Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering af helcelleproteinlysater fra musens ansigtsprocesser og dyrkede palatale mesenchymceller til fosfoproteinanalyse

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen præsenterer en metode til isolering af helcelleproteinlysater fra dissekerede museembryo-ansigtsprocesser eller dyrkede museembryonale palatale mesenchymceller og udfører efterfølgende western blotting for at vurdere fosforylerede proteinniveauer.

Abstract

Pattedyrs kraniofaciale udvikling er en kompleks morfologisk proces, hvor flere cellepopulationer koordinerer for at generere det frontonasale skelet. Disse morfologiske ændringer initieres og opretholdes gennem forskellige signalinteraktioner, som ofte omfatter proteinfosforylering af kinaser. Her gives to eksempler på fysiologisk relevante sammenhænge, hvor man kan studere fosforylering af proteiner under pattedyrs kraniofaciale udvikling: musens ansigtsprocesser, især E11.5 maksillære processer, og dyrkede museembryonale palatale mesenchymceller afledt af E13.5 sekundære palatale hylder. For at overvinde den fælles barriere for dephosphorylering under proteinisolering diskuteres tilpasninger og modifikationer af standard laboratoriemetoder, der muliggør isolering af phosphoproteiner. Derudover gives bedste praksis for korrekt analyse og kvantificering af phosphoproteiner efter vestlig blotting af helcelleproteinlysater. Disse teknikker, især i kombination med farmakologiske hæmmere og /eller murine genetiske modeller, kan bruges til at få større indsigt i dynamikken og rollerne af forskellige phosphoproteiner, der er aktive under kraniofacial udvikling.

Introduction

Pattedyrs kraniofaciale udvikling er en kompleks morfologisk proces, hvor flere cellepopulationer koordinerer for at generere det frontonasale skelet. I musen begynder denne proces på embryonal dag (E) 9,5 med dannelsen af den frontonasale fremtrædende plads og par af maksillære og mandibulære processer, der hver især indeholder post-migrerende kraniale neurale kamceller. De laterale og mediale nasale processer stammer fra den frontonasale fremtrædende plads med udseendet af næsegravene og til sidst smelter sammen for at danne næseborene. Endvidere smelter de mediale nasale processer og maksillære processer sammen for at generere overlæben. Samtidig indledes palatogenese med dannelsen af forskellige udvækst - de sekundære palatale hylder - fra den orale side af de maksillære processer ved E11.5. Over tid vokser de palatale hylder nedad på hver side af tungen, hæver sig til en modsat position over tungen og smelter til sidst sammen ved midterlinjen for at danne en kontinuerlig gane, der adskiller næse- og mundhulen med E16.51.

Disse morfologiske ændringer gennem kraniofacial udvikling initieres og opretholdes gennem forskellige signalinteraktioner, som ofte inkluderer proteinfosforylering af kinaser. For eksempel er cellemembranreceptorer, såsom underfamilier af transformerende vækstfaktor (TGF)-β receptorer, herunder knoglemorfogenetiske proteinreceptorer (BMPR'er) og forskellige receptor tyrosinkinase (RTK) familier, autophosphoryleret ved ligandbinding og aktivering i kraniale neurale kamceller 2,3,4 . Derudover bliver den G-proteinkoblede transmembranreceptor Smoothened fosforyleret i kraniale neurale kamceller og kraniofacial ektoderm nedstrøms for Sonic hedgehog (SHH) ligandbinding til Patched1-receptoren, hvilket resulterer i udjævnet akkumulering ved ciliarymembranen og SHH-vejaktivering5. Sådanne ligandreceptorinteraktioner kan forekomme gennem autokrin, parakrin og / eller juxtacrin signalering i kraniofaciale sammenhænge. For eksempel er BMP6 kendt for at signalere på en autokrin måde under chondrocytdifferentiering6, mens fibroblastvækstfaktor (FGF) 8 udtrykkes i svælgbueektoderm og binder til medlemmer af FGF-familien af RTK'er udtrykt i pharyngeal arch mesenchymen på en parakrin måde for at indlede mønster og udvækst af svælgbuerne7, 8,9,10. Desuden aktiveres Notch-signalering i både chondrocytter og osteoblaster under kraniofacial skeletudvikling gennem juxtacrinsignalering, når transmembrandelta og / eller takkede ligander binder til transmembran Notch-receptorer på naboceller, som efterfølgende spaltes og fosforyleres11. Der er dog andre ligand- og receptorpar, der er vigtige for kraniofacial udvikling, der har fleksibiliteten til at fungere i både autokrin og parakrin signalering. Som et eksempel, under murine tandmorfogenese, blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF)-AA ligand er blevet påvist at signalere på en autokrin måde for at aktivere RTK PDGFRα i emaljeorganepitelet12. I modsætning hertil udtrykkes transkripter, der koder for liganderne PDGF-AA og PDGF-CC, i murine-ansigtsprocesser under midten af drægtigheden i den kraniofaciale ektoderm, mens PDGFRα-receptoren udtrykkes i det underliggende kraniale neurale kamafledte mesenchym, hvilket resulterer i parakrinsignalering 13,14,15,16,17 . Uanset signalmekanismen resulterer disse receptorphosphoryleringshændelser ofte i rekruttering af adaptorproteiner og / eller signalmolekyler, som ofte bliver fosforyleret selv for at initiere intracellulære kinasekaskader såsom den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) vej18,19.

De terminale intracellulære effektorer af disse kaskader kan derefter fosforylere en række substrater, såsom transkriptionsfaktorer, RNA-bindende, cytoskeletale og ekstracellulære matrixproteiner. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 og Sox926 er blandt transkriptionsfaktorerne fosforyleret i forbindelse med kraniofacial udvikling. Denne post-translationelle modifikation (PTM) kan direkte påvirke modtageligheden for alternative PTM'er, dimerisering, stabilitet, spaltning og / eller DNA-bindende affinitet, blandt andre aktiviteter 20,21,25,26. Derudover fosforyleres det RNA-bindende protein Srsf3 i forbindelse med kraniofacial udvikling, hvilket fører til dets nukleare translokation27. Generelt har fosforylering af RNA-bindende proteiner vist sig at påvirke deres subcellulære lokalisering, protein-protein-interaktioner, RNA-binding og / eller sekvensseksealitet28. Desuden kan fosforylering af actomyosin føre til cytoskeletale omlejringer gennem hele kraniofacial udvikling29,30, og fosforylering af ekstracellulære matrixproteiner, såsom små integrinbindende ligand N-bundne glycoproteiner, bidrager til biomineralisering under skeletudvikling31. Gennem ovenstående og talrige andre eksempler er det tydeligt, at der er brede implikationer for proteinfosforylering under kraniofacial udvikling. Ved at tilføje et yderligere reguleringsniveau moduleres proteinphosphorylering yderligere af fosfataser, som modvirker kinaser ved at fjerne fosfatgrupper.

Disse fosforyleringshændelser på både receptor- og effektormolekyleniveauerne er kritiske for udbredelsen af signalveje og resulterer i sidste ende i ændringer i genekspression i kernen, der driver specifikke celleaktiviteter, såsom migration, proliferation, overlevelse og differentiering, hvilket resulterer i korrekt dannelse af pattedyrets ansigt. I betragtning af kontekstskelheden af proteininteraktioner med kinaser og fosfataser, de resulterende ændringer i PTM'er og deres virkninger på celleaktivitet er det afgørende, at disse parametre undersøges i en fysiologisk relevant indstilling for at få en fuldstændig forståelse af fosforyleringshændelsernes bidrag til kraniofacial udvikling. Her gives eksempler på to sammenhænge, hvor man kan studere fosforylering af proteiner og dermed aktivering af signalveje under pattedyrs kraniofaciale udvikling: musens ansigtsprocesser, især E11.5 maksillære processer, og dyrkede museembryale palatale mesenchymceller afledt af E13.5 sekundære palatale hylder - både primære32 og udødeliggjorte33 . Ved E11.5 er de maksillære processer i færd med at smelte sammen med de laterale og mediale nasale processer1 og derved repræsentere et kritisk tidspunkt under musens kraniofaciale udvikling. Endvidere blev maksillære processer og celler afledt af de palatale hylder valgt her, fordi sidstnævnte strukturer er derivater af førstnævnte, hvilket giver forskere mulighed for at forhøre proteinphosphorylering in vivo og in vitro i beslægtede sammenhænge. Denne protokol gælder dog også for alternative ansigtsprocesser og udviklingstidspunkter.

Et kritisk problem ved at studere fosforylerede proteiner er, at de let dephosphoryleres under proteinisolering af rigelige miljøphosphataser. For at overvinde denne barriere diskuteres tilpasninger og modifikationer til standard laboratoriemetoder, der muliggør isolering af fosforylerede proteiner. Derudover findes der bedste praksis for korrekt analyse og kvantificering af fosforylerede proteiner. Disse teknikker, især i kombination med farmakologiske hæmmere og/eller murine genetiske modeller, kan bruges til at få større indsigt i dynamikken og rollerne af forskellige signalveje, der er aktive under kraniofacial udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Colorado Anschutz Medical Campus og udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og regler. Hunmus fra 129S4 ved 1,5-6 måneders alderen og ophuset ved en subtermoneutral temperatur på 21-23 °C blev anvendt til embryohøst. En skematisk arbejdsgang for protokollen er repræsenteret i figur 1. Se tabellen over materialer for detaljer vedrørende alle materialer, udstyr, software, reagenser og dyr, der anvendes i denne protokol.

1. Høstning af E11.5 museembryoner

  1. Aflivning af gravid hunmus 11,5 dage efter påvisning af vaginalprop under tidsstillet parring i et CO2 - kammer ved hjælp af IACUC-godkendt CO2 - strømningshastighed, der kræves for ca. 50% forskydning (2,95 l / min i et 360 i3 kammer) og eksponeringsvarighed (se materialetabel). Udfør cervikal dislokation som en sekundær metode til eutanasi. Fortsæt straks til dissektion.
  2. Læg musekroppen på et dissekeringsbræt med den ventrale side vendt op. Sprøjt musens mave med 70% ethanol.
  3. Åbn bughulen ved at klemme og løfte huden forrest til vaginalåbningen med lige Semken-tang og skære den løftede hud og underliggende lag med lige blad kirurgisk saks i en 45 ° vinkel på hver side for at generere en "V" -form, der strækker sig til hver lateral overflade omtrent halvvejs mellem forbenene og bagbenene.
  4. Brug Semken-tangen til at gribe fat i et af livmoderhornene og skære under ovidukten og over livmoderhalsen med den kirurgiske saks. Skær mesometriumet væk for at muliggøre fuldstændig fjernelse af livmoderhornet.
  5. Overfør det dissekerede livmoderhorn til 10 ml histologifosfatbufret saltvand (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasisk, 10,14 mM Na2HPO4 dibasisk, pH 7,4] i en 10 cm petriskål.
  6. Fjern det andet livmoderhorn på den modsatte side af bukhulen ved hjælp af den samme procedure beskrevet i trin 1,4-1,5.
  7. Læg den 10 cm petriskål, der indeholder begge livmoderhorn, på is, hvis den ikke straks fortsætter til dissektion af individuelle embryoner (dvs. hvis en anden hunmus vil blive dissekeret).
  8. Under et dissekerende stereomikroskop skal du forsigtigt dissekere hvert embryo fra livmoderhornene med Dumont #5 fine tang. Træk langsomt myometrium, decidua og chorion væk. Riv og fjern den relativt gennemsigtige amnion, der omgiver embryoet, og afse navlestrengen, der forbinder embryoet med moderkagen.
  9. Overfør hvert dissekeret embryo til 2,5 ml histologi PBS i en individuel brønd af en 12-brønds cellekulturplade på is ved hjælp af en skåret plastoverførselspipet eller en embryoske.
    BEMÆRK: Hvis du arbejder med et kuld, der kan indeholde embryoner af mere end én genotype, skal du gemme amnionen omkring hvert embryo til genotypning ved at placere hver i sit eget formærkede 0,5 ml mikrocentrifugerør på is.

2. Dissekering af maksillære processer fra E11.5 museembryoner

  1. Forbered tre 10 cm petriskåle indeholdende 10 ml histologi PBS og opbevar dem på is til brug i rotation mellem embryoner.
  2. Overfør et embryo fra en individuel brønd i cellekulturpladen med 12 brønde til en af de 10 cm petriskåle med histologi PBS på is ved hjælp af en skåret plastoverførselspipet eller en embryoske.
  3. Under dissekeringsmikroskopet adskilles hver maksillær proces fra ansigtet ved hjælp af de fine tang. Skær først den forreste side af en maksillær proces langs den naturlige indrykning, der adskiller den laterale nasale proces og den maksillære proces (figur 2A).
  4. For det andet skal du skære den bageste side af den maksillære proces langs den naturlige indrykning, der adskiller den maksillære proces og den mandibulære proces (figur 2A).
  5. For det tredje, for fuldstændigt at adskille den maksillære proces, skal du foretage et lodret snit fra de forreste til bageste sider af den maksillære proces på øjensiden af den maksillære proces, hvor de naturlige fordybninger, der henvises til ovenfor, slutter (figur 2A-C).
  6. Gentag disse tre snit for den maksillære proces på den modsatte side af ansigtet.
  7. Ved hjælp af en 9" Pasteur-pipet med en 2 ml lille latexpære overføres det dissekerede par maksillære processer og en lille dråbe på ca. 30 μL histologi PBS til en mærket 35 mm petriskål på is (figur 2D).
  8. Følg trin 2,3-2,7 for hvert embryo, og drej de tre 10 cm petriskåle indeholdende histologi PBS på is mellem embryoner. Læg individuelle par dissekerede maksillære processer i separate 35 mm petriskåle på is.
    BEMÆRK: Adskillelse af den maksillære proces ektoderm og mesenchym (trin 2.9-2.17) kan udføres efter dissekering af de maksillære processer for alle embryoner i kuldet. Hvis der ønskes intakte maksillære processer, der indeholder både ektoderm og mesenchym, skal du fortsætte til trin 2.18 nedenfor.
  9. Forbered 250 μL frisk 2% trypsin i vævskultur PBS og 250 μL 10% føtalt kvægserum (FBS) i vævskultur PBS og opbevar på is.
  10. Anbring en anden, lille dråbe på ca. 30 μL 2% trypsin i 35 mm petriskålen adskilt fra den første, lille dråbe histologi PBS, der indeholder de maksillære processer. Overfør parret af maksillære processer til den lille dråbe på 2% trypsin ved hjælp af Pasteur-pipetten (figur 2D).
  11. Inkuber skålen på is i 15 minutter.
  12. Fjern 35 mm petriskålen fra isen og læg den under dissekeringsmikroskopet.
  13. Brug den fine tang til langsomt og forsigtigt at trække laget af ektoderm af fra hver maksillær proces (figur 2E).
    BEMÆRK: Hvis ektodermen ikke adskilles fra mesenchymet i et intakt ark, inkuberes i 2% trypsin ved stuetemperatur (RT) i op til 5 yderligere minutter, før du fortsætter med adskillelse. Hvis vævet begynder at opløses i 2% trypsin, skal du flytte de maksillære processer til 10% FBS som beskrevet nedenfor for at neutralisere trypsin og afslutte adskillelsen af ektoderm og mesenchym.
  14. Når den maksillære proces ektoderm og mesenkym er adskilt (figur 2F), overføres det ønskede væv fra parret af maksillære processer til en tredje, lille dråbe på ca. 30 μL af 10% FBS - adskilt fra de to tidligere små dråber - ved hjælp af Pasteur-pipetten (figur 2D).
  15. Læg 35 mm petriskålen på is for at stoppe trypsiniseringen.
  16. Inkuber det maksillære procesvæv på is i 10% FBS i 1-2 minutter, og overfør derefter vævene fra begge maksillære processer til en fjerde, lille dråbe på ca. 30 μL forkølet histologi PBS på is - adskilt fra de tre tidligere små dråber - ved hjælp af Pasteur-pipetten (figur 2D).
  17. Inkuber det maksillære procesvæv i histologi PBS i 1 minut, mens du forsigtigt hvirvler histologien PBS rundt om det maksillære procesvæv med spidsen af Pasteur-pipetten for at sikre, at al FBS skylles af vævet.
  18. Overfør parret af maksillære procesvæv til et mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør på is ved hjælp af Pasteur-pipetten, hvilket minimerer overførslen af histologi PBS. Fjern overskydende histologi PBS i 1,5 ml mikrocentrifugerøret med Pasteur-pipetten.
  19. Følg ovenstående trin for at dissekere de maksillære processer fra hvert embryo i kuldet.
  20. Prøverne behandles straks for at isolere helcelleproteinlysater (nedenfor) eller opbevares ved -80 °C på lang sigt. Før langtidsopbevaring snap-freezes 1,5 ml mikrocentrifugerøret i et bad med 100% EtOH på tøris i 5 minutter.

3. Isolering af helcelleproteinlysater fra musemaksillære processer

  1. Hvis maksillære processer tidligere var frosset ved -80 °C, skal de tøs op på is.
  2. Der tilsættes 0,1 ml iskold NP-40 lysisbuffer (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 % Nonidet P-40, 2 mM EDTA; opbevares ved 4 °C) med protease- og fosfatasehæmmere (1x komplet miniproteasehæmmercocktail [opløst i vand; opbevares ved -20 °C], 1 mM PMSF [opløst i isopropanol; opbevares ved 4 °C] 10 mM NaF [opbevares ved -20 °C; undgå frysning/optøning], 1 mM Na3VO4 [opbevares ved -20 °C], 25 mM β-glycerophosphat [opbevares ved 4 °C]) tilsat umiddelbart før brug på is.
    BEMÆRK: Cellefraktionering kan alternativt udføres for at isolere cytoplasmatiske, nukleare, membran- eller mitokondrielle proteinfraktioner.
  3. Rør op og ned 10 gange med en 200 μL pipetman.
  4. Vortex i 10 s, og derefter pipet op og ned 10 gange med en 200 μL pipetman. Undgå at generere bobler.
  5. Inkuber ved 4 °C i 2 timer, mens du roterer ende over ende ved hjælp af en 1,5 ml/2 ml padle med en rørrevolver.
  6. Centrifugering af prøverne ved 13.500 × g i 20 minutter ved 4 °C.
  7. Saml supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør på is med en 200 ml pipetman.
  8. Kvantificer proteinkoncentrationen med proteinanalysesættet ved hjælp af 10 μL proteinlysat + 10 μL NP-40-lysisbuffer til eksperimentelle prøver og 3-5 fortyndinger af bovin serumalbumin (fraktion V) (BSA) i NP-40 lysisbuffer i et interval på 0,25-2,0 mg/ml som proteinstandarder.
  9. Fortsæt med natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) (trin 5) eller frys hurtigt de resterende lysater på tøris og opbevar ved -80 ° C på lang sigt.

4. Isolering af helcelleprotein lysater fra primære og / eller udødeliggjorte museembryonale palatale mesenchymceller (MEPM)

BEMÆRK: Isolering og dyrkning af primære MEPM-celler fra E13.5-museembryoner og udødeliggjorte MEPM-celler er tidligere beskrevet 32,33,34. Stimulering af celler med vækstfaktor (trin 4.1-4.7) kan udføres før cellelyse. Hvis der ønskes ikke-stimulerede celler, skal du fortsætte til trin 4.8 nedenfor.

  1. Aspirer vækstmediet [Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) med 50 U / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 10% FBS] fra MEPM-cellerne ved ~ 70% sammenløb i en 6 cm cellekulturskål ved hjælp af en 5,75 " Pasteur-pipet fastgjort til et vakuumsystem.
  2. Vask cellerne med 1 ml vævskultur PBS.
  3. Tilsæt 3 ml serumsultmedium [DMEM med 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 0,1 % FBS] forvarmet i et vandbad på 37 °C.
  4. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 23 timer.
  5. Udskift serumsultmediet med 3 ml frisk, forvarmet serumsultmedium.
  6. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time.
  7. Stimuler cellerne med den valgte vækstfaktor i en empirisk bestemt koncentration i den ønskede tid.
  8. Aspirer mediet fra MEPM-cellerne ved 80%-100% sammenløb ved hjælp af en 5,75" Pasteur-pipet, der er fastgjort til et vakuumsystem.
  9. Vask cellerne to gange med iskold vævskultur PBS (1 ml til en 6 cm cellekulturskål); Vip pladen til siden under den sidste vask for at sikre, at al vævskultur PBS aspireres.
  10. Lys cellerne ved at tilsætte iskold NP-40 lysisbuffer med protease- og fosfatasehæmmere tilsat umiddelbart før brug (0,1 ml til en 6 cm cellekulturskål) på is.
  11. Inkuber pladen på is i 5 min med rotation ca. hvert minut for at sikre fuldstændig dækning af pladen.
  12. Skrab cellerne af pladen ved hjælp af en forkølet celleløfter, og overfør cellesuspensionen til et forkølet 1,5 ml mikrocentrifugerør på is.
  13. Inkuber celleophænget ved 4 °C i 30 minutter, mens du roterer ende over ende ved hjælp af en 1,5 ml/2 ml padle med en rørrevolver.
  14. Fortsæt med trin 3.6-3.9 beskrevet ovenfor.

5. Western blotting af helcelleprotein lysater fra musens ansigtsprocesser og / eller MEPM-celler til phosphoproteiner

  1. Forbered helcelleproteinlysatprøver til SDS-PAGE.
    1. Bestem mængden af protein, der skal indlæses, afhængigt af proteinoverflod i vævet / cellen; 12,5 μg er normalt tilstrækkeligt til robust udtrykte proteiner i helcelleproteinlysater.
    2. Tilsæt et lige stort volumen af 2x Laemmli buffer [20% glycerol, 4% SDS, 0,004% bromphenol blå, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] med 10% β-mercaptoethanol tilsat umiddelbart før brug.
      FORSIGTIG: β-mercaptoethanol er hud- eller øjenætsende, giftig, farlig ved indtagelse og har akvatisk toksicitet. Håndter iført handsker, laboratoriefrakke, ansigtsskærm og sikkerhedsbriller i en kemisk røghætte. Bortskaf i henhold til retningslinjerne for miljømæssig sundhed og sikkerhed.
    3. Bland ved hvirvel.
    4. Prøverne opvarmes ved 100 °C i 5 minutter i et mini tørbad.
    5. Bland ved hvirvel og læg prøverne på is.
    6. Centrifuge ved 9.400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
    7. Læg prøverne kortvarigt på is, inden de lægges i SDS-PAGE gel, eller opbevar dem ved -20 °C på lang sigt.
  2. Udfør SDS-PAGE ved hjælp af en elektroforesecelle med en 4% -15% præfabrikeret proteingel og elektroforesebuffer35.
  3. Elektrotransfer proteinerne til en polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) ved hjælp af overførselsbuffer med 0% -20% methanol (0% -10% for proteiner større end 100 kDa; 20% for proteiner mindre end 100 kDa) tilsat umiddelbart før brug35.
  4. Bloker membranen og sonden for phosphoprotein af interesse.
    1. Efter overførsel vaskes membranen i 1x tris-bufret saltvand (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] i 5 minutter i en western blot-kasse.
    2. Inkubere membranen i 5 ml blokerende buffer [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; blandet godt og filtreret gennem et 25 mm sprøjtefilter med 0,2 μm porer ved hjælp af en 10 ml sprøjte med luerspids] i 1 time i en western blot-boks med omrøring på en orbital ryster.
      BEMÆRK: Brug ikke mælk som blokeringsmiddel, når du karakteriserer phosphoproteiner, da det indeholder phosphoprotein kasein, hvilket kan forårsage et højt, ikke-specifikt baggrundssignal.
    3. Vask membranen tre gange i 5 minutter hver i TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] i en western blot-kasse med omrøring på en orbital shaker.
    4. Inkubere membranen i 5 ml primært antistof fortyndet i blokerende buffer ved 4 ° C natten over i et 50 ml konisk rør ved hjælp af en 50 ml padle med en rørrevolver.
      BEMÆRK: Se antistofdatabladet for den passende koncentration for western blotting.
    5. Vask membranen tre gange ved RT i 5 minutter hver i TBS-T i en western blot-kasse med omrøring på en orbital shaker.
    6. Inkubere membranen i 5 ml passende peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer i 1 time i en western blot-boks med omrøring på en orbitalryster.
    7. Vask membranen tre gange i 5 minutter hver i TBS-T i en western blot-kasse med omrøring på en orbital shaker.
    8. Inkubere membranen i forbedret kemiluminescens (ECL) vestligt blottingssubstrat [blanding af lige store mængder fra flasker 1 og 2; 0,5 ml af hver for store (8,6 cm x 6,7 cm) membraner] i 1 min., hvilket sikrer, at hele membranen kontinuerligt udsættes for ECL's vestlige blottingssubstrat.
    9. Tøm membranen af overskydende ECL western blotting substrat og udvikle sig straks ved hjælp af et kemiluminescens imager.
  5. Strip membranen og reprobe for total protein af interesse.
    1. PVDF-membranen anbringes i en gennemsigtig pose med polyethylenforing indeholdende 5 ml strippebuffer [2 % SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] med 8 μL/ml β-mercaptoethanol tilsat umiddelbart før brug.
    2. Inkuber ved 50 °C i 30 minutter med gyngen i en hybridiseringsovn ved 11 omdrejninger pr. minut.
    3. Vask membranen tre gange ved RT i 5 minutter hver i TBS-T i en western blot-kasse med omrøring på en orbital shaker.
    4. Fortsæt med trin 5.4.2-5.4.9 beskrevet ovenfor.
  6. Kvantiter western blot-båndtætheder ved hjælp af ImageJ-software, normalisering af niveauerne af det fosforylerede protein af interesse for niveauerne af det samlede protein af interesse36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når man forsøger at karakterisere fosforylering af proteiner isoleret fra musens ansigtsprocesser og/eller dyrkede palatale mesenchymceller, vil de repræsentative resultater ideelt set afsløre et tydeligt, reproducerbart bånd efter vestlig blotting med et anti-phosphoproteinantistof, der løber i eller nær højden af det tilsvarende samlede proteinbånd (figur 3 ). Men hvis der opstår omfattende fosforylering af proteinet, kan der være en lille opadgående forskydning af phosphoproteinbåndet sammenlignet med det samlede proteinbånd. Yderligere, hvis der findes flere isoformer af et protein i et væv, som hver især er fosforyleret, eller proteinet er forskelligt udsat for yderligere PTM'er, kan der forekomme flere bånd i den vestlige plet med et anti-phosphoproteinantistof. Hvis der ikke observeres noget signal for phosphoproteinet af interesse, på trods af påvisning af det samlede protein af interesse, kan proteinet ikke fosforyleres i den valgte sammenhæng, eller der kan være opstået et teknisk problem med protokollen. I sidstnævnte tilfælde kan western blotting af helcellelysater udføres med anti-phosphoserin/threonin og/eller anti-phosphotyrosin antistoffer for at indikere, om protokollen fungerede som forventet. Da fosforylering af proteiner er rigelig i kraniofacialt væv25,37, vil tilstedeværelsen af flere phosphoproteinbånd indikere en vellykket gennemførelse af protokollen og nøjagtige resultater fra den indledende screening.

Det er ofte nyttigt at sammenligne phosphoproteinniveauer mellem vildtype og mutant embryovæv eller som reaktion på behandlingen af dyrkede celler. I det førstnævnte tilfælde ville en forskel i phosphoproteinniveauer mellem genotyper fremstå som en forskel i båndintensiteter for phosphoproteinet af interesse med lignende niveauer af det samlede protein af interesse27. I sidstnævnte tilfælde vil repræsentative resultater afsløre øgede phosphoproteinbåndintensiteter sammenlignet med ubehandlede cellers intensiteter ved behandling med f.eks. en vækstfaktor (figur 3) og nedsat båndintensitet efter behandling med en kinasehæmmer27,37. Til kvantation af disse forskelle ville niveauerne af phosphoproteinet af interesse blive normaliseret til niveauer af det samlede protein af interesse. Niveauerne af det samlede protein af interesse forventes at være relativt ens mellem prøverne, hvilket bør bekræftes ved separat western blotting ved anvendelse af et eller flere antistoffer mod belastnings- og ekspressionskontrolproteiner såsom β-tubulin, β-actin og/eller GAPDH (figur 3). Til vækstfaktorbehandling af dyrkede celler vil positive resultater sandsynligvis vise en stigning i phosphoproteinniveauer inden for en relativt kort tidsramme på 2-15 minutter efter stimulering (figur 3). Der bør være ringe eller ingen fosforylering i fravær af vækstfaktorbehandling, medmindre der er andre faktorer i spil, der resulterer i fosforylering af proteinet, hvoraf eksempler omfatter endogen ekspression af vækstfaktorer fra cellerne, fosforylering af proteinet med et andet signalmolekyle udtrykt af cellerne og/eller en mutation, der fører til konstitutiv phosphorylering af proteinet i fravær af vækstfaktorbehandling. Disse faktorer bør tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne. Negative resultater omfatter ingen ændring i fosforylering som reaktion på et tidsforløb for vækstfaktorbehandling, i hvilket tilfælde protokollen bør evalueres til vedligeholdelse af phosphoproteiner som beskrevet ovenfor. Derudover kan processen med membranstripping lejlighedsvis påvirke og reducere det samlede proteinniveau. I dette tilfælde ville modsatte tendenser for mængden af phosphoprotein af interesse versus det samlede protein af interesse blive observeret. Dette er suboptimalt, da de samlede proteinniveauer forventes at være relativt ens på tværs af prøver, forudsat at proteinet er lige belastning og ekspression, med ændringer, der kun forekommer i phosphoproteinniveauer.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang for isolering af helcelleproteinlysater fra musens ansigtsprocesser og dyrkede palatale mesenchymceller til phosphoproteinanalyse. Maksillære processer dissekeres fra E11,5 musefostre på is, og/eller mediet aspireres fra dyrkede MEPM-celler ved 80%-100% sammenløb, som efterfølgende vaskes to gange med iskold PBS. Helcelleproteinlysater isoleres ved hjælp af lysisbuffer med protease- og fosfatasehæmmere efterfulgt af SDS-PAGE, elektrooverførsel til en PVDF-membran, blokering af membranen med BSA, sondering for phosphoproteinet, stripping af membranen, reprobing for total protein og kvantation af båndintensiteter. Forkortelser: LNP = lateral nasal proces; MxP = maksillær proces; MdP = mandibulær proces; PA2 = anden svælgbue; PBS = fosfatbufret saltvand; FBS = føtalt kvægserum; PS = palatal hylde; MEPM = museembryonale palatale mesenchym; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese; PVDF = polyvinylidenfluorid; p-P = fosforyleret protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Dissektion af maksillære processer. (A) Sidebillede af et E11.5-museembryo med de tre snit (mærket 1-3), der kræves for at adskille MxP fra det ansigt, der er angivet med farvede linjer. B) Sidebillede af et E11.5-museembryo efter fjernelse af MxP skitseret med en stiplet sort streg. (C) Dissekeret MxP. (D) En 35 mm petriskålsopsætning med små dråber PBS, 2% trypsin og 10% FBS til valgfri adskillelse af MxP-ektoderm og mesenchym. (E) MxP med Ect delvist adskilt fra Mes. (F) Adskilt MxP Ect og Mes. Vægtstænger: 1 mm (A-C,E,F), 10 mm (D). Forkortelser: LNP = lateral nasal proces; MxP = maksillær proces; MdP = mandibulær proces; PA2 = anden svælgbue; PBS = fosfatbufret saltvand; FBS = føtalt kvægserum; Mes = mesenkym; Ect = ektoderm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: PDGFRβ og MAPK effektor Erk1/2 fosforylering som reaktion på PDGF-BB ligand behandling af udødeliggjorte MEPM celler. Western blot-analyse af helcellelysater fra udødeliggjorte MEPM-celler efter et tidsforløb på 10 ng / ml PDGF-BB-ligandstimulering fra 2 minutter til 15 minutter med anti-phospho-PDGFR, anti-PDGFRβ, anti-phospho-Erk1/2, anti-Erk1/2 og anti-β-tubulin (E7) antistoffer. Flere bånd i anti-PDGFRβ blot repræsenterer differentielt glykosylerede proteiner. Forkortelser: PDGF = blodpladeafledt vækstfaktor; WCL = helcellelysat; kD = kilodalton; WB = vestlig blot; p-PDGFR = fosforyleret PDGFR; PDGFR = PDGF-receptor; p-Erk = fosforyleret Erk; Erk = ekstracellulær signalreguleret kinase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her giver forskere mulighed for at undersøge kritiske fosforyleringsafhængige signalhændelser under kraniofacial udvikling på en robust og reproducerbar måde. Der er flere kritiske trin i denne protokol, der sikrer korrekt indsamling af data og analyse af resultater. Uanset om man isolerer phosphoproteiner fra musens ansigtsprocesser og / eller dyrkede palatale mesenchymceller, er det bydende nødvendigt at bevæge sig hurtigt og effektivt, samtidig med at alle reagenser og materialer holdes på is, når det er angivet. Isens lave temperatur bremser metabolisk aktivitet i cellerne og beskytter derved fosforylerede proteiner mod fosfataseaktivitet38 og opretholder et højt proteinudbytte. Anvendelsen af tre separate 10 cm petriskåle under dissektion af maksillære processer sikrer, at alle dissektioner finder sted i tilstrækkeligt forkølet histologi PBS. Relateret er en yderligere, væsentlig komponent i denne proteinisoleringsprotokol brugen af fosfatasehæmmere i alle lysisbuffere. Disse reagenser beskytter også fosfatgrupper på proteinet af interesse39,40 og opretholder integriteten af det fosforylerede protein til yderligere analyse ved western blotting.

Denne protokol introducerer desuden ændringer, der giver mulighed for mere specifikke analyser af phosphoproteiner i væv og dyrkede celler. I processen med at dissekere ansigtsprocesser er der tilføjet valgfrie trin til adskillelse af den maksillære proces ektoderm og mesenchym for at muliggøre undersøgelse af rumspecifik proteinphosphorylering27. For at teste for effektiv isolering af disse vævslag kan brugerne vurdere ekspressionen af gener beriget i ektodermen, såsom Gabrp, Trim29, Esrp1 og Mpzl2, og / eller gener beriget i mesenchymet, såsom Aldh1a2 og AW55198441. Til isolering af phosphoproteiner fra dyrkede palatale mesenchymceller er der tilføjet valgfrie trin til stimulering af vækstfaktor. I dette tilfælde skal celler serumsultes i medium indeholdende 0,0% -0,1% serum. Standardserum som FBS indeholder adskillige vækstfaktorer42 , der kan indvikle resultater fra eksogen vækstfaktorstimulering. Således primer midlertidig serum sult celler til at reagere på akut vækstfaktorbehandling.

Denne protokol giver også optimerede metoder til nøjagtigt at kvantificere proteinfosforylering. I de vestlige blotting trin er det vigtigt at blokere PVDF-membranen ved hjælp af BSA snarere end mælk, som bruges i mange standard vestlige blotting teknikker. Denne switch er bydende nødvendig, da mælk indeholder phosphoprotein kasein43 og fører til højt baggrundssignal i analysen af andre phosphoproteiner. Endvidere er det vigtigt, at niveauerne af det fosforylerede protein af interesse kvantificeres i forhold til niveauer af det samlede protein af interesse snarere end niveauer af et standardbelastningskontrolprotein. På denne måde kan eventuelle ændringer i ekspressionen af det samlede protein af interesse redegøres for i kvantificeringen af phosphoproteinniveauer. Hvis proteinudbyttet generelt er for lavt til nøjagtig phosphoproteindetektion, kan vævsprøver fra samme stadium og genotype samles27, og/eller celler kan dyrkes i større cellekulturbeholdere end dem, der er beskrevet her til fremtidige forsøg. Alternativt, hvis stripping konsekvent ser ud til at ændre de samlede proteinniveauer, kan der anvendes to tilgange til at ændre den beskrevne protokol for at opnå reproducerbare resultater: 1) anvendelse af et antistofskema, der anvender antiphosphoprotein- og antiproteinantistoffer genereret i forskellige værtsarter kombineret med to artsspecifikke sekundære antistoffer og separate (hvis der anvendes HRP-konjugerede sekundære antistoffer) eller samtidig (hvis der anvendes fluoroforkonjugerede sekundære antistoffer) udvikling af blots; eller 2) samtidig behandling af to identiske membraner - den første inkuberet med et anti-phosphoproteinantistof, den anden med et antiproteinantistof. I begge alternative tilgange bør niveauerne af det phosphorylerede protein af interesse stadig kvantificeres i forhold til niveauerne af det samlede protein af interesse. Endelig, da fosforylering er en dynamisk proces, bør phosphoproteinniveauer vurderes i mindst tre biologiske replikater pr. Tilstand. Museanstændingsprocesvæv eller primære MEPM-celler, der stammer fra et individuelt embryon eller en individuel pulje af embryoner fra samme stadium og genotype, ville udgøre en enkelt biologisk replikat. Tilsvarende ville udødeliggjorte MEPM-celler i forskellige passager udgøre biologiske replikater. Hvis dyrkede celler behandles med vækstfaktor, bør behandling af biologiske replikater ske på forskellige dage ved hjælp af separate alikvoter af vækstfaktor.

Der findes to begrænsninger i den tilgang, der præsenteres her, som diskuteres nedenfor og bør overvejes, inden protokollen påbegyndes. Den første involverer det dynamiske område af ECL. ECL western blotting substratet, der anbefales i denne protokol, har et bredt dynamisk område med en lav picogramfølsomhed. Empirisk kan proteiner med lav forekomst eller lav fosforyleringsstatus imidlertid være vanskelige at påvise ved hjælp af disse metoder. Hvis fosforylerede proteiner ikke kan påvises efter 20 minutters ECL-substratinkubation, anbefales det at vaske membranen i TBS-T som beskrevet og i stedet inkubere membranen i et højfølsomt ECL western blotting substrat med lav femtogramfølsomhed. Alternativt kan fluorofor-konjugerede sekundære antistoffer anvendes, som tilbyder et bredere dynamisk område end enzymbaserede tilgange såsom ECL44. En anden begrænsning stammer fra normaliseringsproceduren. Som beskrevet udførligt anbefales det, at signal fra phosphoproteinet af interesse normaliseres til signalet fra det samlede protein af interesse. Denne proces bygger imidlertid på den antagelse, at niveauerne af det samlede protein af interesse ikke ændres mellem prøverne, hvilket ofte bekræftes ved separat western blotting ved hjælp af antistoffer mod et eller flere husholdningsproteiner. En vigtig overvejelse er dog, at niveauerne af husholdningsproteiner kan ændre sig mellem prøver på grund af ujævn belastning, ufuldstændig overførsel til membranen og / eller forskelle i proteinekspression. For at øge nøjagtigheden under normalisering kan forskere således overveje at flytte for at implementere en ægte total proteinplet, såsom Ponceau S45, som registrerer alle proteiner i hver bane af membranen og tegner sig for disse tekniske begrænsninger.

Samlet set overvinder denne protokol problemet med proteindephosphorylering, der almindeligvis opstår under proteinisolering. Nøjagtig analyse af proteinfosforylering vil hjælpe forskere med at få en mere præcis forståelse af fosforylerede proteiners rolle under kraniofacial udvikling. Desuden tilbyder denne protokol robuste og effektive metoder til at analysere fosforylerede proteinniveauer i fysiologisk relevante sammenhænge, hver med deres egne fordele. Mens proteinlysater fra embryovæv giver et statisk øjebliksbillede af proteinphosphorylering in vivo, leverer implementeringen af dyrkede celler data om dynamiske fosforyleringsresponser på akutte behandlinger. Denne protokol har kapacitet til direkte at bekræfte og udvide resultater og hypoteser, der stammer fra store datasæt, f.eks. massespektrometri37 og RNA-sekventering27, for at opdage nye interaktioner inden for signalnetværk. Det er vigtigt, at denne protokol kan bruges til at undersøge, hvordan forstyrrelser i fosforylering direkte påvirker intracellulær signalering, genekspression og cellulær aktivitet i kraniofaciale sammenhænge. Disse forskellige anvendelser vil i høj grad forbedre forståelsen af virkningerne af proteinfosforylering i kraniofacial udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

129S4 mus var en gave fra Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine på Mount Sinai. Dette arbejde blev støttet med midler fra National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 og K02 DE028572 til K.A.F., F31 DE029976 til M.A.R. og F31 DE029364 til B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 182 Kraniofacial udvikling fosforylering phosphoproteiner mus maksillære processer museembryonale palatale mesenchymeceller
Isolering af helcelleproteinlysater fra musens ansigtsprocesser og dyrkede palatale mesenchymceller til fosfoproteinanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter