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Developmental Biology

Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

Il protocollo presenta un metodo per isolare lisati proteici di cellule intere da processi facciali embrionali di topo sezionati o cellule mesenchimali palatali embrionali di topo in coltura ed eseguire il successivo western blotting per valutare i livelli di proteine fosforilate.

Abstract

Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Questi cambiamenti morfologici sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Qui vengono forniti due esempi di contesti fisiologicamente rilevanti in cui studiare la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali del topo, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5. Per superare la barriera comune della defosforilazione durante l'isolamento proteico, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l'isolamento delle fosfoproteine. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un'analisi e una quantificazione adeguate delle fosfoproteine a seguito del western blotting dei lisati proteici di cellule intere. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli di varie fosfoproteine attive durante lo sviluppo craniofacciale.

Introduction

Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Nel topo, questo processo inizia al giorno embrionale (E) 9.5 con la formazione della prominenza frontonasale e coppie di processi mascellari e mandibolari, ognuno dei quali contiene cellule della cresta neurale cranica post-migratoria. I processi nasali laterali e mediali derivano dalla prominenza frontonasale con la comparsa delle fosse nasali e alla fine si fondono per formare le narici. Inoltre, i processi nasali mediali e i processi mascellari si fondono per generare il labbro superiore. Allo stesso tempo, la palatogenesi viene avviata con la formazione di escrescenze distinte - gli scaffali palatali secondari - dal lato orale dei processi mascellari a E11.5. Nel corso del tempo, i ripiani palatali crescono verso il basso su entrambi i lati della lingua, si elevano in una posizione opposta sopra la lingua e alla fine si fondono sulla linea mediana per formare un palato continuo che separa le cavità nasali e orali da E16.51.

Questi cambiamenti morfologici durante lo sviluppo craniofacciale sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Ad esempio, i recettori della membrana cellulare, come le sottofamiglie di recettori del fattore di crescita trasformante (TGF)-β, compresi i recettori delle proteine morfogenetiche ossee (BMMR) e varie famiglie di tirosin-chinasi (RTK), sono autofosforilati dopo il legame del ligando e l'attivazione nelle cellule della cresta neurale cranica 2,3,4 . Inoltre, il recettore transmembrana accoppiato alla proteina G Smoothened diventa fosforilato nelle cellule della cresta neurale cranica e nell'ectoderma craniofacciale a valle del ligando Sonic hedgehog (SHH) che si lega al recettore Patched1, con conseguente accumulo smoothened alla membrana ciliare e attivazione della via SHH5. Tali interazioni ligando-recettore possono avvenire attraverso la segnalazione autocrina, paracrina e/o juxtacrine in contesti craniofacciali. Ad esempio, BMP6 è noto per segnalare in modo autocrino durante la differenziazione dei condrociti6, mentre il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 8 è espresso nell'ectoderma dell'arco faringeo e si lega ai membri della famiglia FGF di RTK espressi nel mesenchima dell'arco faringeo in modo paracrino per avviare il patterning e la crescita degli archi faringei7, 8,9,10. Inoltre, la segnalazione di Notch viene attivata sia nei condrociti che negli osteoblasti durante lo sviluppo scheletrico craniofacciale attraverso la segnalazione juxtacrine quando i ligandi Delta transmembrana e/o Jagged si legano ai recettori Notch transmembrana sulle cellule vicine, che vengono successivamente scissi e fosforilati11. Tuttavia, ci sono altre coppie di ligando e recettori importanti per lo sviluppo craniofacciale che hanno la flessibilità di funzionare sia nella segnalazione autocrina che paracrina. Ad esempio, durante la morfogenesi dei denti murini, è stato dimostrato che il ligando del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF)-AA segnala in modo autocrino l'attivazione del PDGFRα RTK nell'epitelio12 dell'organo dello smalto. Al contrario, nei processi facciali murini durante la gestazione media, i trascritti che codificano i ligandi PDGF-AA e PDGF-CC sono espressi nell'ectoderma craniofacciale, mentre il recettore PDGFRα è espresso nel mesenchima derivato dalla cresta neurale cranica sottostante, con conseguente segnalazione paracrina 13,14,15,16,17 . Indipendentemente dal meccanismo di segnalazione, questi eventi di fosforilazione del recettore spesso provocano il reclutamento di proteine adattatrici e/o molecole di segnalazione, che spesso si fosforilano per avviare cascate di chinasi intracellulari come la via della chinasi proteica attivata dai mitogeni (MAPK)18,19.

Gli effettori intracellulari terminali di queste cascate possono quindi fosforilare una serie di substrati, come fattori di trascrizione, legame con l'RNA, proteine della matrice citoscheletrica ed extracellulare. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 e Sox926 sono tra i fattori di trascrizione fosforilati nel contesto dello sviluppo craniofacciale. Questa modifica post-traduzionale (PTM) può influenzare direttamente la suscettibilità a PTM alternativi, dimerizzazione, stabilità, scissione e / o affinità di legame con il DNA, tra le altre attività 20,21,25,26. Inoltre, la proteina legante l'RNA Srsf3 è fosforilata nel contesto dello sviluppo craniofacciale, portando alla sua traslocazione nucleare27. In generale, è stato dimostrato che la fosforilazione delle proteine leganti l'RNA influisce sulla loro localizzazione subcellulare, sulle interazioni proteina-proteina, sul legame con l'RNA e/o sulla specificità della sequenza28. Inoltre, la fosforilazione dell'actomiosina può portare a riarrangiamenti citoscheletrici durante lo sviluppo craniofacciale29,30 e la fosforilazione delle proteine della matrice extracellulare, come le glicoproteine legate al ligando N legate all'integrina, contribuisce alla biomineralizzazione durante lo sviluppo scheletrico31. Attraverso quanto sopra e numerosi altri esempi, è evidente che ci sono ampie implicazioni per la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale. Aggiungendo un ulteriore livello di regolazione, la fosforilazione delle proteine è ulteriormente modulata dalle fosfatasi, che contrastano le chinasi rimuovendo i gruppi fosfato.

Questi eventi di fosforilazione sia a livello di recettore che di molecola effettrice sono fondamentali per la propagazione delle vie di segnalazione e alla fine provocano cambiamenti nell'espressione genica nel nucleo, guidando attività cellulari specifiche, come la migrazione, la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione, che si traducono in una corretta formazione del volto dei mammiferi. Data la specificità del contesto delle interazioni proteiche con chinasi e fosfatasi, i conseguenti cambiamenti nelle PTM e i loro effetti sull'attività cellulare, è fondamentale che questi parametri siano studiati in un contesto fisiologicamente rilevante per ottenere una comprensione completa del contributo degli eventi di fosforilazione allo sviluppo craniofacciale. Qui vengono forniti esempi di due contesti in cui studiare la fosforilazione delle proteine e, quindi, l'attivazione delle vie di segnalazione durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali dei topi, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5 - entrambi primari32 e immortalati33 . A E11.5, i processi mascellari sono in fase di fusione con i processi nasali laterali e mediali1, rappresentando così un punto temporale critico durante lo sviluppo craniofacciale del topo. Inoltre, i processi mascellari e le cellule derivate dagli scaffali palatali sono stati scelti qui perché queste ultime strutture sono derivati delle prime, fornendo così ai ricercatori l'opportunità di interrogare la fosforilazione proteica in vivo e in vitro in contesti correlati. Tuttavia, questo protocollo è applicabile anche a processi facciali alternativi e punti temporali di sviluppo.

Un problema critico nello studio delle proteine fosforilate è che sono facilmente defosforilate durante l'isolamento proteico da abbondanti fosfatasi ambientali. Per superare questa barriera, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l'isolamento delle proteine fosforilate. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un'analisi e una quantificazione adeguate delle proteine fosforilate. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli delle varie vie di segnalazione attive durante lo sviluppo craniofacciale.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Colorado Anschutz Medical Campus ed eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti istituzionali. Per la raccolta di embrioni sono stati utilizzati topi femmina 129S4 a 1,5-6 mesi di età e alloggiati a una temperatura sub-termoneutrica di 21-23 °C. Un flusso di lavoro schematico del protocollo è rappresentato nella Figura 1. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature, il software, i reagenti e gli animali utilizzati in questo protocollo.

1. Raccolta di embrioni di topo E11.5

  1. Eutanasia di topo femmina incinta 11,5 giorni dopo il rilevamento del tappo vaginale durante l'accoppiamento temporizzato inuna camera di CO2 utilizzando la portata di CO 2 approvata da IACUC necessaria per circa il 50% di spostamento (2,95 L / min in una camera 360 in3 ) e la durata dell'esposizione (vedere Tabella dei materiali). Eseguire la lussazione cervicale come metodo secondario di eutanasia. Procedere immediatamente alla dissezione.
  2. Appoggia il corpo del mouse su una tavola di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Spruzzare l'addome del topo con il 70% di etanolo.
  3. Aprire la cavità addominale pizzicando e sollevando la pelle anteriore all'apertura vaginale con pinze Semken dritte e tagliando la pelle sollevata e gli strati sottostanti con forbici chirurgiche a lama dritta con un angolo di 45 ° su entrambi i lati per generare una forma a "V" che si estende a ciascuna superficie laterale all'incirca a metà strada tra gli arti anteriori e posteriori.
  4. Usando la pinza di Semken, afferrare una delle corna uterine e tagliare sotto l'ovidotto e sopra la cervice con le forbici chirurgiche. Tagliare via il mesometrio per consentire la completa rimozione del corno uterino.
  5. Trasferire il corno uterino sezionato a 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato istologico (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasico, 10,14 mM Na2HPO4 dibasico, pH 7,4] in una capsula di Petri di 10 cm.
  6. Rimuovere il secondo corno uterino sul lato opposto della cavità addominale utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 1.4-1.5.
  7. Posizionare la capsula di Petri di 10 cm contenente entrambe le corna uterine sul ghiaccio se non si procede immediatamente alla dissezione dei singoli embrioni (cioè se verrà sezionato un secondo topo femmina).
  8. Sotto uno stereomicroscopio sezionante, seziona attentamente ogni embrione dalle corna uterine con una pinza fine Dumont #5. Allontana lentamente il miometrio, la decidua e il corion. Strappare e rimuovere l'amnione relativamente trasparente che circonda l'embrione e recidere il cordone ombelicale che collega l'embrione alla placenta.
  9. Trasferire ogni embrione sezionato a 2,5 ml di PBS istologico in un pozzetto individuale di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti su ghiaccio utilizzando un pipetto di trasferimento di plastica tagliato o un cucchiaio di embrione.
    NOTA: Se si lavora con una cucciolata che può contenere embrioni di più di un genotipo, salvare l'amnione che circonda ciascun embrione per la genotipizzazione mettendo ciascuno nel proprio tubo microcentrifuga da 0,5 mL preetichettato sul ghiaccio.

2. Dissezione dei processi mascellari da embrioni di topo E11.5

  1. Preparare tre piastre di Petri da 10 cm contenenti 10 ml di PBS istologico e tenerle sul ghiaccio per essere utilizzate nella rotazione tra gli embrioni.
  2. Trasferire un embrione da un pozzetto individuale della piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti a una delle piastre di Petri da 10 cm con PBS istologico su ghiaccio utilizzando un pipetto di trasferimento di plastica tagliato o un cucchiaio di embrione.
  3. Sotto il microscopio di dissezione, separare ogni processo mascellare dal viso usando la pinza fine. In primo luogo, tagliare il lato anteriore di un processo mascellare lungo la rientranza naturale che separa il processo nasale laterale e il processo mascellare (Figura 2A).
  4. In secondo luogo, tagliare il lato posteriore del processo mascellare lungo la rientranza naturale che separa il processo mascellare e il processo mandibolare (Figura 2A).
  5. In terzo luogo, per separare completamente il processo mascellare, effettuare un taglio verticale dai lati anteriore a quello posteriore del processo mascellare sul lato oculare del processo mascellare dove terminano le rientranze naturali di cui sopra (Figura 2A-C).
  6. Ripeti questi tre tagli per il processo mascellare sul lato opposto del viso.
  7. Utilizzando un pipetto Pasteur da 9" con un piccolo bulbo di lattice da 2 mL, trasferire la coppia sezionata di processi mascellari e una piccola goccia di circa 30 μL di PBS istologico su una capsula di Petri da 35 mm etichettata su ghiaccio (Figura 2D).
  8. Seguire i passaggi 2.3-2.7 per ogni embrione, ruotando le tre piastre di Petri da 10 cm contenenti PBS istologico su ghiaccio tra gli embrioni. Posizionare singole coppie di processi mascellari sezionati in piastre di Petri separate da 35 mm sul ghiaccio.
    NOTA: La separazione del processo mascellare ectoderma e mesenchima (fasi 2.9-2.17) può essere eseguita dopo aver sezionato i processi mascellari di tutti gli embrioni nella lettiera. Se si desiderano processi mascellari intatti contenenti sia l'ectoderma che il mesenchima, procedere al passaggio 2.18 di seguito.
  9. Preparare 250 μL di tripsina fresca al 2% in PBS di coltura tissutale e 250 μL di siero bovino fetale al 10% (FBS) in PBS di coltura tissutale e conservare su ghiaccio.
  10. Posizionare una seconda, piccola goccia di circa 30 μL di tripsina al 2% nella capsula di Petri da 35 mm separata dalla prima, piccola goccia di istologia PBS contenente i processi mascellari. Trasferire la coppia di processi mascellari alla piccola goccia di tripsina al 2% utilizzando il pipetto Pasteur (Figura 2D).
  11. Incubare il piatto su ghiaccio per 15 min.
  12. Rimuovere la capsula di Petri da 35 mm dal ghiaccio e posizionarla sotto il microscopio di dissezione.
  13. Usando la pinza fine, estrarre lentamente e con attenzione lo strato di ectoderma da ogni processo mascellare (Figura 2E).
    NOTA: Se l'ectoderma non si separa dal mesenchima in un foglio intatto, incubare in tripsina al 2% a temperatura ambiente (RT) per un massimo di 5 minuti aggiuntivi prima di continuare con la separazione. Se il tessuto inizia a disintegrarsi nella tripsina al 2%, spostare i processi mascellari al 10% FBS come descritto di seguito per neutralizzare la tripsina e terminare la separazione dell'ectoderma e del mesenchima.
  14. Una volta separati il processo mascellare ectoderma e mesenchima (Figura 2F), trasferire i tessuti desiderati dalla coppia di processi mascellari a una terza goccia piccola di circa 30 μL di FBS al 10% - separata dalle due piccole goccioline precedenti - utilizzando il pipetto Pasteur (Figura 2D).
  15. Posizionare la capsula di Petri da 35 mm sul ghiaccio per fermare la tripsinizzazione.
  16. Incubare i tessuti del processo mascellare sul ghiaccio in FBS al 10% per 1-2 minuti, quindi trasferire i tessuti da entrambi i processi mascellari a una quarta, piccola goccia di circa 30 μL di PBS istologico prechilled su ghiaccio - separata dalle tre precedenti piccole goccioline - usando il pipetto Pasteur (Figura 2D).
  17. Incubare i tessuti del processo mascellare in istologia PBS per 1 minuto mentre ruota delicatamente il PBS istologico attorno ai tessuti del processo mascellare con la punta del pipetto Pasteur per garantire che tutto FBS venga risciacquato dal tessuto.
  18. Trasferire la coppia di tessuti di processo mascellare in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL etichettato su ghiaccio utilizzando il pipetto Pasteur, riducendo al minimo il trasferimento di PBS istologico. Rimuovere l'eventuale istologia in eccesso PBS nel tubo microcentrifuga da 1,5 mL con il pipetto Pasteur.
  19. Seguire i passaggi precedenti per sezionare i processi mascellari da ciascun embrione nella lettiera.
  20. Elaborare immediatamente i campioni per isolare lisati di proteine a cellule intere (sotto) o conservarli a -80 °C a lungo termine. Prima della conservazione a lungo termine, congelare a scatto il tubo microcentrifuga da 1,5 ml in un bagno di EtOH al 100% su ghiaccio secco per 5 minuti.

3. Isolare i lisati proteici delle cellule intere dai processi mascellari del topo

  1. Se i processi mascellari sono stati precedentemente congelati a -80 °C, scongelarli sul ghiaccio.
  2. Aggiungere 0,1 mL di tampone di lisi NP-40 ghiacciato (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; conservato a 4 °C) con inibitori della proteasi e della fosfatasi (1x cocktail completo di mini inibitori della proteasi [disciolto in acqua; conservato a -20 °C], 1 mM PMSF [disciolto in isopropanolo; conservato a 4 °C], 10 mM NaF [conservato a -20 °C; evitare il congelamento/scongelamento], 1 mM Na3VO4 [conservato a -20 °C], 25 mM β-glicerofosfato [conservato a 4 °C]) aggiunto immediatamente prima dell'uso su ghiaccio.
    NOTA: Il frazionamento cellulare può essere eseguito in alternativa per isolare frazioni proteiche citoplasmatiche, nucleari, di membrana o mitocondriali.
  3. Pipettare su e giù 10 volte con un pipetman da 200 μL.
  4. Vortice per 10 s, e poi pipettare su e giù 10 volte con un pipetman da 200 μL. Evitare di generare bolle.
  5. Incubare a 4 °C per 2 ore ruotando da un'estremità all'altra utilizzando una paletta da 1,5 ml/2 mL con un revolver a tubo.
  6. Centrifugare i campioni a 13.500 × g per 20 minuti a 4 °C.
  7. Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml sul ghiaccio con un pipetman da 200 mL.
  8. Quantificare la concentrazione proteica con il kit di analisi proteica, utilizzando 10 μL di lisato proteico + 10 μL di tampone di lisi NP-40 per campioni sperimentali e 3-5 diluizioni di albumina sierica bovina (frazione V) (BSA) in tampone di lisi NP-40 in un intervallo di 0,25-2,0 mg / mL come standard proteici.
  9. Procedere con l'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) (fase 5) o congelare rapidamente i lisati rimanenti su ghiaccio secco e conservare a -80 °C a lungo termine.

4. Isolare i lisati proteici a cellule intere dalle cellule mesenchima palatali embrionali di topo primarie e/o immortalizzate (MEPM)

NOTA: L'isolamento e la coltura di cellule MEPM primarie da embrioni di topo E13.5 e cellule MEPM immortalizzate sono stati precedentemente descritti 32,33,34. La stimolazione delle cellule con fattore di crescita (fasi 4.1-4.7) può essere eseguita prima della lisi cellulare. Se si desiderano cellule non stimolate, procedere al passaggio 4.8 di seguito.

  1. Aspirare il mezzo di crescita [Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) con 50 U/mL di penicillina, 50 μg/mL di streptomicina, 2 mM L-glutammina, 10% FBS] dalle cellule MEPM a ~ 70% di confluenza in una capsula di coltura cellulare di 6 cm utilizzando un pipetto Pasteur da 5,75" attaccato a un sistema di vuoto.
  2. Lavare le cellule con 1 mL di coltura tissutale PBS.
  3. Aggiungere 3 mL di siero di terreno di fame [DMEM con 50 U/mL di penicillina, 50 μg/mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina, 0,1% FBS] preriscaldati a bagnomaria a 37 °C.
  4. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 23 ore.
  5. Sostituire il mezzo di fame sierico con 3 ml di siero da fame fresco e preriscaldato.
  6. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 1 ora.
  7. Stimolare le cellule con il fattore di crescita di scelta ad una concentrazione determinata empiricamente per il periodo di tempo desiderato.
  8. Aspirare il mezzo dalle celle MEPM all'80%-100% di confluenza utilizzando un pipetto Pasteur da 5,75" collegato a un sistema di vuoto.
  9. Lavare le cellule due volte con coltura tissutale ghiacciata PBS (1 mL per una palazzetta di coltura cellulare di 6 cm); inclinare la piastra di lato durante l'ultimo lavaggio per garantire che tutta la coltura tissutale PBS sia aspirata.
  10. Lisare le cellule aggiungendo un tampone di lisi NP-40 ghiacciato con inibitori della proteasi e della fosfatasi aggiunti immediatamente prima dell'uso (0,1 ml per una capsula di coltura cellulare di 6 cm) sul ghiaccio.
  11. Incubare la piastra su ghiaccio per 5 minuti con rotazione circa ogni minuto per garantire una copertura completa della piastra.
  12. Raschiare le cellule dalla piastra usando un sollevatore di celle preraffreddato e trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml preraffreddato su ghiaccio.
  13. Incubare la sospensione cellulare a 4 °C per 30 minuti ruotando da un'estremità all'altra utilizzando una paletta da 1,5 ml/2 mL con un revolver a tubo.
  14. Procedere con i passaggi 3.6-3.9 descritti sopra.

5. Western blotting di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e/o cellule MEPM per fosfoproteine

  1. Preparare campioni di lisato proteico cellulare intero per SDS-PAGE.
    1. Determinare la quantità di proteine da caricare, a seconda dell'abbondanza di proteine nel tessuto / cellula; 12,5 μg sono di solito sufficienti per proteine espresse in modo robusto nei lisati proteici a cellule intere.
    2. Aggiungere un volume uguale di 2 tamponi Laemmli [20% glicerolo, 4% SDS, 0,004% blu bromofenolo, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] con il 10% di β-mercaptoetanolo aggiunto immediatamente prima dell'uso.
      ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è corrosivo per la pelle o per gli occhi, tossico, pericoloso se ingerito e ha tossicità acquatica. Maneggiare indossando guanti, un cappotto da laboratorio, una visiera e occhiali di sicurezza in un cappuccio di fumi chimici. Smaltire secondo le linee guida per la salute e la sicurezza ambientale.
    3. Mescolare vorticando.
    4. Riscaldare i campioni a 100 °C per 5 minuti in un mini bagno secco.
    5. Mescolare vorticosamente e posizionare i campioni sul ghiaccio.
    6. Centrifugare a 9.400 × g per 5 min a 4 °C.
    7. Posizionare brevemente i campioni sul ghiaccio prima di caricarli nel gel SDS-PAGE o conservare a -20 °C a lungo termine.
  2. Eseguire SDS-PAGE utilizzando una cella di elettroforesi con un gel proteico prefabbricato al 4%-15% e tampone di elettroforesi35.
  3. Elettrotrasferire le proteine in una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) utilizzando un tampone di trasferimento con metanolo 0%-20% (0%-10% per proteine superiori a 100 kDa; 20% per proteine inferiori a 100 kDa) aggiunto immediatamente prima dell'uso35.
  4. Bloccare la membrana e la sonda per la fosfoproteina di interesse.
    1. Dopo il trasferimento, lavare la membrana in 1x soluzione salina tris-buffered (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] per 5 minuti in una scatola western blot.
    2. Incubare la membrana in 5 mL di tampone bloccante [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% p/v BSA; miscelata bene e filtrata attraverso un filtro a siringa da 25 mm con pori da 0,2 μm utilizzando una siringa da 10 mL con punta luer] per 1 ora in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
      NOTA: Non usare il latte come agente bloccante quando si caratterizzano le fosfoproteine in quanto contiene la fosfoproteina caseina, che può causare un segnale di fondo elevato e non specifico.
    3. Lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuna in TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    4. Incubare la membrana in 5 mL di anticorpo primario diluito in tampone bloccante a 4 °C durante la notte in un tubo conico da 50 mL utilizzando una paletta da 50 mL con un revolver a tubo.
      NOTA: Consultare la scheda tecnica degli anticorpi per la concentrazione appropriata per il western blotting.
    5. Lavare la membrana tre volte a RT per 5 minuti ciascuna in TBS-T in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    6. Incubare la membrana in 5 mL di appropriato anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) diluito in tampone bloccante per 1 ora in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    7. Lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuna in TBS-T in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    8. Incubare la membrana in substrato western blotting a chemiluminescenza avanzata (ECL) [mescolando volumi uguali dalle bottiglie 1 e 2; 0,5 ml di ciascuno per membrane di grandi dimensioni (8,6 cm x 6,7 cm)] per 1 minuto, assicurando che l'intera membrana sia continuamente esposta al substrato di blotting occidentale ECL.
    9. Drenare la membrana del substrato di blotting occidentale ECL in eccesso e sviluppare immediatamente utilizzando un imager a chemiluminescenza.
  5. Spogliare la membrana e riprovare per la proteina totale di interesse.
    1. Posizionare la membrana pvDF in un sacchetto trasparente con rivestimento in polietilene contenente 5 mL di tampone di stripping [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] con 8 μL/mL di β-mercaptoetanolo aggiunto immediatamente prima dell'uso.
    2. Incubare a 50 °C per 30 min con dondolo in forno di ibridazione a 11 giri al minuto.
    3. Lavare la membrana tre volte a RT per 5 minuti ciascuna in TBS-T in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    4. Procedere con i passaggi 5.4.2-5.4.9 descritti sopra.
  6. Quantitare le densità della banda western blot utilizzando il software ImageJ, normalizzando i livelli della proteina fosforilata di interesse ai livelli della proteina totale di interesse36.

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Representative Results

Quando si tenta di caratterizzare la fosforilazione di proteine isolate da processi facciali di topo e/o cellule mesenchimali palatali in coltura, i risultati rappresentativi riveleranno idealmente una banda distinta e riproducibile dopo il western blotting con un anticorpo antifosfoproteico che corre all'altezza o vicino all'altezza della corrispondente banda proteica totale (Figura 3 ). Tuttavia, se si verifica un'estesa fosforilazione della proteina, potrebbe esserci un leggero spostamento verso l'alto della banda fosfoproteica rispetto a quella della banda proteica totale. Inoltre, se esistono più isoforme di una proteina in un tessuto, ognuna delle quali è fosforilata, o la proteina è variabilmente soggetta a PTM aggiuntivi, più bande possono apparire nella macchia occidentale con un anticorpo anti-fosfoproteina. Se non si osserva alcun segnale per la fosfoproteina di interesse, nonostante il rilevamento della proteina totale di interesse, la proteina potrebbe non essere fosforilata nel contesto scelto o potrebbe essere sorto un problema tecnico con il protocollo. In quest'ultimo caso, il western blotting di lisati a cellule intere può essere eseguito con anticorpi anti-fosfosina / treonina e / o anti-fosfotirosina per indicare se il protocollo ha funzionato come previsto. Poiché la fosforilazione delle proteine è abbondante nei tessuti craniofacciali25,37, la presenza di più bande fosfoproteiche indicherà il completamento con successo del protocollo e risultati accurati dallo screening iniziale.

Spesso è utile confrontare i livelli di fosfoproteine tra tessuti embrionali wild-type e mutanti o in risposta al trattamento di cellule in coltura. Nel primo caso, una differenza nei livelli di fosfoproteine tra i genotipi apparirebbe come una differenza nelle intensità di banda per la fosfoproteina di interesse con livelli simili della proteina totale di interesse27. In quest'ultimo caso, gli esiti rappresentativi rivelerebbero un aumento delle intensità della banda fosfoproteica rispetto a quelle delle cellule non trattate durante il trattamento con, ad esempio, un fattore di crescita (Figura 3) e una diminuzione delle intensità delle bande dopo il trattamento con un inibitore della chinasi27,37. Per la quantificazione di queste differenze, i livelli della fosfoproteina di interesse sarebbero normalizzati a livelli della proteina totale di interesse. I livelli della proteina totale di interesse dovrebbero essere relativamente uguali tra i campioni, un risultato che dovrebbe essere confermato da western blotting separato utilizzando uno o più anticorpi contro le proteine di controllo del carico e dell'espressione come β-tubulina, β-actina e / o GAPDH (Figura 3). Per il trattamento con fattore di crescita delle cellule in coltura, i risultati positivi mostreranno probabilmente un aumento dei livelli di fosfoproteine in un lasso di tempo relativamente breve di 2-15 minuti dopo la stimolazione (Figura 3). Ci dovrebbe essere poca o nessuna fosforilazione in assenza di trattamento con fattore di crescita, a meno che non ci siano altri fattori in gioco che determinano la fosforilazione della proteina, esempi dei quali includono l'espressione endogena dei fattori di crescita da parte delle cellule, la fosforilazione della proteina da parte di un'altra molecola di segnalazione espressa dalle cellule e / o una mutazione che porta alla fosforilazione costitutiva della proteina in assenza di trattamento con fattore di crescita. Questi fattori dovrebbero essere considerati nell'interpretazione dei risultati. I risultati negativi non includono alcun cambiamento nella fosforilazione in risposta a un periodo di tempo del trattamento con fattore di crescita, nel qual caso il protocollo deve essere valutato per il mantenimento delle fosfoproteine come descritto sopra. Inoltre, il processo di stripping della membrana può occasionalmente influenzare e ridurre i livelli di proteine totali. In questo caso, si osserverebbero tendenze opposte per la quantità di fosfoproteina di interesse rispetto alla proteina totale di interesse. Questo non è ottimale, poiché ci si aspetta che i livelli totali di proteine siano relativamente uguali tra i campioni, assumendo lo stesso carico ed espressione della proteina, con cambiamenti che si verificano solo nei livelli di fosfoproteine.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro per l'isolamento di lisati proteici di cellule intere dai processi facciali del topo e cellule mesenchimali palatali in coltura per l'analisi delle fosfoproteine. I processi mascellari vengono sezionati da embrioni di topo E11.5 su ghiaccio e/o il mezzo viene aspirato da cellule MEPM coltivate all'80%-100% di confluenza, che vengono successivamente lavate due volte con PBS ghiacciato. I lisati proteici delle cellule intere vengono isolati utilizzando un tampone di lisi con inibitori della proteasi e della fosfatasi, seguiti da SDS-PAGE, elettrotrasferimento su una membrana PVDF, blocco della membrana con BSA, sondaggio per la fosfoproteina, stripping della membrana, riprobing per proteine totali e quantificazione delle intensità della banda. Abbreviazioni: LNP = processo nasale laterale; MxP = processo mascellare; MdP = processo mandibolare; PA2 = secondo arco faringeo; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; FBS = siero bovino fetale; PS = mensola palatale; MEPM = mesenchima palatale embrionale di topo; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide; PVDF = fluoruro di polivinilidene; p-P = proteina fosforilata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dissezione dei processi mascellari. (A) Vista laterale di un embrione di topo E11.5 con i tre tagli (etichettati 1-3) necessari per separare l'MxP dal viso indicato da linee colorate. (B) Vista laterale di un embrione di topo E11.5 dopo la rimozione di MxP delineato con una linea nera tratteggiata. (C) MxP sezionato. (D) Una parabola di Petri da 35 mm con piccole goccioline di PBS, tripsina al 2% e FBS al 10% per la separazione opzionale di ectoderma MxP e mesenchima. (E) MxP con Ect parzialmente separato da Mes. (F) MxP Ect e Mes separati. Barre di scala: 1 mm (A-C,E,F), 10 mm (D). Abbreviazioni: LNP = processo nasale laterale; MxP = processo mascellare; MdP = processo mandibolare; PA2 = secondo arco faringeo; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; FBS = siero bovino fetale; Mes = mesenchima; Ect = ectoderma. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Fosforilazione dell'effettore PDGFRβ e MAPK Erk1/2 in risposta al trattamento con ligando PDGF-BB di cellule MEPM immortalizzate. Analisi Western blot di lisati di cellule intere da cellule MEPM immortalizzate seguendo un timecors di stimolazione del ligando PDGF-BB 10 ng/mL da 2 min a 15 min con anticorpi anti-fosfo-PDGFR, anti-PDGFRβ, anti-fosfo-Erk1/2, anti-Erk1/2 e anti-β-tubulina (E7). Bande multiple in anti-PDGFRβ blot rappresentano proteine differenzialmente glicosilate. Abbreviazioni: PDGF = fattore di crescita derivato dalle piastrine; WCL = lisato a cellule intere; kD = kilodalton; WB = macchia occidentale; p-PDGFR = PDGFR fosforilato; PDGFR = recettore PDGF; p-Erk = Erk fosforilato; Erk = chinasi regolata dal segnale extracellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo qui descritto consente ai ricercatori di sondare eventi critici di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione durante lo sviluppo craniofacciale in modo robusto e riproducibile. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che garantiscono una corretta raccolta di dati e l'analisi dei risultati. Che si tratti di isolare le fosfoproteine dai processi facciali dei topi e / o dalle cellule mesenchimali palatali in coltura, è imperativo muoversi in modo rapido ed efficiente mantenendo tutti i reagenti e i materiali sul ghiaccio quando indicato. La bassa temperatura del ghiaccio rallenta l'attività metabolica nelle cellule, proteggendo così le proteine fosforilate dall'attività della fosfatasi38 e mantenendo un'alta resa proteica. L'uso di tre piastre di Petri separate da 10 cm durante la dissezione dei processi mascellari assicura che tutte le dissezioni avvengano in PBS istologica sufficientemente prechilled. In relazione a ciò, un componente aggiuntivo ed essenziale di questo protocollo di isolamento proteico è l'uso di inibitori della fosfatasi in tutti i tamponi di lisi. Questi reagenti proteggono anche i gruppi fosfato sulla proteina di interesse39,40 e mantengono l'integrità della proteina fosforilata per ulteriori analisi mediante western blotting.

Questo protocollo introduce inoltre modifiche che consentono analisi più specifiche delle fosfoproteine nei tessuti e nelle cellule coltivate. Nel processo di dissezione dei processi facciali, sono stati aggiunti passaggi opzionali per la separazione del processo mascellare ectoderma e mesenchima per consentire lo studio della fosforilazione proteica compartimentalespecifica 27. Per testare l'isolamento efficiente di questi strati tissutali, gli utenti possono valutare l'espressione di geni arricchiti nell'ectoderma , come Gabrp, Trim29, Esrp1 e Mpzl2, e / o geni arricchiti nel mesenchima, come Aldh1a2 e AW55198441. Per l'isolamento delle fosfoproteine dalle cellule mesenchimali palatali in coltura, sono stati aggiunti passaggi opzionali per la stimolazione del fattore di crescita. In questo caso, le cellule dovrebbero essere siero affamate in mezzo contenente 0,0% -0,1% di siero. I sieri standard come FBS contengono numerosi fattori di crescita42 che possono contorcere i risultati della stimolazione esogena del fattore di crescita. Pertanto, la fame sierica temporanea innesca le cellule per rispondere al trattamento acuto del fattore di crescita.

Questo protocollo fornisce anche metodi ottimizzati per quantificare con precisione la fosforilazione delle proteine. Nelle fasi di western blotting, è importante bloccare la membrana PVDF usando BSA piuttosto che latte, che viene utilizzato in molte tecniche standard di western blotting. Questo interruttore è imperativo, poiché il latte contiene la fosfoproteina caseina43 e porta ad un alto segnale di fondo nell'analisi di altre fosfoproteine. Inoltre, è importante che i livelli della proteina fosforilata di interesse siano quantificati rispetto ai livelli della proteina totale di interesse piuttosto che ai livelli di una proteina di controllo del carico standard. In questo modo, qualsiasi cambiamento nell'espressione della proteina totale di interesse può essere spiegato nella quantificazione dei livelli di fosfoproteine. Se la resa proteica in generale è troppo bassa per un rilevamento accurato delle fosfoproteine, i campioni di tessuto dello stesso stadio e genotipo possono essere raggruppati27 e / o le cellule possono essere coltivate in vasi di coltura cellulare più grandi di quelli descritti qui per esperimenti futuri. In alternativa, se lo stripping sembra alterare costantemente i livelli totali di proteine, è possibile adottare due approcci per modificare il protocollo descritto per ottenere risultati riproducibili: 1) uso di uno schema anticorpale che impiega anticorpi antifosfoproteine e anticorpi antiproteici generati in diverse specie ospiti combinati con due anticorpi secondari specie-specifici e separati (se si utilizzano anticorpi secondari coniugati con HRP) o simultanei (se si utilizzano anticorpi secondari coniugati con fluoroforo) sviluppo delle macchie; o 2) elaborazione simultanea di due membrane identiche - la prima incubata con un anticorpo anti-fosfoproteina, la seconda con un anticorpo anti-proteina. In entrambi gli approcci alternativi, i livelli della proteina fosforilata di interesse dovrebbero ancora essere quantificati rispetto ai livelli della proteina totale di interesse. Infine, poiché la fosforilazione è un processo dinamico, i livelli di fosfoproteine dovrebbero essere valutati in almeno tre repliche biologiche per condizione. Il tessuto di processo facciale del topo o le cellule MEPM primarie derivate da un singolo embrione o da un singolo pool di embrioni dello stesso stadio e genotipo costituirebbero un'unica replica biologica. Allo stesso modo, le cellule MEPM immortalizzate di diversi passaggi costituirebbero repliche biologiche. Se le cellule coltivate sono trattate con fattore di crescita, il trattamento delle repliche biologiche dovrebbe avvenire in giorni diversi utilizzando aliquote separate del fattore di crescita.

Esistono due limitazioni dell'approccio qui presentato, che sono discusse di seguito e dovrebbero essere considerate prima di iniziare il protocollo. Il primo riguarda la gamma dinamica di ECL. Il substrato ECL western blotting raccomandato in questo protocollo ha un'ampia gamma dinamica, con una bassa sensibilità al picogramma. Tuttavia, empiricamente, le proteine a bassa abbondanza o a basso stato di fosforilazione possono essere difficili da rilevare utilizzando questi metodi. Se le proteine fosforilate non sono rilevabili dopo 20 minuti di incubazione del substrato ECL, si raccomanda di lavare la membrana in TBS-T come descritto e invece di incubare la membrana in un substrato di blotting occidentale ECL ad alta sensibilità con una bassa sensibilità al femtogramma. In alternativa, possono essere utilizzati anticorpi secondari coniugati con fluoroforo, che offrono una gamma dinamica più ampia rispetto agli approcci basati su enzimi come eCL44. Una seconda limitazione deriva dalla procedura di normalizzazione. Come ampiamente descritto, si raccomanda che il segnale dalla fosfoproteina di interesse sia normalizzato al segnale dalla proteina totale di interesse. Tuttavia, questo processo si basa sul presupposto che i livelli della proteina totale di interesse non cambino tra i campioni, il che è spesso confermato da un western blotting separato che utilizza anticorpi contro una o più proteine di pulizia. Una considerazione importante è che i livelli delle proteine di pulizia possono cambiare tra i campioni a causa di un carico irregolare, di un trasferimento incompleto alla membrana e / o di differenze nell'espressione proteica. Pertanto, per migliorare l'accuratezza durante la normalizzazione, i ricercatori possono prendere in considerazione l'implementazione di una vera colorazione proteica totale, come Ponceau S45, che rileva tutte le proteine in ogni corsia della membrana e tiene conto di queste limitazioni tecniche.

Nel complesso, questo protocollo supera il problema della defosforilazione proteica che si verifica comunemente durante l'isolamento proteico. Un'analisi accurata della fosforilazione proteica aiuterà i ricercatori a ottenere una comprensione più precisa del ruolo delle proteine fosforilate durante lo sviluppo craniofacciale. Inoltre, questo protocollo offre metodi robusti ed efficienti per analizzare i livelli di proteine fosforilate in contesti fisiologicamente rilevanti, ognuno con i propri benefici. Mentre i lisati proteici dai tessuti embrionali forniscono un'istantanea statica della fosforilazione proteica in vivo, l'implementazione di cellule coltivate fornisce dati sulle risposte dinamiche di fosforilazione ai trattamenti acuti. Questo protocollo ha la capacità di confermare ed espandere direttamente i risultati e le ipotesi derivanti da grandi set di dati, ad esempio la spettrometria di massa37 e il sequenziamento dell'RNA27, per scoprire nuove interazioni all'interno delle reti di segnalazione. È importante sottolineare che questo protocollo può essere utilizzato per sondare come le perturbazioni nella fosforilazione influenzano direttamente la segnalazione intracellulare, l'espressione genica e l'attività cellulare in contesti craniofacciali. Queste diverse applicazioni miglioreranno notevolmente la comprensione degli effetti della fosforilazione proteica nello sviluppo craniofacciale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

129S4 topi sono stati un dono del Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine del Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto con fondi dal National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 a B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

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Biologia dello sviluppo Numero 182 Sviluppo craniofacciale fosforilazione fosfoproteine topo processi mascellari cellule mesenchimali palatali embrionali di topo
Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine
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Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

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