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Biochemistry

Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores

Published: April 5, 2022 doi: 10.3791/63668
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, University of San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Davis

Summary

Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique et de la calorimétrie de titrage isotherme pour sonder et quantifier la thermodynamique de la liaison du Cu(II) aux peptides et aux protéines.

Abstract

Le cuivre(II) est un métal essentiel dans les systèmes biologiques, conférant des propriétés chimiques uniques aux biomolécules avec lesquelles il interagit. Il a été rapporté qu’il se lie directement à une variété de peptides et joue des rôles à la fois nécessaires et pathologiques allant de la structure médiatrice aux propriétés de transfert d’électrons en passant par la transmission de la fonction catalytique. La quantification de l’affinité de liaison et de la thermodynamique de ces complexes Cu(II)-peptide in vitro donne un aperçu de la force motrice thermodynamique de la liaison, des compétitions potentielles entre différents ions métalliques pour le peptide ou entre différents peptides pour Cu(II), et de la prévalence du complexe Cu(II)-peptide in vivo. Cependant, la quantification de la thermodynamique de liaison peut être difficile en raison d’une myriade de facteurs, y compris la prise en compte de tous les équilibres concurrents dans une expérience de titrage, en particulier dans les cas où il y a un manque de poignées spectroscopiques discrètes représentant le peptide, l’ion métallique d-bloc et leurs interactions.

Ici, un ensemble robuste d’expériences est fourni pour la quantification précise de la thermodynamique des peptides Cu(II). Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique en présence et en l’absence de ligands chromophoriques pour fournir la poignée spectroscopique nécessaire sur Cu(II) et l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme sans étiquette. Dans les deux techniques expérimentales, un processus est décrit pour tenir compte de tous les équilibres concurrents. Bien que cet article se concentre sur le Cu(II), l’ensemble d’expériences décrites peut s’appliquer au-delà des interactions Cu(II)-peptide et fournir un cadre pour une quantification précise d’autres systèmes métal-peptide dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Introduction

La biologie a évolué pour utiliser la chimie diversifiée des ions métalliques nécessaires à l’adaptation et à la survie de la vie dans son environnement. On estime que 25% à 50% des protéines utilisent des ions métalliques pour la structure et la fonction1. Le rôle particulier et l’état redox de l’ion métallique sont directement liés à la composition et à la géométrie des ligands biologiques qui le coordonnent. En outre, les ions métalliques redox-actifs tels que Cu(II) doivent être étroitement régulés de peur qu’ils n’interagissent avec les agents oxydants via une chimie de type Fenton pour former des espèces réactives de l’oxygène (ROS)2,3,4. Comprendre les modes de liaison et l’affinité qui sous-tendent sa biochimie devrait aider à élucider le rôle biologique de l’ion métallique.

De nombreuses techniques sont utilisées pour étudier les interactions de liaison des métaux et des peptides. Il s’agit principalement de techniques spectroscopiques, mais elles comprennent également des simulations informatiques utilisant la dynamique moléculaire, comme en témoignent les interactions Cu(II) avec un fragment de bêta-amyloïde (Aβ)5. Une technique spectroscopique largement utilisée et accessible à de nombreuses universités est la résonance magnétique nucléaire (RMN). En utilisant la nature paramagnétique de Cu(II), Gaggelli et al. ont pu montrer où l’ion métallique se lie sur un pétide par relaxation des noyaux voisins6. La résonance paramagnétique électronique (EPR) peut également être utilisée pour sonder l’emplacement et le mode de liaison des ions métalliques paramagnétiques7. D’autres techniques spectroscopiques telles que le dichroïsme circulaire (CD) peuvent décrire la coordination autour de Cu(II) dans des systèmes tels que les systèmes tripeptides8, et la spectrométrie de masse peut montrer la stœchiométrie et les résidus auxquels l’ion métallique est coordonné par des modèles de fragmentation 9,10.

Certaines de ces techniques, telles que la RMN, sont sans étiquette, mais nécessitent de grandes concentrations de peptides, ce qui pose des défis pour l’étude. Une autre technique courante appelée spectroscopie de fluorescence a été utilisée pour relier la position d’une tyrosine ou d’un tryptophane à la trempe à partir d’un Cu(II)11,12. De même, cette technique peut montrer des changements structurels à la suite de la liaison Cu(II)13. Cependant, les défis avec ces études de liaison métal-peptide sont qu’ils sondent les acides aminés chromophoriques tels que la tyrosine que tous les systèmes n’ont pas, que l’ion métallique se lie sous un modèle classique, et que la technique peut ne pas être propice dans des conditions physiologiques. En effet, plusieurs peptides émergent qui ne contiennent pas de tels acides aminés chromophoriques ou se lient selon les modèles classiques, empêchant l’utilisation de ces techniques14,15. Cet article détaille les approches pour évaluer les propriétés de liaison dans ces scénarios dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Les ligands biologiques peuvent adopter différents états de protonation qui peuvent affecter la liaison aux ions métalliques tels que l’anneau imidazole sur l’histidine. Si le pH n’est pas maintenu de manière constante, les résultats peuvent être alambiqués ou contradictoires. Pour cette raison, les tampons sont un composant essentiel dans l’étude des interactions métal-protéine/peptide. Cependant, il a été démontré que de nombreux tampons interagissent favorablement avec les ions métalliques16,17. En plus de rivaliser avec la molécule biologique d’intérêt, le tampon peut avoir des atomes de coordination similaires qui peuvent être difficiles à distinguer des atomes de coordination du peptide ou de la protéine. Dans cette étude, l’accent est mis sur la spectroscopie d’absorption électronique et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) en tant que deux techniques complémentaires pour étudier les interactions Cu(II)-peptide, avec des considérations particulières concernant le choix du tampon.

La spectroscopie d’absorption électronique est une technique rapide et largement accessible pour étudier les interactions de liaison des métaux. L’irradiation avec de la lumière dans les longueurs d’onde ultraviolettes (UV) ou visibles peut entraîner l’absorption de bandes d-d centrées sur le métal, qui fournissent des informations précieuses sur la classification des ligands, les géométries des métaux et les affinités de liaison apparentes18,19. Pour ces complexes, les titrages directs d’ions métalliques dans des solutions protéiques ou peptidiques peuvent quantifier les stœchiométries de liaison et les affinités de liaison apparentes. Dans certains cas, comme les configurations d’électrons d5 ou d10, le complexe n’absorbe pas la lumière (c.-à-d. est spectroscopiquement silencieux). Dans ces complexes de métaux de transition spectroscopiquement silencieux, ces limitations peuvent être contournées en utilisant un ligand concurrent qui, lors de la coordination avec l’ion métallique, donne des bandes de transfert de charge détectables. Dans les deux cas, cette approche se limite à quantifier uniquement la stœchiométrie et l’affinité de liaison apparente, et aucun aperçu de l’enthalpie de liaison n’est fourni sans approximations.

Complétant les informations obtenues par spectroscopie d’absorption électronique, l’ITC est une technique attrayante pour la quantification directe et rigoureuse de l’enthalpie de liaison20. L’ITC mesure directement la chaleur libérée ou consommée lors d’un événement de liaison et, puisque le titrage a lieu à pression constante, la chaleur mesurée est l’enthalpie de tous les équilibres (ΔHITC). De plus, la stœchiométrie de l’événement de liaison (n) et l’affinité de liaison apparente (KITC) sont quantifiées. À partir de ces paramètres, l’énergie libre (ΔGITC) et l’entropie (ΔSITC) sont déterminées, fournissant un instantané thermodynamique de l’événement de liaison. Comme il ne repose pas sur l’absorption de la lumière, l’ITC est une technique idéale pour les espèces spectroscopiquement silencieuses, par exemple, les complexes d’ions métalliques d5 ou d10 . Cependant, étant donné que la calorimétrie mesure la chaleur, tout système tampon non apparié et tout équilibre non comptabilisé peuvent nuire à l’analyse visant à déterminer avec précision la thermodynamique de liaison aux ions métalliques, et il faut prendre grand soin de traiter ces facteurs20. S’il est effectué avec la rigueur appropriée, l’ITC est une technique robuste pour déterminer la thermodynamique des complexes métal-protéine/peptide.

Ici, un peptide de liaison au cuivre chromophoriquement silencieux, le C-peptide, est utilisé pour démontrer l’utilisation complémentaire des deux techniques. Le peptide C est un produit de clivage de 31 résidus (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formé pendant la maturation de l’insuline; il manque de résidus chromophoriques mais il a été démontré qu’il lie le Cu(II) avec une affinité physiologiquement pertinente14,15. Le site de liaison Cu(II) est constitué des chaînes latérales d’un glutamate et d’un aspartate ainsi que du N-terminus du peptide14,15. Ces atomes de coordination ressemblent beaucoup à ceux de nombreux systèmes tampons couramment utilisés. Ici, l’utilisation en tandem des bandes d-d et de transfert de charge en spectroscopie d’absorption électronique et ITC dans la quantification de la thermodynamique de liaison Cu(II) au peptide C est montrée. L’approche de l’étude de la liaison Cu(II) au peptide C peut être appliquée à d’autres ions métalliques et systèmes protéine/peptide.

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Protocol

1. Spectroscopie d’absorption électronique : titrage direct avec compétition tampon

  1. Préparation des échantillons
    1. Préparer une solution tamponnée de 50 mM de 2-[bis(2-hydroxyéthyl)amino]-2-(hydroxyméthyl)propane-1,3-diol (bisTris) à pH 7,4 en utilisant de l’eau ultrapure (résistance >18 MΩ). Éliminer les ions métalliques traces en incubant avec une résine à haute affinité pendant au moins 2 h avec filtration ultérieure.
    2. Dissoudre ou diluer une quantité connue du peptide dans le tampon sans métal.
      REMARQUE: Lors de la surveillance des bandes d-d avec de petits coefficients d’extinction21, des concentrations plus élevées de peptide doivent être utilisées. Ici, la concentration finale de C-peptide en solution tamponnée était de 300 μM (le volume dépend de la taille de la cuvette). Le peptide C a été synthétisé par synthèse peptidique en phase solide et est détaillé ailleurs dans la littérature14.
    3. Dissoudre une masse connue de CuCl2 dans de l’eau ultrapure pour obtenir une solution à 10-15 mM.
      REMARQUE: Il est important de dissoudre initialement le sel métallique dans de l’eau sans tampon pour éviter les précipitations. D’autres sels de Cu(II) peuvent être utilisés, mais il faut veiller à ce que l’anion se coordonne faiblement.
  2. Exécution de l’expérience
    1. Allumez le spectrophotomètre d’absorption électronique et laissez-le se réchauffer pendant environ 15 à 20 minutes avant utilisation. Lancez le logiciel du spectrophotomètre et configurez les paramètres tels que la plage de balayage (200-900 nm), la vitesse de balayage (200 nm/s) et la correction de la ligne de base à double faisceau (d’autres paramètres sont répertoriés dans le fichier supplémentaire).
    2. Prélever une ligne de base sans cuvettes ni échantillons dans les trajectoires de faisceau.
    3. À l’aide de deux cuvettes appariées dans le spectrophotomètre à double faisceau, chargez une cuvette avec 115 μL d’eau ultrapure et l’autre cuvette avec 115 μL de l’échantillon peptidique. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les cuvettes, car elles interféreront avec le signal.
    4. Placez la cuvette avec de l’eau ultrapure dans le faisceau de référence et la cuvette avec du peptide dans le faisceau d’échantillon.
    5. Recueillir le spectre d’absorption du peptide sans métal (apo).
    6. Ajouter une quantité sous-stœchiométrique (0,5 équivalent, 150 μM) de la solution de Cu(II) dans la cuvette avec l’échantillon peptidique. Assurez-vous que le volume de Cu(II) ajouté est inférieur à 3 μL et enregistrez le volume pour analyse ultérieurement.
    7. Pipettez doucement de haut en bas pour mélanger la solution tout en évitant la génération de bulles d’air. Laissez la solution réagir et équilibrer pendant 5 min et enregistrez le spectre d’absorption.
    8. Répéter l’ajout d’aliquotes de Cu(II) comme à l’étape 1.2.6 dans la solution peptidique pour les équivalents suivants : 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 et 5.0 (soit un total de 300, 450, 600, 900 et 1 500 μM). Assurez-vous d’enregistrer le volume total de Cu(II) ajouté et le volume total de la cuvette.
      REMARQUE: Si plus de résolution est souhaitée, réduisez l’espacement entre les équivalents.
    9. Retirez la cuvette d’échantillon et nettoyez soigneusement selon les instructions du fabricant.
    10. Ajouter la solution tamponnée sans peptide et enregistrer le spectre d’absorption. Répéter l’ajout de aliquotes de Cu(II) comme aux étapes 1.2.5-1.2.8, en enregistrant le spectre d’absorption pour chaque équivalent Cu(II).
    11. Exportez tous les spectres sous forme de fichiers csv pour le traitement. Nettoyez soigneusement les cuvettes selon les instructions du fabricant et mettez le spectrophotomètre hors tension.
  3. Traitement des données
    1. Chargez tous les spectres sur un tableur.
    2. Soustrayez le spectre tampon uniquement (0 μM Cu(II)) de tous les autres spectres pour éliminer toute caractéristique d’absorbance du tampon lui-même.
    3. Normaliser chaque spectre pour tenir compte de la dilution résultant de l’ajout de la solution de Cu(II) (étape 1.2.6). Voir le fichier supplémentaire, Eq (1)14 pour un exemple de normalisation où vinitial est le volume (115 μL) de peptide ajouté à la cuvette, vCu(II) est le volume de solution de Cu(II) ajouté à l’étape 1.2.6, et absbuffer subtracted spectrum est les données obtenues à l’étape 1.2.7.
    4. Représentez tous les spectres ensemble pour identifier les régions de changement.
      REMARQUE: Les bandes d-d typiques des complexes Cu (II) vont de 500 à 750 nm. Ce titrage spectrophotométrique peut être difficile en raison du faible coefficient d’extinction des bandes d-d, qui sont des transitions interdites par Laporte en géométrie octaédrique21. Si l’absorbance est trop faible, une autre approche consiste à utiliser des ligands chromophoriques qui entraînent des bandes de transfert de charge lors de la liaison au Cu(II) (voir rubrique 2).

2. Spectroscopie d’absorption électronique : compétition peptidique avec ligand chromophorique

  1. Préparation des échantillons
    1. Dissoudre la 1,10-phénanthroline (phen) dans de l’eau ultrapure pour obtenir une concentration finale d’environ 1 mM.
    2. En plus de la préparation de l’échantillon décrite à la rubrique 1.1 pour le peptide (étape 1.1.2) et le Cu(II) (étape 1.1.3), préparer une solution de 10 μM Cu(II) et 40 μM de phén dans un tampon ([Cu(phen)3]2+). Assurez-vous que le volume remplit la cuvette.
  2. Exécution de l’expérience
    1. Démarrez le spectrophotomètre d’absorption électronique comme dans les étapes 1.2.1 et 1.2.2, mais réglez la plage de balayage sur 200-400 nm.
    2. Dans deux cuvettes appariées, charger une cuvette avec 115 μL d’eau ultrapure et l’autre cuvette avec 115 μL de la solution [Cu(phen)3]2+ . Placer la cuvette avec de l’eau dans le faisceau de référence et la cuvette avec la solution [Cu(phen)3]2+ dans le faisceau d’échantillonnage.
    3. Recueillir le spectre d’absorption du complexe métal-ligand.
    4. Ajouter une quantité stœchiométrique (équivalents ≈1, ≈10 μM) de peptide à la solution [Cu(phen)3]2+ . Pipettez doucement de haut en bas pour bien mélanger, mais veillez à ne pas introduire de bulles d’air. Enregistrez le volume de peptide ajouté pour une analyse future.
      REMARQUE: En utilisant des cuvettes qui contiennent 115 μL, l’ajout de 3,83 μL de 300 μM peptide donne une concentration finale de peptide de 9,7 μM.
    5. Incuber la solution pendant 5 min pour atteindre l’équilibre. Enregistrez le spectre d’absorption.
      REMARQUE: Si l’affinité de liaison du métal-peptide et du métal-ligand est similaire, la concentration de peptide ajouté devra être en excès important. Assurez-vous de tenir compte du volume total de peptide ajouté pour la normalisation.
    6. Répétez l’addition d’aliquotes peptidiques dans la solution [Cu(phen)3]2+ pour les équivalents approximatifs suivants : 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 et 26. Enregistrez le volume de peptide ajouté afin que la concentration diluée puisse être déterminée.
    7. Retirez l’échantillon et nettoyez soigneusement la cuvette conformément aux instructions du fabricant. Collectez un spectre du tampon. Recueillir un spectre de peptides de 50 μM dans le tampon.
    8. Exportez toutes les données sous forme de fichiers csv pour le traitement et nettoyez les cuvettes conformément aux instructions du fabricant.
  3. Traitement des données
    1. Chargez les spectres sur un tableur et soustrayez le spectre tampon des autres spectres.
    2. Normalisez les spectres après le fichier supplémentaire, Eq (2)14.
    3. En utilisant le coefficient d’extinction pour [Cu(phen)3]2+ à 265 nm (εmax = 90 000 M-1 cm-1)22, déterminer la concentration de [Cu(phen)3]2+ à chaque ajout du peptide.
    4. Pour chaque addition du peptide, déterminer la concentration du complexe Cu(II)-peptide en soustrayant la concentration restante de [Cu(phen)3]2+, telle que déterminée à l’étape 2.3.2, de la concentration initiale de [Cu(phen)3]2+ (à 0 μM peptide).
    5. Calculer la concentration de ligand phen libre par l’équation dans le fichier supplémentaire, Eq (3)14.
    6. Calculer la concentration de peptide libre à l’aide du fichier supplémentaire Eq (4)14, où [peptide]stock représente le peptide non dilué titré dans la cuvette, V1 représente le volume de peptide stock ajouté, V2 est le volume total de la cuvette et [Cu2+-peptide] est déterminé à l’étape 2.3.4.
    7. Calculer l’affinité de liaison expérimentale (Kex) à l’aide de Eq (5) dans le fichiersupplémentaire 23.
    8. Relier la constante de dissociation du peptide Cu(II) à Kex par Eq (6)23 dans le fichier supplémentaire, où Kd,Cu(II)-phen = 1,0 × 10-9 (voir 22). Déterminer la moyenne et l’écart-type par rapport à toutes les constantes de dissociation déterminées.
      REMARQUE: Sous un rapport 4: 1 de phen: Cu (II), [Cu (phen) 3] 2 +, [Cu (phen) 2] 2+ et [Cu (phen)]2+ existent dans la solution, et le peptide chélatera Cu (II) loin de l’espèce ([Cu (phen)]2+) avec la liaison la plus faible22.

3. Calorimétrie de titrage isotherme

  1. Préparation des échantillons
    1. Préparer une solution tamponnée d’acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS) de 15 mM à pH 7,4 en utilisant de l’eau ultrapure (résistance >18 MΩ). Éliminez les traces d’ions métalliques en incubant avec une résine à haute affinité pendant au moins 2 h avec filtration sous vide ultérieure à travers une membrane de 0,45 μm sur le dessus de la bouteille.
    2. Dissoudre une masse connue de CuCl2 dans de l’eau ultrapure pour préparer une solution de ≈50-100 mM. Diluer cette solution de Cu(II) dans un tampon pour obtenir une solution de 1,0 mL avec une concentration finale de 1,4 mM Cu(II). Enregistrez le volume exact de la solution CuCl2 utilisée.
    3. Dissoudre ou diluer la solution peptidique dans un tampon pour obtenir 450 μL d’une solution peptidique de 154 μM. Assurez-vous que la même proportion d’eau ultrapure supplémentaire de l’étape 3.1.2 est ajoutée à la solution peptidique, ce qui réduira la chaleur de dilution et augmentera le signal au bruit.
    4. Après la préparation des échantillons, assurez-vous que les solutions ont le même pH et, si nécessaire, ajustez-les en conséquence.
    5. Étape optionnelle : Dégazez les solutions pour minimiser les microbulles chargées dans l’ITC.
  2. Exécution de l’expérience
    1. Activez l’ITC. Lancez le logiciel ITC pour exécuter l’instrument. Attendez la première initialisation, qui demandera de reloger le buret; ensuite, suivez les instructions à l’écran.
    2. Retirez le capot de la cellule de référence. Retirez toute eau de la cellule de référence et rincez trois fois avec 450 μL d’eau ultrapure dégazée.
    3. Aspirez lentement l’eau ultrapure jusqu’à la marque de 450 μL d’une seringue de chargement, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la seringue. Insérez la seringue de chargement dans la cellule de référence jusqu’à ce qu’elle soit ≈1 mm du fond et injectez lentement une partie de la solution jusqu’à ce qu’il reste 150 μL dans la seringue de chargement. Déplacez rapidement le piston de la seringue de chargement de haut en bas de ≈25 μL plusieurs fois pour déloger les bulles à la surface de la cellule. Injecter lentement jusqu’à ce que le piston atteigne la marque de 100 μL sur la seringue de chargement, distribuant ainsi un total de 350 μL d’eau ultrapure dans la cellule de référence, et remplacez le couvercle de la cellule de référence.
    4. Retirer toute solution résiduelle de la cellule d’échantillonnage et charger avec 450 μL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 10 mM à l’aide d’une seringue de chargement. Faire tremper pendant 10 minutes pour s’assurer que les ions métalliques traces sont éliminés, car l’EDTA liera les métaux traces.
    5. Retirez la solution d’EDTA (avec des ions métalliques traces liés) et rincez soigneusement la seringue de chargement avec de grandes quantités d’eau ultrapure.
    6. Nettoyez l’ITC conformément aux instructions du fabricant, en rinçant la cellule d’échantillon avec de l’eau ultrapure.
    7. Conditionnez la cellule de l’échantillon en rinçant avec 450 μL de tampon au moins trois fois.
    8. Retirez le tampon qui conditionne la cellule d’échantillonnage. Chargez la solution peptidique dans la cellule de l’échantillon à l’aide de la seringue de chargement (suivez l’étape 3.2.3).
    9. Rincez la seringue de titrage avec 200 μL de solution tamponnée. Pour ce faire, retirez le piston et utilisez une micropipette pour pipeter le tampon à travers le trou en haut de la seringue de titrage en verre, à travers la seringue et à l’aiguille en dessous.
    10. Insérez complètement le piston dans la seringue de titrage.
    11. Trempez l’extrémité de l’aiguille de la seringue de titrage dans la solution métallique et tirez lentement le piston vers le haut, ce qui fait que la solution métallique remplit la seringue et entraîne un volume vide au sommet de la partie en verre de la seringue de titrage. Retirez la majeure partie du volume vide en faisant pivoter la seringue de titrage parallèlement au sol, retirez le piston et inclinez légèrement la partie en verre vers le sol. Agitez doucement la seringue de titrage afin que la solution se déplace vers l’extrémité de la partie en verre de la seringue de titrage et remplisse la majeure partie du volume du vide, mais assurez-vous qu’il reste 2 à 3 μL de volume de vide. Tout en gardant la seringue parallèle au sol, réinsérez le piston.
    12. Tenez la seringue de titrage à la verticale, trempez l’extrémité de l’aiguille dans la solution métallique et poussez le piston vers le bas jusqu’à ce que l’air cesse de sortir de l’aiguille. Chargez la seringue de titrage en tirant lentement le piston juste au-dessus de la marque de 50 μL tout en maintenant le bout de l’aiguille dans la solution.
    13. Insérez soigneusement la partie en verre de la seringue de titrage dans le buret et vissez jusqu’à ce qu’elle soit serrée au doigt. Lorsqu’une petite quantité de solution sort de la seringue de titrage en raison de la compression du piston, utilisez un essuie-glace délicat léger pour absorber soigneusement la solution sans toucher le bout de l’aiguille.
    14. Insérez le buret avec une seringue de titrage dans la cellule de l’échantillon et fixez-le solidement.
    15. Configurez les paramètres sur le logiciel ITC. À partir de Instrument Control, réglez la vitesse d’agitation (les vitesses d’agitation typiques vont de 150 à 350 tr / min) et la température à laquelle l’expérience sera menée (généralement 25 ° C). Entrez les concentrations de seringues et de cellules en unités millimolaires sous Détails de l’expérience.
    16. Dans la section Méthode expérimentale , sélectionnez Titrage incrémentiel. Cliquez sur Configuration et spécifiez 20 injections de 2,5 μL. Si une plus grande résolution est nécessaire pour observer l’événement de liaison, augmentez le nombre d’injections et diminuez le volume par injection. Entrez l’espacement temporel entre chaque injection afin qu’il soit suffisamment long pour que le signal s’équilibre et revienne à la ligne de base, généralement 300 s.
    17. Cliquez sur le bouton Exécuter pour démarrer l’expérience et spécifier l’emplacement d’enregistrement des données.
    18. À la fin de l’expérience, nettoyez la cellule d’échantillon et la seringue de titrage.
    19. Exécutez toutes les expériences en trois exemplaires au moins pour assurer une collecte de données précise.
    20. Exécutez une expérience de contrôle où la solution métallique est titrée dans la solution tamponnée (en l’absence de peptide) pour s’assurer que la chaleur de dilution de l’ion métallique est faible et qu’il n’y a pas d’équilibres non comptabilisés. Si la chaleur de dilution est importante, envisagez un système tampon différent, si possible.
  3. Traitement des données
    1. Lancez le logiciel d’analyse ITC et chargez le fichier de données pour analyse.
    2. Accédez à l’onglet Configuration de référence et inspectez le thermogramme. Notez toute chaleur exogène produite ou absorbée par des bulles d’air ou d’autres artefacts dans le thermogramme. Recherchez les pointes qui ne sont pas dues à l’injection de la solution métallique.
    3. Assurez-vous que la ligne de base générée par le logiciel d’analyse suit la partie des données après l’injection et l’équilibrage. S’il s’écarte, utilisez les points pivot de la ligne de base pour ajuster la configuration de référence. Assurez-vous que les régions d’intégration incluent le pic généré par l’injection du métal, mais obstruent les bulles d’air ou les artefacts dans le thermogramme trouvés à l’étape 2. Soustrayez la ligne de base du thermogramme.
      REMARQUE: Ce type de manipulation n’est recommandé qu’après la collecte de plusieurs thermogrammes, afin que l’expérimentateur sache ce qui est des données réelles et ce qui est un artefact, car l’ajustement de la ligne de base et des régions d’intégration peut affecter considérablement les données.
    4. Accédez à la fenêtre Modélisation pour commencer à ajuster les données où le logiciel d’analyse affichera les données intégrées et normalisées par concentration pour chaque injection.
    5. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur la référence de la première injection pour la retirer de l’algorithme d’ajustement.
      REMARQUE: Ceci est courant car il y aura un mélange mineur entre le titrant et la solution de cellules d’échantillon conduisant à une distribution molaire inexacte de la première injection.
    6. Dans la section Modèles , sélectionnez Vide (constante) dans le menu déroulant Style , qui est basé sur l’enthalpie d’injection finale et sera soustrait de chaque point de données, en tenant compte de la chaleur de dilution. En outre, sélectionnez Indépendant (ou le meilleur modèle pour le système) dans le deuxième menu déroulant Style pour adapter les données.
      REMARQUE : Pour les interactions de liaison 1:1 standard, le modèle le plus courant est Indépendant.
    7. Ajustez les données à l’aide des deux modèles en appuyant sur le bouton de lecture vert avec un Σ.
      REMARQUE: Un autre logiciel pour traiter les données ITC est SEDPHAT24.
    8. Tenir compte de tous les équilibres concurrents dans l’analyse post hoc précédemment rapportée par Grossoehme et al. 20.

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Representative Results

L’objectif était de quantifier et de corroborer la thermodynamique de la liaison du Cu(II) au peptide C en utilisant les techniques complémentaires de spectroscopie d’absorption électronique et d’ITC. En raison de la nature robuste de la spectroscopie d’absorption électronique, un titrage direct de Cu(II) en peptide C de 300 μM a été effectué (Figure 1). L’ajout de 150 μM de Cu(II) a provoqué une augmentation immédiate de la bande à 600 nm, attribuée à la bande d-d de Cu(II), et a continué d’augmenter jusqu’à ce que 300 μM Cu(II) soient ajoutés. Une addition supplémentaire supérieure à 300 μM Cu(II) n’a pas augmenté l’absorption de la bande d-d, indiquant la saturation et que Cu(II) se lie au peptide C dans un complexe 1:1. De plus, en raison de l’affinité relativement élevée du bis-Tris pour la liaison au Cu(II) (log K = 5,27)16, l’affinité Cu(II)/C-peptide devrait avoir une limite inférieure dans la gamme micromolaire (log K > 6) pour chélater l’ion métallique loin du tampon. Dans ce système, la quantification précise des bandes d’absorption est difficile en raison du faible coefficient d’extinction.

Pour contourner le petit coefficient d’extinction de la bande d-d, un ligand chromophorique, phen, a été utilisé comme décrit ci-dessus. Le peptide C a été titré en ≈10 μM [Cu(phen)3]2+ (Figure 2A), et l’absorption de la bande de transfert de charge à 265 nm a diminué (Figure 2B), indiquant que le peptide C était capable de chélater Cu(II) à partir du ligand phen. En y regardant de plus près, une grande concentration de peptide C (jusqu’à 140 μM) a été nécessaire pour surpasser modestement le ligand phen (tableau 1). Cela n’est pas surprenant étant donné les grandes constantes de formation séquentielle pour [Cu(phen)3]2+ (9,0, 15,7 et 20,8 pour le log K1, β2 et β3, respectivement)22. L’analyse des spectres montre que l’affinité de liaison au peptide Cu(II)/C est comprise entre log K = 7,4-7,8 (tableau 1).

L’étalon-or de la mesure de la thermodynamique complète d’une interaction de liaison est l’ITC. La figure 3 fournit un thermogramme représentatif de Cu(II) titré en C-peptide dans 15 mM MOPS, pH 7,4, qui fournit la concurrence pour le Cu(II). Ici, le tampon MOPS a été utilisé à la place du tampon bis-Tris parce que KCu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25, et fournirait moins de concurrence afin que l’ITC puisse mesurer avec précision l’affinité (voir la discussion). En mesurant la chaleur consommée ou évoluée parmi tous les équilibres, le thermogramme fournit une forme sigmoïdale. Les injections initiales de Cu(II) avant que le peptide ne soit saturé entraînent de grandes quantités de chaleur par rapport à la chaleur de dilution. La différence dans ces valeurs de chaleur est ΔHITC. Le point d’inflexion décrit deux informations utiles. La première est la stœchiométrie de liaison des espèces dans la seringue par rapport aux espèces dans la cellule (c’est-à-dire que Cu(II):C-peptide est 1:1). Deuxièmement, la pente de l’ajustement au point d’inflexion est directement proportionnelle à KITC. Après avoir recueilli des données en trois exemplaires et en tampons multiples, une analyse post hoc20 où tous les équilibres concurrents sont pris en compte a été effectuée (tableau 2) et la thermodynamique indépendante du tampon est déterminée. Pour la liaison Cu(II) au C-peptide, KCu(II)/C-peptide = 1 (± 1) x 108 et ΔHCu(II)/C-peptide = -8 (± 4) kJ mol-1. À partir de ceux-ci, d’autres paramètres thermodynamiques de liaison sont déterminés où ΔG°Cu(II)/C-peptide = -46 (± 4) kJ mol-1 et ΔSCu(II)/C-peptide = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (voir 15).

Figure 1
Figure 1 : Surveillance de la bande Cu(II) d-d lors de l’addition de 150, 300, 450, 600, 900 et 1 500 μM Cu(II) à 300 μM de C-peptide dans 50 mM bis-Tris, pH 7,4. La bande d-d de Cu(II) augmente à 600 nm jusqu’à ce qu’un complexe 1:1 Cu(II):C-peptide soit formé. Auparavant, Magyar et Godwin ont rapporté que l’affinité Cu(II)-bis-Tris est log K = 5,2716. Ce titrage montre que le peptide C peut surpasser le tampon pour se lier au Cu(II) et indique une affinité Cu(II)/C-peptide dans la gamme micromolaire. Cette figure est réimprimée avec la permission de Stevenson et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Formation de [Cu(phen)3]2+ et spectres d’absorption électronique représentatifs surveillant la diminution de la bande de transfert de charge lors de l’ajout de C-peptide. (A) Schéma de réaction montrant la formation de [Cu(phen)3]2+ et sa bande de transfert de charge centrée à 265 nm (ε° ≈ 90 000 M-1 cm-1)22. Les constantes de formation sont 9,0, 15,7 et 20,8 pour les log k1, β2 et β3, respectivement22. (B) Spectres d’absorption électronique représentatifs surveillant la diminution de la bande de transfert de charge de [Cu(phen)3]2+ lorsque le peptide C chélate Cu(II). Le titrage a été effectué en bis-Tris de 50 mM, pH 7,4. L’analyse des données est présentée dans le tableau 1. Cette figure est réimprimée avec la permission de Stevenson et al.14. Abréviation : MLCT = transfert de charge métal-ligand. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Thermogrammes représentatifs de Cu(II) titrés en peptide C et tampon. (A) Ce thermogramme représentatif montre le titrage de 1,4 mM Cu(II) en 154 μM C-peptide dans 15 mM MOPS, pH 7,4. Les données sont adaptées à un modèle à site unique avec les paramètres suivants : n = 1,2 ± 0,1 ; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3,4 ± 0,2 kJ mol-1. (B) Un titrage témoin représentatif de 1,4 mM Cu(II) en 15 mM MOPS, pH 7,4, en l’absence de peptide C ne montrant aucun thermogramme de liaison qui est vu dans le panneau A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

[Peptide C] A265 [Cu(phen)3] 2+ [phén] libre [Peptide C] libre [Cu(II)/C-peptide] Kex (x108) KdCu(II)/C-peptide log KdCu(II)/C-peptide
0.0 1.0649 11.83 4.5 0 0.00 Nd Nd Nd
9.7 0.9948 11.05 6.84 7.45 0.78 0.0543 1.84E-08 7.75
18.7 0.9785 10.87 7.38 16.00 0.96 0.0367 2.73E-08 7.56
27.3 0.9651 10.72 7.83 24.09 1.11 0.0310 3.23E-08 7.49
35.3 0.9475 10.53 8.42 31.55 1.30 0.0307 3.26E-08 7.49
42.8 0.9374 10.42 8.75 38.79 1.42 0.0288 3.48E-08 7.46
50.0 0.9283 10.31 9.06 45.64 1.52 0.0275 3.63E-08 7.44
56.7 0.9134 10.15 9.55 51.92 1.68 0.0288 3.47E-08 7.46
63.1 0.9025 10.03 9.92 57.97 1.81 0.0291 3.43E-08 7.46
69.2 0.8927 9.92 10.24 63.73 1.91 0.0294 3.40E-08 7.47
75.0 0.878 9.76 10.73 69.04 2.08 0.0314 3.19E-08 7.50
85.7 0.8542 9.49 11.53 78.99 2.34 0.0341 2.93E-08 7.53
95.4 0.8316 9.24 12.28 88.01 2.59 0.0371 2.69E-08 7.57
104.3 0.8151 9.06 12.83 96.38 2.78 0.0387 2.58E-08 7.59
112.4 0.7976 8.86 13.41 103.98 2.97 0.0411 2.44E-08 7.61
126.9 0.7809 8.68 13.97 117.87 3.16 0.0411 2.44E-08 7.61
139.2 0.7586 8.43 14.71 129.53 3.40 0.0437 2.29E-08 7.64
Gamme 7.4-7.8

Tableau 1 : Calculs représentatifs des concentrations d’espèces en solution de la figure 2B. Toutes les concentrations sont en micromolaire. Ce tableau est reproduit avec la permission de Stevenson et al.14.

Équlibria n ΔH (kJ mol-1) n × ΔH (kJ mol-1)
Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS 1 5.4 5.44
MOPS + H+ → MOPS-H+ 0.097 −21,0 −2,04
Cu(II) + C-peptide-H+ → Cu(II)/C-peptide + H+ 1 X X
ΔHITC = Χ + 3,40
Χ = ΔHITC − 3,40
Χ = ΔHCu(II)/C-peptide = −6,8 kJ mol-1

Tableau 2 : Analyse post-hoc pour déterminer leΔH Cu(II)/C-peptide. Comme le montre la figure 3,1,4 mM Cu(II) a été titré en 154 μM C-peptide dans 15 mM MOPS, pH 7,4, en triplicate. Après avoir pris en compte tous les équilibres concurrents présentés dans le tableau, leΔH Cu(II)/C-peptide se trouve à −8,66 kJ mol-1. Le nombre de protons déplacés du peptide C par Cu(II) est déterminé à partir de la pente de (ΔHITC + ΔHCu(II)-Buffer) vs ΔHBuffer-H où les données sont collectées dans plusieurs tampons. Toutes les valeurs d’enthalpie se trouvent dans le NIST25 ou sont déterminées ailleurs dans la littérature15. Tous les équilibres concurrents sont comptabilisés comme décrit par Grossoehme et al.20 Cette figure est réimprimée avec la permission de Stevenson et al.15.

Fichier supplémentaire: Équations pertinentes utilisées dans la section du protocole et paramètres supplémentaires pour le spectrophotomètre d’absorption électronique et la configuration ITC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cet article fournit une méthode robuste pour quantifier l’affinité et la thermodynamique de la liaison cu(II) aux peptides. Les complexes avec Cu(II) sont parfaitement adaptés pour surveiller la bande d’absorption d-d sur le site métallique en raison de sa configuration électronique d9 . Bien que le coefficient d’extinction soit faible, nécessitant ainsi de plus grandes concentrations du complexe pour produire un signal fiable, les titrages de Cu(II) en peptide peuvent rapidement fournir un aperçu de la stœchiométrie de liaison et de l’affinité de liaison approximative. Cependant, il peut être difficile de discerner une différence de spectre si le métal est coordonné par des atomes et des géométries similaires à la fois du tampon et du peptide. Pour déterminer quantitativement l’affinité de liaison, des ligands chromophoriques tels que phen sont souvent utilisés en raison de leurs transferts de charge autorisés par symétrie avec les ions métalliques21. En mettant en place une compétition entre un ligand chromophorique et un peptide non chromophorique et en connaissant l’affinité du métal pour le ligand, l’affinité métal-peptide peut être directement déterminée. Une analyse thermodynamique plus poussée à l’aide de la spectroscopie d’absorption électronique est un défi. Pour quantifier l’enthalpie de liaison à l’aide d’une technique telle que la spectroscopie UV-Vis, l’affinité de liaison doit être déterminée à plusieurs températures et une analyse de van’t Hoff doit être effectuée. Cette analyse suppose que la chaleur spécifique de liaison est nulle, ce qui est rarement vrai et ne fournit donc qu’une estimation de l’enthalpie de liaison20.

La calorimétrie de titrage isotherme est mieux adaptée pour élucider un aperçu plus complet de la thermodynamique des interactions métal-peptide. Dans cette technique, un ion métallique est titré dans la solution peptidique et la chaleur de divers équilibres est directement mesurée. Comme l’expérience est menée à pression constante, la chaleur mesurée par l’ITC est égale à l’enthalpie. L’ITC peut surmonter certaines des limites de la spectroscopie d’absorption électronique, telles que l’étude spectroscopique des ions métalliques silencieux et le fait de ne pas avoir besoin de faire les hypothèses comme cela a été fait dans l’analyse de van’t Hoff. Cependant, parfois, les réactions qui ont lieu dans l’ITC génèrent peu ou pas de chaleur et ne sont donc pas observées. Cela peut être contourné en augmentant les concentrations de métal et de peptide ou en utilisant un tampon différent avec une enthalpie de protonation différente. Ce dernier est particulièrement utile si l’ion métallique déplace plusieurs protons lors de la liaison au peptide. Cependant, les deux techniques - ITC et spectroscopie d’absorption électronique - fournissent des méthodes orthogonales pour étudier le même système et bien se compléter.

Il existe de nombreux aspects difficiles dans les deux techniques lors de l’étude de la liaison des ions métalliques aux peptides. De nombreux ions métalliques sont insolubles ou peu solubles dans l’eau. Ceci est encore exacerbé par la précipitation de l’ion métallique lorsqu’il est ajouté au tampon. Dans l’ITC, cela peut se manifester par un changement lent et progressif de la ligne de base et de grandes quantités de chaleur générées lorsque le métal est injecté. Ceci est révélateur de grandes valeurs de chaleur de dilution même après que le peptide soit saturé par l’ion métallique. En spectroscopie d’absorption électronique, la précipitation d’ions métalliques se manifeste par une absorption accrue à des longueurs d’onde plus faibles et ressemble à un large pic centré dans la région UV. Dans les deux techniques, l’expérimentateur doit s’assurer que l’ion métallique est soluble dans les conditions de son choix (p. ex. tampon, pH, température, concentration). Une autre limitation aux deux méthodes peut se manifester à travers le concept d’ordre d’addition. Dans certains cas, un complexe métallique formé peut être labile, tandis que l’ajout des mêmes réactifs dans un ordre différent rendrait une autre espèce intermédiaire inerte. Cette illustration du contrôle cinétique par rapport au contrôle thermodynamique entrave l’analyse précise de tous les équilibres concurrents.

L’ITC et la spectroscopie d’absorption électronique reposent sur des compétitions entre le peptide et le tampon ou le ligand pour lier l’ion métallique. Ici, la valeur c est introduite, ce qui aide à identifier si KITC peut être déterminé avec précision par l’algorithme d’ajustement. La valeur c est définie dans le fichier supplémentaire Eq (7)20, où n est stœchiométrie, KITC est l’affinité de liaison apparente et [cellule échantillon] est la concentration de l’espèce dans la cellule échantillon. Lorsque la valeur c est comprise entre 1 et 1 000, le KITC déterminé est exact. Toutefois, les valeurs c inférieures à 1 ne peuvent fournir qu’une limite supérieure à KITC, tandis que les valeurs c supérieures à 1 000 ne peuvent fournir qu’une limite inférieurede 20. C’est la valeur de la collecte de données à partir de techniques complémentaires: si quelque chose est manqué dans une technique en raison de ses limites, il peut être pris dans sa technique complémentaire. Dans ces expériences, si la compétition est grandement favorisée à une espèce (c’est-à-dire que l’affinité ionique métallique du peptide est beaucoup plus grande que l’affinité du tampon), les équilibres seront déplacés, ce qui le rendra difficile à interpréter. Ceci est également montré en détail par Kocyla et al.23. Pour contourner ce défi, l’introduction ou le remplacement par un ligand concurrent différent, ou le choix d’un tampon différent est souvent utilisé pour augmenter la concurrence entre le ligand et le peptide pour une quantification précise. En effet, la différence d’affinités métal-tampon (ou métal-ligand) et métal-peptide permettrait à la valeur c de tomber dans la fenêtre de 1 à 1 000. Il convient toutefois de noter que l’utilisation d’un ligand concurrent ou d’un autre tampon pour l’analyse quantitative nécessite que les paramètres thermodynamiques du complexe métal-ligand ou métal-tampon soient connus ou puissent être déterminés par d’autres moyens.

Enfin, quantifier avec précision la concentration de peptides peut être difficile. Certaines façons courantes de quantifier les concentrations de peptides sont de mesurer des acides aminés spécifiques et de relier la quantité de ces acides aminés à la séquence du peptide. Par exemple, la spectroscopie d’absorption électronique peut mesurer des résidus aromatiques tels que la tyrosine, le réactif d’Ellman peut quantifier le nombre de thiols libres26, et les essais de Bradford fournissent une indication du nombre de résidus présents27. Malheureusement, les peptides tels que celui utilisé dans cette étude n’ont pas de résidus aromatiques ou de thiols libres, et les tests de Bradford posent des défis lorsqu’ils comparent les étalons de protéines massives avec le petit peptide d’intérêt. Au lieu de cela, la concentration en peptides a été déterminée par la masse sèche. Bien qu’elles ne soient pas idéales et sujettes à de légères surestimations de la concentration peptidique (car les mesures de masse apparente sont probablement plus élevées que les masses peptidiques réelles en raison de la présence de sels), toutes les aliquotes pour la mesure ont été traitées de la même manière, ce qui permet des comparaisons plus précises. Dans les études spectroscopiques, si la concentration de peptide libre est plus faible que prévu, l’affinité de liaison calculée représente une limite inférieure (Fichier supplémentaire, Eq (5) et Eq (6)). Il y a des défis associés aux deux techniques montrées, mais avec la littérature comme guide, beaucoup peuvent être surmontés.

L’approche expérimentale détaillée ici permet une quantification précise de la thermodynamique de liaison métal-peptide. L’ITC et la spectroscopie d’absorption électronique sont orthogonales et fournissent un aperçu de l’affinité de liaison, mais l’ITC permet une quantification directe de l’enthalpie. Une fois ces thermodynamiques quantifiées, on peut déduire si ces complexes métal-peptide peuvent se former dans des conditions physiologiques. Au fur et à mesure que la compréhension du flux physiologique d’ions métalliques se développe, il est possible de prédire si l’affinité de liaison est suffisamment forte pour une formation complexe in vivo . En outre, le chercheur peut faire des prédictions sur les compétitions entre plusieurs ions métalliques pour le même peptide ou plusieurs peptides pour le même ion métallique. En examinant ces compétitions entre les ions métalliques et les peptides, le chercheur peut commencer à comprendre ce qui contribue à l’affinité de liaison du complexe métal-peptide en analysant l’énergie libre en contributions d’enthalpie et d’entropie. La thermodynamique fait partie intégrante de l’appréciation de l’interaction dynamique entre les ions métalliques et les peptides, et l’ITC et la spectroscopie d’absorption électronique fournissent des poignées pour interroger ces systèmes. Les méthodes décrites ici peuvent être étendues et utilisées pour étudier d’autres interactions de liaison aux ions métalliques avec les macromolécules, et peuvent avoir des implications dans les processus physiologiques, la conception de médicaments, etc.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

SC remercie la bourse de recherche d’été Whitehead. MJS remercie les Startup Funds et le Faculty Development Fund de l’Université de San Francisco. MCH reconnaît le financement des National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) et de la National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma Aldrich 131377-25G
bis-Tris buffer Fisher BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane Nalgene 296-4545 Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride Alfa Aesar 12458
EDTA Sigma Aldrich EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer Varian Cary 5000 Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin Sigma Aldrich C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC) TA Instruments Nano ITC Low Volume
ITC analysis software TA Instruments NanoAnalyze SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software TA Instruments ITCRun
light-duty delicate wiper Kimwipe 34155
loading syringe Hamilton Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes Starna Cells, Inc 16.100-Q-10/Z20 Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer Alfa Aesar A12914
spectrophotometer software Cary WinUV Scan
spreadsheet program Microsoft Excel Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe TA Instruments 5346
ultrapure water Millipore Sigma Milli-Q Any water is okay as long as >18 MΩ resistance

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References

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Biochimie numéro 182
Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores
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Choi, S., San Juan, J. A., Heffern,… More

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).

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