Summary
Questo articolo si concentra sull'uso della spettroscopia di assorbimento elettronica e della calorimetria di titolazione isotermica per sondare e quantificare la termodinamica del legame di Cu(II) a peptidi e proteine.
Abstract
Il rame (II) è un metallo essenziale nei sistemi biologici, conferendo proprietà chimiche uniche alle biomolecole con cui interagisce. È stato riportato che si lega direttamente a una varietà di peptidi e svolge ruoli sia necessari che patologici che vanno dalla struttura mediatrice alle proprietà di trasferimento degli elettroni all'impartire la funzione catalitica. Quantificare l'affinità di legame e la termodinamica di questi complessi peptidici Cu(II) in vitro fornisce informazioni sulla forza motrice termodinamica del legame, sulle potenziali competizioni tra diversi ioni metallici per il peptide o tra diversi peptidi per Cu(II) e sulla prevalenza del complesso Cu(II)-peptide in vivo. Tuttavia, quantificare la termodinamica di legame può essere difficile a causa di una miriade di fattori, tra cui la contabilità di tutti gli equilibri concorrenti all'interno di un esperimento di titolazione, specialmente nei casi in cui vi è una mancanza di maniglie spettroscopiche discrete che rappresentano il peptide, lo ione metallico d-block e le loro interazioni.
Qui, viene fornita una robusta serie di esperimenti per la quantificazione accurata della termodinamica del peptide Cu(II). Questo articolo si concentra sull'uso della spettroscopia di assorbimento elettronico in presenza e assenza di ligandi cromoforici per fornire la necessaria maniglia spettroscopica su Cu (II) e l'uso della calorimetria isotermica a titolazione senza etichetta. In entrambe le tecniche sperimentali, viene descritto un processo per tenere conto di tutti gli equilibri concorrenti. Mentre il focus di questo articolo è su Cu(II), l'insieme descritto di esperimenti può applicarsi oltre le interazioni Cu(II)-peptide e fornire un quadro per una quantificazione accurata di altri sistemi metallo-peptidi in condizioni fisiologicamente rilevanti.
Introduction
La biologia si è evoluta per utilizzare la diversa chimica degli ioni metallici necessari alla vita per adattarsi e sopravvivere nell'ambiente circostante. Si stima che il 25%-50% delle proteine utilizzi ioni metallici per la struttura e la funzione1. Il particolare ruolo e stato redox dello ione metallico è direttamente correlato alla composizione e alla geometria dei ligandi biologici che lo coordinano. Inoltre, gli ioni metallici redox-attivi come Cu(II) devono essere strettamente regolati per timore che interagiscano con agenti ossidanti attraverso la chimica simile a Fenton per formare specie reattive dell'ossigeno (ROS)2,3,4. Comprendere i modi di legame e l'affinità che guidano la sua biochimica dovrebbe aiutare a chiarire il ruolo biologico dello ione metallico.
Molte tecniche sono utilizzate per studiare le interazioni di legame di metalli e peptidi. Queste sono per lo più tecniche spettroscopiche, ma includono anche simulazioni al computer che utilizzano la dinamica molecolare, come visto attraverso le interazioni Cu (II) con un frammento di amiloide-beta (Aβ) 5. Una tecnica spettroscopica ampiamente utilizzata che è accessibile a molte università è la risonanza magnetica nucleare (NMR). Usando la natura paramagnetica di Cu(II), Gaggelli et al. sono stati in grado di mostrare dove lo ione metallico si lega su un petide attraverso il rilassamento dei nuclei vicini6. La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) può anche essere utilizzata per sondare la posizione e la modalità del legame ionico metallico paramagnetico7. Altre tecniche spettroscopiche come il dicroismo circolare (CD) possono descrivere il coordinamento su Cu(II) in sistemi come i sistemi tripartitici8, e la spettrometria di massa può mostrare stechiometria e a quali residui lo ione metallico è coordinato attraverso modelli di frammentazione 9,10.
Alcune di queste tecniche, come la NMR, sono prive di etichette ma richiedono grandi concentrazioni di peptide, ponendo sfide per lo studio. Un'altra tecnica comune chiamata spettroscopia di fluorescenza è stata utilizzata per mettere in relazione la posizione di una tirosina o triptofano con la tempra da un Cu(II)11,12. Allo stesso modo, questa tecnica può mostrare cambiamenti strutturali come risultato del legame Cu(II)13. Tuttavia, le sfide con questi studi di legame metallo-peptide sono che sondano gli amminoacidi cromoforici come la tirosina che non tutti i sistemi hanno, che lo ione metallico si lega sotto un modello classico e che la tecnica potrebbe non essere favorevole in condizioni fisiologiche. In effetti, stanno emergendo diversi peptidi che non contengono tali amminoacidi cromoforici o si legano sotto modelli classici, precludendo l'uso di queste tecniche14,15. Questo articolo descrive in dettaglio gli approcci per valutare le proprietà di legame in questi scenari in condizioni fisiologicamente rilevanti.
I ligandi biologici possono adottare diversi stati di protonazione che possono influenzare il legame con ioni metallici come l'anello imidazolo sull'istidina. Se il pH non viene mantenuto in modo coerente, i risultati possono essere contorti o conflittuali. Per questo motivo, i tamponi sono una componente essenziale nello studio delle interazioni metallo-proteina/peptide. Tuttavia, molti buffer hanno dimostrato di interagire favorevolmente con gli ioni metallici16,17. Oltre a competere con la molecola biologica di interesse, il buffer può avere atomi di coordinamento simili che possono essere difficili da distinguere dagli atomi coordinati del peptide o della proteina. In questo studio, l'attenzione si concentra sulla spettroscopia di assorbimento elettronico e sulla calorimetria a titolazione isotermica (ITC) come due tecniche complementari per lo studio delle interazioni Cu(II)-peptide, con considerazioni speciali riguardanti la scelta del tampone.
La spettroscopia elettronica di assorbimento è una tecnica rapida e ampiamente accessibile per lo studio delle interazioni metallo-legame. L'irradiazione con la luce nelle lunghezze d'onda ultraviolette (UV) o visibili può portare all'assorbimento di bande d-d centrate sul metallo, che forniscono preziose informazioni sulla classificazione dei ligandi, sulle geometrie dei metalli e sulle apparenti affinità di legame18,19. Per questi complessi, le titolazioni dirette di ioni metallici in soluzioni proteiche o peptidiche possono quantificare le stechiometrie di legame e le apparenti affinità di legame. In alcuni casi, come le configurazioni di elettroni d5 o d10, il complesso non assorbe la luce (cioè è spettroscopicamente silenzioso). In questi complessi di metalli di transizione spettroscopicamente silenziosi, queste limitazioni possono essere aggirate utilizzando un ligando concorrente che, coordinandosi con lo ione metallico, produce bande di trasferimento di carica rilevabili. In entrambi i casi, questo approccio si limita a quantificare solo la stechiometria e l'apparente affinità di legame, e nessuna comprensione dell'entalpia di legame è fornita senza approssimazioni.
Integrando le informazioni ottenute dalla spettroscopia elettronica di assorbimento, l'ITC è una tecnica interessante per la quantificazione diretta e rigorosa dell'entalpiadi legame 20. ITC misura direttamente il calore rilasciato o consumato durante un evento legante e, poiché la titolazione avviene a pressione costante, il calore misurato è l'entalpia di tutti gli equilibri (ΔHITC). Inoltre, la stechiometria dell'evento di legame (n) e l'apparente affinità di legame (KITC) sono quantificate. Da questi parametri vengono determinate l'energia libera (ΔGITC) e l'entropia (ΔSITC), fornendo un'istantanea termodinamica dell'evento di legame. Poiché non si basa sull'assorbimento della luce, ITC è una tecnica ideale per specie spettroscopicamente silenziose, ad esempio complessi di ioni metallici d5 o d10 . Tuttavia, poiché la calorimetria misura il calore, qualsiasi sistema tampone senza pari e gli equilibri non contabilizzati possono influire negativamente sull'analisi per determinare con precisione la termodinamica legante gli ioni metallici e occorre prestare molta attenzione per affrontare questi fattori20. Se eseguita con il rigore appropriato, l'ITC è una tecnica robusta per determinare la termodinamica dei complessi metallo-proteina/peptide.
Qui, un peptide legante il rame cromoforicamente silenzioso, il peptide C, viene utilizzato per dimostrare l'uso complementare delle due tecniche. Il peptide C è un prodotto di scissione di 31 residui (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formato durante la maturazione dell'insulina; manca di residui cromoforici ma ha dimostrato di legare Cu(II) con affinità fisiologicamente rilevante14,15. Il sito di legame Cu(II) è costituito dalle catene laterali di un glutammato e di un aspartato, nonché dall'N-terminale del peptide14,15. Questi atomi di coordinamento assomigliano molto a quelli di molti sistemi tamponati comunemente usati. Qui, viene mostrato l'uso in tandem delle bande d-d e di trasferimento di carica nella spettroscopia elettronica di assorbimento e ITC nel quantificare la termodinamica di legame Cu(II) al peptide C. L'approccio derivante dallo studio del legame di Cu(II) al peptide C può essere applicato ad altri ioni metallici e sistemi proteici/peptidici.
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Protocol
1. Spettroscopia elettronica di assorbimento: titolazione diretta con competizione tampone
- Preparazione del campione
- Preparare una soluzione tamponata di 50 mM 2-[bis(2-idrossietil)ammino]-2-(idrossimetil)propano-1,3-diolo (bisTris) a pH 7,4 utilizzando acqua ultrapura (resistenza >18 MΩ). Rimuovere gli ioni metallici in traccia incubandoli con una resina ad alta affinità per almeno 2 ore con successiva filtrazione.
- Sciogliere o diluire una quantità nota del peptide nel tampone privo di metalli.
NOTA: Quando si monitorano bande d-d con piccoli coefficienti di estinzione21, è necessario utilizzare concentrazioni più elevate di peptide. Qui, la concentrazione finale del peptide C in soluzione tamponata era di 300 μM (il volume dipende dalla dimensione della cuvetta). Il peptide C è stato sintetizzato dalla sintesi peptidica in fase solida ed è dettagliato altrove nella letteratura14. - Sciogliere una massa nota di CuCl2 in acqua ultrapura per ottenere una soluzione a 10-15 mM.
NOTA: è importante sciogliere inizialmente il sale metallico in acqua non tamponata per evitare precipitazioni. Possono essere utilizzati altri sali di Cu(II), ma bisogna fare attenzione a garantire che l'anione sia debolmente coordinato.
- Esecuzione dell'esperimento
- Accendere lo spettrofotometro elettronico di assorbimento e lasciarlo riscaldare per ~ 15-20 minuti prima dell'uso. Avviare il software dello spettrofotometro e configurare i parametri come l'intervallo di scansione (200-900 nm), la velocità di scansione (200 nm/ s) e il doppio fascio corretto dalla linea di base (più parametri sono elencati nel file supplementare).
- Raccogliere una linea di base senza cuvette o campioni nei percorsi del fascio.
- Utilizzando due cuvette abbinate nello spettrofotometro a doppio fascio, caricare una cuvetta con 115 μL di acqua ultrapura e l'altra cuvetta con 115 μL del campione peptidico. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nelle cuvette in quanto interferiscono con il segnale.
- Posizionare la cuvetta con acqua ultrapura nel fascio di riferimento e la cuvetta con peptide nel fascio di campionamento.
- Raccogliere lo spettro di assorbimento del peptide privo di metalli (apo).
- Aggiungere una quantità sub-stechiometrica (0,5 equivalenti, 150 μM) della soluzione di Cu(II) nella cuvetta con il campione peptidico. Assicurarsi che il volume di Cu(II) aggiunto sia inferiore a 3 μL e registrare il volume per l'analisi in un secondo momento.
- Pipettare delicatamente su e giù per mescolare la soluzione evitando la generazione di bolle d'aria. Lasciare che la soluzione reagisca ed equilibrare per 5 minuti e registrare lo spettro di assorbimento.
- Ripetere l'aggiunta di aliquote Cu(II) come al punto 1.2.6 nella soluzione peptidica per i seguenti equivalenti: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 e 5,0 (o un totale di 300, 450, 600, 900 e 1.500 μM). Assicurarsi di registrare il volume totale di Cu(II) aggiunto e il volume totale della cuvetta.
NOTA: se si desidera una maggiore risoluzione, ridurre la spaziatura tra gli equivalenti. - Rimuovere la cuvetta campione e pulire accuratamente secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere la soluzione tamponata senza peptide e registrare lo spettro di assorbimento. Ripetere l'aggiunta di aliquote Cu(II) come nei passaggi 1.2.5-1.2.8, registrando lo spettro di assorbimento per ogni equivalente Cu(II).
- Esporta tutti gli spettri come file csv per l'elaborazione. Pulire accuratamente le cuvette secondo le istruzioni del produttore e spegnere lo spettrofotometro.
- Trattamento dei dati
- Carica tutti gli spettri su un foglio di calcolo.
- Sottrarre lo spettro solo buffer (0 μM Cu(II)) da ogni altro spettro per rimuovere eventuali caratteristiche di assorbanza dal buffer stesso.
- Normalizzare ogni spettro per tenere conto della diluizione risultante dall'aggiunta della soluzione di Cu(II) (fase 1.2.6). Vedere il file supplementare, Eq (1)14 per un esempio della normalizzazione in cui viniziale è il volume (115 μL) di peptide aggiunto alla cuvetta, vCu(II) è il volume della soluzione di Cu(II) aggiunto nel passaggio 1.2.6 e lospettro sottratto dal buffer Abs è il dato ottenuto nel passaggio 1.2.7.
- Rappresentare graficamente tutti gli spettri insieme per identificare le regioni di cambiamento.
NOTA: le bande d-d tipiche dei complessi Cu(II) vanno da 500 a 750 nm. Questa titolazione spettrofotometrica può essere difficile a causa del piccolo coefficiente di estinzione delle bande d-d, che sono transizioni proibite da Laporte nella geometria ottaedrica21. Se l'assorbanza è troppo debole, un approccio alternativo consiste nell'utilizzare ligandi cromoforici che si traducono in bande di trasferimento di carica al momento del legame a Cu(II) (vedere paragrafo 2).
2. Spettroscopia elettronica di assorbimento: competizione peptidica con ligando cromoforico
- Preparazione del campione
- Sciogliere l'1,10-fenantrolina (fenolo) in acqua ultrapura per ottenere una concentrazione finale di ~1 mM.
- Oltre alla preparazione del campione descritta al paragrafo 1.1 per il peptide (fase 1.1.2) e Cu(II) (fase 1.1.3), preparare una soluzione di Cu(II) e 40 μM di fen in tampone ([Cu(phen)3]2+). Assicurarsi che il volume riempia la cuvetta.
- Esecuzione dell'esperimento
- Avviare lo spettrofotometro elettronico di assorbimento come nei passaggi 1.2.1 e 1.2.2, ma impostare l'intervallo di scansione su 200-400 nm.
- In due cuvette abbinate, caricare una cuvetta con 115 μL di acqua ultrapura e l'altra cuvetta con 115 μL della soluzione [Cu(phen)3]2+ . Posizionare la cuvetta con acqua nel fascio di riferimento e la cuvetta con la soluzione di [Cu(phen)3]2+ nel fascio di campionamento.
- Raccogliere lo spettro di assorbimento del complesso metallo-ligando.
- Aggiungere una quantità stechiometrica (equivalenti ≈1, ≈10 μM) di peptide alla soluzione [Cu(phen)3]2 +. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare accuratamente, ma fare attenzione a non introdurre bolle d'aria. Registrare il volume di peptide aggiunto per analisi future.
NOTA: utilizzando cuvette che contengono 115 μL, aggiungendo 3,83 μL di peptide da 300 μM si ottiene una concentrazione peptidica finale di 9,7 μM. - Incubare la soluzione per 5 minuti per raggiungere l'equilibrio. Registrare lo spettro di assorbimento.
NOTA: Se l'affinità di legame del metallo-peptide e del metallo-ligando è simile, la concentrazione di peptide aggiunto dovrà essere in grande eccesso. Assicurati di tenere conto del volume totale di peptide aggiunto per la normalizzazione. - Ripetere l'aggiunta di aliquote peptidiche nella soluzione [Cu(phen)3]2+ per i seguenti equivalenti approssimativi: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 e 26. Registrare il volume di peptide aggiunto in modo da poter determinare la concentrazione diluita.
- Rimuovere il campione e pulire accuratamente la cuvetta secondo le istruzioni del produttore. Raccogliere uno spettro del buffer. Raccogliere uno spettro di 50 μM peptide nel tampone.
- Esporta tutti i dati come file csv per l'elaborazione e pulisci le cuvette secondo le istruzioni del produttore.
- Trattamento dei dati
- Caricare gli spettri su un foglio di calcolo e sottrarre lo spettro del buffer dagli altri spettri.
- Normalizzare gli spettri seguendo il file supplementare, Eq (2)14.
- Usando il coefficiente di estinzione per [Cu(phen)3]2+ a 265 nm (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22, determinare la concentrazione di [Cu(phen)3]2+ con ogni aggiunta del peptide.
- Per ogni aggiunta del peptide, determinare la concentrazione del complesso Cu(II)-peptide sottraendo la concentrazione rimanente di [Cu(phen)3]2+, come determinato nel passaggio 2.3.2, dalla concentrazione iniziale di [Cu(phen)3]2+ (a 0 μM peptide).
- Calcola la concentrazione del ligando del fenolo libero dall'equazione in File supplementare, Eq (3)14.
- Calcola la concentrazione di peptide libero usando Il file supplementare, Eq (4)14, dove [peptide]stock rappresenta il peptide non diluito titolato nella cuvetta, V1 rappresenta il volume di peptide stock aggiunto, V2 è il volume totale della cuvetta e [Cu2+-peptide] è determinato nel passaggio 2.3.4.
- Calcolare l'affinità di legame sperimentale (Kex) utilizzando Eq (5) nel file supplementare23.
- Correlare la costante di dissociazione del peptide Cu(II)-peptide a Kex da Eq (6)23 in File supplementare, dove Kd,Cu(II)-phen = 1,0 × 10-9 (vedi 22). Determinare la deviazione media e standard da tutte le costanti di dissociazione determinate.
NOTA: Sotto un rapporto 4:1 di fen:Cu(II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+ e [Cu(phen)]2+ esistono nella soluzione, e il peptide chela Cu(II) lontano dalla specie ([Cu(phen)]2+) con il legame più debole22.
3. Calorimetria isotermica di titolazione
- Preparazione del campione
- Preparare una soluzione tampone di acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS) di 15 mM a pH 7,4 utilizzando acqua ultrapura (resistenza >18 MΩ). Rimuovere gli ioni metallici in traccia incubandoli con una resina ad alta affinità per almeno 2 ore con successiva filtrazione sottovuoto attraverso una membrana da 0,45 μm a bottiglia.
- Sciogliere una massa nota di CuCl2 in acqua ultrapura per preparare una soluzione di ≈50-100 mM. Diluire questa soluzione di Cu(II) in tampone per ottenere una soluzione da 1,0 mL con concentrazione finale di 1,4 mM Cu(II). Registrare il volume esatto della soluzione CuCl2 utilizzata.
- Sciogliere o diluire la soluzione peptidica in tampone per produrre 450 μL di una soluzione peptidica da 154 μM. Assicurarsi che la stessa proporzione di acqua ultrapura aggiuntiva dal punto 3.1.2 venga aggiunta alla soluzione peptidica, il che ridurrà il calore di diluizione e aumenterà il segnale al rumore.
- Dopo la preparazione dei campioni, assicurarsi che le soluzioni siano allo stesso pH e, se necessario, regolare di conseguenza.
- Passaggio opzionale: degassare le soluzioni per ridurre al minimo le microbolle caricate nell'ITC.
- Esecuzione dell'esperimento
- Attivare l'ITC. Avviare il software ITC per eseguire lo strumento. Attendere la prima inizializzazione, che chiederà di riportare a casa il buret; quindi, seguire le istruzioni sullo schermo.
- Rimuovere il coperchio dalla cella di riferimento. Rimuovere l'acqua dalla cella di riferimento e risciacquare tre volte con 450 μL di acqua ultrapura degassata.
- Aspirare lentamente acqua ultrapura fino al segno di 450 μL di una siringa di carico, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella siringa. Inserire la siringa di carico nella cella di riferimento fino a quando non viene ≈1 mm dal fondo e iniettare lentamente parte della soluzione fino a quando 150 μL rimangono nella siringa di carico. Spostare rapidamente lo stantuffo della siringa di carico su e giù di ≈25 μL più volte per rimuovere eventuali bolle sulla superficie cellulare. Iniettare lentamente fino a quando lo stantuffo raggiunge il segno di 100 μL sulla siringa di carico, erogando così un totale di 350 μL di acqua ultrapura nella cella di riferimento e sostituire il coperchio della cella di riferimento.
- Rimuovere qualsiasi soluzione residua dalla cella del campione e caricare con 450 μL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) da 10 mM utilizzando una siringa di carico. Immergere per 10 minuti per assicurarsi che gli ioni di metallo traccia vengano rimossi perché l'EDTA legherà i metalli in traccia.
- Rimuovere la soluzione di EDTA (con ioni metallici in traccia legati) e risciacquare accuratamente la siringa di carico con abbondanti quantità di acqua ultrapura.
- Pulire l'ITC secondo le indicazioni del produttore, risciacquando la cella del campione con acqua ultrapura.
- Condizionare la cella campione risciacquando con 450 μL di tampone almeno tre volte.
- Rimuovere il buffer che condiziona la cella campione. Caricare la soluzione peptidica nella cella campione utilizzando la siringa di carico (seguire il passaggio 3.2.3).
- Risciacquare la siringa di titolazione con 200 μL di soluzione tamponata. Per fare ciò, rimuovere lo stantuffo e utilizzare una micropipetta per pipettare il tampone attraverso il foro nella parte superiore della siringa di titolazione in vetro, attraverso la siringa e fuori dall'ago sottostante.
- Inserire completamente lo stantuffo nella siringa di titolazione.
- Immergere la punta dell'ago della siringa di titolazione nella soluzione metallica e tirare lentamente lo stantuffo verso l'alto, facendo sì che la soluzione metallica riempia la siringa e provochi un volume vuoto nella parte superiore della parte di vetro della siringa di titolazione. Rimuovere la maggior parte del volume vuoto ruotando la siringa di titolazione parallelamente al pavimento, rimuovere lo stantuffo e inclinare leggermente la parte in vetro verso il pavimento. Dare alla siringa di titolazione un delicato agitare in modo che la soluzione si sposti all'estremità della parte di vetro della siringa di titolazione e riempia la maggior parte del volume vuoto, ma assicurarsi che rimangano 2-3 μL di volume vuoto. Mantenendo la siringa parallela al pavimento, reinserire lo stantuffo.
- Tenere la siringa di titolazione in posizione verticale, immergere nuovamente la punta dell'ago nella soluzione metallica e spingere lo stantuffo verso il basso fino a quando l'aria cessa di uscire dall'ago. Caricare la siringa di titolazione tirando lentamente lo stantuffo appena sopra il segno di 50 μL mantenendo la punta dell'ago nella soluzione.
- Inserire con attenzione la parte in vetro della siringa di titolazione nel buretto e avvitare fino a quando non si stringono le dita. Quando una piccola quantità di soluzione esce dalla siringa di titolazione a causa della compressione dello stantuffo, utilizzare un tergicristallo delicato leggero per assorbire con cura la soluzione senza toccare la punta dell'ago.
- Inserire il buretto con la siringa di titolazione nella cella del campione e fissarlo saldamente.
- Impostare i parametri sul software ITC. A partire da Instrument Control, impostare la velocità di agitazione (le velocità di agitazione tipiche vanno da 150 a 350 RPM) e la temperatura alla quale verrà condotto l'esperimento (in genere 25 °C). Immettere le concentrazioni di siringhe e cellule in unità millimolari in Dettagli esperimento.
- Nella sezione Metodo esperimento selezionare Titolazione incrementale. Fare clic su Setup e specificare 20 iniezioni da 2,5 μL. Se è necessaria una maggiore risoluzione per osservare l'evento legante, aumentare il numero di iniezioni e diminuire il volume per iniezione. Immettere la distanza temporale tra ogni iniezione in modo che sia abbastanza lunga da consentire al segnale di equilibrarsi e tornare alla linea di base, in genere 300 s.
- Fare clic sul pulsante Esegui per avviare l'esperimento e specificare dove salvare i dati.
- Al termine dell'esperimento, pulire la cella campione e la siringa di titolazione.
- Esegui tutti gli esperimenti almeno in triplice copia per garantire una raccolta dati precisa.
- Eseguire un esperimento di controllo in cui la soluzione metallica viene titolata nella soluzione tamponata (in assenza di peptide) per garantire che il calore di diluizione dallo ione metallico sia piccolo e che non vi siano equilibri non contabilizzati. Se il calore di diluizione è grande, considerare un sistema tampone diverso, se possibile.
- Trattamento dei dati
- Avviare il software di analisi ITC e caricare il file di dati per l'analisi.
- Passare alla scheda Baseline e ispezionare il termogramma. Nota qualsiasi calore esogeno evoluto o assorbito da bolle d'aria o altri artefatti nel termogramma. Cerca i picchi che non sono dovuti all'iniezione della soluzione metallica.
- Assicurarsi che la linea di base generata dal software di analisi segua la parte dei dati dopo l'iniezione e l'equilibrio. Se si discosta, utilizzare Punti pivot baseline per regolare la baseline. Assicurarsi che le regioni di integrazione includano il picco generato dall'iniezione del metallo, ma occludano eventuali bolle d'aria o artefatti nel termogramma trovato nel passaggio 2. Sottrarre la linea di base dal termogramma.
NOTA: questo tipo di manipolazione è consigliato solo dopo la raccolta di più termogrammi, in modo che lo sperimentatore sappia quali sono i dati reali e cos'è un artefatto, poiché la regolazione della linea di base e delle regioni di integrazione può influire drasticamente sui dati. - Passare alla finestra Modellazione per iniziare a montare i dati in cui il software di analisi mostrerà i dati integrati e normalizzati dalla concentrazione per ogni iniezione.
- Fate clic con il pulsante sinistro del mouse sul Riferimento della prima iniezione per rimuoverlo dall'algoritmo di raccordo.
NOTA: Questo è comune poiché ci sarà una piccola miscelazione tra il titolante e la soluzione cellulare campione che porta all'erogazione molare inesatta della prima iniezione. - Nella sezione Modelli , selezionare Vuoto (costante) nel menu a discesa Stile , che si basa sull'entalpia di iniezione finale e verrà sottratto da ogni punto dati, tenendo conto del calore di diluizione. Inoltre, selezionare Indipendente (o il modello migliore per il sistema) nel secondo menu a discesa Stile per adattare i dati.
NOTA: per le interazioni di associazione standard 1:1, il modello più comune è Indipendente. - Adatta i dati utilizzando i due modelli premendo il pulsante di riproduzione verde con una Σ.
NOTA: Un altro software per elaborare i dati ITC è SEDPHAT24. - Tenere conto di tutti gli equilibri concorrenti nell'analisi post hoc precedentemente riportata da Grossoehme et al. 20.
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Representative Results
L'obiettivo era quello di quantificare e corroborare la termodinamica del legame di Cu(II) al peptide C utilizzando le tecniche complementari della spettroscopia elettronica di assorbimento e dell'ITC. A causa della natura robusta della spettroscopia elettronica di assorbimento, è stata eseguita una titolazione diretta di Cu(II) in 300 μM di peptide C (Figura 1). L'aggiunta di 150 μM di Cu(II) ha causato un immediato aumento della banda a 600 nm, attribuito alla banda d-d di Cu(II), e ha continuato ad aumentare fino a quando non sono stati aggiunti 300 μM Cu(II). Un'ulteriore aggiunta superiore a 300 μM Cu(II) non ha aumentato l'assorbimento della banda d-d, indicando la saturazione e che Cu(II) si lega al peptide C in un complesso 1:1. Inoltre, a causa dell'affinità relativamente elevata del bis-Tris per il legame a Cu(II) (log K = 5,27)16, l'affinità Cu(II)/C-peptide dovrebbe avere un limite inferiore nell'intervallo micromolare (log K > 6) per chelare lo ione metallico lontano dal tampone. In questo sistema, la quantificazione precisa delle bande di assorbimento è difficile a causa del piccolo coefficiente di estinzione.
Per aggirare il piccolo coefficiente di estinzione della banda d-d, è stato utilizzato un ligando cromoforico, il fen, come descritto sopra. Il peptide C è stato titolato in ≈10 μM [Cu(phen)3]2+ (Figura 2A) e l'assorbimento dalla banda di trasferimento della carica a 265 nm è diminuito (Figura 2B), indicando che il peptide C era in grado di chelare Cu(II) dal ligando fen. A un esame più attento, è stata necessaria una grande concentrazione di peptide C (fino a 140 μM) per superare modestamente il ligando del fenolo (Tabella 1). Ciò non sorprende date le grandi costanti di formazione sequenziale per [Cu(fen)3]2+ (9,0, 15,7 e 20,8 per log K1, β2 e β3, rispettivamente)22. L'analisi degli spettri mostra che l'affinità di legame cu(II)/C-peptide è nell'intervallo di log K = 7,4-7,8 (Tabella 1).
Il gold standard per misurare la termodinamica completa di un'interazione di legame è ITC. La Figura 3 fornisce un termogramma rappresentativo di Cu(II) titolato in C-peptide in 15 mM MOPS, pH 7.4, che fornisce la concorrenza per il Cu(II). Qui, il buffer MOPS è stato utilizzato al posto del buffer bis-Tris perché KCu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25 e fornirebbe meno concorrenza in modo che l'ITC possa misurare con precisione l'affinità (vedi discussione). Misurando il calore consumato o evoluto tra tutti gli equilibri, il termogramma fornisce una forma sigmoidale. Le iniezioni iniziali di Cu(II) prima che il peptide sia saturo provocano grandi quantità di calore rispetto al calore di diluizione. La differenza in questi valori di calore sono ΔHITC. Il punto di inflessione descrive due informazioni utili. Il primo è la stechiometria di legame della specie nella siringa rispetto alla specie nella cellula (cioè Cu(II):C-peptide è 1:1). In secondo luogo, la pendenza dell'adattamento nel punto di inflessione è direttamente proporzionale a KITC. Dopo aver raccolto i dati in triplice copia e in più buffer, è stata eseguita un'analisi post hoc20 in cui vengono presi in considerazione tutti gli equilibri concorrenti (Tabella 2) e viene determinata la termodinamica indipendente dal buffer. Per cu(II) che si lega al peptide C, KCu(II)/C-peptide = 1 (± 1) x 108 e ΔHCu(II)/C-peptide = -8 (± 4) kJ mol-1. Da questi, vengono determinati altri parametri termodinamici di legame dove ΔG°Cu(II)/C-peptide = -46 (± 4) kJ mol-1 e ΔSCu(II)/C-peptide = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (vedi 15).
Figura 1: Monitoraggio della banda Cu(II) d-d con aggiunta di 150, 300, 450, 600, 900 e 1.500 μM Cu(II) a 300 μM C-peptide in 50 mM bis-Tris, pH 7,4. La banda d-d di Cu(II) aumenta a 600 nm fino a formare un complesso 1:1 Cu(II):C-peptide. In precedenza, Magyar e Godwin hanno riferito che l'affinità Cu(II)-bis-Tris è log K = 5,2716. Questa titolazione mostra che il peptide C può superare il tampone per legare Cu(II) e indica un'affinità Cu(II)/C-peptide nell'intervallo micromolare. Questa figura è ristampata con il permesso di Stevenson et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Formazione di [Cu(phen)3]2+ e spettri rappresentativi di assorbimento elettronico che monitorano la diminuzione della banda di trasferimento di carica con l'aggiunta di C-peptide. (A) Lo schema di reazione che mostra la formazione di [Cu(phen)3]2+ e la sua banda di trasferimento di carica centrata a 265 nm (ε° ≈ 90.000 M-1 cm-1)22. Le costanti di formazione sono 9,0, 15,7 e 20,8 per il log K1, β2 e β3, rispettivamente22. (B) Spettri di assorbimento elettronici rappresentativi che monitorano la diminuzione della banda di trasferimento di carica da [Cu(phen)3]2+ come chelati C-peptidici Cu(II). La titolazione è stata condotta in 50 mM bis-Tris, pH 7,4. L'analisi dei dati è mostrata nella Tabella 1. Questa figura è ristampata con il permesso di Stevenson et al.14. Abbreviazione: MLCT = trasferimento di carica da metallo a ligando. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Termogrammi rappresentativi di Cu(II) titolato in peptide C e tampone. (A) Questo termogramma rappresentativo mostra la titolazione di 1,4 mM Cu(II) in 154 μM C-peptide in 15 mM MOPS, pH 7,4. I dati sono adatti a un modello a sito unico con i seguenti parametri: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3,4 ± 0,2 kJ mol-1. (B) Una titolazione di controllo rappresentativa di 1,4 mM Cu(II) in MOPS 15 mM, pH 7,4, in assenza di peptide C che non mostri alcun termogramma legante che si osserva nel pannello A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| [C-peptide] | A265 | [Cu(phen)3] 2+ | [fen] gratuito | [C-peptide] gratuito | [Cu(II)/C-peptide] | Kex (x108) | KdCu(II)/C-peptide | log KdCu(II)/C-peptide | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | Nd | Nd | Nd | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1,84E-08 | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2,73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3,23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3,26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3,48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3,63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3,47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3,43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3,40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3,19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2,93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2,69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2,58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2,44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2,44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2,29E-08 | 7.64 | |
| Gamma | 7.4-7.8 | ||||||||
Tabella 1: Calcoli rappresentativi per le concentrazioni di specie in soluzione dalla Figura 2B. Tutte le concentrazioni sono in micromolare. Questa tabella è ristampata con il permesso di Stevenson et al.14.
| Equlibria | n | ΔH (kJ mol-1) | n × ΔH (kJ mol-1) |
| Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS | 1 | 5.4 | 5.44 |
| MOPS + H+ → MOPS-H+ | 0.097 | −21,0 | −2,04 |
| Cu(II) + C-peptide-H+ → Cu(II)/C-peptide + H+ | 1 | X | X |
| ΔHITC = Χ + 3,40 | |||
| Χ = ΔHITC − 3,40 | |||
| Χ = ΔHCu(II)/C-peptide = −6,8 kJ mol-1 |
Tabella 2: Analisi post hoc per determinare ΔHCu(II)/C-peptide. Come mostrato nella Figura 3,1.4 mM Cu(II) è stato titolato in 154 μM C-peptide in 15 mM MOPS, pH 7.4, in triplice copia. Dopo aver tenuto conto di tutti gli equilibri concorrenti mostrati nella tabella, ilpeptide ΔH Cu(II)/C è risultato essere −8,66 kJ mol-1. Il numero di protoni spostati dal peptide C da Cu(II) è determinato dalla pendenza di (ΔHITC + ΔHCu(II)-Buffer) vs ΔHBuffer-H dove i dati sono raccolti in più buffer. Tutti i valori di entalpia si trovano nel NIST25 o determinati altrove nella letteratura15. Tutti gli equilibri concorrenti sono rappresentati come descritto da Grossoehme et al.20 Questa cifra è ristampata con il permesso di Stevenson et al.15.
File supplementare: equazioni rilevanti utilizzate nella sezione del protocollo e parametri aggiuntivi per lo spettrofotometro elettronico di assorbimento e la configurazione ITC. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo articolo fornisce un metodo robusto per quantificare l'affinità e la termodinamica del legame di Cu(II) ai peptidi. I complessi con Cu(II) sono ideali per monitorare la banda di assorbimento d-d nel sito metallico grazie alla sua configurazione di elettroni d9 . Sebbene il coefficiente di estinzione sia piccolo, richiedendo quindi concentrazioni maggiori del complesso per produrre un segnale affidabile, le titolazioni di Cu(II) in peptide possono fornire rapidamente informazioni sulla stechiometria di legame e sull'affinità di legame approssimativa. Tuttavia, può essere difficile discernere una differenza negli spettri se il metallo è coordinato da atomi e geometrie simili sia dal tampone che dal peptide. Per determinare quantitativamente l'affinità di legame, i ligandi cromoforici come il fen sono spesso usati a causa dei loro trasferimenti di carica consentiti dalla simmetria con ioni metallici21. Attraverso la creazione di una competizione tra un ligando cromoforico e un peptide non cromoforico e conoscendo l'affinità del metallo al ligando, l'affinità metallo-peptide può essere determinata direttamente. Un'ulteriore analisi termodinamica mediante spettroscopia elettronica di assorbimento è impegnativa. Per quantificare l'entalpia di legame utilizzando una tecnica come la spettroscopia UV-Vis, l'affinità di legame deve essere determinata a più temperature e deve essere eseguita un'analisi di van't Hoff. Questa analisi presuppone che il calore specifico di legame sia zero, il che è raramente vero e quindi fornisce solo una stima dell'entalpia di legame20.
La calorimetria a titolazione isotermica è più adatta per chiarire una panoramica più completa della termodinamica delle interazioni metallo-peptide. In questa tecnica, uno ione metallico viene titolato nella soluzione peptidica e il calore di vari equilibri viene misurato direttamente. Poiché l'esperimento è condotto a pressione costante, il calore misurato dall'ITC è uguale all'entalpia. ITC può superare alcuni dei limiti della spettroscopia di assorbimento elettronico come lo studio spettroscopico di ioni metallici silenziosi e non la necessità di fare le ipotesi come fatto nell'analisi di van't Hoff. Tuttavia, a volte, le reazioni che si verificano nell'ITC generano poco o nessun calore e quindi non vengono osservate. Questo può essere aggirato aumentando le concentrazioni di metallo e peptide o utilizzando un tampone diverso con una diversa entalpia di protonazione. Quest'ultimo è particolarmente utile se lo ione metallico sposta più protoni dopo essersi legato al peptide. Tuttavia, entrambe le tecniche - ITC e spettroscopia di assorbimento elettronico - forniscono metodi ortogonali per studiare lo stesso sistema e completarsi a vicenda.
Ci sono molti aspetti impegnativi in entrambe le tecniche quando si studiano gli ioni metallici che si legano ai peptidi. Molti ioni metallici sono insolubili o scarsamente solubili in acqua. Ciò è ulteriormente esacerbato dalla precipitazione dello ione metallico quando viene aggiunto al tampone. Nell'ITC, questo può manifestarsi con un lento e graduale spostamento della linea di base e grandi quantità di calore generato quando il metallo viene iniettato. Questo è indicativo di grandi valori di calore di diluizione anche dopo che il peptide sarebbe saturo di ioni metallici. Nella spettroscopia elettronica di assorbimento, la precipitazione di ioni metallici si manifesta attraverso un maggiore assorbimento a lunghezze d'onda più basse e assomiglia a un ampio picco centrato nella regione UV. In entrambe le tecniche, lo sperimentatore deve assicurarsi che lo ione metallico sia solubile nelle condizioni di scelta (ad esempio, tampone, pH, temperatura, concentrazione). Un'altra limitazione a entrambi i metodi può manifestarsi attraverso il concetto di ordine di addizione. In alcuni casi, un complesso metallico formato può essere labile, mentre l'aggiunta degli stessi reagenti in un ordine diverso renderebbe inerte un'altra specie intermedia. Questa illustrazione del controllo cinetico rispetto a quello termodinamico ostacola l'analisi accurata di tutti gli equilibri concorrenti.
Sia l'ITC che la spettroscopia elettronica di assorbimento si basano sulle competizioni tra il peptide e il tampone o il ligando per legare lo ione metallico. Qui viene introdotto il valore c, che aiuta a identificare se KITC può essere determinato con precisione dall'algoritmo di fitting. Il valore c è definito in File supplementare, Eq (7)20, dove n è stechiometria, KITC è l'apparente affinità di legame e [cellula campione] è la concentrazione della specie nella cellula campione. Quando il valore c è compreso tra 1 e 1.000,l'ITC K determinato è accurato. Tuttavia, i valori c inferiori a 1 possono fornire solo un limite superiore a KITC, mentre i valori c superiori a 1.000 possono fornire solo un limite inferiore20. Questo è il valore della raccolta di dati da tecniche complementari: se qualcosa manca in una tecnica a causa dei suoi limiti, può essere catturato nella sua tecnica complementare. In questi esperimenti, se la competizione è molto favorita per una specie (cioè, l'affinità ionica metallica del peptide è molto maggiore dell'affinità del tampone), gli equilibri saranno spostati, rendendo difficile l'interpretazione. Questo è anche mostrato in dettaglio da Kocyla et al.23. Per aggirare questa sfida, l'introduzione o la sostituzione con un ligando concorrente diverso, o la scelta di un buffer diverso viene spesso utilizzata per aumentare la competizione tra ligando e peptide per una quantificazione accurata. Questo perché la differenza di affinità metallo-tampone (o metallo-ligando) e metallo-peptide consentirebbe al valore c di rientrare nella finestra da 1 a 1.000. Va notato, tuttavia, che l'uso di un ligando concorrente o di un altro tampone per l'analisi quantitativa richiede che i parametri termodinamici del complesso metallo-ligando o metallo-tampone siano noti o possano essere determinati con altri mezzi.
Infine, quantificare con precisione la concentrazione di peptidi può essere difficile. Alcuni modi comuni per quantificare le concentrazioni di peptidi sono misurare aminoacidi specifici e mettere in relazione la quantità di tali amminoacidi con la sequenza del peptide. Ad esempio, la spettroscopia elettronica di assorbimento può misurare residui aromatici come la tirosina, il reagente di Ellman può quantificare il numero di tioli liberi26 e i saggi di Bradford forniscono un'indicazione di quanti residui sono presenti27. Sfortunatamente, peptidi come quello utilizzato in questo studio non hanno residui aromatici o tioli liberi, e i saggi di Bradford pongono sfide quando si confrontano gli standard delle proteine massicce con il piccolo peptide di interesse. Invece, la concentrazione di peptidi è stata determinata dalla massa secca. Sebbene non ideali e inclini a concentrazioni che sono lievi sovrastimazioni della concentrazione peptidica (poiché le misurazioni della massa apparente sono probabilmente superiori alle masse peptidiche effettive a causa della presenza di sali), tutte le aliquote per la misurazione sono state trattate allo stesso modo, il che consente confronti più accurati. Negli studi spettroscopici, se la concentrazione di peptide libero è inferiore al previsto, l'affinità di legame calcolata rappresenta un limite inferiore (File supplementare, Eq (5) ed Eq (6)). Ci sono sfide associate a entrambe le tecniche mostrate, ma con la letteratura come guida, molte possono essere superate.
L'approccio sperimentale qui descritto consente una quantificazione accurata della termodinamica di legame metallo-peptide. Sia l'ITC che la spettroscopia elettronica di assorbimento sono ortogonali e forniscono informazioni sull'affinità di legame, ma l'ITC consente la quantificazione diretta dell'entalpia. Una volta quantificata questa termodinamica, si può dedurre se questi complessi metallo-peptidi possono formarsi in condizioni fisiologiche. Man mano che la comprensione del flusso fisiologico di ioni metallici cresce, si può fare la previsione se l'affinità di legame è abbastanza forte per la formazione di complessi in vivo . Inoltre, il ricercatore può fare previsioni sulle competizioni tra più ioni metallici per lo stesso peptide o più peptidi per lo stesso ione metallico. Osservando queste competizioni tra ioni metallici e peptidi, il ricercatore può iniziare a capire cosa contribuisce all'affinità di legame del complesso metallo-peptide analizzando l'energia libera in contributi di entalpia ed entropia. La termodinamica è parte integrante dell'apprezzamento dell'interazione dinamica tra ioni metallici e peptidi, e la spettroscopia ITC ed elettronica di assorbimento stanno fornendo maniglie per interrogare questi sistemi. I metodi qui descritti possono essere ampliati e utilizzati per studiare altre interazioni di legame con ioni metallici con macromolecole e possono avere implicazioni nei processi fisiologici, nella progettazione di farmaci e altro ancora.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
SC ringrazia la Whitehead Summer Research Fellowship. MJS ringrazia gli Startup Funds e il Faculty Development Fund dell'Università di San Francisco. MCH riconosce i finanziamenti del National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) e della National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
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