriska titrering kan vara utmanande på grund av den lilla extinktionskoefficienten från d-d-band, som är Laporte-förbjudna övergångar i oktaedrisk geometri21. Om absorbansen är för svag är ett alternativt tillvägagångssätt att använda kromoforiska ligander som resulterar i laddningsöverföringsband vid bindning till Cu (II) (se avsnitt 2).
2. Elektronisk absorptionsspektroskopi: peptidkonkurrens med kromoforisk ligand
- Beredning av prov
- Lös upp 1,10-fenantrolin (fen) i ultrarent vatten för att erhålla en slutlig koncentration på ~1 mM.
- Förutom den provberedning som beskrivs i avsnitt 1.1 för peptiden (steg 1.1.2) och Cu(II) (steg 1.1.3), bered en 10 μM Cu(II) och 40 μM fenlösning i buffert ([Cu(fen)3]2+). Se till att volymen fyller kyvetten.
- Köra experimentet
- Starta den elektroniska absorptionsspektrofotometern som i steg 1.2.1 och 1.2.2 men ställ in skanningsområdet på 200-400 nm.
- I två matchade cuvetter, ladda en kyvett med 115 μL ultrarent vatten och den andra kyvetten med 115 μL av [Cu (fen) 3] 2+ lösningen. Placera kyvetten med vatten i referensstrålen och kyvetten med [Cu(phen)3]2+ lösning i provstrålen.
- Samla absorptionsspektrumet för metall-ligandkomplexet.
- Tillsätt en stökiometrisk mängd (≈1 ekvivalenter, ≈10 μM) peptid till [Cu(fen)3]2+ lösningen. Pipettera försiktigt upp och ner för att blanda noggrant men var försiktig så att du inte inför luftbubblor. Registrera volymen peptid som läggs till för framtida analys.
OBS: Användning av kuvetter som rymmer 115 μL, tillsats av 3,83 μL 300 μM peptid ger en slutlig peptidkoncentration på 9,7 μM. - Inkubera lösningen i 5 minuter för att nå jämvikt. Registrera absorptionsspektrumet.
OBS: Om bindningsaffiniteten hos metallpeptid och metallligand är likartade, måste koncentrationen av tillsatt peptid vara i stort överskott. Var noga med att ta hänsyn till den totala volymen peptid som tillsätts för normalisering. - Upprepa tillsatsen av peptid alikvoter i [Cu(phen)3]2+- lösningen för följande ungefärliga ekvivalenter: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 och 26. Registrera volymen peptid tillsatt så att den utspädda koncentrationen kan bestämmas.
- Ta bort provet och rengör kyvetten noggrant enligt tillverkarens anvisningar. Samla ett spektrum av bufferten. Samla ett spektrum av 50 μM peptid i bufferten.
- Exportera all data som csv-filer för bearbetning och rengör cuvetterna enligt tillverkarens instruktioner.
- Behandling av uppgifterna
- Ladda spektra på ett kalkylprogram och subtrahera buffertspektrumet från de andra spektra.
- Normalisera spektra efter Tilläggsfil, Eq (2)14.
- Använd extinktionskoefficienten för [Cu(fen)3]2+ vid 265 nm (εmax = 90 000 M-1 cm-1)22, bestäm koncentrationen av [Cu(fen)3]2+ med varje tillsats av peptiden.
- För varje tillsats av peptiden, bestäm koncentrationen av Cu (II) -peptidkomplexet genom att subtrahera den återstående koncentrationen av [Cu (fen) 3] 2+, bestämd i steg 2.3.2, från den initiala koncentrationen av [Cu (fen) 3] 2+ (vid 0 μM peptid).
- Beräkna koncentrationen av fri fenligand med ekvationen i Supplemental File, Eq (3)14.
- Beräkna koncentrationen av fri peptid med hjälp av Supplemental File, Eq (4)14, där [peptid]stock representerar den outspädda peptiden titrerad i kyvetten, V1 representerar volymen av tillsatt stampeptid, V2 är den totala volymen av kyvetten och [Cu2+-peptid] bestäms i steg 2.3.4.
- Beräkna den experimentella bindningsaffiniteten (Kex) med hjälp av Eq (5) i tilläggsfil23.
- Relatera dissociationskonstanten för Cu(II)-peptid till Kex med Eq (6)23 i Supplemental File, där Kd,Cu(II)-phen = 1,0 × 10-9 (se 22). Bestäm medelvärdet och standardavvikelsen från alla bestämda dissociationskonstanter.
OBS: Under ett 4: 1-förhållande av fen: Cu (II) finns [Cu (fen) 3] 2 +, [Cu (fen) 2] 2 + och [Cu (fen) ] 2 + i lösningen, och peptiden kommer att kelatera Cu (II) bort från arten ([Cu (fen)] 2+) med den svagaste bindningen22.
3. Isotermisk titreringskalorimetri
- Beredning av prov
- Bered en buffrad lösning av 15 mM 3-morfolinopropan-1-sulfonsyra (MOPS) vid pH 7,4 med ultrarent vatten (>18 MΩ motstånd). Avlägsna spårmetalljoner genom att inkubera med ett harts med hög affinitet i minst 2 timmar med efterföljande vakuumfiltrering genom ett flasktopp 0,45 μm membran.
- Lös upp en känd massaCuCl2 i ultrarent vatten för att bereda en lösning av ≈50-100 mM. Späd denna Cu(II)-lösning till buffert för att erhålla en 1,0 ml lösning med en slutlig koncentration på 1,4 mM Cu(II). Registrera den exakta volymen av den CuCl2-lösning som används.
- Lös upp eller späd peptidlösningen i buffert för att göra 450 μL av en peptidlösning på 154 μM. Se till att samma andel ytterligare ultrarent vatten från steg 3.1.2 tillsätts till peptidlösningen, vilket minskar utspädningsvärmen och ökar signal-till-brus.
- Efter beredning av proverna, se till att lösningarna har samma pH och justera vid behov därefter.
- Valfritt steg: Degas lösningarna för att minimera mikrobubblor som laddas i ITC.
- Köra experimentet
- Slå på ITC. Starta ITC-programvaran för att köra instrumentet. Vänta på den första initialiseringen, som kommer att be om att omplacera buret; följ sedan instruktionerna på skärmen.
- Ta bort locket från referenscellen. Ta bort eventuellt vatten från referenscellen och skölj tre gånger med 450 μL avgasat ultrarent vatten.
- Dra långsamt upp ultrarent vatten till 450 μL-märket för en laddningsspruta, var försiktig så att du inte inför luftbubblor i sprutan. Sätt in laddningssprutan i referenscellen tills den är ≈1 mm från botten och injicera långsamt en del av lösningen tills 150 μl återstår i laddningssprutan. Flytta laddningssprutkolven snabbt upp och ner med ≈25 μl flera gånger för att lossa eventuella bubblor på cellytan. Injicera långsamt tills kolven når 100 μL-märket på laddningssprutan och fördela därmed totalt 350 μL ultrarent vatten i referenscellen och byt ut referenscellens lock.
- Avlägsna eventuell kvarvarande lösning från provcellen och ladda med 450 μL 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) med hjälp av en laddningsspruta. Blötlägg i 10 minuter för att säkerställa att spårmetalljoner avlägsnas eftersom EDTA kommer att binda spårmetaller.
- Ta bort EDTA-lösningen (med bundna spårmetalljoner) och skölj laddningssprutan noggrant med rikliga mängder ultrarent vatten.
- Rengör ITC i enlighet med tillverkarens anvisningar och skölj provcellen med ultrarent vatten.
- Konditionera provcellen genom att skölja med 450 μl buffert minst tre gånger.
- Ta bort bufferten som konditionerar provcellen. Ladda peptidlösningen i provcellen med hjälp av laddningssprutan (följ steg 3.2.3).
- Skölj titreringssprutan med 200 μL buffrad lösning. För att göra detta, ta bort kolven och använd en mikropipett för att pipettera bufferten genom hålet högst upp på glastitreringssprutan, genom sprutan och ut nålen nedan.
- Sätt in kolven helt i titreringssprutan.
- Doppa spetsen på titreringssprutnålen i metalllösningen och dra långsamt upp kolven, vilket gör att metalllösningen fyller sprutan och resulterar i en tomrumsvolym högst upp på glasdelen av titreringssprutan. Ta bort det mesta av tomrumsvolymen genom att rotera titreringssprutan parallellt med golvet, ta bort kolven och luta glasdelen något mot golvet. Ge titreringssprutan en försiktig skakning så att lösningen rör sig till slutet av glasdelen av titreringssprutan och fyller det mesta av tomrumsvolymen, men se till att 2-3 μL tomrumsvolym kvarstår. Håll sprutan parallell med golvet, sätt tillbaka kolven.
- Håll titreringssprutan upprätt, doppa nålspetsen tillbaka i metalllösningen och tryck ner kolven tills luft upphör att komma ut ur nålen. Ladda titreringssprutan genom att långsamt dra upp kolven till strax över 50 μL-märket samtidigt som nålspetsen hålls kvar i lösningen.
- Sätt försiktigt in glasdelen av titreringssprutan i buret och skruva fast den är fingertät. När en liten mängd lösning kommer ut ur titreringssprutan på grund av kompression av kolven, använd en lätt känslig torkare för att försiktigt absorbera lösningen utan att röra nålspetsen.
- Sätt in buret med titreringsspruta i provcellen och fäst den ordentligt.
- Ställ in parametrarna på ITC-programvaran. Börja med instrumentstyrning och ställ in omrörningshastigheten (typiska omrörningshastigheter varierar från 150 till 350 rpm) och temperaturen vid vilken experimentet kommer att utföras (vanligtvis 25 °C). Ange sprutan och cellkoncentrationerna i millimolära enheter under Experimentdetaljer.
- I avsnittet Experimentmetod väljer du Inkrementell titrering. Klicka på Setup och ange 20 injektioner på 2,5 μL. Om mer upplösning krävs för att observera bindningshändelsen, öka antalet injektioner och minska volymen per injektion. Mata in tidsavståndet mellan varje injektion så att det är tillräckligt länge för att signalen ska kunna balansera och återgå till baslinjen, vanligtvis 300 s.
- Klicka på körningsknappen för att starta experimentet och ange var data ska sparas.
- När experimentet är klart, rengör provcellen och titreringssprutan.
- Kör alla experiment i minst tre exemplar för att säkerställa exakt datainsamling.
- Kör ett kontrollexperiment där metalllösningen titreras i den buffrade lösningen (i frånvaro av peptid) för att säkerställa att utspädningsvärmen från metalljonen är liten och att det inte finns några oredovisade jämvikter. Om utspädningsvärmen är stor, överväg om möjligt ett annat buffertsystem.
- Behandling av uppgifterna
- Starta ITC-analysprogramvaran och ladda datafilen för analys.
- Navigera till fliken Baslinje och inspektera termogrammet. Observera eventuell exogen värme som utvecklats eller absorberats från luftbubblor eller andra artefakter i termogrammet. Leta efter spikar som inte beror på injektion av metalllösningen.
- Se till att baslinjen som genereras av analysprogramvaran följer den del av data som finns efter injektion och jämvikt. Om den avviker använder du baslinjepivotpunkter för att justera originalplanen. Se till att integrationsregionerna inkluderar toppen som genereras från injektion av metallen, men ockludera eventuella luftbubblor eller artefakter i termogrammet som finns i steg 2. Subtrahera baslinjen från termogrammet.
Obs: Denna typ av manipulation rekommenderas först efter att flera termogram har samlats in, så experimentören vet vad som är verkliga data och vad som är en artefakt, eftersom justering av baslinjen och integrationsregionerna drastiskt kan påverka data. - Navigera till modelleringsfönstret för att börja anpassa data där analysprogramvaran visar integrerade och koncentrationsnormaliserade data för varje injektion.
- Vänsterklicka på datumet för den första injektionen för att ta bort den från anpassningsalgoritmen.
OBS: Detta är vanligt eftersom det kommer att finnas en mindre blandning mellan titranten och provcellslösningen som leder till inexakt molär dosering av den första injektionen. - I avsnittet Modeller väljer du Tom (konstant) i rullgardinsmenyn Stil , som baseras på den slutliga injektionsentalpien och kommer att subtraheras från varje datapunkt, med hänsyn till utspädningsvärmen. Välj dessutom Oberoende (eller den bästa modellen för systemet) i den andra rullgardinsmenyn Stil för att passa data.
OBS: För standard 1: 1-bindningsinteraktioner är den vanligaste modellen oberoende. - Anpassa data med de två modellerna genom att trycka på den gröna uppspelningsknappen med en Σ.
EN ANNAN programvara för att bearbeta ITC-data är SEDPHAT24. - Redogöra för alla konkurrerande jämvikter i post hoc-analys som tidigare rapporterats av Grossoehme et al. 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet var att kvantifiera och bekräfta termodynamiken för Cu(II)-bindning till C-peptid med hjälp av de komplementära teknikerna för elektronisk absorptionsspektroskopi och ITC. På grund av den elektroniska absorptionsspektroskopins robusta karaktär utfördes en direkt titrering av Cu(II) till 300 μM C-peptid (figur 1). Tillsats av 150 μM Cu (II) orsakade en omedelbar ökning av bandet vid 600 nm, tillskrivet d-d-bandet av Cu (II), och fortsatte att öka tills 300 μM Cu (II) tillsattes. Ytterligare tillägg över 300 μM Cu(II) ökade inte absorptionen av d-d-bandet, vilket indikerar mättnad och att Cu(II) binder till C-peptid i ett 1:1-komplex. På grund av den relativt höga affiniteten hos bis-Tris för bindning till Cu(II) (log K = 5,27)16, bör Cu(II)/C-peptidaffiniteten dessutom ha en nedre gräns i det mikromolära intervallet (log K > 6) för att kelatera metalljonen bort från bufferten. I detta system är exakt kvantifiering av absorptionsbanden utmanande på grund av den lilla extinktionskoefficienten.
För att kringgå d-d-bandets lilla extinktionskoefficient användes en kromoforisk ligand, fen, som beskrivits ovan. C-peptid titrerades till ≈10 μM [Cu(fen)3]2+ (figur 2A), och absorptionen från laddningsöverföringsbandet vid 265 nm minskade (figur 2B), vilket indikerar att C-peptid kunde kelatera Cu (II) från fenliganden. Vid närmare granskning behövdes en stor koncentration av C-peptid (upp till 140 μM) för att blygsamt konkurrera ut fenliganden (tabell 1). Detta är inte förvånande med tanke på de stora sekventiella bildningskonstanterna för [Cu(phen)3]2+ (9,0, 15,7 och 20,8 för log K1, β2 respektive β3)22. Analys av spektra visar att Cu(II)/C-peptidbindningsaffiniteten ligger i intervallet log K = 7,4-7,8 (tabell 1).
Guldstandarden för att mäta den fullständiga termodynamiken för en bindande interaktion är ITC. Figur 3 ger ett representativt termogram av Cu(II) titrerat till C-peptid i 15 mM MOPS, pH 7,4, vilket ger konkurrensen om Cu(II). Här användes MOPS-buffert istället för bis-Tris-buffert eftersom KCu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25, och skulle ge mindre konkurrens så att ITC kan mäta affiniteten exakt (se diskussion). Genom att mäta värmen som förbrukas eller utvecklas bland alla jämvikter ger termogrammet en sigmoid form. Initiala injektioner av Cu(II) innan peptiden är mättad resulterar i stora mängder värme jämfört med utspädningsvärmen. Skillnaden i dessa värmevärden är ΔHITC. Brytpunkten beskriver två användbara uppgifter. Den första är den bindande stökiometrin för arten i sprutan jämfört med arten i cellen (dvs Cu(II):C-peptid är 1:1). För det andra är passformens lutning vid böjpunkten direkt proportionell mot KITC. Efter insamling av data i tre exemplar och i flera buffertar utfördes en post hoc-analys20 där alla konkurrerande jämvikter redovisas (tabell 2) och den buffertoberoende termodynamiken bestäms. För Cu(II)-bindning till C-peptid, KCu(II)/C-peptid = 1 (± 1) x 108 och ΔHCu(II)/C-peptid = -8 (± 4) kJ mol-1. Utifrån dessa bestäms andra bindande termodynamiska parametrar där ΔG°Cu(II)/C-peptid = -46 (± 4) kJ mol-1 och ΔSCu(II)/C-peptid = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (se 15).
Figur 1: Övervakning av Cu(II) d-d-bandet vid tillsats av 150, 300, 450, 600, 900 och 1 500 μM Cu(II) till 300 μM C-peptid i 50 mM bis-Tris, pH 7,4. D-d-bandet av Cu(II) ökar vid 600 nm tills ett 1:1 Cu(II):C-peptidkomplex bildas. Tidigare rapporterade Magyar och Godwin att Cu(II)-bis-Tris affinitet är log K = 5,2716. Denna titrering visar att C-peptid kan konkurrera ut bufferten för att binda Cu (II) och indikerar en Cu (II) / C-peptidaffinitet i det mikromolära intervallet. Denna siffra är omtryckt med tillstånd från Stevenson et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bildning av [Cu(fen)3]2+ och representativa elektroniska absorptionsspektra som övervakar minskningen av laddningsöverföringsbandet ≈ ε vid tillsats av C-peptid. Bildningskonstanterna är 9,0, 15,7 och 20,8 för log K1, β2 respektive β3 22. (B) Representativa elektroniska absorptionsspektra som övervakar minskningen av laddningsöverföringsbandet från [Cu(fen)3]2+ som C-peptidkelater Cu(II). Titreringen utfördes i 50 mM bis-Tris, pH 7,4. Dataanalys visas i tabell 1. Denna siffra är omtryckt med tillstånd från Stevenson et al.14. Förkortning: MLCT = metall till ligand laddningsöverföring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa termogram av Cu(II) titrerade i C-peptid och buffert. Data är anpassade till en enplatsmodell med följande parametrar: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3,4 ± 0,2 kJ mol-1. B) En representativ kontrolltitrering på 1,4 mM Cu(II) till 15 mM MOPS, pH 7,4, i avsaknad av C-peptid som inte visar något bindande termogram som ses på panel A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| [C-peptid] | En265 | [Cu(fen)3] 2+ | [fen] gratis | [C-peptid] gratis | [Cu(II)/C-peptid] | Kex (x108) | KdCu(II)/C-peptid | log KdCu(II)/C-peptid | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | Nd | Nd | Nd | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1.84E-08 | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2.73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3.23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3.26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3.48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3.63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3.47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3.43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3.40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3.19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2.93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2.69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2.58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2.29E-08 | 7.64 | |
| Sortiment | 7.4-7.8 | ||||||||
Tabell 1: Representativa beräkningar för koncentrationerna av arter i lösning från figur 2B. Alla koncentrationer är i mikromolar. Denna tabell är omtryckt med tillstånd från Stevenson et al.14.
| Equlibria | n | ΔH (kJ mol-1) | n × ΔH (kJ mol-1) |
| Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS | 1 | 5.4 | 5.44 |
| MOPS + H+ → MOPS-H+ | 0.097 | −21,0 | −2,04 |
| Cu(II) + C-peptid-H+ → Cu(II)/C-peptid + H+ | 1 | X | X |
| ΔHITC = Χ + 3,40 | |||
| Χ = ΔHITC − 3,40 | |||
| Χ = ΔHCu(II)/C-peptid = −6,8 kJ mol-1 |
Tabell 2: Post hoc-analys för att bestämma ΔHCu(II)/C-peptid. Som visas i figur 3 titrerades 1,4 mM Cu(II) till 154 μM C-peptid i 15 mM MOPS, pH 7,4, i tre exemplar. Efter att ha redovisat alla konkurrerande jämvikter som visas i tabellen visar sig ΔHCu(II)/C-peptid vara −8,66 kJ mol-1. Antalet protoner som förskjuts från C-peptid av Cu (II) bestäms från lutningen av (ΔHITC + ΔHCu (II) -Buffer) vs ΔHBuffer-H där data samlas in i flera buffertar. Alla entalpivärden finns i NIST25 eller bestäms någon annanstans i litteratur15. Alla konkurrerande jämvikter redovisas enligt beskrivningen av Grossoehme et al.20 Denna siffra trycks om med tillstånd från Stevenson et al.15.
Tilläggsfil: Relevanta ekvationer som används i protokollavsnittet och ytterligare parametrar för elektronisk absorptionsspektrofotometer och ITC-inställning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel ger en robust metod för att kvantifiera affiniteten och termodynamiken hos Cu(II)-bindning till peptider. Komplex med Cu(II) är idealiska för att övervaka d-d-absorptionsbandet på metallplatsen på grund av dess d 9-elektronkonfiguration. Även om extinktionskoefficienten är liten, vilket kräver större koncentrationer av komplexet för att ge en tillförlitlig signal, kan titreringar av Cu (II) till peptid snabbt ge insikt i bindningsstökiometrin och ungefärlig bindningsaffinitet. Det kan dock vara utmanande att urskilja en skillnad i spektra om metallen koordineras av liknande atomer och geometrier från både buffert och peptid. För att bestämma bindningsaffiniteten kvantitativt används ofta kromoforiska ligander såsom fen på grund av deras symmetri-tillåtna laddningsöverföringar med metalljoner21. Genom att skapa en tävling mellan en kromoforisk ligand och en icke-kromofor peptid och genom att känna till metallens affinitet till liganden kan metall-peptidaffiniteten direkt bestämmas. Ytterligare termodynamisk analys med elektronisk absorptionsspektroskopi är utmanande. För att kvantifiera bindningsentalpi med hjälp av en teknik som UV-Vis-spektroskopi måste bindningsaffiniteten bestämmas vid flera temperaturer och en van't Hoff-analys utföras. Denna analys förutsätter att den specifika bindningsvärmen är noll, vilket sällan är sant och därmed endast ger en uppskattning av bindningsentalpi20.
Isotermisk titreringskalorimetri är bättre lämpad för att belysa en mer fullständig översikt över termodynamiken i metall-peptidinteraktioner. I denna teknik titreras en metalljon i peptidlösningen och värmen från olika jämvikter mäts direkt. Eftersom experimentet utförs vid konstant tryck är värmen som mäts av ITC lika med entalpi. ITC kan övervinna några av begränsningarna med elektronisk absorptionsspektroskopi som att studera spektroskopiskt tysta metalljoner och inte behöva göra antagandena som gjorts i van't Hoff-analysen. Men ibland genererar reaktionerna som äger rum i ITC liten eller ingen värme och observeras därför inte. Detta kan kringgås genom antingen ökande koncentrationer av metall och peptid eller genom att använda en annan buffert med en annan entalpi av protonering. Det senare är särskilt användbart om metalljonen förskjuter flera protoner vid bindning till peptiden. Båda teknikerna - ITC och elektronisk absorptionsspektroskopi - ger dock ortogonala metoder för att studera samma system och komplettera varandra väl.
Det finns många utmanande aspekter i båda teknikerna när man studerar metalljoner som binder till peptider. Många metalljoner är olösliga eller sparsamt lösliga i vatten. Detta förvärras ytterligare av utfällning av metalljonen när den tillsätts till buffert. I ITC kan detta manifesteras av en långsam, gradvis förskjutning av baslinjen och stora mängder värme som genereras när metallen injiceras. Detta indikerar stora värden av utspädningsvärme även efter att peptiden skulle mättas av metalljon. I elektronisk absorptionsspektroskopi manifesterar sig metalljonutfällning genom ökad absorption vid lägre våglängder och liknar en bred topp centrerad i UV-regionen. I båda teknikerna måste försöksledaren se till att metalljonen är löslig under de valda förhållandena (t.ex. buffert, pH, temperatur, koncentration). En annan begränsning för båda metoderna kan visa sig genom begreppet tilläggsordning. I vissa fall kan ett metallkomplex som bildas vara labilt, medan tillsats av samma reagens i en annan ordning skulle göra en annan mellanliggande art inert. Denna illustration av kinetisk kontra termodynamisk kontroll hindrar noggrann analys av alla konkurrerande jämvikter.
Både ITC och elektronisk absorptionsspektroskopi förlitar sig på tävlingar mellan peptiden och antingen buffert eller ligand för att binda metalljonen. Här introduceras c-värdet, vilket hjälper till att identifiera om KITC kan bestämmas exakt av anpassningsalgoritmen. C-värdet definieras i Supplemental File, Eq (7)20, där n är stökiometri, KITC är den skenbara bindningsaffiniteten och [provcellen] är koncentrationen av arten i provcellen. När c-värdet är mellan 1 och 1 000 är den bestämda KITC korrekt. C-värden under 1 får dock endast ge en övre gräns för KITC, medan c-värden över 1 000 endast ger en nedre gräns20. Detta är värdet av att samla in data från komplementära tekniker: om något saknas i en teknik på grund av dess begränsningar kan det fångas i sin komplementära teknik. I dessa experiment, om konkurrensen är mycket gynnad för en art (dvs peptidens metalljonaffinitet är mycket större än buffertens affinitet), kommer jämvikten att flyttas, vilket gör det svårt att tolka. Detta visas också i detalj av Kocyla et al.23. För att komma runt denna utmaning används ofta introduktion av eller ersättning med en annan konkurrerande ligand eller att välja en annan buffert för att öka konkurrensen mellan ligand och peptid för exakt kvantifiering. Detta beror på att skillnaden mellan metallbuffert (eller metall-ligand) och metall-peptidaffiniteter skulle göra det möjligt för c-värdet att falla inom fönstret 1 till 1 000. Det bör dock noteras att användningen av en konkurrerande ligand eller annan buffert för kvantitativ analys kräver att de termodynamiska parametrarna för metall-liganden eller metallbuffertkomplexet är kända eller kan bestämmas på annat sätt.
Slutligen kan det vara utmanande att exakt kvantifiera peptidkoncentrationen. Några vanliga sätt att kvantifiera peptidkoncentrationer är att mäta specifika aminosyror och relatera mängden av dessa aminosyror till peptidens sekvens. Till exempel kan elektronisk absorptionsspektroskopi mäta aromatiska rester som tyrosin, Ellmans reagens kan kvantifiera antalet fria tioler26 och Bradford-analyser ger en indikation på hur många rester som finns27. Tyvärr har peptider som den som används i denna studie inte aromatiska rester eller fria tioler, och Bradford-analyser utgör utmaningar när man jämför standarder från massiva proteiner med den lilla peptiden av intresse. Istället bestämdes peptidkoncentrationen av torr massa. Även om det inte är idealiskt och benäget för koncentrationer som är små överskattningar av peptidkoncentrationen (eftersom de uppenbara massmätningarna sannolikt är högre än faktiska peptidmassor på grund av närvaron av salter), behandlades alla alikvoter för mätning på samma sätt, vilket möjliggör mer exakta jämförelser. I de spektroskopiska studierna, om koncentrationen av fri peptid är lägre än förväntat, representerar den beräknade bindningsaffiniteten en lägre gräns (Supplemental File, Eq (5) och Eq (6)). Det finns utmaningar förknippade med båda teknikerna som visas, men med litteraturen som vägledning kan många övervinnas.
Det experimentella tillvägagångssättet som beskrivs här möjliggör noggrann kvantifiering av metall-peptidbindande termodynamik. Både ITC och elektronisk absorptionsspektroskopi är ortogonala och ger insikt i bindningsaffiniteten, men ITC möjliggör direkt entalpikvantifiering. När dessa termodynamiker har kvantifierats kan man dra slutsatsen om dessa metallpeptidkomplex kan bildas under fysiologiska förhållanden. När förståelsen för fysiologiskt metalljonflöde växer kan förutsägelsen om bindningsaffiniteten är tillräckligt stark för komplex bildning in vivo göras. Dessutom kan forskaren göra förutsägelser om tävlingar mellan flera metalljoner för samma peptid eller flera peptider för samma metalljon. Genom att titta på dessa tävlingar mellan metalljon och peptider kan forskaren börja förstå vad som bidrar till bindningsaffiniteten hos metallpeptidkomplexet genom att analysera den fria energin till entalpi- och entropibidrag. Termodynamik är en integrerad del av att uppskatta det dynamiska samspelet mellan metalljoner och peptider, och ITC och elektronisk absorptionsspektroskopi tillhandahåller handtag för att förhöra dessa system. Metoderna som beskrivs här kan utökas och användas för att studera andra metalljonbindande interaktioner med makromolekyler och kan ha konsekvenser i fysiologiska processer, läkemedelsdesign och mer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
SC tackar Whitehead Summer Research Fellowship. MJS tackar Startup Funds och Faculty Development Fund vid University of San Francisco. MCH erkänner finansiering från National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) och National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
- Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
- Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
- Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
- Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
- Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
- Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
- García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
- Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
- Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
- Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
- Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
- Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
- Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
- Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
- Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
- Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
- Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
- Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
- Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
- Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
- Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
- Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
- Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
- Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
- NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
- Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
