Summary
この記事では、電子吸収分光法と等温滴定熱量測定を使用して、ペプチドおよびタンパク質に結合するCu(II)の熱力学をプローブおよび定量することに焦点を当てます。
Abstract
銅(II)は、生体系に不可欠な金属であり、相互作用する生体分子に独自の化学的特性を与えます。様々なペプチドに直接結合し、構造の媒介から電子移動特性、触媒機能の付与に至るまで、必要かつ病理学的役割を果たすことが報告されている。これらのCu(II)-ペプチド複合体の結合親和性と熱力学を インビトロで 定量化することで、結合の熱力学的駆動力、ペプチドの異なる金属イオン間またはCu(II)の異なるペプチド間の潜在的な競合、およびCu(II)-ペプチド複合体の インビボでの有病率についての洞察が得られます。しかし、結合熱力学を定量化することは、滴定実験内のすべての競合平衡を説明することを含む無数の要因のために、特にペプチド、dブロック金属イオン、およびそれらの相互作用を表す離散的な分光ハンドルが欠落している場合には困難であり得る。
ここでは、Cu(II)-ペプチド熱力学の正確な定量化のための堅牢な一連の実験が提供されています。この記事では、Cu(II)に必要な分光ハンドルを提供するために、発色性リガンドの存在下および非存在下での電子吸収分光法の使用と、ラベルフリーの等温滴定熱量測定の使用に焦点を当てています。両方の実験技術において、すべての競合する平衡を説明するプロセスが記述されている。本稿の焦点はCu(II)にあるが、記載された一連の実験はCu(II)-ペプチド相互作用を超えて適用することができ、生理学的に関連する条件下で他の金属ペプチド系を正確に定量するためのフレームワークを提供することができる。
Introduction
生物学は、生命が周囲の環境に適応し、生き残るために必要な金属イオンの多様な化学を利用するように進化してきました。タンパク質の推定25%〜50%が構造および機能1に金属イオンを使用する。金属イオンの特定の役割および酸化還元状態は、それを調整する生物学的リガンドの組成および幾何学的形状に直接関係する。さらに、Cu(II)などの酸化還元活性金属イオンは、フェントン様化学を介して酸化剤と相互作用して活性酸素種(ROS)2,3,4を形成しないように、厳密に調整する必要があります。その生化学を駆動する結合様式と親和性を理解することは、金属イオンの生物学的役割を解明するのに役立つはずです。
金属とペプチドの結合相互作用を研究するために多くの技術が使用されています。これらは主に分光学的手法ですが、アミロイドベータ(Aβ)5の断片とのCu(II)相互作用から見られるように、分子動力学を用いたコンピュータシミュレーションも含まれます。多くの大学がアクセスできる広く使用されている分光技術は、核磁気共鳴(NMR)です。Cu(II)の常磁性の性質を利用して、Gaggelliらは、近くの原子核6の緩和を通じて、金属イオンが小柄な上でどこで結合するかを示すことができた。電子常磁性共鳴(EPR)は、常磁性金属イオン結合7の位置および様式をプローブするために利用することもできる。円二色性(CD)などの他の分光技術は、トリペプチド系8などの系におけるCu(II)に関する配位を記述することができ、質量分析は化学量論および金属イオンが断片化パターン9,10を介してどの残基に配位されるかを示すことができる。
NMRなどのこれらの技術のいくつかは、標識フリーですが、大量のペプチドを必要とし、研究の課題を提起します。蛍光分光法と呼ばれる別の一般的な技術は、チロシンまたはトリプトファンの位置をCu(II)11,12からの消光に関連付けるために利用されている。同様に、この技術は、Cu(II)結合13の結果としての構造変化を示すことができる。しかし、これらの金属ペプチド結合研究の課題は、すべての系が持っているわけではないチロシンなどの発色性アミノ酸をプローブすること、金属イオンが古典的なモデルの下で結合すること、およびこの技術が生理学的条件下では助長されない可能性があることである。実際、そのような発色性アミノ酸を含まないか、または古典モデルの下で結合しないいくつかのペプチドが出現しており、これらの技術の使用を妨げている14、15。この記事では、生理学的に関連する条件下でこれらのシナリオで結合特性を評価するためのアプローチについて詳しく説明します。
生物学的リガンドは、ヒスチジン上のイミダゾール環などの金属イオン結合に影響を与え得る異なるプロトン化状態を採用し得る。pHが一貫して維持されていない場合、結果は複雑または矛盾する可能性があります。このため、バッファーは金属-タンパク質/ペプチド相互作用の研究において不可欠な成分です。しかしながら、多くの緩衝液は、金属イオン16、17と良好に相互作用することが示されている。目的の生体分子と競合することに加えて、緩衝液は、ペプチドまたはタンパク質の配位原子と区別することが困難な類似の配位原子を有し得る。本研究では、Cu(II)-ペプチド相互作用を研究するための2つの補完的手法として、緩衝液の選択に関する特別な考慮事項として、電子吸収分光法と等温滴定熱量測定(ITC)に焦点を当てています。
電子吸収分光法は、金属結合相互作用を研究するための迅速で広くアクセス可能な技術です。紫外線(UV)または可視波長の光を照射すると、金属中心d-dバンドの吸収につながる可能性があり、配位子の分類、金属形状、および見かけ上の結合親和性に関する貴重な情報を提供します18,19。これらの複合体について、金属イオンをタンパク質またはペプチド溶液に直接滴定することで、結合化学量論および明らかな結合親和性を定量化することができる。d5またはd10電子配置などのいくつかの場合において、錯体は光を吸収しない(すなわち、分光学的に静かである)。これらの分光学的に静かな遷移金属錯体では、金属イオンに配位すると検出可能な電荷移動バンドを生成する競合する配位子を使用することによって、これらの制限を回避することができる。いずれの場合も、このアプローチは化学量論と明らかな結合親和性の定量化のみに限定され、近似なしでは結合エンタルピーに関する洞察は提供されません。
電子吸収分光法から得られた情報を補完するITCは、結合エンタルピー20の直接的かつ厳密な定量化のための魅力的な技術である。ITCは、結合事象中に放出または消費される熱を直接測定し、滴定は一定の圧力で行われるため、測定される熱はすべての平衡のエンタルピー(ΔHITC)です。さらに、結合事象(n)および見かけ上の結合親和性(KITC)の化学量論が定量化される。これらのパラメータから、自由エネルギー(ΔG ITC)およびエントロピー(ΔSITC)が決定され、結合事象の熱力学的スナップショットを提供する。ITCは光吸収に依存しないため、分光学的にサイレントな種、例えばd5またはd10金属イオン錯体にとって理想的な技術である。しかし、熱量測定は熱を測定するため、比類のないバッファーシステムや考慮されていない平衡は、金属イオン結合熱力学を正確に決定するための分析に悪影響を及ぼす可能性があり、これらの要因に対処するために細心の注意を払わなければなりません20。適切な厳密さで実施すれば、ITCは金属-タンパク質/ペプチド複合体の熱力学を決定するための堅牢な技術です。
ここでは、発色学的に静かな銅結合ペプチドであるC-ペプチドを使用して、2つの技術の相補的な使用を実証します。C-ペプチドは、インスリン成熟中に形成される31残基の切断産物(EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ)である。発色性残基を欠いているが、Cu(II)と生理学的に関連する親和性で結合することが示されている14,15。Cu(II)結合部位は、グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩の側鎖、ならびにペプチド14,15のN末端からなる。これらの配位原子は、一般的に使用される多くの緩衝系の原子とよく似ている。ここでは、C-ペプチドへのCu(II)結合熱力学の定量における電子吸収分光法およびITCにおけるd-dおよび電荷移動バンドのタンデム使用が示されている。C-ペプチドへのCu(II)結合を研究することからのアプローチは、他の金属イオンおよびタンパク質/ペプチド系に適用することができる。
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Protocol
1.電子吸収分光法:バッファー競合による直接滴定
- サンプル調製
- 超純水を用いてpH7.4で50mM 2-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール(ビストリス)の緩衝溶液を調製する(>18MΩ耐性)。その後のろ過で少なくとも2時間、高親和性樹脂とインキュベートすることにより、微量金属イオンを除去します。
- 既知量のペプチドを無金属緩衝液に溶解または希釈する。
注:吸光係数21の小さいd-dバンドをモニタリングする場合は、高濃度のペプチドを使用する必要があります。ここで、緩衝溶液中のCペプチドの最終濃度は300μMであった(体積はキュベットのサイズに依存する)。C-ペプチドは固相ペプチド合成によって合成され、文献14の他の箇所で詳述されている。 - 既知の質量のCuCl2 を超純水に溶解し、10〜15mMで溶液を作製する。
注:沈殿を防ぐために、最初に金属塩を非緩衝水に溶解させることが重要です。他のCu(II)塩を用いてもよいが、アニオンが弱く配位するように注意しなければならない。
- 実験の実行
- 電子吸収分光光度計の電源を入れ、使用前に〜15〜20分間ウォームアップさせます。分光光度計ソフトウェアを起動し、スキャン範囲(200-900 nm)、スキャンレート(200 nm/s)、ダブルビームベースライン補正などのパラメータを設定します(その他のパラメータは 補足ファイルにリストされています)。
- ビーム経路にキュベットやサンプルがないベースラインを収集します。
- ダブルビーム分光光度計でマッチした2つのキュベットを使用して、1つのキュベットに115μLの超純水を、もう1つのキュベットに115μLのペプチドサンプルを負荷します。キュベットに気泡がないことを確認します。気泡は信号に干渉するためです。
- 参照ビームに超純水を入れたキュベットを、サンプルビームにペプチドを入れたキュベットを置きます。
- 無金属(アポ)ペプチドの吸収スペクトルを収集します。
- 化学量論的量以下(0.5当量、150μM)のCu(II)溶液をペプチドサンプルとともにキュベットに加えます。添加したCu(II)の容量が3μL未満であることを確認し、後で分析するために容量を記録します。
- 静かに上下にピペットで泡の発生を避けながら溶液を混合します。溶液を反応させて5分間平衡化し、吸収スペクトルを記録する。
- ステップ 1.2.6 と同様に Cu(II) アリコートをペプチド溶液に繰り返し添加し、1.0、1.5、2.0、3.0、および 5.0 (または合計 300、450、600、900、および 1,500 μM) の等価物を求めます。追加したCu(II)の総体積とキュベットの総体積を必ず記録してください。
メモ: より多くの解像度が必要な場合は、同等の間隔を狭めます。 - サンプルキュベットを取り外し、製造元の指示に従って徹底的に清掃します。
- ペプチドを含まない緩衝溶液を加え、吸収スペクトルを記録する。ステップ1.2.5-1.2.8のようにCu(II)アリコートの添加を繰り返し、各Cu(II)相当の吸収スペクトルを記録する。
- すべてのスペクトルを処理用のcsvファイルとしてエクスポートします。製造元の指示に従ってキュベットを徹底的に清掃し、分光光度計の電源を切ります。
- データの処理
- スプレッドシートプログラムにすべてのスペクトルをロードします。
- バッファーのみ(0 μM Cu(II))スペクトルを他のすべてのスペクトルから減算して、バッファー自体から吸光度の特徴を削除します。
- Cu(II)溶液の添加による希釈を考慮して、各スペクトルを正規化します(ステップ1.2.6)。正規化の例については、 補足ファイルEq (1)14 を参照してください。ここで、vinitial はキュベットに添加されたペプチドの体積(115 μL)、v Cu(II)はステップ1.2.6で添加されたCu(II) 溶液の体積、Absバッファー減算スペクトル はステップ1.2.7で得られたデータです。
- すべてのスペクトルをまとめてグラフ化して、変化領域を特定します。
注:Cu(II)錯体の典型的なd-dバンドの範囲は500〜750nmです。この分光光度滴定は、八面体幾何学21におけるラポルテ禁断遷移であるd−dバンドからの小さな吸光係数のために困難であり得る。吸光度が弱すぎる場合、別のアプローチは、Cu(II)に結合する際に電荷移動バンドをもたらす発色性リガンドを利用することである(セクション2を参照)。
2. 電子吸収分光法:発色性リガンドとのペプチド競合
- サンプル調製
- 1,10−フェナントロリン(フェン)を超純水に溶解し、〜1mMの最終濃度を得た。
- ペプチド(工程1.1.2)およびCu(II)(工程1.1.3)についてセクション1.1で説明したサンプル調製に加えて、緩衝液中の10μMのCu(II)および40μMのフェン溶液([Cu(phen)3]2+)を調製する。ボリュームがキュベットに充填されていることを確認します。
- 実験の実行
- 手順1.2.1および1.2.2のように電子吸収分光光度計を起動し、スキャン範囲を200-400 nmに設定します。
- マッチした2つのキュベットに、1つのキュベットに115μLの超純水を、もう1つのキュベットに115μLの[Cu(phen)3]2+ 溶液をロードします。参照ビームに水を入れたキュベットを、サンプルビームに[Cu(phen)3]2+ 溶液を入れたキュベットを置きます。
- 金属配位子錯体の吸収スペクトルを収集する。
- 化学量論量(≈1当量、≈10μM)のペプチドを[Cu(phen)3]2+ 溶液に加える。軽く上下にピペットで混ぜ合わせますが、気泡が入らないように注意してください。将来の分析のために添加されたペプチドの量を記録します。
注:115 μLを保持するキュベットを使用して、3.83 μLの300 μMペプチドを加えると、最終ペプチド濃度9.7 μMが得られます。 - 平衡に達するために溶液を5分間インキュベートする。吸収スペクトルを記録します。
注:金属ペプチドと金属リガンドの結合親和性が類似している場合、添加されるペプチドの濃度は大きく過剰である必要があります。正規化のために添加されたペプチドの総量を必ず考慮してください。 - ペプチドアリコートを [Cu(phen)3]2+ 溶液に繰り返し添加し、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、22、および 26 の近似等価物を求めます。希釈濃度が決定できるように添加したペプチドの量を記録する。
- サンプルを取り出し、製造元の指示に従ってキュベットを徹底的に清掃します。バッファーのスペクトルを収集します。バッファー中の50 μMペプチドのスペクトルを収集します。
- すべてのデータを処理用のcsvファイルとしてエクスポートし、製造元の指示に従ってキュベットをクリーニングします。
- データの処理
- スペクトルをスプレッドシートプログラムにロードし、他のスペクトルからバッファスペクトルを減算します。
- 補足ファイルEq (2)14に従ってスペクトルを正規化します。
- 265nmにおける[Cu(phen)3]2+(εmax=90,000 M-1 cm-1)22における[Cu(phen)3]2+の吸光係数を用いて、ペプチドを添加するたびに[Cu(phen)3]2+の濃度を求める。
- ペプチドを添加するたびに、[Cu(phen)3]2+の初期濃度(0 μMペプチド時)から、ステップ2.3.2で決定した[Cu(phen)3]2+の残存濃度を差し引いて、Cu(II)-ペプチド複合体の濃度を決定します。
- 遊離フェンリガンドの濃度は、補足ファイルの式(3)14により計算する。
- 補足ファイル、式(4)14を使用して遊離ペプチドの濃度を計算し、ここで、[ペプチド]stockはキュベットに滴定された希釈されていないペプチドを表し、V1は添加されたストックペプチドの体積を表し、V2はキュベットの全体積であり、[Cu2+-ペプチド]はステップ2.3.4で決定される。
- 実験的結合親和性(Kex)は、補足ファイル23のEq(5)を用いて計算する。
- 補足ファイルのEq (6)23によってCu(II)-ペプチドの解離定数をKexに関連付け、ここでKd,Cu(II)-phen = 1.0 × 10-9(22参照)。決定されたすべての解離定数から平均と標準偏差を求めます。
注:フェン:Cu(II)、[Cu(phen)3]2+、[Cu(phen)2]2+、および[Cu(phen)]2+の4:1の比率では、溶液中に存在し、ペプチドは種([Cu(phen)]2+)から離れてCu(II)をキレートし、最も弱い結合22でキレートします。
3. 等温滴定熱量測定
- サンプル調製
- 超純水を用いてpH7.4で15mM 3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)の緩衝溶液を調製する(>18MΩ耐性)。高親和性樹脂と少なくとも2時間インキュベートし、その後ボトルトップ0.45μm膜を通る真空ろ過を行うことで、微量金属イオンを除去します。
- 既知の質量のCuCl2 を超純水に溶解し、≈50〜100mMの溶液を調製した。このCu(II)溶液を緩衝液に希釈し、終濃度1.4mM Cu(II)の1.0mL溶液を得た。使用したCuCl2 溶液の正確な体積を記録する。
- ペプチド溶液を緩衝液に溶解または希釈して、450 μLの154 μMペプチド溶液を作ります。ステップ3.1.2からの追加の超純水を同じ割合でペプチド溶液に添加することを確認し、希釈熱を低減し、シグナル対ノイズを増加させる。
- サンプルの調製後、溶液が同じpHにあることを確認し、必要に応じて調整します。
- オプションのステップ:ITCにロードされるマイクロバブルを最小限に抑えるために、溶液を脱気します。
- 実験の実行
- ITC をオンにします。ITCソフトウェアを起動して計測器を実行します。最初の初期化を待ってから、ビュレットをリホームするように要求します。次に、画面の指示に従います。
- 参照セルからカバーを取り外します。基準セルから水を取り除き、450 μLの脱気超純水で3回すすいでください。
- ローディングシリンジの450μLマークに超純水をゆっくりと吸い上げ、シリンジに気泡を入らないように注意します。ローディングシリンジを底部から≈1mmになるまで基準セルに挿入し、150μLがローディングシリンジに残るまで溶液の一部をゆっくりと注入する。ローディングシリンジプランジャーを≈25 μLずつ素早く上下に数回動かして、細胞表面の気泡を取り除きます。プランジャーがローディングシリンジの100 μLマークに達するまでゆっくりと注入し、それによって合計350 μLの超純水を基準セルに分配し、基準細胞カバーを交換する。
- サンプルセルから残留溶液を取り出し、ローディングシリンジを使用して450 μLの10 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を負荷します。EDTAが微量金属と結合するため、微量金属イオンが除去されるように10分間浸します。
- EDTA溶液(結合した微量金属イオンを含む)を取り出し、大量の超純水でローディングシリンジを十分にすすいでください。
- 製造元の指示に従ってITCを洗浄し、サンプルセルを超純水ですすいでください。
- 450 μLのバッファーで少なくとも3回リンスすることにより、サンプル細胞をコンディショニングします。
- サンプルセルをコンディショニングしているバッファーを削除します。ローディングシリンジを使用してペプチド溶液をサンプルセルにロードします(ステップ3.2.3に従います)。
- 滴定シリンジを200μLの緩衝溶液ですすいでください。これを行うには、プランジャーを取り外し、マイクロピペットを使用して、ガラス滴定シリンジの上部にある穴、シリンジ、および下の針を通してバッファーをピペットします。
- プランジャーを滴定シリンジに完全に挿入します。
- 滴定シリンジ針の先端を金属溶液に浸し、プランジャーをゆっくりと引き上げて、金属溶液がシリンジを満たし、滴定シリンジのガラス部分の上部に空隙体積をもたらす。滴定シリンジを床に平行に回転させて空隙体積の大部分を取り除き、プランジャーを取り外し、ガラス部分を床に向かってわずかに傾ける。溶液が滴定シリンジのガラス部分の端に移動し、空隙体積の大部分を満たすように滴定シリンジを穏やかに振るが、2〜3μLの空隙容積が残っていることを確認する。シリンジを床に平行に保ちながら、プランジャーを挿入し直します。
- 滴定シリンジを直立させ、針の先端を金属溶液に浸し直し、空気が針から出なくなるまでプランジャーを押し下げます。針の先端を溶液中に保ちながら、プランジャーを50 μLマークのすぐ上までゆっくりと引き上げて、滴定シリンジに負荷をかけます。
- 滴定シリンジのガラス部分を慎重にビュレットに挿入し、指がきつく締められるまでねじ込みます。プランジャーの圧縮により滴定シリンジから少量の溶液が出た場合は、軽量の繊細なワイパーを使用して、針の先端に触れることなく溶液を慎重に吸収します。
- 滴定シリンジ付きのビュレットをサンプルセルに挿入し、しっかりと固定します。
- ITCソフトウェアのパラメータを設定します。機器制御から始めて、攪拌速度(典型的な攪拌速度は150〜350 RPMの範囲)と実験を行う温度(通常25°C)を設定します。シリンジと細胞濃度をミリモル単位で「実験の詳細」に入力します。
- [実験方法]セクションで、[増分滴定]を選択します。「セットアップ」をクリックし、2.5 μL の注入を 20 回指定します。結合事象を観察するためにより多くの分解能が必要な場合は、注射回数を増やし、注射あたりの体積を減少させる。各注入間の時間間隔を入力して、信号が平衡化してベースラインに戻るのに十分な長さ(通常は300秒)になるようにします。
- [ 実行 ] ボタンをクリックして実験を開始し、データの保存場所を指定します。
- 実験の完了時に、試料細胞および滴定シリンジを洗浄する。
- すべての実験を少なくとも 3 回で実行して、正確なデータ収集を確保します。
- 金属溶液を緩衝溶液(ペプチドの非存在下)に滴定して、金属イオンからの希釈熱が小さく、考慮されていない平衡がないことを確認する対照実験を実行します。希釈熱が大きい場合は、可能であれば別のバッファーシステムを検討してください。
- データの処理
- ITC 解析ソフトウェアを起動し、解析用のデータファイルをロードします。
- [ ベースライン] タブに移動し、サーモグラムを調べます。サーモグラム内の気泡やその他のアーチファクトから発生または吸収された外因性熱に注意してください。金属溶液の注入によるものではないスパイクを探します。
- 解析ソフトウェアによって生成されたベースラインが、注入および平衡化後のデータの一部に従っていることを確認します。逸脱した場合は、「 ベースライン」ピボットポイント を使用してベースラインを調整します。 積分領域 には金属の注入から生成されたピークが含まれていることを確認しますが、手順2で見つかったサーモグラム内の気泡やアーチファクトは隠します。サーモグラムからベースラインを減算します。
注: このタイプの操作は、複数のサーモグラムが収集された後にのみ推奨されるため、ベースラインと 統合領域 を調整するとデータに大きく影響する可能性があるため、実験者は実際のデータとアーティファクトが何であるかを把握できます。 - [ モデリング] ウィンドウに移動して、分析ソフトウェアが各注射の統合および濃度正規化されたデータを表示するデータの適合を開始します。
- 最初の射出のデータムを左クリックして、継ぎ手アルゴリズムから除去します。
注:滴定液とサンプル細胞溶液の間にはわずかな混合があり、最初の注射の不正確なモル分注につながるため、これは一般的です。 - [モデル]セクションで、[スタイル]ドロップダウンメニューの[空白(定数)]を選択します。これは、最終的な射出エンタルピーに基づいており、希釈熱を考慮してすべてのデータポイントから差し引かれます。さらに、2 番目の [スタイル] ドロップダウン メニューで [独立] (またはシステムに最適なモデル) を選択して、データを適合させます。
メモ: 標準の 1:1 バインディング相互作用の場合、最も一般的なモデルは独立モデルです。 - 2つのモデルを使用してデータを当てはめるには、緑色の 再生 ボタンをΣで押します。
メモ: ITC データを処理するもう 1 つのソフトウェアは、SEDPHAT24 です。 - Grossoehmeらによって以前に報告された事後分析におけるすべての競合する均衡を説明する。20。
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Representative Results
目標は、電子吸収分光法とITCの相補的技術を使用して、Cu(II)とC-ペプチドに結合する熱力学を定量化し、裏付けることでした。電子吸収分光法の堅牢な性質により、Cu(II)を300μM Cペプチドに直接滴定しました(図1)。150μMのCu(II)を添加すると、Cu(II)のd-dバンドに起因する600nmでのバンドの即時増加が起こり、300μMのCu(II)が添加されるまで増加し続けた。さらに300μMを超えるCu(II)を添加すると、d-dバンドの吸収は増加せず、飽和状態を示し、Cu(II)は1:1複合体中のC-ペプチドに結合することが示された。さらに、Cu(II)への結合に対するビストリスの親和性が比較的高いため(log K = 5.27)16、Cu(II)/C-ペプチド親和性は、金属イオンを緩衝液から遠ざけてキレートするためにマイクロモル範囲(logK >6)の下限を持つべきである。このシステムでは、吸光係数が小さいため、吸収バンドの正確な定量化が困難です。
d−dバンドの小さな吸光係数を回避するために、発色性リガンドであるphenを、上記のように使用した。C-ペプチドを≈10 μM [Cu(phen)3]2+に滴定すると(図2A)、265 nmの電荷移動バンドからの吸収が減少し(図2B)、C-ペプチドがフェンリガンドからCu(II)をキレートできたことが示された。詳しく調べると、フェンリガンドを適度に凌駕するには、高濃度のCペプチド(最大140 μM)が必要でした(表1)。これは、[Cu(phen)3]2+ (対数 K 1、β 2、および β3 のそれぞれ 9.0、15.7、および 20.8) 22 の大きな逐次形成定数を考えると驚くべきことではありません。スペクトルの分析は、Cu(II)/C-ペプチド結合親和性がlog K = 7.4-7.8の範囲にあることを示している(表1)。
結合相互作用の完全な熱力学を測定するゴールドスタンダードはITCです。図3は、15mM MOPS、pH 7.4でCペプチドに滴定されたCu(II)の代表的なサーモグラムを提供し、Cu(II)の競合を提供します。ここでは、KCU(II)-MOPSがKCu(II)-bis-Tris 16,25を<し、ITCが親和性を正確に測定できるように競争が少なくなるため、bis-Trisバッファの代わりにMOPSバッファを使用しました(議論を参照)。すべての平衡間で消費または進化した熱を測定することによって、サーモグラムはシグモイド形状を提供する。ペプチドが飽和する前にCu(II)を最初に注入すると、希釈熱と比較して大量の熱が発生します。これらの熱値の差はΔHITCである。変曲点は、2 つの有用な情報を記述します。1つ目は、細胞内の種と比較したシリンジ内の種の結合化学量論です(すなわち、Cu(II):C-ペプチドは1:1です)。第2に、変曲点における適合の傾きは、KITCに正比例する。三連および複数のバッファーでデータを収集した後、すべての競合平衡が考慮される事後分析20が実行され(表2)、バッファーに依存しない熱力学が決定されます。C-ペプチドへのCu(II)結合の場合、K Cu(ii)/C-ペプチド = 1 (± 1) x 10 8 および ΔH Cu(II)/C-ペプチド = -8 (± 4) kJmol-1 である。これらから、ΔG°Cu(II)/C-ペプチド=-46(±4)kJ mol-1およびΔS Cu(II)/C-ペプチド=120(±10)J mol-1 K-1(15参照)の他の結合熱力学的パラメータが決定される。
図1:50 mM ビストリス、pH 7.4 で 150、300、450、600、900、および 1,500 μM Cu(II) を 300 μM C-ペプチドに添加したときの Cu(II) d-d バンドのモニタリング。 Cu(II)のd-dバンドは、1:1のCu(II):C-ペプチド複合体が形成されるまで、600nmで増加する。以前、MagyarとGodwinは、Cu(II)-bis-Trisアフィニティはlog K = 5.2716であると報告しました。この滴定は、C-ペプチドがCu(II)に結合するためにバッファーを凌駕できることを示し、マイクロモル範囲でCu(II)/C-ペプチド親和性を示します。この図は、Stevenson et al.14の許可を得て転載されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:[Cu(phen)3]2+の形成およびC-ペプチド添加時の電荷移動バンドの減少を監視する代表的な電子吸収スペクトル(A)265nm(ε°≈90,000 M-1 cm-1)22を中心とする[Cu(phen)3]2+およびその電荷移動バンドの形成を示す反応スキーム。形成定数は、log K 1、β 2、および β3 (それぞれ22) に対して 9.0、15.7、および 20.8 です。(B)C-ペプチドがCu(II)をキレートする際の[Cu(phen)3]2+からの電荷移動バンドの減少を監視する代表的な電子吸収スペクトル。滴定は、50 mM ビストリス、pH 7.4 で行った。データ解析結果を表1に示す。この図は、Stevenson et al.14の許可を得て転載されています。略称:MLCT=金属から配位子への電荷移動。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:C-ペプチドとバッファーに滴定されたCu(II)の代表的なサーモグラム(A)この代表的なサーモグラムは、15 mM MOPS、pH 7.4で154 μM C-ペプチドに1.4 mM Cu(II)を滴定したことを示しています。データは、次のパラメータを持つ1サイトモデルに適合します: n = 1.2 ± 0.1;Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7;ΔHITC = −3.4 ± 0.2 kJ mol-1.(B)パネルAに見られる結合サーモグラムを示さないCペプチドの非存在下で、15mM MOPS、pH7.4への1.4mM Cu(II)の代表的な対照滴定。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| [C-ペプチド] | A265 | [Cu(phen)3]2+ | [フェン]無料 | [C-ペプチド]無料 | [Cu(II)/C-ペプチド] | Kex (x108) | KdCu(II)/C-ペプチド | log KdCu(II)/C-ペプチド | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | ティッカー | ティッカー | ティッカー | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1.84E-08 · | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2.73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3.23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3.26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3.48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3.63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3.47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3.43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3.40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3.19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2.93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2.69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2.58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2.29E-08 | 7.64 | |
| 範囲 | 7.4-7.8 | ||||||||
表1: 図2Bからの溶液中の種の濃度についての代表的な計算。 すべての濃度はマイクロモルである。この表は、Stevenson et al.14の許可を得て転載されています。
| エクリブリア | n | ΔH (kJ mol-1) | n× ΔH(kJモル-1) |
| Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS | 1 | 5.4 | 5.44 |
| モップス + H+ → モップス-H+ | 0.097 | -21.0 | -2.04 |
| Cu(II) + C-ペプチド-H+ → Cu(II)/C-ペプチド + H+ | 1 | X | X |
| ΔHITC = Χ + 3.40 | |||
| Χ = ΔHITC − 3.40 | |||
| Χ = ΔHCu(II)/C-ペプチド = −6.8 kJ mol-1 |
表2:ΔHCu(II)/C-ペプチドを決定するためのポストホック分析。図3に示すように、1.4 mM Cu(II)を15 mM MOPS、pH 7.4、3連で154 μM Cペプチドに滴定しました。表に示されたすべての競合平衡を考慮した後、ΔHCu(II)/Cペプチドは−8.66kJ mol−1であることがわかる。Cu(II)によってCペプチドから置換されたプロトンの数は、データが複数のバッファーで収集される(ΔHITC + ΔHCu(II)バッファー)対ΔHバッファー-Hの傾きから決定されます。すべてのエンタルピー値は、NIST25に見られるか、文献15の他の箇所で決定される。すべての競合する均衡は、Grossoehme et al.20によって記述されているように説明されており、この数字はStevenson et al.15の許可を得て転載されています。
補足ファイル:プロトコルセクションで使用される関連する方程式と、電子吸収分光光度計とITCセットアップの追加パラメータ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、ペプチドへのCu(II)結合の親和性と熱力学を定量化するための堅牢な方法を提供します。Cu(II)との錯体は、そのd9 電子配置のために金属部位のd-d吸収帯を監視するのに理想的である。吸光係数は小さいため、信頼性の高いシグナルを得るためには、より高い濃度の複合体が必要ですが、Cu(II)をペプチドに滴定すると、結合化学量論と近似結合親和性に関する洞察が迅速に得られます。しかし、金属がバッファーとペプチドの両方から類似の原子や形状によって配位している場合、スペクトルの違いを識別することは困難です。結合親和性を定量的に決定するために、フェンなどの発色性リガンドは、金属イオン21との対称性許容電荷移動のためにしばしば使用される。発色性リガンドと非発色性ペプチドとの間の競合を設定し、リガンドに対する金属の親和性を知ることによって、金属 - ペプチド親和性を直接決定することができる。電子吸収分光法を用いたさらなる熱力学的分析は困難である。UV-Vis分光法などの技術を使用して結合エンタルピーを定量するには、結合親和性を複数の温度で測定し、バントホフ分析を実施する必要があります。この分析では、結合の比熱がゼロであると仮定していますが、これはめったに真ではないため、結合エンタルピー20の推定のみを提供します。
等温滴定熱量測定は、金属-ペプチド相互作用の熱力学のより完全な概要を解明するのに適しています。この技術では、金属イオンをペプチド溶液に滴定し、様々な平衡の熱を直接測定する。実験は一定の圧力で行われるため、ITCによって測定される熱はエンタルピーに等しくなります。ITCは、分光学的に静かな金属イオンを研究し、バントホフ分析で行われたような仮定をする必要がないなど、電子吸収分光法の限界のいくつかを克服することができます。しかし、ITCで起こっている反応は、熱をほとんどまたはまったく発生しないため、観察されないことがあります。これは、金属およびペプチドの濃度を増加させるか、またはプロトンネーションの異なるエンタルピーを有する異なる緩衝液を使用することによってバイパスすることができる。後者は、金属イオンがペプチドに結合する際に複数のプロトンを置換する場合に特に有用である。しかし、ITCと電子吸収分光法の両方の技術は、同じシステムを研究し、互いによく補完するための直交法を提供します。
ペプチドに結合する金属イオンを研究する際には、両方の技術に多くの挑戦的な側面があります。多くの金属イオンは、水に不溶性または難溶性である。これは、緩衝液に添加した場合の金属イオンの沈殿によってさらに悪化する。ITCでは、これはベースラインのゆっくりとした緩やかなシフトと、金属が注入されたときに発生する大量の熱によって現れることがあります。これは、ペプチドが金属イオンによって飽和してしまう後でも希釈熱の値が大きいことを示している。電子吸収分光法では、金属イオン沈殿は、より低い波長での吸収の増加によって現れ、UV領域を中心とする広いピークに似ている。両方の技術において、実験者は、金属イオンが、選択された条件(例えば、緩衝液、pH、温度、濃度)下で可溶性であることを確認しなければならない。両方の方法に対するもう1つの制限は、加算順序の概念を通してそれ自身を示すことができます。場合によっては、形成される1つの金属錯体は不安定であり得るが、同じ試薬を異なる順序で添加すると、別の中間種が不活性になる。動力学制御と熱力学的制御のこの図は、競合するすべての平衡の正確な分析を妨げます。
ITCと電子吸収分光法の両方は、金属イオンを結合するためにペプチドとバッファーまたはリガンドとの間の競合に依存しています。ここでは、C 値が導入されており、フィッティング アルゴリズムによって KITC を正確に決定できるかどうかを識別するのに役立ちます。c値は、補足ファイルのEq (7)20で定義されており、nは化学量論、KITCは見かけ上の結合親和性、[サンプルセル]はサンプルセル内の種の濃度です。c 値が 1 ~ 1,000 の場合、決定された KITC は正確です。ただし、1 未満の c 値は KITC の上限のみを提供し、1,000 を超える c 値は下限20 のみを提供する場合があります。これは補完的な手法からデータを収集することの価値であり、ある手法でその限界のために何かが欠落している場合、その相補的な手法に引っかかる可能性があります。これらの実験では、競合が1つの種に大きく有利である場合(すなわち、ペプチドの金属イオン親和性が緩衝液の親和性よりもはるかに大きい場合)、平衡がシフトし、解釈が困難になる。これは、Kocylaら23によっても詳細に示されている。この課題を回避するために、異なる競合リガンドの導入もしくは置換、または異なる緩衝液の選択は、正確な定量のためにリガンドとペプチドとの間の競合を増大させるためにしばしば使用される。これは、金属バッファー(または金属リガンド)と金属ペプチドの親和性の違いにより、c値が1〜1,000のウィンドウ内に収まるためです。しかしながら、定量分析のために競合する配位子または別の緩衝液を使用するには、金属-配位子または金属-緩衝錯体の熱力学的パラメータが既知であるか、または他の手段によって決定可能であることが必要であることに留意すべきである。
最後に、ペプチド濃度を正確に定量することは困難な場合があります。ペプチド濃度を定量するいくつかの一般的な方法は、特定のアミノ酸を測定し、それらのアミノ酸の量をペプチドの配列に関連付けることです。例えば、電子吸収分光法はチロシンなどの芳香族残基を測定することができ、エルマンの試薬は遊離チオール26の数を定量することができ、ブラッドフォードアッセイは残基27の数を示すことができる。残念なことに、この研究で使用されたようなペプチドは芳香族残基または遊離チオールを有さず、ブラッドフォードアッセイは、大量のタンパク質からの標準を目的の小さなペプチドと比較する際に課題をもたらす。代わりに、ペプチド濃度を乾燥質量で決定した。理想的ではなく、ペプチド濃度のわずかな過大評価である濃度になりやすいが(塩の存在により、見かけ上の質量測定値が実際のペプチド質量よりも高い可能性が高いため)、測定用のすべてのアリコートを同じように処理し、より正確な比較を可能にする。分光研究において、遊離ペプチドの濃度が予想よりも低い場合、計算された結合親和性は下限を表す(Supplemental File、Eq(5)およびEq(6))。示されている両方のテクニックに関連する課題がありますが、文献をガイドとして、多くを克服することができます。
ここで詳述する実験的アプローチは、金属ペプチド結合熱力学の正確な定量を可能にする。ITCと電子吸収分光法はどちらも直交しており、結合親和性に関する洞察を提供しますが、ITCは直接エンタルピー定量を可能にします。これらの熱力学が定量化されると、これらの金属ペプチド複合体が生理学的条件下で形成できるかどうかが推測できる。生理学的金属イオンフラックスの理解が深まるにつれて、結合親和性が インビボでの 複合体形成に十分に強いかどうかを予測することができる。さらに、研究者は、同じペプチドの複数の金属イオン間の競合、または同じ金属イオンの複数のペプチド間の競合について予測を行うことができます。金属イオンとペプチドの間のこれらの競合を見ると、研究者は自由エネルギーをエンタルピーとエントロピーの寄与に解析することによって、金属 - ペプチド複合体の結合親和性に寄与するものを理解し始めることができます。熱力学は、金属イオンとペプチドの間の動的相互作用を評価する上で不可欠な部分であり、ITCと電子吸収分光法は、これらのシステムを調査するためのハンドルを提供しています。ここで説明する方法は、巨大分子と他の金属イオン結合相互作用を研究するために拡張および使用することができ、生理学的プロセス、薬物設計などにおいて意味を有する可能性がある。
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Disclosures
著者らは、競合する利益を宣言していない。
Acknowledgments
SCはホワイトヘッド・サマー・リサーチ・フェローシップに感謝します。MJSは、サンフランシスコ大学のスタートアップファンドとファカルティ・ディベロップメント・ファンドに感謝します。MCHは、国立衛生研究所(NIH MIRA 5R35GM133684-02)および国立科学財団(NSF CAREER 2048265)からの資金提供を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
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