Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

قياس التفاعلات الملزمة بين Cu(II) وبقايا الببتيد في وجود وغياب الكروموفور

Published: April 5, 2022 doi: 10.3791/63668
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, University of San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Davis

Summary

تركز هذه المقالة على استخدام التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص وقياس السعرات الحرارية بالمعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة لفحص وقياس الديناميكا الحرارية لارتباط Cu(II) بالببتيدات والبروتينات.

Abstract

النحاس (II) هو معدن أساسي في النظم البيولوجية ، ويمنح خصائص كيميائية فريدة للجزيئات الحيوية التي يتفاعل معها. وقد أفيد أنه يرتبط مباشرة بمجموعة متنوعة من الببتيدات ويلعب أدوارا ضرورية ومرضية تتراوح من بنية الوساطة إلى خصائص نقل الإلكترون إلى نقل الوظيفة الحفازة. إن تحديد تقارب الارتباط والديناميكا الحرارية لمجمعات Cu(II)-peptide هذه في المختبر يوفر نظرة ثاقبة على القوة الدافعة الديناميكية الحرارية للربط ، والمسابقات المحتملة بين أيونات المعادن المختلفة للببتيد أو بين الببتيدات المختلفة ل Cu(II) ، وانتشار مركب Cu(II)-الببتيد في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن تحديد الديناميكا الحرارية الملزمة يمكن أن يكون تحديا بسبب عدد لا يحصى من العوامل، بما في ذلك حساب جميع التوازنات المتنافسة ضمن تجربة المعايرة، خاصة في الحالات التي يكون فيها هناك نقص في المقابض الطيفية المنفصلة التي تمثل الببتيد، وأيون المعدن d-block، وتفاعلاتهما.

هنا ، يتم توفير مجموعة قوية من التجارب لتحديد كمي دقيق للديناميكا الحرارية Cu(II)-peptide. تركز هذه المقالة على استخدام التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص في وجود وغياب الروابط الكروموفورية لتوفير المقبض الطيفي اللازم على Cu(II) واستخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة الخالي من الملصقات. في كلتا التقنيتين التجريبيتين ، يتم وصف العملية لحساب جميع التوازنات المتنافسة. في حين أن تركيز هذه المقالة ينصب على Cu(II) ، يمكن أن تنطبق مجموعة التجارب الموصوفة على ما وراء تفاعلات Cu(II) - الببتيد ، وتوفر إطارا للقياس الكمي الدقيق لأنظمة الببتيد المعدني الأخرى في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

Introduction

تطورت البيولوجيا للاستفادة من الكيمياء المتنوعة لأيونات المعادن اللازمة للحياة للتكيف والبقاء على قيد الحياة في البيئة المحيطة بها. ما يقدر بنحو 25٪ -50٪ من البروتينات تستخدم أيونات المعادن للهيكل والوظيفة1. يرتبط الدور الخاص وحالة الأكسدة والاختزال لأيون المعدن ارتباطا مباشرا بتكوين وهندسة الروابط البيولوجية التي تنسقه. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنظيم أيونات المعادن النشطة بالأكسدة والاختزال مثل Cu (II) بإحكام خشية أن تتفاعل مع العوامل المؤكسدة عبر كيمياء تشبه فينتون لتشكيل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) 2،3،4. إن فهم أوضاع الربط والتقارب التي تقود الكيمياء الحيوية يجب أن يساعد في توضيح الدور البيولوجي لأيون المعدن.

تستخدم العديد من التقنيات لدراسة التفاعلات الملزمة للمعادن والببتيدات. هذه هي في الغالب تقنيات طيفية ولكنها تشمل أيضا محاكاة الكمبيوتر باستخدام الديناميكا الجزيئية ، كما يتضح من خلال تفاعلات Cu (II) مع جزء من بيتا أميلويد (Aβ)5. تقنية طيفية مستخدمة على نطاق واسع والتي يمكن الوصول إليها من قبل العديد من الجامعات هي الرنين المغناطيسي النووي (NMR). باستخدام الطبيعة البارامغناطيسية ل Cu(II) ، تمكن Gaggelli et al. من إظهار المكان الذي يرتبط فيه أيون المعدن على البتيد من خلال استرخاء النوى القريبة6. يمكن أيضا استخدام الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني (EPR) لاستكشاف موقع ووضع ربط أيون المعدن شبه المغناطيسي7. يمكن للتقنيات الطيفية الأخرى مثل الثنائيات الدائرية (CD) أن تصف التنسيق حول Cu (II) في أنظمة مثل أنظمة الببتيد الثلاثي8 ، ويمكن أن يظهر قياس الطيف الكتلي قياس stoichiometry وأي بقايا يتم تنسيق أيون المعدن من خلال أنماط التجزئة 9,10.

بعض هذه التقنيات ، مثل الرنين المغناطيسي النووي ، خالية من الملصقات ولكنها تتطلب تركيزات كبيرة من الببتيد ، مما يشكل تحديات للدراسة. تم استخدام تقنية شائعة أخرى تسمى التحليل الطيفي الفلوري لربط موضع التيروزين أو التربتوفان مع التبريد من Cu(II)11,12. وبالمثل ، يمكن لهذه التقنية إظهار التغيرات الهيكلية نتيجة لربط Cu (II)13. ومع ذلك ، فإن التحديات التي تواجه دراسات ربط الببتيد المعدني هذه هي أنها تسبر الأحماض الأمينية الكروموفورية مثل التيروزين التي لا تمتلكها جميع الأنظمة ، وأن أيون المعدن يرتبط بموجب نموذج كلاسيكي ، وأن هذه التقنية قد لا تكون مواتية في ظل الظروف الفسيولوجية. في الواقع ، تظهر العديد من الببتيدات التي لا تحتوي على مثل هذه الأحماض الأمينية الكروموفورية أو ترتبط بموجب النماذج الكلاسيكية ، مما يحول دون استخدام هذه التقنيات14,15. توضح هذه المقالة بالتفصيل طرق تقييم خصائص الربط في هذه السيناريوهات في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

قد تعتمد الروابط البيولوجية حالات بروتونات مختلفة يمكن أن تؤثر على ربط أيون المعدن مثل حلقة الإيميدازول على الهستيدين. إذا لم يتم الحفاظ على درجة الحموضة باستمرار ، فقد تكون النتائج معقدة أو متضاربة. لهذا السبب ، تعد المخازن المؤقتة مكونا أساسيا في دراسة تفاعلات البروتين المعدني / الببتيد. ومع ذلك ، فقد ثبت أن العديد من المخازن المؤقتة تتفاعل بشكل إيجابي مع أيونات المعادن16,17. بالإضافة إلى التنافس مع الجزيء البيولوجي محل الاهتمام ، قد يكون للمخزن المؤقت ذرات منسقة مماثلة قد يكون من الصعب تمييزها عن الذرات المنسقة للببتيد أو البروتين. في هذه الدراسة ، ينصب التركيز على التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني وقياس السعرات الحرارية بالمعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) كتقنيتين تكميليتين لدراسة تفاعلات Cu (II) - الببتيد ، مع اعتبارات خاصة تتعلق باختيار المخزن المؤقت.

التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص هو تقنية سريعة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة التفاعلات المرتبطة بالمعادن. يمكن أن يؤدي التشعيع بالضوء في الأشعة فوق البنفسجية (UV) أو الأطوال الموجية المرئية إلى امتصاص نطاقات d-d المتمركزة حول المعادن ، والتي توفر معلومات قيمة عن تصنيف الليغاند ، والهندسة المعدنية ، وتقاربات الارتباط الواضحة18,19. بالنسبة لهذه المجمعات ، يمكن للمعايرة المباشرة لأيونات المعادن إلى محاليل البروتين أو الببتيد أن تحدد كميا مقاييس stoichiometry الملزمة والتقاربات الملزمة الواضحة. في بعض الحالات ، مثل تكوينات الإلكترون d5 أو d10 ، لا يمتص المجمع الضوء (أي أنه صامت طيفيا). في هذه المجمعات الفلزية الانتقالية الصامتة طيفيا ، يمكن التحايل على هذه القيود باستخدام رباط منافس ، عند التنسيق مع أيون المعدن ، ينتج نطاقات نقل شحنة يمكن اكتشافها. وفي كلتا الحالتين، يقتصر هذا النهج على القياس الكمي فقط لقياس الستويشيومتري والتقارب الواضح بين الروابط، ولا يتم توفير أي نظرة ثاقبة على المحتوى الحراري الملزم دون تقريب.

واستكمالا للمعلومات التي تم الحصول عليها من التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص، يعد مركز التجارة الدولية تقنية جذابة للقياس الكمي المباشر والصارم للمحتوى الحراري20 الملزم. يقيس مركز التجارة الدولية مباشرة الحرارة المنبعثة أو المستهلكة أثناء حدث ملزم ، وبما أن المعايرة بالتحليل الحجمي تتم عند ضغط ثابت ، فإن الحرارة المقاسة هي المحتوى الحراري لجميع التوازنات (ΔHITC). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد كمية قياس stoichiometry لحدث الربط (n) وتقارب الارتباط الظاهر (KITC). من هذه المعلمات ، يتم تحديد الطاقة الحرة (ΔG ITC) والإنتروبيا (ΔSITC) ، مما يوفر لقطة ديناميكية حرارية لحدث الربط. وبما أنه لا يعتمد على امتصاص الضوء، فإن مركز التجارة الدولية هو تقنية مثالية للأنواع الصامتة طيفيا، على سبيل المثال، d5 أو d10 مجمعات أيون معدنية. ومع ذلك ، نظرا لأن قياس السعرات الحرارية يقيس الحرارة ، فإن أي أنظمة عازلة لا مثيل لها وتوازن غير محسوب قد يؤثر سلبا على التحليل لتحديد الديناميكا الحرارية المرتبطة بأيون المعدن بدقة ، ويجب توخي الحذر الشديد لمعالجة هذه العوامل20. إذا تم تنفيذ ITC بدقة مناسبة ، فهي تقنية قوية لتحديد الديناميكا الحرارية لمجمعات البروتين المعدني / الببتيد.

هنا ، يتم استخدام ببتيد ملزم بالنحاس صامت كروموفوريا ، C-peptide ، لإثبات الاستخدام التكميلي للتقنيتين. الببتيد C هو منتج انقسام بقايا 31 (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) يتكون أثناء نضج الأنسولين. يفتقر إلى بقايا الكروموفوريك ولكن ثبت أنه يربط Cu (II) مع التقارب ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية14,15. يتكون موقع ربط Cu(II) من سلاسل جانبية من الغلوتامات والأسبارتات بالإضافة إلى المحطة N للببتيد14,15. تشبه هذه الذرات المنسقة إلى حد كبير تلك الموجودة في العديد من الأنظمة العازلة شائعة الاستخدام. هنا ، يظهر الاستخدام الترادفي لنطاقات نقل الشحنة d-d والشحنة في التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني و ITC في تحديد الديناميكا الحرارية الملزمة Cu (II) بالببتيد C. يمكن تطبيق النهج من دراسة ارتباط Cu (II) بالببتيد C على أيونات المعادن الأخرى وأنظمة البروتين / الببتيد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني: المعايرة بالتحليل الحجمي المباشر مع منافسة المخزن المؤقت

  1. إعداد العينات
    1. تحضير محلول مخزن من 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol (bisTris) عند درجة الحموضة 7.4 باستخدام ماء فائق النقاء (مقاومة >18 MΩ). قم بإزالة أيونات المعادن النزرة عن طريق الحضانة باستخدام راتنج عالي التقارب لمدة 2 ساعة على الأقل مع الترشيح اللاحق.
    2. قم بإذابة أو تخفيف كمية معروفة من الببتيد في المخزن المؤقت الخالي من المعادن.
      ملاحظة: عند رصد نطاقات d-d ذات معاملات الانقراض الصغيرة21 ، يجب استخدام تركيزات أعلى من الببتيد. هنا ، كان التركيز النهائي للببتيد C في محلول مخزن مؤقتا 300 ميكرومتر (يعتمد الحجم على حجم الكوفيت). تم تصنيع الببتيد C عن طريق تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة ويتم تفصيله في مكان آخر في الأدب14.
    3. قم بإذابة كتلة معروفة من CuCl2 في ماء فائق النقاء لصنع محلول عند 10-15 mM.
      ملاحظة: من المهم في البداية إذابة الملح المعدني في المياه غير العازلة لمنع هطول الأمطار. يمكن استخدام أملاح Cu(II) أخرى ، ولكن يجب توخي الحذر للتأكد من أن الأنيون ضعيف التنسيق.
  2. تشغيل التجربة
    1. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي الإلكتروني للامتصاص واتركه يسخن لمدة 15-20 دقيقة تقريبا قبل الاستخدام. قم بتشغيل برنامج مقياس الطيف الضوئي وقم بتكوين المعلمات مثل نطاق المسح الضوئي (200-900 نانومتر) ومعدل المسح الضوئي (200 نانومتر / ثانية) وتصحيح خط الأساس للحزمة المزدوجة (يتم سرد المزيد من المعلمات في الملف التكميلي).
    2. اجمع خط أساس بدون كوفيت أو عينات في مسارات الحزمة.
    3. باستخدام اثنين من الكوفيت المتطابقة في مقياس الطيف الضوئي مزدوج الحزمة، قم بتحميل كوفيت واحد مع 115 ميكرولتر من الماء فائق النقاء والآخر كوفيت مع 115 ميكرولتر من عينة الببتيد. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الكوفيت لأنها سوف تتداخل مع الإشارة.
    4. ضع الكوفيت بماء فائق النقاء في الشعاع المرجعي والكوفيت مع الببتيد في شعاع العينة.
    5. جمع طيف امتصاص الببتيد الخالي من المعادن (apo).
    6. أضف كمية دون stoichiometric (0.5 مكافئ ، 150 ميكرومتر) من محلول Cu (II) إلى cuvette مع عينة الببتيد. تأكد من أن حجم Cu(II) المضاف أقل من 3 ميكرولتر وسجل المجلد للتحليل لاحقا.
    7. ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لخلط المحلول مع تجنب توليد فقاعات الهواء. دع المحلول يتفاعل ويتوازن لمدة 5 دقائق وسجل طيف الامتصاص.
    8. كرر إضافة ألينات Cu(II) كما في الخطوة 1.2.6 إلى محلول الببتيد للمعادلات التالية: 1.0 و 1.5 و 2.0 و 3.0 و 5.0 (أو ما مجموعه 300 و 450 و 600 و 900 و 1500 ميكرومتر). تأكد من تسجيل الحجم الإجمالي ل Cu(II) المضافة والحجم الإجمالي للكوفيت.
      ملاحظة: إذا كنت ترغب في مزيد من الدقة، قم بتقليل التباعد بين المعادلات.
    9. قم بإزالة العينة cuvette وتنظيفها جيدا وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.
    10. أضف المحلول المخزن مؤقتا بدون الببتيد وسجل طيف الامتصاص. كرر إضافة الاقتباسات Cu(II) كما في الخطوات 1.2.5-1.2.8، مع تسجيل طيف الامتصاص لكل مكافئ Cu(II).
    11. تصدير جميع الأطياف كملفات csv للمعالجة. قم بتنظيف الكوفيت جيدا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي.
  3. معالجة البيانات
    1. قم بتحميل جميع الأطياف على برنامج جدول بيانات.
    2. اطرح طيف المخزن المؤقت فقط (0 μM Cu(II)) من كل طيف آخر لإزالة أي ميزات امتصاص من المخزن المؤقت نفسه.
    3. تطبيع كل طيف لحساب التخفيف الناتج عن إضافة محلول Cu(II) (الخطوة 6.2.1). انظر الملف التكميلي، Eq (1)14 للحصول على مثال على التطبيع حيث vالأولي هو حجم (115 ميكرولتر) من الببتيد المضاف إلى الكوفيت، v Cu(II) هو حجم محلولCu(II) المضاف في الخطوة 1.2.6،والطيف المطروح لمخزن ABS هو البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.7.
    4. رسم بياني لجميع الأطياف معا لتحديد مناطق التغيير.
      ملاحظة: تتراوح نطاقات d-d النموذجية من مجمعات Cu(II) من 500 إلى 750 نانومتر. يمكن أن يكون هذا المعايرة بالتحليل الحجمي الطيفي تحديا بسبب معامل الانقراض الصغير من نطاقات d-d ، وهي انتقالات محظورة من لابورت في الهندسة ثماني السطوح21. إذا كان الامتصاص ضعيفا جدا ، فإن النهج البديل هو استخدام روابط كروموفوريك تؤدي إلى نطاقات نقل الشحنة عند الارتباط ب Cu (II) (انظر القسم 2).

2. التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني: منافسة الببتيد مع الرباط الكروموفوري

  1. إعداد العينات
    1. قم بإذابة 1,10-phenanthroline (phen) في ماء فائق النقاء للحصول على تركيز نهائي يبلغ ~ 1 mM.
    2. بالإضافة إلى إعداد العينة الموصوفة في القسم 1.1 للببتيد (الخطوة 1.1.2) و Cu(II) (الخطوة 1.1.3) ، قم بإعداد محلول 10 ميكرومتر Cu(II) و 40 μM phen في المخزن المؤقت ([Cu(phen)3]2+). تأكد من أن وحدة التخزين تملأ الكوفيت.
  2. تشغيل التجربة
    1. ابدأ تشغيل مقياس الطيف الضوئي الإلكتروني للامتصاص كما في الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2 ولكن اضبط نطاق المسح الضوئي على 200-400 نانومتر.
    2. في اثنين من الكوفيت المتطابقة ، قم بتحميل كوفيت واحد مع 115 ميكرولتر من الماء فائق النقاء والآخر كوفيت مع 115 ميكرولتر من محلول [Cu(phen)3]2+ . ضع الكوفيت بالماء في الشعاع المرجعي والكوفيت بمحلول [Cu(phen)3]2+ في شعاع العينة.
    3. جمع طيف امتصاص مجمع الليغاند المعدني.
    4. أضف كمية stoichiometric (≈1 مكافئة ، ≈10 ميكرومتر) من الببتيد إلى محلول [Cu(phen)3] 2+ . ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لخلط جيدا ولكن احرص على عدم إدخال فقاعات الهواء. سجل حجم الببتيد المضاف للتحليل المستقبلي.
      ملاحظة: باستخدام cuvettes التي تحمل 115 ميكرولتر ، إضافة 3.83 ميكرولتر من 300 ميكرومتر الببتيد ينتج تركيز الببتيد النهائي من 9.7 ميكرومتر.
    5. احتضان الحل لمدة 5 دقائق للوصول إلى التوازن. سجل طيف الامتصاص.
      ملاحظة: إذا كان تقارب ربط الببتيد المعدني والليغاند المعدني متشابهين ، فيجب أن يكون تركيز الببتيد المضاف زائدا بشكل كبير. تأكد من حساب الحجم الإجمالي للببتيد المضاف للتطبيع.
    6. كرر إضافة أليكوتات الببتيد إلى محلول [Cu(phen)3]2+ للمعادلات التقريبية التالية: 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 و 12 و 14 و 16 و 18 و 22 و 26 . سجل حجم الببتيد المضاف بحيث يمكن تحديد التركيز المخفف.
    7. قم بإزالة العينة وتنظيف الكوفيت جيدا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. جمع طيف من المخزن المؤقت. جمع طيف من الببتيد 50 ميكرومتر في المخزن المؤقت.
    8. قم بتصدير جميع البيانات كملفات csv لمعالجة وتنظيف cuvettes وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. معالجة البيانات
    1. قم بتحميل الأطياف على برنامج جدول بيانات واطرح الطيف العازل من الأطياف الأخرى.
    2. تطبيع الأطياف التالية الملف التكميلي، Eq (2)14.
    3. باستخدام معامل الانقراض ل [Cu(phen)3]2+ عند 265 نانومتر (εكحد أقصى = 90000 M-1 cm-1)22، أوجد تركيز [Cu(phen)3]2+ مع كل إضافة للببتيد.
    4. لكل إضافة للببتيد، أوجد تركيز مركب الببتيد Cu(II)-الببتيد بطرح التركيز المتبقي من [Cu(phen)3]2+، كما هو محدد في الخطوة 2.3.2، من التركيز الأولي ل [Cu(phen)3]2+ (عند 0 μM الببتيد).
    5. احسب تركيز رباط الفين الحر بواسطة المعادلة في الملف التكميلي، Eq (3)14.
    6. احسب تركيز الببتيد الحر باستخدام الملف التكميلي، Eq (4)14، حيث يمثل مخزون [الببتيد] الببتيد غير المخفف المعاير في الكوفيت، ويمثل V1 حجم الببتيد المضاف، وV 2 هو الحجم الإجمالي للكوفيت، ويتم تحديد [Cu2+-peptide] في الخطوة 2.3.4.
    7. احسب تقارب الربط التجريبي (Kex) باستخدام Eq (5) في الملف التكميلي23.
    8. ربط ثابت التفكك ل Cu(II)-peptide ب Kex بواسطة Eq (6)23 في الملف التكميلي ، حيث Kd ، Cu (II) -phen = 1.0 × 10-9 (انظر 22). أوجد متوسط الانحراف المعياري عن جميع ثوابت التفكك المحددة.
      ملاحظة: تحت نسبة 4: 1 من phen:Cu(II) و [Cu(phen)3]2+، [Cu(phen)2]2+، و [Cu(phen)]2+ موجودة في المحلول، وسوف يقوم الببتيد بتخليب Cu(II) بعيدا عن الأنواع ([Cu(phen)]2+) مع أضعف ربط 22.

3. معايرة حرارية متساوية الحرارة

  1. إعداد العينات
    1. قم بإعداد محلول مخزن مؤقتا من 15 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) عند درجة الحموضة 7.4 باستخدام ماء فائق النقاء (مقاومة >18 MΩ). قم بإزالة أيونات المعادن النزرة عن طريق الحضانة باستخدام راتنج عالي التقارب لمدة 2 ساعة على الأقل مع ترشيح فراغي لاحق من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر أعلى زجاجة.
    2. قم بإذابة كتلة معروفة من CuCl2 في ماء فائق النقاء لإعداد محلول ≈50-100 mM. قم بتخفيف محلول Cu(II) هذا إلى مخزن مؤقت للحصول على محلول 1.0 مل بتركيز نهائي يبلغ 1.4 mM Cu(II). سجل الحجم الدقيق لمحلول CuCl2 المستخدم.
    3. قم بإذابة أو تخفيف محلول الببتيد في المخزن المؤقت لصنع 450 ميكرولتر من محلول الببتيد 154 ميكرومتر. تأكد من إضافة نفس النسبة من الماء الإضافي فائق النقاء من الخطوة 3.1.2 إلى محلول الببتيد ، مما يقلل من حرارة التخفيف ويزيد من الإشارة إلى الضوضاء.
    4. بعد إعداد العينات ، تأكد من أن المحاليل في نفس درجة الحموضة ، وإذا لزم الأمر ، اضبطها وفقا لذلك.
    5. الخطوة الاختيارية: قم بتفريغ الحلول لتقليل الفقاعات الدقيقة المحملة في مركز التجارة الدولية.
  2. تشغيل التجربة
    1. قم بتشغيل مركز التجارة الدولية. قم بتشغيل برنامج ITC لتشغيل الأداة. انتظر التهيئة الأولى ، والتي ستطلب إعادة توطين buret ؛ ثم اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة.
    2. قم بإزالة الغطاء من الخلية المرجعية. قم بإزالة أي ماء من الخلية المرجعية وشطفه ثلاث مرات باستخدام 450 ميكرولتر من الماء فائق النقاء المنزوع الغاز.
    3. اسحب الماء فائق النقاء ببطء إلى علامة 450 ميكرولتر لمحقنة التحميل ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في المحقنة. أدخل حقنة التحميل في الخلية المرجعية حتى ≈1 مم من الأسفل ، وقم بحقن جزء من المحلول ببطء حتى يبقى 150 ميكرولتر في حقنة التحميل. حرك مكبس حقنة التحميل بسرعة لأعلى ولأسفل بمقدار ≈25 ميكرولتر عدة مرات لإزاحة أي فقاعات على سطح الخلية. حقن ببطء حتى يصل المكبس إلى علامة 100 ميكرولتر على حقنة التحميل ، وبالتالي توزيع ما مجموعه 350 ميكرولتر من الماء فائق النقاء في الخلية المرجعية ، واستبدال غطاء الخلية المرجعية.
    4. قم بإزالة أي محلول متبقي من خلية العينة وقم بتحميله ب 450 ميكرولتر من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) 10 ملليمتر باستخدام حقنة تحميل. انقع لمدة 10 دقائق لضمان إزالة أيونات المعادن النزرة لأن EDTA سيربط المعادن النزرة.
    5. قم بإزالة محلول EDTA (مع أيونات المعادن النزرة المربوطة) وشطف حقنة التحميل جيدا بكميات وفيرة من الماء فائق النقاء.
    6. قم بتنظيف ITC وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة ، وشطف خلية العينة بالماء فائق النقاء.
    7. قم بتهيئة خلية العينة عن طريق الشطف باستخدام 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثلاث مرات على الأقل.
    8. قم بإزالة المخزن المؤقت الذي يقوم بتكييف خلية العينة. قم بتحميل محلول الببتيد في خلية العينة باستخدام حقنة التحميل (اتبع الخطوة 3.2.3).
    9. شطف حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي مع 200 ميكرولتر من محلول التخزين المؤقت. للقيام بذلك ، قم بإزالة المكبس واستخدم ماصة دقيقة لماصة المخزن المؤقت من خلال الفتحة الموجودة أعلى حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي الزجاجية ، من خلال المحقنة ، وخارج الإبرة أدناه.
    10. أدخل المكبس بالكامل في حقنة المعايرة.
    11. اغمس طرف إبرة حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في المحلول المعدني واسحب المكبس ببطء لأعلى، مما يتسبب في ملء المحلول المعدني للمحقنة وينتج عنه حجم فراغ في الجزء العلوي من الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة. قم بإزالة معظم حجم الفراغ عن طريق تدوير حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي موازية للأرض ، وإزالة المكبس ، وإمالة الجزء الزجاجي قليلا نحو الأرض. امنح حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي هزة لطيفة بحيث ينتقل المحلول إلى نهاية الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي ويملأ معظم حجم الفراغ ، ولكن تأكد من بقاء 2-3 ميكرولتر من حجم الفراغ. مع الحفاظ على المحقنة موازية للأرضية ، أعد إدخال المكبس.
    12. أمسك حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في وضع مستقيم ، واغمس طرف الإبرة مرة أخرى في المحلول المعدني ، وادفع المكبس لأسفل حتى يتوقف الهواء عن الخروج من الإبرة. قم بتحميل حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي عن طريق سحب المكبس ببطء إلى أعلى بقليل من علامة 50 ميكرولتر مع الحفاظ على طرف الإبرة في المحلول.
    13. أدخل بعناية الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في البوريت والمسمار حتى يضيق الإصبع. عندما تخرج كمية صغيرة من المحلول من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي بسبب ضغط المكبس ، استخدم ممسحة حساسة خفيفة لامتصاص المحلول بعناية دون لمس طرف الإبرة.
    14. أدخل البوريت مع حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في خلية العينة واربطها بإحكام.
    15. قم بإعداد المعلمات على برنامج ITC. بدءا من التحكم في الأداة، اضبط معدل التحريك (تتراوح معدلات التحريك النموذجية من 150 إلى 350 دورة في الدقيقة) ودرجة الحرارة التي ستجرى عندها التجربة (عادة 25 درجة مئوية). أدخل تركيزات المحقنة والخلية بوحدات الملليمولار ضمن تفاصيل التجربة.
    16. في القسم طريقة التجربة ، حدد المعايرة بالتحليل الحجمي التزايدي. انقر فوق إعداد وحدد 20 حقنة من 2.5 ميكرولتر. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الدقة لمراقبة حدث الربط ، فقم بزيادة عدد الحقن وتقليل الحجم لكل حقنة. أدخل التباعد الزمني بين كل حقنة بحيث تكون طويلة بما يكفي لتوازن الإشارة والعودة إلى خط الأساس ، عادة 300 ثانية.
    17. انقر على زر التشغيل لبدء التجربة وتحديد مكان حفظ البيانات.
    18. عند الانتهاء من التجربة ، قم بتنظيف خلية العينة ومحقنة المعايرة بالتحليل الحجمي.
    19. قم بإجراء جميع التجارب في ثلاثة أضعاف على الأقل لضمان جمع البيانات بدقة.
    20. قم بإجراء تجربة تحكم حيث يتم معايرة المحلول المعدني في المحلول المخزن مؤقتا (في حالة عدم وجود الببتيد) لضمان أن تكون حرارة التخفيف من أيون المعدن صغيرة وأنه لا توجد توازنات غير محسوبة. إذا كانت حرارة التخفيف كبيرة ، ففكر في نظام تخزين مؤقت مختلف ، إن أمكن.
  3. معالجة البيانات
    1. قم بتشغيل برنامج تحليل ITC وقم بتحميل ملف البيانات للتحليل.
    2. انتقل إلى علامة التبويب Baseline وافحص مخطط الحرارة. لاحظ أي حرارة خارجية تطورت أو امتصت من فقاعات الهواء أو غيرها من القطع الأثرية في مخطط الحرارة. ابحث عن المسامير التي لا ترجع إلى حقن المحلول المعدني.
    3. تأكد من أن خط الأساس الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج التحليل يتبع جزء البيانات بعد الحقن والتوازن. إذا انحرفت، فاستخدم النقاط المحورية الأساسية لضبط الخط الأساسي. تأكد من أن مناطق التكامل تشمل الذروة الناتجة عن حقن المعدن ، ولكن تحجب أي فقاعات هواء أو قطع أثرية في مخطط الحرارة الموجود في الخطوة 2. اطرح خط الأساس من مخطط الحرارة.
      ملاحظة: يوصى بهذا النوع من المعالجة فقط بعد جمع درجات حرارة متعددة، بحيث يعرف المجرب ما هي البيانات الحقيقية وما هي القطعة الأثرية، حيث أن ضبط خط الأساس ومناطق التكامل قد يؤثر بشكل كبير على البيانات.
    4. انتقل إلى نافذة النمذجة لبدء ملاءمة البيانات حيث سيعرض برنامج التحليل البيانات المتكاملة والطبيعية للتركيز لكل حقنة.
    5. انقر بزر الماوس الأيسر على مسند الحقن الأول لإزالته من خوارزمية التركيب.
      ملاحظة: هذا أمر شائع لأنه سيكون هناك خلط بسيط بين المعايرة ومحلول خلية العينة مما يؤدي إلى توزيع مولاري غير دقيق للحقنة الأولى.
    6. في قسم النماذج ، حدد فارغ (ثابت) في القائمة المنسدلة نمط ، والتي تستند إلى المحتوى الحراري النهائي للحقن وسيتم طرحها من كل نقطة بيانات، مع مراعاة حرارة التخفيف. بالإضافة إلى ذلك، حدد مستقل (أو أفضل طراز للنظام) في القائمة المنسدلة النمط الثاني لاحتواء البيانات.
      ملاحظة: بالنسبة للتفاعلات الملزمة القياسية 1:1، يكون النموذج الأكثر شيوعا هو Independent.
    7. قم بملاءمة البيانات باستخدام النموذجين عن طريق الضغط على زر التشغيل الأخضر باستخدام Σ.
      ملاحظة: برنامج آخر لمعالجة بيانات مركز التجارة الدولية هو SEDPHAT24.
    8. () حساب جميع التوازنات المتنافسة في التحليل اللاحق المخصص الذي سبق أن أبلغ عنه غروسوهمي وآخرون. 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان الهدف هو تحديد الديناميكا الحرارية لارتباط Cu(II) بالببتيد C وتأكيدها باستخدام التقنيات التكميلية للتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني ومركز التجارة الدولية. نظرا للطبيعة القوية للتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني ، تم إجراء معايرة مباشرة ل Cu (II) إلى 300 μM C-peptide (الشكل 1). تسببت إضافة 150 ميكرومتر من Cu(II) في زيادة فورية في النطاق عند 600 نانومتر ، تعزى إلى النطاق d-d من Cu(II) ، واستمرت في الزيادة حتى تمت إضافة 300 μM Cu (II). إضافة أخرى فوق 300 ميكرومتر مكعب (II) لم تزيد من امتصاص النطاق d-d ، مما يشير إلى التشبع وأن Cu (II) يرتبط بالببتيد C في مجمع 1: 1. علاوة على ذلك ، نظرا للتقارب العالي نسبيا ل bis-Tris للارتباط ب Cu (II) (log K = 5.27)16 ، يجب أن يكون لتقارب Cu (II) / C-peptide حد أدنى في نطاق micromolar (log K > 6) لتخليب أيون المعدن بعيدا عن المخزن المؤقت. في هذا النظام ، يمثل التحديد الكمي الدقيق لنطاقات الامتصاص تحديا بسبب معامل الانقراض الصغير.

للتحايل على معامل الانقراض الصغير للنطاق d-d ، تم استخدام رباط كروموفوري ، phen ، كما هو موضح أعلاه. تمت معايرة الببتيد C إلى ≈10 ميكرومتر [Cu(phen)3]2+ (الشكل 2A) ، وانخفض الامتصاص من نطاق نقل الشحنة عند 265 نانومتر (الشكل 2B) ، مما يشير إلى أن الببتيد C كان قادرا على تخليب Cu (II) من رباط الفين. عند الفحص الدقيق ، كانت هناك حاجة إلى تركيز كبير من الببتيد C (يصل إلى 140 ميكرومتر) للتفوق بشكل متواضع على رابطة الفين (الجدول 1). هذا ليس مفاجئا بالنظر إلى ثوابت التكوين المتسلسلة الكبيرة ل [Cu(phen)3]2+ (9.0 و 15.7 و 20.8 للسجل K1 و β2 و β 3 ، على التوالي)22. ويبين تحليل الأطياف أن تقارب ربط الببتيد Cu(II)/C-Peptide يقع في نطاق السجل K = 7.4-7.8 (الجدول 1).

المعيار الذهبي لقياس الديناميكا الحرارية الكاملة للتفاعل الملزم هو ITC. يوفر الشكل 3 مخططا حراريا تمثيليا ل Cu (II) معايرا إلى C-peptide في 15 mM MOPS ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، والذي يوفر المنافسة على Cu (II). وهنا، استخدم المخزن المؤقت MOPS بدلا من المخزن المؤقت bis-Tris لأن K Cu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25، وسيوفر منافسة أقل حتى يتمكن مركز التجارة الدولية من قياس التقارب بدقة(انظر المناقشة). من خلال قياس الحرارة المستهلكة أو المتطورة بين جميع التوازنات ، يوفر مخطط الحرارة شكلا سينيا. الحقن الأولية من Cu(II) قبل تشبع الببتيد يؤدي إلى كميات كبيرة من الحرارة مقارنة بحرارة التخفيف. الفرق في قيم الحرارة هذه هي ΔHITC. تصف نقطة الانعطاف قطعتين مفيدتين من المعلومات. الأول هو قياس stoichiometry الملزم للأنواع الموجودة في المحقنة مقارنة بالأنواع الموجودة في الخلية (أي Cu(II):C-peptide هو 1: 1). ثانيا ، يتناسب ميل الملاءمة عند نقطة الانعطاف طرديا مع KITC. بعد جمع البيانات في مخازن مؤقتة ثلاثية وفي مخازن مؤقتة متعددة ، تم إجراء تحليل لاحق20 حيث يتم حساب جميع التوازنات المتنافسة (الجدول 2) ، ويتم تحديد الديناميكا الحرارية المستقلة عن المخزن المؤقت. بالنسبة للربط Cu(II) بالببتيد C، فإن K Cu(II)/C-peptide = 1 (± 1) × 10 8 و ΔHCu(II)/C-peptide = -8 (± 4) kJmol-1. من هذه ، يتم تحديد معلمات الديناميكا الحرارية الملزمة الأخرى حيث ΔG°Cu(II)/C-peptide = -46 (± 4) kJ mol-1 و ΔS Cu(II)/C-peptide = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (انظر 15).

Figure 1
الشكل 1: رصد النطاق Cu(II) d-d عند إضافة 150 و300 و450 و600 و900 و1500 ميكرومتر مكعب (II) إلى 300 ميكرومتر مكعب من الببتيد في 50 مللي متر مكرر تريس، والرقم الهيدروجيني 7.4. يزداد نطاق d-d من Cu(II) عند 600 نانومتر حتى يتم تشكيل مركب الببتيد 1: 1 Cu (II): C. في السابق ، ذكرت Magyar و Godwin أن تقارب Cu (II) - bis-Tris هو log K = 5.2716. يوضح هذا المعايرة بالتحليل الحجمي أن الببتيد C يمكن أن يتفوق على المخزن المؤقت لربط Cu(II) ويشير إلى تقارب Cu(II)/C-peptide في نطاق الميكرومولار. تمت إعادة طباعة هذا الرقم بإذن من ستيفنسون وآخرون.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تكوين [Cu(phen)3]2+ وأطياف امتصاص إلكترونية تمثيلية ترصد انخفاض نطاق نقل الشحنة عند إضافة الببتيد C. (A) مخطط التفاعل الذي يظهر تكوين [Cu(phen)3]2+ ونطاق نقل الشحنة الخاص به يتمركز عند 265 نانومتر (ε° ≈ 90,000 M-1 cm-1)22. ثوابت التكوين هي 9.0 و 15.7 و 20.8 للسجل K1 و β2 و β3 ، على التوالي22. (ب) أطياف امتصاص إلكترونية تمثيلية ترصد انخفاض نطاق نقل الشحنة من [Cu(phen)3]2+ حيث أن مخلبات الببتيد C Cu(II). تم إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي في 50 mM bis-Tris ، الرقم الهيدروجيني 7.4. ويبين الجدول 1 تحليل البيانات. تمت إعادة طباعة هذا الرقم بإذن من ستيفنسون وآخرون.14. اختصار: MLCT = نقل شحن المعادن إلى الليغاند. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: المخططات الحرارية التمثيلية ل Cu(II) المعايرة إلى الببتيد C والعازل . (A) يوضح هذا المخطط الحراري التمثيلي معايرة 1.4 mM Cu(II) إلى 154 μM C-peptide في 15 mM MOPS ، الرقم الهيدروجيني 7.4. والبيانات مناسبة لنموذج موقع واحد مع المعلمات التالية: n = 1.2 ± 0.1؛ n = 1.2 0.1؛ n = 1.2 0.1؛ n = 1.2 0.1؛ n = 1.2 Kd,ITC = 6 (± 3) × 10-7; ΔHITC = −3.4 ± 0.2 كيلو جول مول-1. (ب) معايرة تحكم تمثيلية تبلغ 1.4 مللي متر مكعب (II) إلى 15 ملليمتر مكعب (MOPS)، والرقم الهيدروجيني 7.4، في حالة عدم وجود ببتيد C يظهر أي مخطط حراري ملزم يظهر في اللوحة ألف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

[C-الببتيد] أ265 [Cu (phen)3] 2+ [فين] خال [C-الببتيد] خال [Cu(II)/C-الببتيد] Kالسابقين (x108) KdCu(II)/C-الببتيد سجل KdCu (II) / C - الببتيد
0.0 1.0649 11.83 4.5 0 0.00 ND ND ND
9.7 0.9948 11.05 6.84 7.45 0.78 0.0543 1.84E-08 7.75
18.7 0.9785 10.87 7.38 16.00 0.96 0.0367 2.73E-08 7.56
27.3 0.9651 10.72 7.83 24.09 1.11 0.0310 3.23E-08 7.49
35.3 0.9475 10.53 8.42 31.55 1.30 0.0307 3.26E-08 7.49
42.8 0.9374 10.42 8.75 38.79 1.42 0.0288 3.48E-08 7.46
50.0 0.9283 10.31 9.06 45.64 1.52 0.0275 3.63E-08 7.44
56.7 0.9134 10.15 9.55 51.92 1.68 0.0288 3.47E-08 7.46
63.1 0.9025 10.03 9.92 57.97 1.81 0.0291 3.43E-08 7.46
69.2 0.8927 9.92 10.24 63.73 1.91 0.0294 3.40E-08 7.47
75.0 0.878 9.76 10.73 69.04 2.08 0.0314 3.19E-08 7.50
85.7 0.8542 9.49 11.53 78.99 2.34 0.0341 2.93E-08 7.53
95.4 0.8316 9.24 12.28 88.01 2.59 0.0371 2.69E-08 7.57
104.3 0.8151 9.06 12.83 96.38 2.78 0.0387 2.58E-08 7.59
112.4 0.7976 8.86 13.41 103.98 2.97 0.0411 2.44E-08 7.61
126.9 0.7809 8.68 13.97 117.87 3.16 0.0411 2.44E-08 7.61
139.2 0.7586 8.43 14.71 129.53 3.40 0.0437 2.29E-08 7.64
نطاق 7.4-7.8

الجدول 1: حسابات تمثيلية لتركيزات الأنواع في المحلول من الشكل 2 ب. جميع التركيزات في ميكرومولار. تمت إعادة طباعة هذا الجدول بإذن من Stevenson et al.14.

إكليبريا n ΔH (كيلوجول مول-1) ن × ΔH (كيلوجول مول-1)
Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS 1 5.4 5.44
MOPS + H + → MOPS-H + 0.097 −21.0 −2.04
Cu(II) + C-peptide-H+ → Cu(II)/C-peptide + H+ 1 X X
ΔHITC = Χ + 3.40
Χ = ΔHITC − 3.40
Χ = ΔHCu(II)/C-peptide = −6.8 kJ mol-1

الجدول 2: تحليل لاحق مخصص لتحديد ΔHCu(II)/C-peptide. كما هو موضح في الشكل ، تمت معايرة 3,1.4 mM Cu (II) إلى 154 μM C-peptide في 15 mM MOPS ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، في ثلاثة أضعاف. بعد حساب جميع التوازنات المتنافسة الموضحة في الجدول ، وجد أن ΔHCu (II) / C-peptide هو -8.66 kJ mol-1. يتم تحديد عدد البروتونات التي تم إزاحتها من الببتيد C بواسطة Cu(II) من منحدر (ΔHITC + ΔHCu(II)-Buffer) مقابل ΔHBuffer-H حيث يتم جمع البيانات في مخازن مؤقتة متعددة. تم العثور على جميع قيم المحتوى الحراري في NIST25 أو تم تحديدها في مكان آخر في الأدب15. وتؤخذ جميع التوازنات المتنافسة في الحسبان على النحو الذي وصفه غروسويهم وآخرون(20).

الملف التكميلي: المعادلات ذات الصلة المستخدمة في قسم البروتوكول والمعلمات الإضافية لمقياس الطيف الضوئي للامتصاص الإلكتروني وإعداد ITC. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توفر هذه المقالة طريقة قوية لقياس التقارب والديناميكا الحرارية لارتباط Cu(II) بالببتيدات. تعتبر المجمعات المزودة ب Cu(II) مناسبة بشكل مثالي لمراقبة نطاق امتصاص d-d في موقع المعدن بسبب تكوين الإلكترون d9 . على الرغم من أن معامل الانقراض صغير ، مما يتطلب تركيزات أكبر من المجمع لإنتاج إشارة موثوقة ، إلا أن معايرة Cu (II) إلى الببتيد يمكن أن توفر بسرعة نظرة ثاقبة على قياس stoichiometry الملزم وتقارب الارتباط التقريبي. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تمييز الفرق في الأطياف إذا تم تنسيق المعدن بواسطة ذرات وهندسات مماثلة من كل من المخزن المؤقت والببتيد. لتحديد تقارب الارتباط كميا ، غالبا ما تستخدم الروابط الكروموفورية مثل phen بسبب عمليات نقل الشحنة المسموح بها بالتماثل مع أيونات المعادن21. من خلال إقامة منافسة بين الرباط الكروموفوري والببتيد غير الكروموفوري ومعرفة تقارب المعدن مع الرباط ، يمكن تحديد تقارب الببتيد المعدني مباشرة. يعد المزيد من التحليل الديناميكي الحراري باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني تحديا. لتحديد المحتوى الحراري الملزم باستخدام تقنية مثل التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية، يجب تحديد تقارب الربط عند درجات حرارة متعددة وإجراء تحليل فانت هوف. يفترض هذا التحليل أن الحرارة النوعية للربط هي صفر ، وهو أمر نادر الحدوث ، وبالتالي لا يوفر سوى تقدير للمحتوى الحراريالمرتبط 20.

يعد قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة أكثر ملاءمة لتوضيح نظرة عامة أكثر اكتمالا على الديناميكا الحرارية للتفاعلات بين المعادن والببتيد. في هذه التقنية ، يتم معايرة أيون معدني في محلول الببتيد ويتم قياس حرارة التوازنات المختلفة مباشرة. وبما أن التجربة تجرى تحت ضغط ثابت، فإن الحرارة التي يقيسها مركز التجارة الدولية تساوي المحتوى الحراري. يمكن لمركز التجارة الدولية التغلب على بعض القيود المفروضة على التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني مثل دراسة أيونات المعادن الصامتة طيفيا وعدم الحاجة إلى وضع الافتراضات كما هو الحال في تحليل فان هوف. ومع ذلك، في بعض الأحيان، تولد التفاعلات التي تحدث في مركز التجارة الدولية حرارة قليلة أو معدومة وبالتالي لا يتم ملاحظتها. يمكن تجاوز ذلك إما من خلال زيادة تركيزات المعدن والببتيد أو باستخدام مخزن مؤقت مختلف مع محتوى طبيعي مختلف من البروتون. هذا الأخير مفيد بشكل خاص إذا كان أيون المعدن يحل محل بروتونات متعددة عند الارتباط بالببتيد. ومع ذلك ، فإن كلتا التقنيتين - ITC والتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني - توفران طرقا متعامدة لدراسة نفس النظام واستكمال بعضهما البعض بشكل جيد.

هناك العديد من الجوانب الصعبة في كلتا التقنيتين عند دراسة أيونات المعادن المرتبطة بالببتيدات. العديد من أيونات المعادن غير قابلة للذوبان أو قابلة للذوبان بشكل ضئيل في الماء. ويتفاقم هذا الأمر بسبب هطول الأمطار من أيون المعدن عند إضافته إلى المخزن المؤقت. في مركز التجارة الدولية ، يمكن أن يتجلى ذلك من خلال تحول بطيء وتدريجي في خط الأساس وكميات كبيرة من الحرارة المتولدة عند حقن المعدن. هذا يدل على قيم كبيرة من حرارة التخفيف حتى بعد تشبع الببتيد بأيون المعدن. في التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني ، يتجلى هطول أيون المعدن من خلال زيادة الامتصاص عند الأطوال الموجية المنخفضة ويشبه ذروة واسعة تتركز في منطقة الأشعة فوق البنفسجية. في كلتا التقنيتين ، يجب على المجرب التأكد من أن أيون المعدن قابل للذوبان في ظل ظروف الاختيار (على سبيل المثال ، المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني ، درجة الحرارة ، التركيز). يمكن أن يظهر قيد آخر لكلتا الطريقتين من خلال مفهوم ترتيب الإضافة. في بعض الحالات ، قد يكون أحد المجمعات المعدنية التي تم تشكيلها متداخلا ، في حين أن إضافة نفس الكواشف بترتيب مختلف من شأنه أن يجعل نوعا وسيطا آخر خاملا. هذا الرسم التوضيحي للتحكم الحركي مقابل الديناميكا الحرارية يعيق التحليل الدقيق لجميع التوازنات المتنافسة.

يعتمد كل من ITC والتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني على المنافسات بين الببتيد وإما المخزن المؤقت أو الرباط لربط أيون المعدن. هنا ، يتم تقديم قيمة c ، مما يساعد على تحديد ما إذا كان يمكن تحديد KITC بدقة بواسطة خوارزمية التركيب. يتم تعريف قيمة c في الملف التكميلي ، Eq (7) 20 ، حيث n هو stoichiometry ، KITC هو التقارب المرتبط الواضح ، و [خلية العينة] هي تركيز الأنواع في خلية العينة. عندما تكون قيمة c بين 1 و 1000 ، يكون KITC المحدد دقيقا. ومع ذلك، قد توفر قيم c الأقل من 1 حدا أعلى ل KITC فقط، في حين أن قيم c التي تزيد عن 1000 قد توفر حدا أدنى20 فقط. هذه هي قيمة جمع البيانات من التقنيات التكميلية: إذا تم تفويت شيء ما في تقنية واحدة بسبب قيودها ، فقد يتم القبض عليها في تقنيتها التكميلية. في هذه التجارب ، إذا تم تفضيل المنافسة بشكل كبير على نوع واحد (أي أن تقارب أيون المعدن للببتيد أكبر بكثير من تقارب المخزن المؤقت) ، تغيير التوازن ، مما يجعل من الصعب تفسيره. ويظهر ذلك أيضا بالتفصيل بواسطة Kocyla et al.23. للتغلب على هذا التحدي ، غالبا ما يستخدم إدخال أو استبدال رباط منافس مختلف ، أو اختيار مخزن مؤقت مختلف لزيادة المنافسة بين الليغاند والببتيد لتحديد كمي دقيق. ويرجع ذلك إلى أن الفرق بين العازلة المعدنية (أو الخيط المعدني) وتقارب الببتيد المعدني من شأنه أن يسمح بسقوط القيمة c ضمن نافذة من 1 إلى 1000. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استخدام ليغاند منافس أو مخزن مؤقت آخر للتحليل الكمي يتطلب أن تكون البارامترات الديناميكية الحرارية للمركب المعدني أو العازل المعدني معروفة أو يمكن تحديدها بوسائل أخرى.

أخيرا ، يمكن أن يكون التحديد الكمي الدقيق لتركيز الببتيد تحديا. بعض الطرق الشائعة لقياس تركيزات الببتيد هي قياس أحماض أمينية محددة وربط كمية تلك الأحماض الأمينية بتسلسل الببتيد. على سبيل المثال ، يمكن للتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني قياس المخلفات العطرية مثل التيروزين ، ويمكن لكاشف إلمان تحديد عدد الثيولات الحرة26 ، وتوفر فحوصات برادفورد مؤشرا على عدد المخلفات الموجودة27. لسوء الحظ ، لا تحتوي الببتيدات مثل تلك المستخدمة في هذه الدراسة على بقايا عطرية أو ثيولات حرة ، وتشكل اختبارات برادفورد تحديات عند مقارنة المعايير من البروتينات الضخمة مع الببتيد الصغير محل الاهتمام. بدلا من ذلك ، تم تحديد تركيز الببتيد بواسطة الكتلة الجافة. على الرغم من أنها ليست مثالية وعرضة للتركيزات التي هي مبالغة طفيفة في تقدير تركيز الببتيد (حيث أن قياسات الكتلة الظاهرة من المحتمل أن تكون أعلى من كتل الببتيد الفعلية بسبب وجود الأملاح) ، فقد عوملت جميع الأليكوتات للقياس بنفس الطريقة ، مما يسمح بإجراء مقارنات أكثر دقة. في الدراسات الطيفية ، إذا كان تركيز الببتيد الحر أقل مما كان متوقعا ، فإن تقارب الارتباط المحسوب يمثل حدا أدنى (الملف التكميلي ، Eq (5) و Eq (6)). هناك تحديات مرتبطة بكلتا التقنيتين المعروضتين ، ولكن مع الأدب كدليل ، يمكن التغلب على العديد منها.

يسمح النهج التجريبي المفصل هنا بالتحديد الكمي الدقيق للديناميكا الحرارية المرتبطة بالببتيد المعدني. كل من ITC والتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني متعامدان ويوفران نظرة ثاقبة على تقارب الربط ، لكن ITC يسمح بتحديد كمية المحتوى الحراري المباشر. بمجرد تحديد هذه الديناميكا الحرارية كميا ، يمكن الاستدلال على ما إذا كانت هذه المجمعات المعدنية الببتيد يمكن أن تتشكل في ظل ظروف فسيولوجية. مع نمو فهم تدفق أيون المعادن الفسيولوجي ، يمكن التنبؤ بما إذا كان تقارب الارتباط قويا بما يكفي للتكوين المعقد في الجسم الحي . علاوة على ذلك ، يمكن للباحث إجراء تنبؤات حول المسابقات بين أيونات معدنية متعددة لنفس الببتيد أو الببتيدات المتعددة لنفس أيون المعدن. بالنظر إلى هذه المسابقات بين أيون المعدن والببتيدات ، يمكن للباحث البدء في فهم ما يساهم في التقارب الملزم لمجمع الببتيد المعدني عن طريق تحليل الطاقة الحرة إلى مساهمات المحتوى الحراري والانتروبيا. الديناميكا الحرارية هي جزء لا يتجزأ من تقدير التفاعل الديناميكي بين أيونات المعادن والببتيدات ، ويوفر ITC والتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني مقابض لاستجواب هذه الأنظمة. يمكن توسيع الطرق الموصوفة هنا واستخدامها لدراسة تفاعلات ربط أيون المعادن الأخرى مع الجزيئات الكبيرة ، وقد يكون لها آثار في العمليات الفسيولوجية وتصميم الأدوية والمزيد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تشكر اللجنة العليا زمالة وايتهيد الصيفية للبحوث. تشكر MJS صناديق الشركات الناشئة وصندوق تطوير أعضاء هيئة التدريس في جامعة سان فرانسيسكو. تعترف MCH بالتمويل المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH MIRA 5R35GM133684-02) والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF CAREER 2048265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma Aldrich 131377-25G
bis-Tris buffer Fisher BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane Nalgene 296-4545 Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride Alfa Aesar 12458
EDTA Sigma Aldrich EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer Varian Cary 5000 Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin Sigma Aldrich C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC) TA Instruments Nano ITC Low Volume
ITC analysis software TA Instruments NanoAnalyze SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software TA Instruments ITCRun
light-duty delicate wiper Kimwipe 34155
loading syringe Hamilton Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes Starna Cells, Inc 16.100-Q-10/Z20 Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer Alfa Aesar A12914
spectrophotometer software Cary WinUV Scan
spreadsheet program Microsoft Excel Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe TA Instruments 5346
ultrapure water Millipore Sigma Milli-Q Any water is okay as long as >18 MΩ resistance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
  2. Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
  3. Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
  4. Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
  5. Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
  6. Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
  7. García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
  8. Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
  9. Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
  10. Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
  11. Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
  12. Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
  13. Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
  14. Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
  15. Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
  16. Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
  17. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  18. Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
  19. Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
  20. Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
  21. Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
  22. Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
  23. Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
  24. Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
  25. NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
  26. Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 182 ،
قياس التفاعلات الملزمة بين Cu(II) وبقايا الببتيد في وجود وغياب الكروموفور
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern,… More

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter