Summary
상기 프로토콜은 해부된 마우스 배아 안면 과정 또는 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 단리하고 인산화된 단백질 수준을 평가하기 위해 후속 웨스턴 블롯팅을 수행하는 방법을 제시한다.
Abstract
포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 여기에서, 포유동물 두개골 발달 동안 단백질의 인산화를 연구하는 생리학적으로 관련된 맥락의 두 가지 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래된 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포. 단백질 분리 중 탈인산화의 공통적 인 장벽을 극복하기 위해 포스포 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 전체 세포 단백질 용해물의 웨스턴 블롯팅에 따른 포스포단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 발달 동안 활성인 다양한 포스포단백질의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.
Introduction
포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 마우스에서,이 과정은 배아 일 (E) 9.5에서 전두엽 두드러기와 상악 및 하악 과정의 쌍을 형성하면서 시작되며, 각각은 철새 후 두개골 신경 볏 세포를 포함합니다. 측면 및 내측 비강 과정은 비강 구덩이의 출현과 함께 전두엽 두드러짐에서 발생하고 결국 융합되어 콧 구멍을 형성합니다. 또한, 내측 비강 과정과 상악 과정은 상립을 생성하기 위해 융합된다. 동시에, 고형성 (palatogenesis)은 E11.5에서 상악 과정의 구강 측에서 뚜렷한 파생물 (이차 구개 선반)의 형성으로 시작됩니다. 시간이 지남에 따라 구개골 선반은 혀의 양쪽에서 아래쪽으로 자라며 혀 위의 반대 위치로 상승하고 결국 중간 선에서 융합되어 E16.51에 의해 비강과 구강 충치를 분리하는 연속 구개열을 형성합니다.
두개골 안면 발달 전반에 걸친 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 예를 들어, 골형성 단백질 수용체 (BMPRs) 및 다양한 수용체 티로신 키나제 (RTK) 패밀리를 포함하는 형질전환 성장 인자 (TGF)-β 수용체의 서브패밀리와 같은 세포막 수용체는 두개골 신경 크레스트 세포 2,3,4에서 리간드 결합 및 활성화시 자가인산화된다. . 추가적으로, G 단백질-결합된 막횡단 수용체 평활화는 Patched1 수용체에 결합하는 소닉 헤지호그(SHH) 리간드의 두개골 신경 크레스트 세포 및 두개골 외배엽 하류에서 인산화되어, 섬모막 및 SHH 경로 활성화5에서의 평활화된 축적을 초래한다. 이러한 리간드-수용체 상호작용은 두개골 맥락에서 자가분비, 파라크린, 및/또는 병타크린 신호전달을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, BMP6는 연골세포 분화 6 동안 자가분비 방식으로 신호를 보내는 것으로 알려져 있는 반면, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 8은 인두 아치 외배엽에서 발현되고 인두 아치 중간엽에서 발현되는 RTKs의 FGF 패밀리의 구성원에 결합하여 인두 아치의 패터닝 및 발발을 개시하는 파라크린 방식으로7, 8,9,10. 또한, 노치 신호전달은 막횡단 델타 및/또는 재그드 리간드가 이웃 세포 상의 막횡단 노치 수용체에 결합할 때 juxtacrine 신호전달을 통해 두개골 골격 발달 동안 연골세포 및 조골세포 둘 다에서 활성화되며, 이는 후속적으로 절단되고 인산화된다(11). 그러나, 자가분비 및 파라크린 신호전달 둘 다에서 기능할 수 있는 유연성을 갖는 두개골 발달에 중요한 다른 리간드 및 수용체 쌍이 있다. 일례로서, 뮤린 치아 형태형성 동안, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)-AA 리간드는 법랑질 기관 상피12에서 RTK PDGFRα를 활성화시키는 자가분비 방식으로 신호를 보내는 것으로 입증되었다. 대조적으로, 임신 중반 동안의 뮤린 안면 과정에서, 리간드 PDGF-AA 및 PDGF-CC를 코딩하는 전사체는 두개골 외배엽에서 발현되는 반면, PDGFRα 수용체는 기저 두개골 신경 볏 유래 중간엽에서 발현되어, 파라크린 신호전달13,14,15,16,17을 초래한다. . 신호전달 메카니즘에 관계없이, 이러한 수용체 인산화 사건은 종종 어댑터 단백질 및/또는 신호전달 분자의 모집을 초래하며, 이는 종종 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 경로와 같은 세포내 키나제 캐스케이드를 개시하기 위해 스스로 인산화된다18,19.
이들 캐스케이드의 말단 세포내 이펙터는 이어서 전사 인자, RNA-결합, 세포골격 및 세포외 매트릭스 단백질과 같은 기질의 어레이를 인산화할 수 있다. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 및 Sox9 26은 두개골 안면 발달의 맥락에서 인산화된 전사 인자 중 하나이다. 이러한 번역 후 변형(PTM)은 다른 활동들 중에서도 대안적인 PTM, 이량체화, 안정성, 절단 및/또는 DNA 결합 친화도에 대한 감수성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다(20,21,25,26). 추가적으로, RNA-결합 단백질 Srsf3는 두개골 안면 발달의 맥락에서 인산화되어, 그의 핵 전좌(27)로 이어진다. 일반적으로, RNA-결합 단백질의 인산화는 그들의 세포외 국소화, 단백질-단백질 상호작용, RNA 결합, 및/또는 서열 특이성(28)에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 더욱이, 악토묘신의 인산화는 두개골 발달 전반에 걸쳐 세포골격 재배열(29,30)을 유도할 수 있고, 작은 인테그린 결합 리간드 N-결합 당단백질과 같은 세포외 매트릭스 단백질의 인산화는 골격 발달 동안 생광물화에 기여한다(31). 상기 및 다수의 다른 예를 통해, 두개골 안면 발달 동안 단백질 인산화에 대한 광범위한 함의가 있음이 명백하다. 추가적인 수준의 조절을 추가하면, 단백질 인산화는 포스파타제에 의해 더욱 조절되며, 이는 포스페이트 그룹을 제거함으로써 키나아제를 상쇄시킨다.
수용체 및 이펙터 분자 수준 모두에서 이러한 인산화 사건은 신호전달 경로의 전파에 매우 중요하며, 궁극적으로 핵에서의 유전자 발현의 변화를 초래하여, 이동, 증식, 생존 및 분화와 같은 특정 세포 활동을 유도하여, 포유동물 얼굴의 적절한 형성을 초래한다. 키나제 및 포스파타아제와의 단백질 상호작용의 맥락 특이성, PTM의 결과적인 변화, 세포 활성에 미치는 영향을 고려할 때, 이러한 파라미터가 생리학적으로 관련된 환경에서 연구되어 두개골 발달에 대한 인산화 사건의 기여에 대한 완전한 이해를 얻는 것이 중요하다. 여기에서, 단백질의 인산화 및 따라서 포유동물 두개골 발달 동안 신호전달 경로의 활성화를 연구하는 두 가지 맥락의 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래 - 일차32차 및 불멸화33 둘 다 . E11.5에서, 상악 과정은 측방 및 내측 비강 과정1과 융합하는 과정에 있으며, 이로써 마우스 두개골 안면 발달 동안 중요한 시점을 나타낸다. 또한, 상악 과정 및 구개골 선반에서 유래 된 세포는 후자의 구조가 전자의 유도체이기 때문에 여기에서 선택되었으며, 따라서 연구자들은 관련 맥락에서 생체 내 및 시험관 내에서 단백질 인산화를 조사 할 수있는 기회를 제공합니다. 그러나이 프로토콜은 대체 얼굴 프로세스 및 발달 시점에도 적용 할 수 있습니다.
인산화된 단백질을 연구할 때 중요한 문제는 풍부한 환경 포스파타제에 의한 단백질 분리 중에 쉽게 탈인산화된다는 것입니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 인산화 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 인산화된 단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 안면 발달 동안 활성인 다양한 신호전달 경로의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.
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Protocol
동물과 관련된 모든 절차는 콜로라도 대학 안슈츠 메디컬 캠퍼스의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 제도적 지침 및 규정을 준수하여 수행되었습니다. 암컷 129S4 마우스를 1.5-6개월령에 21-23°C의 열중성 이하 온도에서 사육하여 배아 수확에 사용하였다. 프로토콜의 개략적인 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비, 소프트웨어, 시약 및 동물에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.
1. E11.5 마우스 배아 수확
- 임신 한 여성 마우스를 CO2 챔버에서 시간 정합 중에 질 플러그를 검출 한 후 11.5 일 후에 약 50 % 변위 (3 챔버에서2.95 L / min) 및 노출 기간 (재료 표 참조)에 필요한 IACUC 승인CO2 유량을 사용하여 안락사시킨다. 안락사의 보조 방법으로 자궁 경부 탈구를 수행하십시오. 즉시 해부로 진행하십시오.
- 복부 쪽을 위로 향하게하는 해부 보드에 마우스 몸체를 놓습니다. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오.
- 직선 Semken 포셉으로 질 개구부의 앞쪽 피부를 꼬집고 들어 올려 복강을 열고 양쪽에서 45 ° 각도로 직선 블레이드 수술 가위로 들어 올린 피부와 기본 층을 절단하여 앞다리와 뒷다리 사이의 대략 절반 정도의 각 측면 표면으로 확장되는 "V"모양을 생성합니다.
- Semken 포셉을 사용하여 자궁 뿔 중 하나를 잡고 난관 아래와 수술 가위로 자궁 경부 위를 자릅니다. 자궁 경적을 완전히 제거 할 수 있도록 mesometrium을 잘라냅니다.
- 해부된 자궁 경적을 10 mL의 조직학 포스페이트 완충 식염수 (PBS) [0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 일염기성, 10.14 mMNa2HPO4이염기성, pH 7.4]를 10 cm 페트리 디쉬에 옮긴다.
- 단계 1.4-1.5에 설명된 것과 동일한 절차를 사용하여 복강의 반대편에 있는 두 번째 자궁 경적을 제거합니다.
- 개별 배아의 해부로 즉시 진행하지 않으면 두 개의 자궁 뿔이 들어있는 10cm 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다 (즉, 두 번째 암컷 마우스가 해부 될 경우).
- 해부 스테레오 현미경으로 Dumont # 5 미세 포셉으로 자궁 뿔에서 각 배아를 조심스럽게 해부하십시오. 천천히 myometrium, decidua, chorion을 떼어냅니다. 배아를 둘러싸고 있는 비교적 투명한 양수를 찢고 제거하고, 배아와 태반을 연결하는 탯줄을 절단한다.
- 각각의 해부된 배아를 절단된 플라스틱 전달 피펫 또는 배아 스푼을 사용하여 얼음 상의 12-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에서 조직학 PBS의 2.5 mL로 옮긴다.
참고: 둘 이상의 유전자형의 배아를 포함할 수 있는 깔짚으로 작업하는 경우, 얼음 위에 미리 표시된 0.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 각각 배치하여 지노타이핑을 위해 각 배아를 둘러싸고 있는 양수를 저장하십시오.
2. E11.5 마우스 배아에서 상악 과정 해부
- 조직학 PBS 10mL가 들어있는 세 개의 10cm 페트리 접시를 준비하고 배아 사이의 회전에 사용할 얼음 위에 보관하십시오.
- 12-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰로부터 하나의 배아를 절단된 플라스틱 전달 피펫 또는 배아 스푼을 사용하여 얼음 상의 조직학 PBS가 있는 10 cm 페트리 접시 중 하나로 옮긴다.
- 해부 현미경 아래에서 미세 포셉을 사용하여 각 상악 과정을 얼굴과 분리하십시오. 먼저, 자연 압흔을 따라 상악 과정의 전방을 절단하여 측방 비강 과정과 상악 과정을 분리한다(도 2A).
- 둘째, 상악 과정과 하악 과정을 분리하는 자연 압흔을 따라 상악 과정의 후방을 절단합니다 (그림 2A).
- 셋째, 상악 과정을 완전히 분리하기 위해, 상악 과정의 눈 쪽에서 상악 과정의 전방에서 후방으로 수직으로 절단하여 자연 압흔이 위에서 참조되는 쪽을 만든다(그림 2A-C).
- 얼굴의 반대쪽에있는 상악 과정에 대해이 세 가지 컷을 반복하십시오.
- 2mL의 작은 라텍스 전구가 있는 9" 파스퇴르 피펫을 사용하여, 해부된 상악 공정 쌍과 약 30μL의 조직학 PBS의 작은 액적을 얼음 위에 라벨이 붙은 35mm 페트리 접시로 옮깁니다(그림 2D).
- 각 배아에 대해 단계 2.3-2.7을 따라, 배아 사이의 얼음 상에서 조직학 PBS를 함유하는 3개의 10 cm 페트리 접시를 회전시킨다. 해부 된 상악 과정의 개별 쌍을 얼음 위에 별도의 35mm 페트리 접시에 넣으십시오.
참고 : 상악 과정 외배엽과 중간엽의 분리 (단계 2.9-2.17)는 깔짚에있는 모든 배아의 상악 과정을 해부 한 후에 수행 할 수 있습니다. 외배엽과 중간엽을 모두 포함하는 손상되지 않은 상악 과정이 필요한 경우 아래 2.18 단계로 진행하십시오. - 조직 배양 PBS에서 조직 배양 PBS에 신선한 2% 트립신 250 μL와 10% 우태아 혈청(FBS) 250 μL를 준비하고, 얼음 위에 보관한다.
- 상악 과정을 포함하는 조직학 PBS의 첫 번째, 작은 액적으로부터 분리된 35 mm 페트리 디쉬에 대략 30 μL의 2% 트립신의 두 번째, 작은 액적을 놓는다. 한 쌍의 상악 공정을 파스퇴르 피펫을 사용하여 2% 트립신의 작은 액적으로 옮깁니다(그림 2D).
- 접시를 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 얼음에서 35mm 페트리 접시를 꺼내 해부 현미경 아래에 놓습니다.
- 미세한 포셉을 사용하여 천천히 조심스럽게 각 상악 과정에서 외배엽 층을 떼어냅니다 (그림 2E).
참고: 외배엽이 손상되지 않은 시트에서 중간엽으로부터 분리되지 않는 경우, 분리를 계속하기 전에 실온에서 2% 트립신(RT)에서 최대 5분 동안 추가로 배양하십시오. 조직이 2 % 트립신에서 붕해되기 시작하면 아래에 설명 된 바와 같이 상악 과정을 10 % FBS로 이동하여 트립신을 중화시키고 외배엽과 중간엽의 분리를 완료하십시오. - 상악 과정 외배엽과 중간엽이 분리되면(도 2F), 한 쌍의 상악 공정으로부터 원하는 조직을 파스퇴르 피펫을 사용하여 이전의 두 개의 작은 액적으로부터 분리된 10% FBS의 약 30 μL의 세 번째 작은 액적으로 옮긴다(도 2D).
- 트립신화를 막기 위해 얼음 위에 35mm 페트리 접시를 놓습니다.
- 상악 처리 조직을 1-2분 동안 10% FBS의 얼음 상에서 인큐베이션한 다음, 두 상악 과정 모두에서 조직을 얼음 상에서 약 30 μL의 미리 냉각된 조직학 PBS의 네 번째, 작은 액적으로 옮기고-파스퇴르 피펫을 사용하여 이전의 세 개의 작은 액적으로부터 분리한다(도 2D).
- 상악 처리 조직을 조직학 PBS에서 1분 동안 인큐베이션하면서 파스퇴르 피펫의 끝으로 상악 프로세스 조직 주위의 조직학 PBS를 부드럽게 소용돌이치면서 모든 FBS가 조직으로부터 헹구어지도록 한다.
- 한 쌍의 상악 처리 조직을 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음 상의 표지된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 조직학 PBS의 전달을 최소화한다. 파스퇴르 피펫으로 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내의 임의의 과량의 조직학 PBS를 제거하였다.
- 위의 단계에 따라 깔짚에있는 각 배아에서 상악 과정을 해부하십시오.
- 샘플을 즉시 처리하여 전체 세포 단백질 용해물을 분리하거나 (아래) -80°C에서 장기간 보관한다. 장기간 보관하기 전에, 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 드라이아이스 상에서 100% EtOH의 욕조에서 5분 동안 스냅-동결시킨다.
3. 마우스 상악 과정에서 전체 세포 단백질 용해물을 분리하는 것
- 상악 공정이 이전에 -80 °C에서 동결 된 경우 얼음 위에서 해동하십시오.
- 0.1 mL의 빙냉 NP-40 용해 완충액 (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1% 노니데트 P-40, 2 mM EDTA; 4°C에서 저장)을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (1x 완전 미니 프로테아제 억제제 칵테일 [물에 용해; -20°C에서 저장], 1 mM PMSF [이소프로판올에 용해; 4°C에서 저장], 10 mM NaF[-20°C에서 저장; 동결/해동 방지], 1 mMNa3VO4[-20°C에서 저장], 25 mM β-글리세로포스페이트[4°C에서 저장])를 얼음 위에 사용하기 직전에 첨가하였다.
참고: 세포 분획화는 대안적으로 세포질, 핵, 막 또는 미토콘드리아 단백질 분획을 분리하기 위해 수행될 수 있다. - 200 μL 피펫맨으로 10 번 위아래로 피펫하십시오.
- 10초 동안 소용돌이치고, 200μL 피펫맨으로 10회 위아래로 피펫팅한다. 거품을 생성하지 마십시오.
- 튜브 리볼버가 있는 1.5 mL/2 mL 패들을 사용하여 끝단을 회전시키면서 4°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
- 샘플을 4°C에서 20분 동안 13,500 × g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 200 mL 피펫맨과 함께 얼음 위에 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 수집한다.
- 실험 샘플에 10 μL의 단백질 용해물 + 10 μL의 NP-40 용해 완충액 및 단백질 표준으로 0.25-2.0 mg/mL의 범위에서 NP-40 용해 완충액의 소 혈청 알부민(분획 V)(BSA)의 3-5 희석액을 사용하여 단백질 분석 키트로 단백질 농도를 정량화합니다.
- 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 진행하거나(단계 5) 나머지 용해물을 드라이아이스 상에서 신속하게 동결시키고 -80°C에서 장기간 보관한다.
4. 일차 및/또는 불멸화된 마우스 배아 구개 중간엽(MEPM) 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하는 단계
주: E13.5 마우스 배아 및 불멸화된 MEPM 세포로부터의 일차 MEPM 세포의 단리 및 배양은 이전에 기술되었다32,33,34. 성장 인자를 갖는 세포의 자극 (단계 4.1-4.7)은 세포 용해 전에 수행될 수 있다. 자극되지 않은 세포가 필요한 경우, 아래의 단계 4.8로 진행하십시오.
- 진공 시스템에 부착된 5.75" 파스퇴르 피펫을 사용하여 6cm 세포 배양 접시에서 ~70% 합류로 MEPM 세포로부터 성장 배지[둘베코 변형 이글 배지(DMEM)를 50 U/mL의 페니실린, 50 μg/mL의 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10% FBS로 흡인한다.
- 세포를 조직 배양 PBS 1 mL로 세척한다.
- 혈청 기아 배지 3 mL[페니실린 50 U/mL, 스트렙토마이신 50 μg/mL, 2 mM L-글루타민, 0.1% FBS가 있는 DMEM]을 37°C 수조에서 예열하여 첨가한다.
- 37°C 및 5%CO2에서 23시간 동안 인큐베이션한다.
- 혈청 기아 배지를 3 mL의 신선하고 예열된 혈청 기아 배지로 교체하십시오.
- 37°C 및 5%CO2 에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 원하는 시간 동안 경험적으로 결정된 농도에서 선택의 성장 인자로 세포를 자극하십시오.
- 진공 시스템에 부착된 5.75" 파스퇴르 피펫을 사용하여 MEPM 세포로부터의 배지를 80%-100% 합류로 흡인한다.
- 세포를 빙냉 조직 배양 PBS (6 cm 세포 배양 접시에 대해 1 mL)로 두 번 세척하고; 마지막 세척 동안 플레이트를 옆으로 기울여 모든 조직 배양물을 PBS가 흡인되도록 한다.
- 사용 직전에 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 첨가된 빙냉 NP-40 용해 완충액(6 cm 세포 배양 접시의 경우 0.1 mL)을 얼음 위에 첨가하여 세포를 용해시킨다.
- 플레이트의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 대략 매 분마다 회전하면서 5 분 동안 얼음 위에서 플레이트를 인큐베이션하십시오.
- 예냉된 셀 리프터를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어내고 세포 현탁액을 얼음 위에 미리 냉각된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 세포 현탁액을 튜브 리볼버와 함께 1.5 mL/2 mL 패들을 사용하여 말단을 회전시키면서 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 위에서 설명한 3.6-3.9단계를 진행합니다.
5. 마우스 안면 과정 및/또는 포스포단백질에 대한 MEPM 세포로부터의 전체 세포 단백질 용해물의 웨스턴 블롯팅
- SDS-PAGE용 전체 세포 단백질 용해물 샘플을 준비합니다.
- 조직 / 세포의 단백질 풍부도에 따라로드 할 단백질의 양을 결정하십시오. 12.5 μg은 일반적으로 전체 세포 단백질 용해물에서 견고하게 발현된 단백질에 충분하다.
- 사용 직전에 10% β-메르캅토에탄올로 동량의 2x Laemmli 완충액[20% 글리세롤, 4% SDS, 0.004% 브로모페놀 블루, 0.125 M 트리스 HCl pH 6.8]을 첨가한다.
주의: β-메르캅토에탄올은 피부 또는 눈 부식성이며, 독성이 있으며, 삼키면 위험하며, 수생 독성이 있습니다. 화학 흄 후드에 장갑, 실험실 코트, 얼굴 방패 및 안전 안경을 착용하십시오. 환경 보건 및 안전 지침에 따라 폐기하십시오. - 볼텍싱으로 혼합하십시오.
- 샘플을 100°C에서 5분 동안 미니 건조 욕조에서 가열한다.
- 볼텍싱으로 혼합하고 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
- 9,400 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.
- 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하기 전에 얼음 위에 간단히 놓거나, -20°C에서 장기간 보관한다.
- 4%-15% 프리캐스트 단백질 겔 및 전기영동 완충액(35)을 갖는 전기영동 셀을 사용하여 SDS-PAGE를 수행한다.
- 사용 직전에 첨가된 0%-20% 메탄올(100 kDa 초과 단백질의 경우 0%-10%, 100 kDa 미만의 단백질의 경우 20%)이 첨가된 전사 완충액을 사용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 단백질을 전기전달합니다.
- 관심있는 포스포단백질에 대한 막 및 프로브를 차단한다.
- 전사 후, 멤브레인을 1x 트리스 완충 식염수 (TBS) [20 mM 트리스, 0.137 M NaCl, pH 7.6]로 5분 동안 웨스턴 블롯 박스에서 세척한다.
- 멤브레인을 5 mL의 블로킹 버퍼[1x TBS, 0.1% 트윈 20, 5% w/v BSA]로 인큐베이션하고, 잘 혼합하고, 루어 팁이 있는 10 mL 시린지를 사용하여 0.2 μm 기공을 갖는 25 mm 시린지 필터를 통해 여과한다]를 오비탈 진탕기 상에서 교반하면서 웨스턴 블롯 박스에서 1시간 동안 여과한다.
참고: 높은 비특이적 배경 신호를 유발할 수 있는 포스포단백질 카제인이 포함되어 있으므로 포스포단백질을 특성화할 때는 우유를 차단제로 사용하지 마십시오. - 멤브레인을 TBS-T[1x TBS, 0.1% 트윈 20]에서 각각 5분 동안 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 웨스턴 블롯 박스에서 세 번 세척한다.
- 멤브레인을 블로킹 버퍼에 희석된 5 mL의 일차 항체 중에서 4°C에서 하룻밤 동안 50 mL 원뿔형 튜브에서 50 mL 로볼버와 함께 튜브 리볼버를 사용하여 인큐베이션한다.
참고: 웨스턴 블롯팅을 위한 적절한 농도에 대해서는 항체 데이터시트를 참조하십시오. - 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 서부 블롯 박스에서 TBS-T에서 각각 5분 동안 RT에서 멤브레인을 세 번 세척한다.
- 멤브레인을 5 mL의 적절한 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 이차 항체를 오비탈 진탕기 상에서 교반하면서 웨스턴 블롯 박스에서 1 h 동안 블로킹 완충액에 희석하여 인큐베이션한다.
- TBS-T에서 각각 5분 동안 멤브레인을 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 웨스턴 블롯 박스에서 세 번 세척한다.
- 멤브레인을 강화된 화학발광(ECL) 웨스턴 블롯팅 기질[병 1 및 2로부터 동량 혼합; 대형 (8.6 cm x 6.7 cm) 멤브레인에 대해 각각 0.5 mL]에서 1분 동안 인큐베이션하여, 전체 멤브레인이 ECL 웨스턴 블롯팅 기판에 지속적으로 노출되도록 한다.
- 과량의 ECL 웨스턴 블롯팅 기질의 멤브레인을 배수하고 즉시 화학발광 이미저를 사용하여 개발한다.
- 멤브레인을 제거하고 관심있는 총 단백질에 대해 다시 조사하십시오.
- PVDF 멤브레인을 5 mL의 스트리핑 완충액[2% SDS, 62.5 mM Tris HCl pH 6.8]을 함유하는 폴리에틸렌 라이닝이 있는 투명 파우치에 넣고 사용 직전에 8 μL/mL의 β-메르캅토에탄올을 첨가하였다.
- 50°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 분당 11회전으로 혼성화 오븐에서 흔든다.
- 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 서부 블롯 박스에서 TBS-T에서 각각 5분 동안 RT에서 멤브레인을 세 번 세척한다.
- 위에서 설명한 5.4.2-5.4.9단계를 진행합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 밴드 밀도를 정량화하고, 관심있는 인산화된 단백질의 수준을 관심 대상 총 단백질의 수준(36)으로 정규화한다.
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Representative Results
마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개 중간엽 세포로부터 분리된 단백질의 인산화를 특성화하려고 시도할 때, 대표적인 결과는 상응하는 총 단백질 밴드의 높이 또는 그 근처에서 실행되는 항-포스포단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 이어 뚜렷하고 재현 가능한 밴드를 이상적으로 드러낼 것이다(그림 3 ). 그러나, 단백질의 광범위한 인산화가 발생하는 경우, 전체 단백질 밴드의 그것과 비교하여 포스포단백질 밴드의 약간의 상향 이동이 있을 수 있다. 또한, 단백질의 다중 이소형이 조직에 존재하거나, 이들 각각이 인산화되거나, 단백질이 가변적으로 추가적인 PTMs를 받는 경우, 항포스포단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯에서 다중 밴드가 나타날 수 있다. 관심있는 포스포단백질에 대한 신호가 관찰되지 않으면, 관심있는 전체 단백질의 검출에도 불구하고, 단백질은 선택된 맥락에서 인산화되지 않을 수 있거나, 프로토콜에 기술적 문제가 발생했을 수 있다. 후자의 경우, 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅은 프로토콜이 예상대로 작동했는지 여부를 나타내기 위해 항-포스포세린/트레오닌 및/또는 항-포스포티로신 항체로 수행될 수 있다. 단백질의 인산화가 두개골 조직25,37에 풍부하기 때문에, 다수의 포스포단백질 밴드의 존재는 프로토콜의 성공적인 완료와 초기 스크리닝으로부터의 정확한 결과를 나타낼 것이다.
야생형과 돌연변이 배아 조직 사이의 포스포단백질 수준을 비교하거나 배양된 세포의 치료에 반응하는 것이 종종 유용하다. 전자의 경우, 유전자형 사이의 포스포단백질 수준의 차이는 관심있는 총 단백질27의 유사한 수준을 갖는 관심있는 포스포단백질에 대한 밴드 강도의 차이로서 나타날 것이다. 후자의 경우, 대표적인 결과는 예를 들어 성장 인자 (도 3)로 처리시 처리되지 않은 세포의 포스포단백질 밴드 강도에 비해 증가된 포스포단백질 밴드 강도 (도 3) 및 키나제 억제제27,37로 처리한 후 밴드 강도를 감소시켰음을 나타낼 것이다. 이러한 차이의 정량을 위해, 관심있는 포스포단백질의 수준은 관심있는 총 단백질의 수준으로 정규화될 것이다. 관심있는 총 단백질의 수준은 샘플 간에 비교적 동일할 것으로 예상되며, 이는 β-튜불린, β-액틴 및/또는 GAPDH와 같은 로딩 및 발현 조절 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 사용하는 별도의 웨스턴 블롯팅에 의해 확인되어야 한다(도 3). 배양된 세포의 성장 인자 처리의 경우, 양성 결과는 자극 후 2-15분의 비교적 짧은 시간 프레임에서 포스포단백질 수준의 증가를 보여줄 것이다(도 3). 성장 인자 처리의 부재 하에, 단백질의 인산화를 초래하는 다른 인자가 없는 한, 그 예에는 세포에 의한 성장 인자의 내인성 발현, 세포에 의해 발현되는 다른 신호전달 분자에 의한 단백질의 인산화, 및/또는 성장 인자 처리의 부재 하에 단백질의 구성적 인산화를 유도하는 돌연변이가 포함되지 않는 한 인산화가 거의 또는 전혀 없어야 한다. 이러한 요소는 결과의 해석에서 고려되어야합니다. 음성 결과에는 성장 인자 처리의 시간 과정에 대한 반응에서 인산화의 변화가 없으며, 이 경우 프로토콜은 상기 상술된 바와 같이 포스포단백질의 유지에 대해 평가되어야 한다. 또한, 막 스트리핑 과정은 때때로 총 단백질 수준에 영향을 미치고 감소시킬 수 있습니다. 이 경우, 관심있는 포스포단백질의 양 대 관심있는 전체 단백질의 양에 대한 반대 추세가 관찰될 것이다. 이것은 총 단백질 수준이 샘플에 걸쳐 상대적으로 동일할 것으로 예상되기 때문에, 단백질의 동일한 로딩 및 발현을 가정하고, 포스포단백질 수준에서만 변화가 일어난다고 가정하기 때문에 차선책이다.
그림 1: 포스포단백질 분석을 위해 마우스 안면 과정 및 배양된 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하기 위한 워크플로우. 상악 처리는 얼음 상의 E11.5 마우스 배아로부터 해부되고/되거나 배지는 80%-100% 합류로 배양된 MEPM 세포로부터 흡인되고, 이는 이어서 빙냉 PBS로 두 번 세척된다. 전체 세포 단백질 용해물은 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 사용한 용해 완충액을 사용하여 단리한 다음, SDS-PAGE, PVDF 막으로의 전기전달, BSA로 막의 차단, 포스포단백질에 대한 프로빙, 막의 스트리핑, 총 단백질에 대한 리블러빙, 및 밴드 강도의 정량화에 이어진다. 약어: LNP = 측면 비강 과정; MxP = 상악 과정; MdP = 하악 과정; PA2 = 제2인두 아치; PBS = 포스페이트-완충 식염수; FBS = 소 태아 혈청; PS = 팔라탈 선반; MEPM = 마우스 배아 구개 중간엽; SDS-PAGE = 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동; PVDF = 폴리비닐리덴 플루오라이드; p-P = 인산화된 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 상악 과정의 해부. (a) 착색된 선으로 표시된 얼굴로부터 MxP를 분리하는데 필요한 3개의 절단(표지된 1-3)을 갖는 E11.5 마우스 배아의 측면도. (b) MxP의 제거 후 E11.5 마우스 배아의 측면도는 점선 검정선으로 윤곽을 그렸다. (C) 해부된 MxP. (D) MxP 외배엽과 중간엽의 선택적인 분리를 위해 PBS, 2% 트립신 및 10% FBS의 작은 물방울로 35mm 페트리 접시 셋업. (e) Mes로부터 부분적으로 분리된 Ect를 갖는 MxP. (f) 분리된 MxP ect 및 Mes. 스케일 바: 1 mm (A-C, E, F), 10 mm (D). 약어: LNP = 측면 비강 과정; MxP = 상악 과정; MdP = 하악 과정; PA2 = 제2인두 아치; PBS = 포스페이트-완충 식염수; FBS = 소 태아 혈청; Mes = 중간엽; 요법 = 외배엽. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 불멸화된 MEPM 세포의 PDGFRβ 및 MAPK 이펙터 Erk1/2 처리에 대한 PDGF-BB 리간드 처리에 반응하여 인산화. 항-포스포-PDGFR, 항-PDGFRβ, 항-포스포-Erk1/2, 항-Erk1/2, 및 항-β-튜불린(E7) 항체로 2분에서 15분까지 10 ng/mL PDGF-BB 리간드 자극의 시간 과정에 따라 불멸화된 MEPM 세포로부터의 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석. 항-PDGFRβ 블롯에서 다중 밴드는 차등적으로 글리코실화된 단백질을 나타낸다. 약어: PDGF = 혈소판 유래 성장 인자; WCL = 전체 세포 용해물; kD = 킬로달톤; WB = 웨스턴 블롯; p-PDGFR = 인산화된 PDGFR; PDGFR = PDGF 수용체; p-Erk = 인산화된 Erk; Erk = 세포외 신호-조절된 키나아제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜을 통해 연구원은 두개골 안면 발달 중에 중요한 인산화 의존성 신호 전달 사건을 강력하고 재현 가능한 방식으로 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 적절한 데이터 수집 및 결과 분석을 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개골 중간엽 세포로부터 포스포단백질을 분리하든, 지시될 때 모든 시약과 물질을 얼음 위에 유지하면서 신속하고 효율적으로 이동하는 것이 필수적입니다. 얼음의 저온은 세포의 대사 활성을 늦추고, 이로써 포스파타제 활성(38)으로부터 인산화된 단백질을 보호하고 높은 단백질 수율을 유지한다. 상악 과정의 해부 동안 세 개의 분리 된 10cm 페트리 접시를 사용하면 모든 해부가 충분히 미리 냉각 된 조직학 PBS에서 일어난다는 것을 보장합니다. 이와 관련하여, 이러한 단백질 분리 프로토콜의 추가적인, 필수 성분은 모든 용해 완충제에서 포스파타제 억제제의 사용이다. 이들 시약은 또한 관심있는 단백질39,40 상의 포스페이트 그룹을 보호하고 웨스턴 블롯팅에 의한 추가 분석을 위해 인산화된 단백질의 완전성을 유지한다.
이 프로토콜은 조직 및 배양 세포에서 포스포단백질의 보다 구체적인 분석을 허용하는 변형을 추가로 도입한다. 안면 과정을 해부하는 과정에서, 상악 과정 외배엽과 중간엽의 분리를 위한 선택적인 단계들이 추가되어 구획 특이적 단백질 인산화(27)의 연구를 허용한다. 이러한 조직층의 효율적인 단리를 시험하기 위해, 사용자는 Gabrp, Trim29, Esrp1 및 Mpzl2와 같은 외배엽에 풍부해진 유전자 및/또는 Aldh1a2 및 AW551984 41과 같은 중간엽에 풍부해진 유전자의 발현을 평가할 수 있다. 배양된 구개 중간엽 세포로부터 포스포단백질의 단리를 위해, 성장 인자 자극을 위한 선택적인 단계가 첨가되었다. 이 경우, 세포는 0.0%-0.1% 혈청을 함유하는 배지에서 굶주린 혈청이어야 한다. FBS와 같은 표준 혈청은 외인성 성장 인자 자극으로부터의 결과를 연상시킬 수 있는 수많은 성장 인자(42)를 함유한다. 따라서, 일시적 혈청 기아는 세포가 급성 성장 인자 치료에 반응하도록 프라임 세포를 전성시킨다.
이 프로토콜은 또한 단백질 인산화를 정확하게 정량화하는 최적화된 방법을 제공합니다. 웨스턴 블롯팅 단계에서, 많은 표준 웨스턴 블롯팅 기술에 사용되는 우유가 아닌 BSA를 사용하여 PVDF 멤브레인을 차단하는 것이 중요합니다. 우유에는 포스포단백질 카제인43 이 포함되어 있고 다른 포스포단백질 분석에서 높은 배경 신호가 나오기 때문에 이 전환이 필수적입니다. 또한, 관심있는 인산화된 단백질의 수준이 표준 로딩 조절 단백질의 수준보다는 관심있는 총 단백질의 수준에 대해 정량화되는 것이 중요하다. 이러한 방식으로, 관심있는 총 단백질의 발현의 임의의 변화는 포스포단백질 수준의 정량화에 있어서 설명될 수 있다. 일반적으로 단백질 수율이 정확한 포스포단백질 검출을 위해 너무 낮다면, 동일한 단계 및 유전자형으로부터의 조직 샘플은 풀링(27)될 수 있고, 및/또는 세포는 미래의 실험을 위해 여기에 기술된 것보다 더 큰 세포 배양 용기에서 성장될 수 있다. 대안적으로, 스트리핑이 일관되게 전체 단백질 수준을 변화시키는 것으로 나타나는 경우, 재현 가능한 결과를 달성하기 위해 기술된 프로토콜을 수정하기 위해 두 가지 접근법이 취해질 수 있다: 1) 상이한 숙주 종에서 생성된 항-포스포단백질 및 항-단백질 항체를 사용하는 항체 스킴의 사용과 두 종 특이적 이차 항체와 조합된 분리(HRP 접합된 이차 항체를 사용하는 경우) 또는 동시(형광단-접합된 이차 항체를 사용하는 경우) 블로트의 개발; 또는 2) 2개의 동일한 막의 동시 처리-첫 번째는 항포스포단백질 항체와 함께 인큐베이션되고, 두 번째는 항-단백질 항체와 함께 인큐베이션된다. 두 가지 대안적인 접근법 모두에서, 관심있는 인산화된 단백질의 수준은 여전히 관심있는 총 단백질의 수준에 대해 정량화되어야 한다. 마지막으로, 인산화는 역동적인 과정이기 때문에, 포스포단백질 수준은 조건당 적어도 세 번의 생물학적 반복실험에서 평가되어야 한다. 마우스 안면 처리 조직 또는 동일한 단계 및 유전자형으로부터의 개별 배아 또는 배아의 개별 풀로부터 유래된 일차 MEPM 세포는 단일 생물학적 복제를 구성할 것이다. 유사하게, 상이한 계대들의 불멸화된 MEPM 세포는 생물학적 반복실험을 구성할 것이다. 배양 된 세포가 성장 인자로 처리되는 경우, 생물학적 복제물의 처리는 성장 인자의 별도의 분취량을 사용하여 다른 날에 이루어져야합니다.
여기에 제시된 접근 방식의 두 가지 제한 사항이 존재하며, 이는 아래에서 논의되며 프로토콜을 시작하기 전에 고려해야 합니다. 첫 번째는 ECL의 동적 범위를 포함합니다. 이 프로토콜에서 권장되는 ECL 웨스턴 블롯팅 기판은 낮은 피코그램 감도와 함께 넓은 다이나믹 레인지를 갖는다. 그러나, 경험적으로, 낮은 풍부도 또는 낮은 인산화 상태의 단백질은 이들 방법을 사용하여 검출하기 어려울 수 있다. ECL 기질 인큐베이션 20분 후에 인산화된 단백질이 검출될 수 없는 경우, 기술된 바와 같이 TBS-T로 멤브레인을 세척하고 대신 낮은 펨토그램 감도를 갖는 고감도 ECL 웨스턴 블롯팅 기질에서 멤브레인을 인큐베이션하는 것이 좋다. 대안적으로, 형광단-접합된 이차 항체가 사용될 수 있으며, 이는 ECL44와 같은 효소-기반 접근법보다 더 넓은 동적 범위를 제공한다. 두 번째 제한은 정규화 절차에서 발생합니다. 광범위하게 설명된 바와 같이, 관심있는 포스포단백질로부터의 신호는 관심있는 전체 단백질로부터의 신호로 정규화되는 것이 좋다. 그러나, 이 과정은 관심있는 총 단백질의 수준이 샘플 사이에서 변하지 않는다는 가정에 의존하며, 이는 종종 하나 이상의 하우스 키핑 단백질에 대한 항체를 사용하는 별도의 웨스턴 블롯팅에 의해 확인됩니다. 그러나 중요한 고려 사항은 하우스 키핑 단백질의 수준이 고르지 않은 로딩, 막으로의 불완전한 전달 및 / 또는 단백질 발현의 차이로 인해 샘플간에 변경 될 수 있다는 것입니다. 따라서 정규화 중에 정확도를 향상시키기 위해 연구자들은 멤브레인의 각 차선에있는 모든 단백질을 감지하고 이러한 기술적 한계를 설명하는 Ponceau S45와 같은 진정한 총 단백질 염색을 구현하기 위해 이동하는 것을 고려할 수 있습니다.
전반적으로,이 프로토콜은 단백질 분리 중에 일반적으로 발생하는 단백질 탈인산화 문제를 극복합니다. 단백질 인산화의 정확한 분석은 연구자가 두개골 안면 발달 동안 인산화 된 단백질의 역할에 대한보다 정확한 이해를 얻는 데 도움이 될 것입니다. 또한,이 프로토콜은 생리 학적 관련 맥락에서 인산화 된 단백질 수준을 분석 할 수있는 강력하고 효율적인 방법을 제공하며, 각각은 고유 한 이점을 가지고 있습니다. 배아 조직으로부터의 단백질 용해물은 생체 내에서 단백질 인산화의 정적 스냅 샷을 제공하는 반면, 배양 된 세포의 구현은 급성 치료에 대한 동적 인산화 반응에 대한 데이터를 제공합니다. 이 프로토콜은 큰 데이터 세트, 예를 들어, 질량 분광법(37 ) 및 RNA-시퀀싱(27)으로부터 유래된 결과 및 가설을 직접 확인하고 확장하여, 신호전달 네트워크 내에서 새로운 상호작용을 발견할 수 있는 능력을 갖는다. 중요하게도, 이 프로토콜은 인산화의 교란이 두개골 맥락에서의 세포내 신호전달, 유전자 발현 및 세포 활성에 직접적으로 어떻게 영향을 미치는지를 조사하는 데 사용될 수 있다. 이러한 다양한 응용 프로그램은 두개골 발달에서 단백질 인산화의 효과에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
129S4 마우스는 시나이 산의 이칸 의과 대학 필립 소리아노 박사의 선물이었다. 이 연구는 NIH (National Institutes of Health) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 및 K02 DE028572에서 K.A.F., F31 DE029976에서 M.A.R. 및 F31 DE029364에서 B.J.C.D.까지의 기금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
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