Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

Het protocol presenteert een methode voor het isoleren van hele cel eiwitlysaten van ontleedde muis embryo gezichtsprocessen of gekweekte muis embryonale palatale mesenchym cellen en het uitvoeren van daaropvolgende western blotting om gefosforyleerde eiwitniveaus te beoordelen.

Abstract

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Deze morfologische veranderingen worden geïnitieerd en in stand gehouden door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylering door kinasen. Hier worden twee voorbeelden gegeven van fysiologisch relevante contexten waarin fosforylering van eiwitten tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren kan worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11.5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken. Om de gemeenschappelijke barrière van defosforylering tijdens eiwitisolatie te overwinnen, worden aanpassingen en wijzigingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van fosfoproteïnen mogelijk maken. Daarnaast worden best practices verstrekt voor een goede analyse en kwantificering van fosfoproteïnen na western blotting van hele cel eiwitlysaten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of murine genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende fosfoproteïnen die actief zijn tijdens craniofaciale ontwikkeling.

Introduction

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Bij de muis begint dit proces op embryonale dag (E) 9,5 met de vorming van de frontonasale prominentie en paren van maxillaire en mandibulaire processen, die elk post-migrerende craniale neurale crestcellen bevatten. De laterale en mediale nasale processen ontstaan uit de frontonasale prominentie met het verschijnen van de neusputten en smelten uiteindelijk samen tot de neusgaten. Verder smelten de mediale neusprocessen en maxillaire processen samen om de bovenlip te genereren. Tegelijkertijd wordt palatogenese geïnitieerd met de vorming van verschillende uitwassen - de secundaire palatale planken - van de orale kant van de maxillaire processen bij E11.5. Na verloop van tijd groeien de palatale planken aan weerszijden van de tong naar beneden, verheffen zich tot een tegengestelde positie boven de tong en smelten uiteindelijk samen aan de middellijn om een continu gehemelte te vormen dat de neus- en mondholten scheidt door E16.51.

Deze morfologische veranderingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling worden geïnitieerd en ondersteund door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylatie door kinasen. Celmembraanreceptoren, zoals subfamilies van transformerende groeifactor (TGF)-β receptoren, waaronder botmorfogenetische eiwitreceptoren (BMPRs) en verschillende receptor tyrosinekinase (RTK) families, worden bijvoorbeeld autofosforyleerd op ligandbinding en activering in craniale neurale crestcellen 2,3,4 . Bovendien wordt de G-eiwit-gekoppelde transmembraanreceptor Smoothened gefosforyleerd in craniale neurale crestcellen en craniofacial ectoderm stroomafwaarts van Sonic hedgehog (SHH) ligandbinding aan de Patched1-receptor, wat resulteert in gladgestreken accumulatie op het ciliaire membraan en SHH-routeactivering5. Dergelijke ligand-receptor interacties kunnen optreden via autocriene, paracriene en / of juxtacrine signalering in craniofaciale contexten. Van BMP6 is bijvoorbeeld bekend dat het op een autocriene manier signaleert tijdens chondrocytendifferentiatie6, terwijl fibroblastgroeifactor (FGF) 8 wordt uitgedrukt in het faryngeale boogectoderm en bindt aan leden van de FGF-familie van RTK's uitgedrukt in het faryngeale boogmes mesenchym op een paracriene manier om patroonvorming en uitgroei van de faryngeale bogen te initiëren7, 8,9,10. Bovendien wordt Notch-signalering geactiveerd in zowel chondrocyten als osteoblasten tijdens craniofaciale skeletontwikkeling door juxtacrine-signalering wanneer transmembraandelta en / of gekartelde liganden binden aan transmembraan Notch-receptoren op naburige cellen, die vervolgens worden gesplitst en gefosforyleerd11. Er zijn echter andere ligand- en receptorparen die belangrijk zijn voor craniofaciale ontwikkeling die de flexibiliteit hebben om te functioneren in zowel autocriene als paracriene signalering. Tijdens morfogenese van muizentanden is bijvoorbeeld aangetoond dat van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF)-AA-ligand op een autocriene manier signaleert om de RTK PDGFRα in het glazuurorgaanepitheelte activeren 12. Daarentegen worden bij muriene gezichtsprocessen tijdens de zwangerschap transcripten die coderen voor de liganden PDGF-AA en PDGF-CC uitgedrukt in het craniofaciale ectoderm, terwijl de PDGFRα-receptor wordt uitgedrukt in het onderliggende craniale neurale crest-afgeleide mesenchym, wat resulteert in paracriene signalering 13,14,15,16,17 . Ongeacht het signaleringsmechanisme resulteren deze receptorfosforylatiegebeurtenissen vaak in de rekrutering van adaptoreiwitten en / of signaalmoleculen, die vaak zelf gefosforyleerd worden om intracellulaire kinasecascades te initiëren, zoals de mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) -route18,19.

De terminale intracellulaire effectoren van deze cascades kunnen vervolgens een reeks substraten fosforyleren, zoals transcriptiefactoren, RNA-binding, cytoskeletale en extracellulaire matrixeiwitten. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 en Sox926 behoren tot de transcriptiefactoren die gefosforyleerd zijn in de context van craniofaciale ontwikkeling. Deze posttranslationele modificatie (PTM) kan direct van invloed zijn op de gevoeligheid voor alternatieve PTM's, dimerisatie, stabiliteit, splitsing en/of DNA-bindende affiniteit, naast andere activiteiten 20,21,25,26. Bovendien wordt het RNA-bindende eiwit Srsf3 gefosforyleerd in de context van craniofaciale ontwikkeling, wat leidt tot zijn nucleaire translocatie27. Over het algemeen is aangetoond dat fosforylering van RNA-bindende eiwitten hun subcellulaire lokalisatie, eiwit-eiwitinteracties, RNA-binding en / of sequentiespecificiteitbeïnvloedt 28. Bovendien kan fosforylering van actomyosine leiden tot cytoskeletale herschikkingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling29,30, en fosforylering van extracellulaire matrixeiwitten, zoals kleine integrinebindende ligand N-gebonden glycoproteïnen, draagt bij aan biomineralisatie tijdens de ontwikkeling van het skelet31. Door het bovenstaande en tal van andere voorbeelden is het duidelijk dat er brede implicaties zijn voor eiwitfosforylering tijdens craniofaciale ontwikkeling. Door een extra niveau van regulatie toe te voegen, wordt eiwitfosforylering verder gemoduleerd door fosfatasen, die kinasen tegengaan door fosfaatgroepen te verwijderen.

Deze fosforyleringsgebeurtenissen op zowel het receptor- als effectormolecuulniveau zijn van cruciaal belang voor de voortplanting van signaalroutes en resulteren uiteindelijk in veranderingen in genexpressie in de kern, waardoor specifieke celactiviteiten worden aangedreven, zoals migratie, proliferatie, overleving en differentiatie, die resulteren in de juiste vorming van het zoogdiergezicht. Gezien de contextspecificiteit van eiwitinteracties met kinasen en fosfatasen, de resulterende veranderingen in PTM's en hun effecten op celactiviteit, is het van cruciaal belang dat deze parameters worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving om volledig inzicht te krijgen in de bijdrage van fosforyleringsgebeurtenissen aan craniofaciale ontwikkeling. Hier worden voorbeelden gegeven van twee contexten waarin fosforylering van eiwitten en dus activering van signaalroutes tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren moet worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11,5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken - zowel primaire32 als vereeuwigde33 . Bij E11.5 zijn de maxillaire processen in het proces van versmelting met de laterale en mediale nasale processen1, waardoor een kritisch tijdspunt wordt weergegeven tijdens de craniofaciale ontwikkeling van de muis. Verder werden hier maxillaire processen en cellen afgeleid van de palatale planken gekozen omdat de laatste structuren derivaten zijn van de eerste, waardoor onderzoekers de mogelijkheid krijgen om eiwitfosforylatie in vivo en in vitro in gerelateerde contexten te ondervragen. Dit protocol is echter ook van toepassing op alternatieve gezichtsprocessen en ontwikkelingstijdpunten.

Een cruciaal probleem bij het bestuderen van gefosforyleerde eiwitten is dat ze gemakkelijk worden gedefosforyleerd tijdens eiwitisolatie door overvloedige omgevingsfosfatasen. Om deze barrière te overwinnen, worden aanpassingen en aanpassingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van gefosforyleerde eiwitten mogelijk maken. Daarnaast worden best practices gegeven voor een goede analyse en kwantificering van gefosforyleerde eiwitten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of muriene genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende signaalroutes die actief zijn tijdens de craniofaciale ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Colorado Anschutz Medical Campus en uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en voorschriften. Vrouwelijke 129S4-muizen op een leeftijd van 1,5-6 maanden en gehuisvest bij een subthermoneutrale temperatuur van 21-23 ° C werden gebruikt voor embryo-oogsten. Een schematische workflow van het protocol is weergegeven in figuur 1. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, apparatuur, software, reagentia en dieren die in dit protocol worden gebruikt.

1. Het oogsten van E11.5 muizenembryo's

  1. Euthanaseer zwangere vrouwelijke muis 11,5 dagen na detectie van vaginale plug tijdens getimede paring in een CO2-kamer met behulp van IACUC-goedgekeurd CO2-debiet dat nodig is voor ongeveer 50% verplaatsing (2,95 l / min in een 360 in3 kamer) en duur van blootstelling (zie tabel met materialen). Voer cervicale dislocatie uit als een secundaire methode van euthanasie. Ga onmiddellijk over tot dissectie.
  2. Leg het muislichaam op een ontleedbord met de ventrale kant naar boven gericht. Spuit de muizenbuik in met 70% ethanol.
  3. Open de buikholte door de huidanterieur naar de vaginale opening te knijpen en op te tillen met een rechte Semken-tang en de opgetilde huid en onderliggende lagen te snijden met een rechte chirurgische schaar in een hoek van 45 ° aan weerszijden om een "V" -vorm te genereren die zich uitstrekt tot elk lateraal oppervlak ongeveer halverwege tussen de voorpoten en achterpoten.
  4. Pak met behulp van de Semken-tang een van de baarmoederhoorns vast en knip onder de eileider en boven de baarmoederhals met de chirurgische schaar. Snijd het mesometrium weg om de baarmoederhoorn volledig te kunnen verwijderen.
  5. Breng de ontleedde baarmoederhoorn over op 10 ml histologische fosfaatbuffered saline (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasisch, 10,14 mM Na2HPO4 dibasisch, pH 7,4] in een petrischaaltje van 10 cm.
  6. Verwijder de tweede baarmoederhoorn aan de andere kant van de buikholte volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 1.4-1.5.
  7. Plaats de petrischaal van 10 cm met beide baarmoederhoorns op ijs als u niet onmiddellijk overgaat tot de dissectie van individuele embryo's (d.w.z. als een tweede vrouwelijke muis wordt ontleed).
  8. Ontleed onder een ontleedende stereomicroscoop zorgvuldig elk embryo uit de baarmoederhoorns met Dumont #5 fijne tang. Trek langzaam het myometrium, decidua en chorion weg. Scheur en verwijder het relatief transparante amnion rond het embryo en breek de navelstreng door die het embryo met de placenta verbindt.
  9. Breng elk ontleed embryo over op 2,5 ml histologie PBS in een individuele put van een 12-well celkweekplaat op ijs met behulp van een gesneden plastic transferpipet of een embryolepel.
    OPMERKING: Als u werkt met een nest dat embryo's van meer dan één genotype kan bevatten, bewaar dan het amnion rond elk embryo voor genotypering door elk in zijn eigen vooraf gelabelde 0,5 ml microcentrifugebuis op ijs te plaatsen.

2. Ontleden van maxillaire processen van E11.5 muisembryo's

  1. Bereid drie petrischalen van 10 cm met 10 ml histologie PBS en bewaar ze op ijs om te worden gebruikt in rotatie tussen embryo's.
  2. Breng één embryo uit een individuele put van de 12-well celkweekplaat over naar een van de 10 cm petrischalen met histologie PBS op ijs met behulp van een gesneden plastic transferpipet of een embryolepel.
  3. Scheid onder de ontleedmicroscoop elk maxillair proces van het gezicht met behulp van de fijne tang. Snijd eerst de voorste zijde van een maxillair proces langs de natuurlijke inkeping die het laterale nasale proces en het maxillaire proces scheidt (figuur 2A).
  4. Snijd ten tweede de achterste kant van het maxillaire proces langs de natuurlijke inkeping die het maxillaire proces en het mandibulaire proces scheidt (figuur 2A).
  5. Ten derde, om het maxillaire proces volledig te scheiden, maakt u een verticale snede van de voorste naar de achterste zijden van het maxillaire proces aan de oogzijde van het maxillaire proces waar de natuurlijke inkepingen waarnaar boven het uiteinde wordt verwezen (figuur 2A-C).
  6. Herhaal deze drie sneden voor het maxillaire proces aan de andere kant van het gezicht.
  7. Breng met behulp van een 9" Pasteur pipet met een kleine latexbol van 2 ml het ontlede paar maxillaire processen en een klein druppeltje van ongeveer 30 μL histologie PBS over naar een gelabelde petrischaal van 35 mm op ijs (figuur 2D).
  8. Volg stappen 2,3-2,7 voor elk embryo en draai de drie petrischalen van 10 cm met histologie PBS op ijs tussen embryo's. Plaats afzonderlijke paren van ontleedde maxillaire processen in afzonderlijke petrischalen van 35 mm op ijs.
    OPMERKING: Scheiding van het maxillaire proces ectoderm en mesenchym (stappen 2.9-2.17) kan worden uitgevoerd na het ontleden van de maxillaire processen van alle embryo's in het nest. Als intacte maxillaire processen die zowel het ectoderm als het mesenchym bevatten gewenst zijn, gaat u verder met stap 2.18 hieronder.
  9. Bereid 250 μL vers 2% trypsine in weefselkweek PBS en 250 μL 10% foetaal runderserum (FBS) in weefselkweek PBS en bewaar op ijs.
  10. Plaats een tweede, klein druppeltje van ongeveer 30 μL 2% trypsine in de 35 mm petrischaal gescheiden van het eerste, kleine druppeltje histologie PBS met de maxillaire processen. Breng het paar maxillaire processen over op het kleine druppeltje van 2% trypsine met behulp van het Pasteur-pipet (figuur 2D).
  11. Incubeer het gerecht op ijs gedurende 15 minuten.
  12. Haal de 35 mm petrischaal van het ijs en leg deze onder de ontleedmicroscoop.
  13. Trek met behulp van de fijne tang langzaam en voorzichtig de laag ectoderm van elk maxillair proces af (figuur 2E).
    OPMERKING: Als het ectoderm niet scheidt van het mesenchym in een intacte plaat, incubeer dan in 2% trypsine bij kamertemperatuur (RT) gedurende maximaal 5 extra minuten voordat u doorgaat met scheiden. Als het weefsel begint te desintegreren in de 2% trypsine, verplaats dan de maxillaire processen naar de 10% FBS zoals hieronder beschreven om het trypsine te neutraliseren en de scheiding van het ectoderm en mesenchym te voltooien.
  14. Zodra het maxillaire proces ectoderm en mesenchym zijn gescheiden (figuur 2F), breng de gewenste weefsels van het paar maxillaire processen over naar een derde, kleine druppel van ongeveer 30 μL van 10% FBS - gescheiden van de twee vorige kleine druppeltjes - met behulp van de Pasteur pipet (figuur 2D).
  15. Plaats de 35 mm petrischaal op ijs om de trypsinisatie te stoppen.
  16. Incubeer de maxillaire procesweefsels op ijs in 10% FBS gedurende 1-2 minuten en breng vervolgens de weefsels van beide maxillaire processen over naar een vierde, kleine druppel van ongeveer 30 μL voorgekookte histologie PBS op ijs - gescheiden van de drie vorige kleine druppeltjes - met behulp van de Pasteur-pipet (figuur 2D).
  17. Incubeer de maxillaire procesweefsels in histologie PBS gedurende 1 minuut terwijl u de histologie PBS voorzichtig rond de maxillaire procesweefsels wervelt met de punt van de Pasteur-pipet om ervoor te zorgen dat alle FBS van het weefsel wordt gespoeld.
  18. Breng het paar maxillaire procesweefsels over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs met behulp van de Pasteur-pipet, waardoor de overdracht van histologie PBS wordt geminimaliseerd. Verwijder overtollige histologie PBS in de microcentrifugebuis van 1,5 ml met de Pasteur pipet.
  19. Volg de bovenstaande stappen om de maxillaire processen van elk embryo in het nest te ontleden.
  20. Verwerk de monsters onmiddellijk om hele celeiwitlysaten (hieronder) te isoleren of langdurig bij -80 °C te bewaren. Voordat u deze langdurig opslaat, vriest u de microcentrifugebuis van 1,5 ml in een bad van 100% EtOH gedurende 5 minuten in op droogijs.

3. Isoleren van hele cel eiwitlysaten van muis maxillaire processen

  1. Als maxillaire processen eerder bij -80 °C werden ingevroren, ontdooi ze dan op ijs.
  2. Voeg 0,1 ml ijskoude NP-40 lysisbuffer (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; bewaard bij 4 °C) toe met protease- en fosfataseremmers (1x complete mini-proteaseremmercocktail [opgelost in water; bewaard bij -20 °C], 1 mM PMSF [opgelost in isopropanol; bewaard bij 4 °C], 10 mM NaF [bewaard bij -20 °C; vermijd bevriezing/dooi], 1 mM Na3VO4 [bewaard bij -20 °C], 25 mM β-glycerofosfaat [opgeslagen bij 4 °C]) toegevoegd onmiddellijk voor gebruik op ijs.
    OPMERKING: Celfractionering kan als alternatief worden uitgevoerd om cytoplasmatische, nucleaire, membraan- of mitochondriale eiwitfracties te isoleren.
  3. Pipetteer 10 keer op en neer met een pipetman van 200 μL.
  4. Vortex gedurende 10 s, en pipetteer dan 10 keer op en neer met een 200 μL pipetman. Vermijd het genereren van bubbels.
  5. Incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur terwijl u het uiteinde over het uiteinde draait met behulp van een peddel van 1,5 ml /2 ml met een buis revolver.
  6. Centrifugeer de monsters bij 13.500 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  7. Verzamel het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs met een pipetman van 200 ml.
  8. Kwantificeer de eiwitconcentratie met de eiwittestkit, met behulp van 10 μL eiwitlysaat + 10 μL NP-40 lysisbuffer voor experimentele monsters en 3-5 verdunningen van runderserumalbumine (fractie V) (BSA) in NP-40 lysisbuffer in een bereik van 0,25-2,0 mg / ml als eiwitstandaarden.
  9. Ga verder met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) (stap 5) of vries de resterende lysaten snel in op droogijs en bewaar op -80 °C langdurig.

4. Isoleren van hele cel eiwitlysaten uit primaire en/of vereeuwigde muis embryonale palatale mesenchym (MEPM) cellen

OPMERKING: Isolatie en kweek van primaire MEPM-cellen van E13.5-muizenembryo's en onsterfelijke MEPM-cellen zijn eerder beschreven 32,33,34. Stimulatie van cellen met groeifactor (stappen 4.1-4.7) kan worden uitgevoerd voorafgaand aan cellysis. Als niet-gestimuleerde cellen gewenst zijn, ga dan verder met stap 4.8 hieronder.

  1. Zuig het groeimedium [Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 50 U/ml penicilline, 50 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 10% FBS] uit de MEPM-cellen bij ~70% confluentie in een celkweekschaal van 6 cm met behulp van een 5,75" Pasteur pipet bevestigd aan een vacuümsysteem.
  2. Was de cellen met 1 ml weefselkweek PBS.
  3. Voeg 3 ml serumafhongermedium [DMEM met 50 E/ml penicilline, 50 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 0,1% FBS] toe, voorgewarmd in een waterbad van 37 °C.
  4. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 23 uur.
  5. Vervang het serumverhongeringsmedium door 3 ml vers, voorverwarmd serumverhongeringsmedium.
  6. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
  7. Stimuleer de cellen met de groeifactor van keuze in een empirisch bepaalde concentratie gedurende de gewenste tijdsduur.
  8. Zuig het medium uit de MEPM-cellen aan bij 80%-100% confluentie met behulp van een 5,75" Pasteur pipet bevestigd aan een vacuümsysteem.
  9. Was de cellen tweemaal met ijskoude weefselkweek PBS (1 ml voor een celkweekschaal van 6 cm); kantel de plaat tijdens de laatste wasbeurt opzij om ervoor te zorgen dat alle weefselkweek PBS wordt aangezogen.
  10. Lyseer de cellen door ijskoude NP-40 lysisbuffer met protease- en fosfataseremmers die vlak voor gebruik (0,1 ml voor een celkweekschaal van 6 cm) op ijs worden toegevoegd.
  11. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten op ijs met rotatie ongeveer elke minuut om volledige dekking van de plaat te garanderen.
  12. Schraap de cellen van de plaat met behulp van een voorgekoelde cellifter en breng de celsuspensie over naar een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs.
  13. Incubeer de celsuspensie bij 4 °C gedurende 30 minuten terwijl u uiteinde over uiteinde draait met behulp van een peddel van 1,5 ml / 2 ml met een buis revolver.
  14. Ga verder met de stappen 3.6-3.9 die hierboven zijn beschreven.

5. Western blotting van hele cel eiwit lysaten uit muis gezichtsprocessen en/of MEPM cellen voor fosfoproteïnen

  1. Bereid hele cel eiwit lysaat monsters voor SDS-PAGE.
    1. Bepaal de hoeveelheid eiwit die moet worden geladen, afhankelijk van de eiwitrijkdom in het weefsel / de cel; 12,5 μg is meestal voldoende voor robuust tot expressie gebrachte eiwitten in hele cel eiwitlysaten.
    2. Voeg een gelijk volume van 2x Laemmli buffer [20% glycerol, 4% SDS, 0,004% broomfenol blauw, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] toe met 10% β-mercaptoethanol toegevoegd direct voor gebruik.
      LET OP: β-mercaptoethanol is huid- of oogcorroserend, giftig, gevaarlijk bij inslikken en heeft aquatische toxiciteit. Draag handschoenen, een laboratoriumjas, gezichtsscherm en een veiligheidsbril in een chemische zuurkast. Weggooien volgens de richtlijnen voor milieuhygiëne en -veiligheid.
    3. Meng door vortexing.
    4. Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C in een minidroog bad.
    5. Meng door vortexing en plaats de monsters op ijs.
    6. Centrifugeer bij 9.400 × g gedurende 5 min bij 4 °C.
    7. Plaats de monsters kort op ijs voordat ze in SDS-PAGE-gel worden geladen of bewaar ze langdurig bij -20 °C.
  2. Voer SDS-PAGE uit met behulp van een elektroforesecel met een 4%-15% prefab eiwitgel en elektroforesebuffer35.
  3. Elektrotransfer van de eiwitten naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met behulp van transferbuffer met 0%-20% methanol (0%-10% voor eiwitten groter dan 100 kDa; 20% voor eiwitten kleiner dan 100 kDa) toegevoegd onmiddellijk voor gebruik35.
  4. Blokkeer het membraan en sonde voor fosfoproteïne van belang.
    1. Was het membraan na overdracht gedurende 5 minuten in 1x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] in een western blot box.
    2. Incubeer het membraan in 5 ml blokkeerbuffer [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; goed gemengd en gefilterd door een 25 mm spuitfilter met 0,2 μm poriën met behulp van een 10 ml spuit met luerpunt] gedurende 1 uur in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
      OPMERKING: Gebruik melk niet als een blokkerend middel bij het karakteriseren van fosfoproteïnen, omdat het de fosfoproteïnecaseïne bevat, wat een hoog, niet-specifiek achtergrondsignaal kan veroorzaken.
    3. Was het membraan driemaal gedurende 5 minuten elk in TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    4. Incubeer het membraan in 5 ml primair antilichaam verdund in blokkerende buffer bij 4 °C 's nachts in een conische buis van 50 ml met behulp van een peddel van 50 ml met een buis revolver.
      OPMERKING: Raadpleeg de antilichaam datasheet voor de juiste concentratie voor western blotting.
    5. Was het membraan driemaal bij RT gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    6. Incubeer het membraan in 5 ml geschikte mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 1 uur in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    7. Was het membraan driemaal gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    8. Incubeer het membraan in enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting substrate [mengen van gelijke volumes uit flessen 1 en 2; 0,5 ml van elk voor grote (8,6 cm x 6,7 cm) membranen] gedurende 1 minuut, zodat het hele membraan voortdurend wordt blootgesteld aan het ECL western blotting substraat.
    9. Giet het membraan van overtollig ECL western blotting substraat af en ontwikkel onmiddellijk met behulp van een chemiluminescentie imager.
  5. Strip het membraan en reprobe voor totaal eiwit van belang.
    1. Plaats het PVDF-membraan in een transparant zakje met polyethyleen voering met 5 ml strippingbuffer [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] met 8 μL/ml β-mercaptoethanol dat onmiddellijk voor gebruik wordt toegevoegd.
    2. Incubeer bij 50 °C gedurende 30 minuten met schommelen in een hybridisatieoven met 11 omwentelingen per minuut.
    3. Was het membraan driemaal bij RT gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    4. Ga verder met de stappen 5.4.2-5.4.9 die hierboven zijn beschreven.
  6. Kwantificeer western blot band dichtheden met behulp van ImageJ-software, normaliseren van de niveaus van het gefosforyleerde eiwit van belang tot de niveaus van het totale eiwit van belang36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bij pogingen om de fosforylering van eiwitten geïsoleerd uit gezichtsprocessen van muizen en/of gekweekte palatale mesenchymcellen te karakteriseren, zullen de representatieve resultaten idealiter een duidelijke, reproduceerbare band onthullen na western blotting met een antifosfoproteïne-antilichaam dat op of nabij de hoogte van de overeenkomstige totale eiwitband loopt (figuur 3 ). Als er echter uitgebreide fosforylering van het eiwit optreedt, kan er een lichte opwaartse verschuiving van de fosfoproteïneband zijn in vergelijking met die van de totale eiwitband. Verder, als er meerdere isovormen van een eiwit bestaan in een weefsel, dat elk gefosforyleerd is, of als het eiwit variabel wordt onderworpen aan extra PTM's, kunnen meerdere banden in de western blot verschijnen met een antifosfoproteïne-antilichaam. Als er geen signaal wordt waargenomen voor het fosfoproteïne van belang, ondanks de detectie van het totale eiwit van belang, kan het eiwit niet worden gefosforyleerd in de gekozen context, of kan er een technisch probleem zijn ontstaan met het protocol. In het laatste geval kan western blotting van hele cellysaten worden uitgevoerd met antifosfosforine / threonine en / of antifosfotyrosine-antilichamen om aan te geven of het protocol werkte zoals verwacht. Aangezien fosforylering van eiwitten overvloedig aanwezig is in craniofaciale weefsels25,37, zal de aanwezigheid van meerdere fosfoproteïnebanden wijzen op een succesvolle voltooiing van het protocol en nauwkeurige resultaten van de eerste screening.

Het is vaak nuttig om fosfoproteïneniveaus te vergelijken tussen wild-type en gemuteerde embryoweefsels of als reactie op de behandeling van gekweekte cellen. In het eerste geval zou een verschil in fosfoproteïneniveaus tussen genotypen verschijnen als een verschil in bandintensiteiten voor het fosfoproteïne van belang met vergelijkbare niveaus van het totale eiwit van belang27. In het laatste geval zouden representatieve uitkomsten verhoogde fosfoproteïnebandintensiteiten onthullen in vergelijking met die van onbehandelde cellen bij behandeling met bijvoorbeeld een groeifactor (figuur 3) en verminderde bandintensiteiten na behandeling met een kinaseremmer27,37. Voor de kwantificering van deze verschillen zouden de niveaus van het betreffende fosfoproteïne worden genormaliseerd tot niveaus van het totale eiwit van belang. De niveaus van het totale eiwit van belang zijn naar verwachting relatief gelijk tussen de monsters, een bevinding die moet worden bevestigd door afzonderlijke western blotting met behulp van een of meer antilichamen tegen belastings- en expressiecontrole-eiwitten zoals β-tubuline, β-actine en / of GAPDH (figuur 3). Voor groeifactorbehandeling van gekweekte cellen zullen positieve resultaten waarschijnlijk een toename van fosfoproteïneniveaus laten zien in een relatief kort tijdsbestek van 2-15 minuten na stimulatie (figuur 3). Er mag weinig of geen fosforylering zijn bij afwezigheid van groeifactorbehandeling, tenzij er andere factoren in het spel zijn die resulteren in fosforylering van het eiwit, zoals endogene expressie van groeifactoren door de cellen, fosforylering van het eiwit door een ander signaalmolecuul dat door de cellen wordt uitgedrukt, en / of een mutatie die leidt tot constitutieve fosforylering van het eiwit in afwezigheid van groeifactorbehandeling. Met deze factoren moet rekening worden gehouden bij de interpretatie van de resultaten. Negatieve resultaten omvatten geen verandering in fosforylering als reactie op een tijdsloop van groeifactorbehandeling, in welk geval het protocol moet worden geëvalueerd voor het onderhoud van fosfoproteïnen zoals hierboven beschreven. Bovendien kan het proces van membraanstrippen af en toe de totale eiwitniveaus beïnvloeden en verlagen. In dit geval zouden tegenovergestelde trends worden waargenomen voor de hoeveelheid fosfoproteïne van belang versus het totale eiwit van belang. Dit is suboptimaal, omdat de totale eiwitniveaus naar verwachting relatief gelijk zijn tussen monsters, uitgaande van gelijke belasting en expressie van het eiwit, waarbij veranderingen alleen optreden in fosfoproteïneniveaus.

Figure 1
Figuur 1: Workflow voor isolatie van hele cel eiwitlysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse. Maxillaire processen worden ontleed uit E11.5 muizenembryo's op ijs, en/of het medium wordt geaspireerd uit gekweekte MEPM-cellen bij 80%-100% confluentie, die vervolgens tweemaal worden gewassen met ijskoude PBS. Hele cel eiwitlysaten worden geïsoleerd met behulp van lysisbuffer met protease- en fosfataseremmers, gevolgd door SDS-PAGE, elektrotransfer naar een PVDF-membraan, blokkering van het membraan met BSA, onderzoek naar het fosfoproteïne, strippen van het membraan, reprobing voor totaal eiwit en kwantificering van bandintensiteiten. Afkortingen: LNP = lateraal nasaal proces; MxP = maxillair proces; MdP = mandibulair proces; PA2 = tweede faryngeale boog; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; FBS = foetaal runderserum; PS = palatale plank; MEPM = muis embryonaal palataal mesenchym; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese; PVDF = polyvinylideenfluoride; p-P = gefosforyleerd eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Dissectie van maxillaire processen. (A) Zijdelingse weergave van een E11.5-muizenembryo met de drie sneden (gelabeld 1-3) die nodig zijn om de MxP te scheiden van het gezicht dat wordt aangegeven door gekleurde lijnen. (B) Zijdelingse weergave van een E11.5-muizenembryo na verwijdering van MxP omlijnd met een onderbroken zwarte lijn. (C) Ontleed MxP. (D) Een petrischaaltje van 35 mm met kleine druppeltjes PBS, 2% trypsine en 10% FBS voor optionele scheiding van MxP ectoderm en mesenchym. (E) MxP met Ect gedeeltelijk gescheiden van Mes. (F) Gescheiden MxP Ect en Mes. Schaalbalken: 1 mm (A-C, E, F), 10 mm (D). Afkortingen: LNP = lateraal nasaal proces; MxP = maxillair proces; MdP = mandibulair proces; PA2 = tweede faryngeale boog; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; FBS = foetaal runderserum; Mes = mesenchym; Ect = ectoderm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: PDGFRβ en MAPK-effector Erk1/2 fosforylering als reactie op PDGF-BB ligandbehandeling van vereeuwigde MEPM-cellen. Western blot analyse van hele cel lysaten van vereeuwigde MEPM cellen na een tijdsloop van 10 ng / ml PDGF-BB ligand stimulatie van 2 min tot 15 minuten met anti-fosfo-PDGFR, anti-PDGFRβ, anti-fosfo-Erk1/2, anti-Erk1/2 en anti-β-tubuline (E7) antilichamen. Meerdere banden in anti-PDGFRβ-vlek vertegenwoordigen differentieel geglycosyleerde eiwitten. Afkortingen: PDGF = van bloedplaatjes afgeleide groeifactor; WCL = hele cel lysaat; kD = kilodalton; WB = western blot; p-PDGFR = gefosforyleerde PDGFR; PDGFR = PDGF receptor; p-Erk = gefosforyleerd Erk; Erk = extracellulair signaalgereguleerd kinase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het hier beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om kritische fosforyleringsafhankelijke signaleringsgebeurtenissen tijdens craniofaciale ontwikkeling op een robuuste en reproduceerbare manier te onderzoeken. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die zorgen voor een goede verzameling van gegevens en analyse van resultaten. Of het nu gaat om het isoleren van fosfoproteïnen van gezichtsprocessen van muizen en / of gekweekte palatale mesenchymcellen, het is noodzakelijk om snel en efficiënt te bewegen terwijl alle reagentia en materialen op ijs blijven wanneer dit aangegeven is. De lage temperatuur van ijs vertraagt de metabole activiteit in de cellen, waardoor gefosforyleerde eiwitten worden beschermd tegen fosfataseactiviteit38 en een hoge eiwitopbrengst wordt gehandhaafd. Het gebruik van drie afzonderlijke petrischalen van 10 cm tijdens de dissectie van maxillaire processen zorgt ervoor dat alle dissecties plaatsvinden in voldoende voorgekookte histologie PBS. Een bijkomend, essentieel onderdeel van dit eiwitisolatieprotocol is het gebruik van fosfataseremmers in alle lysisbuffers. Deze reagentia beschermen ook fosfaatgroepen op het eiwit van belang39,40 en behouden de integriteit van het gefosforyleerde eiwit voor verdere analyse door western blotting.

Dit protocol introduceert bovendien wijzigingen die meer specifieke analyses van fosfoproteïnen in weefsel en gekweekte cellen mogelijk maken. In het proces van het ontleden van gezichtsprocessen zijn optionele stappen toegevoegd voor de scheiding van het maxillaire proces ectoderm en mesenchym om de studie van compartimentspecifieke eiwitfosforylatie mogelijk te maken27. Om te testen op efficiënte isolatie van deze weefsellagen, kunnen gebruikers de expressie beoordelen van genen verrijkt in het ectoderm, zoals Gabrp, Trim29, Esrp1 en Mpzl2, en / of genen verrijkt in het mesenchym, zoals Aldh1a2 en AW55198441. Voor de isolatie van fosfoproteïnen uit gekweekte palatale mesenchymcellen zijn optionele stappen toegevoegd voor groeifactorstimulatie. In dit geval moeten cellen worden uitgehongerd in een medium dat 0,0% -0,1% serum bevat. Standaard serums zoals FBS bevatten tal van groeifactoren42 die de resultaten van exogene groeifactorstimulatie kunnen convolueren. Tijdelijke serumverhongering bereidt cellen dus voor om te reageren op acute groeifactorbehandeling.

Dit protocol biedt ook geoptimaliseerde methoden om eiwitfosforylering nauwkeurig te kwantificeren. In de western blotting-stappen is het belangrijk om het PVDF-membraan te blokkeren met behulp van BSA in plaats van melk, wat wordt gebruikt in veel standaard western blotting-technieken. Deze schakelaar is noodzakelijk, omdat melk het fosfoproteïne caseïne43 bevat en leidt tot een hoog achtergrondsignaal bij de analyse van andere fosfoproteïnen. Verder is het belangrijk dat de niveaus van het gefosforyleerde eiwit van belang worden gekwantificeerd tegen niveaus van het totale eiwit van belang in plaats van niveaus van een standaard belastingscontrole-eiwit. Op deze manier kunnen eventuele veranderingen in de expressie van het totale eiwit van belang worden verantwoord bij de kwantificering van fosfoproteïneniveaus. Als de eiwitopbrengst in het algemeen te laag is voor nauwkeurige detectie van fosfoproteïne, kunnen weefselmonsters uit hetzelfde stadium en genotype worden samengevoegd27, en / of cellen kunnen worden gekweekt in grotere celkweekvaten dan die hier beschreven voor toekomstige experimenten. Als alternatief, als strippen consequent de totale eiwitniveaus lijkt te veranderen, kunnen twee benaderingen worden gevolgd om het beschreven protocol te wijzigen om reproduceerbare resultaten te bereiken: 1) gebruik van een antilichaamschema dat antifosfoproteïne en anti-eiwitantistoffen gebruikt die zijn gegenereerd in verschillende gastheersoorten in combinatie met twee soortspecifieke secundaire antilichamen en afzonderlijk (bij gebruik van HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen) of gelijktijdig (bij gebruik van fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen) ontwikkeling van de vlekken; of 2) gelijktijdige verwerking van twee identieke membranen - de eerste geïncubeerd met een antifosfoproteïne-antilichaam, de tweede met een anti-eiwitantilichaam. In beide alternatieve benaderingen moeten de niveaus van het gefosforyleerde eiwit van belang nog steeds worden gekwantificeerd tegen de niveaus van het totale eiwit van belang. Ten slotte, aangezien fosforylering een dynamisch proces is, moeten fosfoproteïneniveaus worden beoordeeld in ten minste drie biologische replicaties per aandoening. Weefsel van muizengezichtsproces of primaire MEPM-cellen afgeleid van een individueel embryo of een individuele pool van embryo's uit hetzelfde stadium en genotype zou een enkele biologische replicatie vormen. Evenzo zouden vereeuwigde MEPM-cellen van verschillende passages biologische replicaties vormen. Als gekweekte cellen worden behandeld met een groeifactor, moet de behandeling van biologische replicaties op verschillende dagen plaatsvinden met behulp van afzonderlijke aliquots van groeifactor.

Er zijn twee beperkingen van de hier gepresenteerde aanpak, die hieronder worden besproken en moeten worden overwogen voordat het protocol wordt gestart. De eerste betreft het dynamisch bereik van ECL. Het ECL western blotting substraat aanbevolen in dit protocol heeft een breed dynamisch bereik, met een lage picogram gevoeligheid. Empirisch gezien kunnen eiwitten met een lage abundantie of een lage fosforyleringsstatus echter moeilijk te detecteren zijn met behulp van deze methoden. Als gefosforyleerde eiwitten niet detecteerbaar zijn na 20 minuten ECL-substraatincubatie, wordt aanbevolen om het membraan in TBS-T te wassen zoals beschreven en in plaats daarvan het membraan te incuberen in een zeer gevoelig ECL western blotting-substraat met een lage femtogramgevoeligheid. Als alternatief kunnen fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen worden gebruikt, die een breder dynamisch bereik bieden dan op enzymen gebaseerde benaderingen zoals ECL44. Een tweede beperking vloeit voort uit de normalisatieprocedure. Zoals uitgebreid beschreven, wordt aanbevolen om het signaal van het fosfoproteïne van belang te normaliseren naar het signaal van het totale eiwit van belang. Dit proces is echter gebaseerd op de veronderstelling dat de niveaus van het totale eiwit van belang niet veranderen tussen monsters, wat vaak wordt bevestigd door afzonderlijke western blotting met behulp van antilichamen tegen een of meer huishoudelijke eiwitten. Een belangrijke overweging is echter dat de niveaus van huishoudelijke eiwitten tussen monsters kunnen veranderen als gevolg van ongelijke belasting, onvolledige overdracht naar het membraan en / of verschillen in eiwitexpressie. Dus, om de nauwkeurigheid tijdens normalisatie te verbeteren, kunnen onderzoekers overwegen om over te stappen om een echte totale eiwitvlek te implementeren, zoals Ponceau S45, die alle eiwitten in elke rijstrook van het membraan detecteert en rekening houdt met deze technische beperkingen.

Over het algemeen overwint dit protocol het probleem van eiwitdefosforylering dat vaak voorkomt tijdens eiwitisolatie. Nauwkeurige analyse van eiwitfosforylatie zal onderzoekers helpen een nauwkeuriger inzicht te krijgen in de rol van gefosforyleerde eiwitten tijdens de craniofaciale ontwikkeling. Bovendien biedt dit protocol robuuste en efficiënte methoden om gefosforyleerde eiwitniveaus te analyseren in fysiologisch relevante contexten, elk met hun eigen voordelen. Terwijl eiwitlysaten uit embryoweefsels een statische momentopname van eiwitfosforylering in vivo bieden, levert de implementatie van gekweekte cellen gegevens op dynamische fosforyleringsreacties op acute behandelingen. Dit protocol heeft de capaciteit om resultaten en hypothesen die voortkomen uit grote datasets, bijvoorbeeld massaspectrometrie37 en RNA-sequencing27, direct te bevestigen en uit te breiden om nieuwe interacties binnen signaleringsnetwerken te ontdekken. Belangrijk is dat dit protocol kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe verstoringen in fosforylering de intracellulaire signalering, genexpressie en cellulaire activiteit in craniofaciale contexten direct beïnvloeden. Deze diverse toepassingen zullen het begrip van de effecten van eiwitfosforylering in de craniofaciale ontwikkeling aanzienlijk verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

129S4 muizen waren een geschenk van Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine op de berg Sinaï. Dit werk werd ondersteund met fondsen van de National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 en K02 DE028572 tot K.A.F., F31 DE029976 tot M.A.R. en F31 DE029364 tot B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Nummer 182 Craniofaciale ontwikkeling fosforylering fosfoproteïnen muis maxillaire processen muis embryonale palatale mesenchymcellen
Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter