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Developmental Biology

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

O protocolo apresenta um método para isolar os lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de embriões de camundongos dissecados ou células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas e realizar posteriormente manchas ocidentais para avaliar os níveis de proteína fosfoilada.

Abstract

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. Essas alterações morfológicas são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Aqui, são fornecidos dois exemplos de contextos fisiologicamente relevantes para estudar a fosforilação de proteínas durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilarres E11,5, e células de mesenquime palatina palatina embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5. Para superar a barreira comum da desfosforilação durante o isolamento de proteínas, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento das fosfoproteínas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de fosfoproteínas após a mancha ocidental de lises de proteínas celulares inteiras. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinas, podem ser usadas para obter maior percepção sobre a dinâmica e os papéis de várias fosfoproteínas ativas durante o desenvolvimento craniofacial.

Introduction

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. No camundongo, esse processo começa no dia embrionário (E) 9.5 com a formação da proeminência frontonasal e pares de processos maxilares e mandibulares, cada um dos quais contém células de crista neural craniana pós-migratória. Os processos nasais laterais e mediais surgem do destaque frontonasal com o aparecimento das covas nasais e eventualmente se fundem para formar as narinas. Além disso, os processos nasais medial e processos maxilarários se fundem para gerar o lábio superior. Simultaneamente, a palatogênese é iniciada com a formação de crescimentos distintos - as prateleiras palatais secundárias - do lado oral dos processos maxilares em E11,5. Com o tempo, as prateleiras palatais crescem para baixo em ambos os lados da língua, elevam para uma posição oposta acima da língua, e eventualmente se fundem na linha média para formar um paladar contínuo que separa as cavidades nasais e orais por E16,51.

Essas alterações morfológicas ao longo do desenvolvimento craniofacial são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Por exemplo, receptores de membrana celular, como subfamílias de fator de crescimento transformador (TGF)-β receptores, incluindo receptores de proteína morfogenética óssea (BMPRs), e várias famílias receptoras de tyrosina quinase (RTK), são autofosforilados sobre ligação de ligante e ativação em células de crista neural craniana 2,3,4 . Além disso, o receptor de transmembrano acoplado à proteína G Smoothened torna-se fosforilado em células de crista neural craniana e ectoderme craniofacial a jusante do ligante de ouriço Sonic (SHH) ligado ao receptor Patched1, resultando em acúmulo de liso na membrana ciliar e ativação da via SHH5. Tais interações ligantes-receptor podem ocorrer através de sinalização autocrina, paracrina e/ou justacrina em contextos craniofaciais. Por exemplo, BMP6 é conhecido por sinalizar de forma autocririna durante a diferenciação de condrocito6, enquanto o fator de crescimento do fibroblasto (FGF) 8 é expresso no arco faringeal e se liga aos membros da família FGF de RTKs expressas no arco faringeal mesenchyme de forma paracrina para o início do padrão e crescimento do arco faringeal7, 8,9,10. Além disso, a sinalização de Entalhe é ativada em condrócitos e osteoblastos durante o desenvolvimento esquelético craniofacial através da sinalização justacririna quando os ligantes delta e/ou irregulares se ligam aos receptores de notch transmembrano em células vizinhas, que são posteriormente cortados e fosfoilados11. No entanto, existem outros pares de ligantes e receptores importantes para o desenvolvimento craniofacial que têm a flexibilidade de funcionar tanto na sinalização autocrina quanto na paracrina. Como exemplo, durante a morgênese dentária murina, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)-AA foi demonstrado para sinalizar de forma autocrina para ativar o RTK PDGFRα no epitélio do órgão de esmalte12. Em contraste, nos processos faciais murinos durante a gestação média, as transcrições que codificam os ligantes PDGF-AA e PDGF-CC são expressas no ectoderme craniofacial, enquanto o receptor PDGFRα é expresso no mesenchyme craniano-derivado, resultando em sinalização paracrina 13,14,15, 16,17 . Independentemente do mecanismo de sinalização, esses eventos de fosforilação receptora frequentemente resultam no recrutamento de proteínas adaptadoras e/ou moléculas de sinalização, que frequentemente se tornam fosforilatos para iniciar cascatas de quinase intracelular, como a via de quinase de proteína ativada por mitogênio (MAPK)18,19.

Os efeitos intracelulares terminais dessas cascatas podem então fosforilarar uma matriz de substratos, como fatores de transcrição, RNA-binding, citoskeletal e proteínas de matriz extracelular. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 e Sox926 estão entre os fatores de transcrição fosfoilados no contexto do desenvolvimento craniofacial. Essa modificação pós-translacional (PTM) pode afetar diretamente a suscetibilidade a PTMs alternativos, dimerização, estabilidade, decote e/ou afinidade de vinculação de DNA, entre outras atividades 20,21,25,26. Além disso, a proteína de ligação de RNA Srsf3 é fosfoilada no contexto do desenvolvimento craniofacial, levando à sua translocação nuclear27. Em geral, a fosforilação de proteínas de ligação de RNA tem sido demonstrada para afetar sua localização subcelular, interações proteína-proteína, ligação RNA e/ou especificidade de sequência28. Além disso, a fosforilação da actomiose pode levar a rearranjos citosqueletal em todo o desenvolvimento craniofacial29,30, e a fosforilação de proteínas da matriz extracelular, como pequenas ligatérias integrinas ligadas à N-proteína, contribui para a biomineralização durante o desenvolvimento esquelético31. Através dos exemplos acima e numerosos, é evidente que há amplas implicações para a fosforilação proteica durante o desenvolvimento craniofacial. Adicionando um nível adicional de regulação, a fosforilação proteica é ainda mais modulada por fosfattases, que neutralizam as quinases removendo grupos de fosfato.

Esses eventos de fosforilação nos níveis de receptor e molécula de efeitos são críticos para a propagação de vias de sinalização e, em última instância, resultam em mudanças na expressão genética no núcleo, conduzindo atividades celulares específicas, como migração, proliferação, sobrevivência e diferenciação, que resultam na formação adequada da face mamífera. Dada a especificidade do contexto das interações proteicas com quinases e fosfates, as mudanças resultantes nos PTMs e seus efeitos sobre a atividade celular, é fundamental que esses parâmetros sejam estudados em um cenário fisiologicamente relevante para obter uma compreensão completa da contribuição dos eventos fosforilação para o desenvolvimento craniofacial. Aqui, são fornecidos exemplos de dois contextos para estudar a fosforilação de proteínas e, assim, a ativação de vias de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilares E11,5, e células mesenquima palatinas embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5 - ambas primárias32 e imortal33 . Na E11.5, os processos maxilarianos estão em processo de fusão com os processos nasais laterais e mediais1, representando assim um ponto de tempo crítico durante o desenvolvimento craniofacial do rato. Além disso, processos maxilares e células derivadas das prateleiras palatais foram escolhidos aqui porque essas últimas estruturas são derivadas da primeira, proporcionando aos pesquisadores a oportunidade de interrogar a fosforilação proteica em ambientes vivos e in vitro em contextos relacionados. No entanto, este protocolo também é aplicável a processos faciais alternativos e pontos de tempo de desenvolvimento.

Um problema crítico no estudo de proteínas fosfoiladas é que elas são facilmente desfosforiladas durante o isolamento de proteínas por fosfattases ambientais abundantes. Para superar essa barreira, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento de proteínas fosforilaladas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de proteínas fosforilalatadas. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinos, podem ser usadas para obter maior visão sobre a dinâmica e os papéis de várias vias de sinalização ativas durante o desenvolvimento craniofacial.

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Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz e realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos institucionais. Camundongos 129S4 femininos com 1,5-6 meses de idade e alojados a uma temperatura sub-termoneutral de 21-23 °C foram usados para colheitas de embriões. Um fluxo de trabalho esquemático do protocolo está representado na Figura 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos, softwares, reagentes e animais utilizados neste protocolo.

1. Colheita de embriões de camundongos E11.5

  1. Eutanize o camundongo gestante 11,5 dias após a detecção de plugue vaginal durante o acasalamento cronometrado em uma câmarade CO 2 usando a taxa de fluxo de CO2 aprovada pela IACUC necessária para aproximadamente 50% de deslocamento (2,95 L/min em um 360 em3 câmara) e duração da exposição (ver Tabela de Materiais). Realizar luxação cervical como método secundário de eutanásia. Prossiga imediatamente para dissecção.
  2. Coloque o corpo do rato em uma placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima. Pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol.
  3. Abra a cavidade abdominal beliscando e levantando a pele anterior à abertura vaginal com fórceps semken retos e cortando a pele levantada e camadas subjacentes com tesoura cirúrgica de lâmina reta em um ângulo de 45° em ambos os lados para gerar uma forma "V" que se estende a cada superfície lateral aproximadamente no meio do caminho entre os membros dianteiros e os retas.
  4. Usando as fórceps Semken, segure um dos chifres uterinos e corte abaixo do oviduto e acima do colo do útero com a tesoura cirúrgica. Corte o mesometrium para permitir a remoção completa do chifre uterino.
  5. Transfira o chifre uterino dissecado para 10 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobásico, 10,14 mM Na2HPO4 dibasic, pH 7.4] em uma placa de Petri de 10 cm.
  6. Remova o segundo chifre uterino no lado oposto da cavidade abdominal usando o mesmo procedimento descrito nas etapas 1.4-1.5.
  7. Coloque a placa de Petri de 10 cm contendo ambos os chifres uterinos no gelo se não proceder imediatamente à dissecção de embriões individuais (ou seja, se um segundo rato fêmea for dissecado).
  8. Sob um microscópio estéreo dissecado, disseca cuidadosamente cada embrião dos chifres uterinos com fórceps finos Dumont #5. Lentamente afastar o miométrio, decidiua e chorão. Rasgue e remova o amnion relativamente transparente ao redor do embrião, e corte o cordão umbilical que liga o embrião à placenta.
  9. Transfira cada embrião dissecado para 2,5 mL de histologia PBS em um poço individual de uma placa de cultura celular de 12 poços no gelo usando uma tubulação de transferência de plástico cortada ou uma colher de embrião.
    NOTA: Se trabalhar com uma ninhada que possa conter embriões de mais de um genótipo, salve o amnion em torno de cada embrião para genotipagem colocando cada um em seu próprio tubo de microcentrifuuge de 0,5 mL pré-rotulado no gelo.

2. Dissecando processos maxilares de embriões de camundongos E11.5

  1. Prepare três pratos petri de 10 cm contendo 10 mL de histologia PBS e mantenha-as no gelo para serem usadas em rotação entre embriões.
  2. Transfira um embrião de um poço individual da placa de cultura celular de 12 poços para uma das placas de Petri de 10 cm com histologia PBS no gelo usando um tubo de transferência de plástico cortado ou uma colher de embrião.
  3. Sob o microscópio de dissecação, separe cada processo maxilar do rosto usando as fórceps finas. Primeiro, corte o lado anterior de um processo maxilar ao longo da recuo natural que separa o processo nasal lateral e o processo maxilar (Figura 2A).
  4. Em segundo lugar, corte o lado posterior do processo maxilar ao longo da recuo natural que separa o processo maxilar e o processo mandibular (Figura 2A).
  5. Em terceiro lugar, para separar completamente o processo maxilar, faça um corte vertical dos lados anterior para posterior do processo maxilar no lado dos olhos do processo maxilar onde as entradas naturais referenciadas acima da extremidade (Figura 2A-C).
  6. Repita estes três cortes para o processo maxilar no lado oposto do rosto.
  7. Usando uma tubulação Pasteur de 9" com uma pequena lâmpada de látex de 2 mL, transfira o par dissecado de processos maxilarias e uma pequena gota de aproximadamente 30 μL de histologia PBS para uma placa de Petri de 35 mm rotulada no gelo (Figura 2D).
  8. Siga os passos 2.3-2.7 para cada embrião, girando as três placas de Petri de 10 cm contendo histologia PBS no gelo entre embriões. Coloque pares individuais de processos maxilares dissecados em placas de Petri separadas de 35 mm no gelo.
    NOTA: A separação do ectoderme do processo maxilar e do mesenquime (etapas 2.9-2.17) pode ser realizada após dissecar os processos maxilais de todos os embriões na ninhada. Se forem desejados processos maxilais intactos contendo o ectoderme e o mesenchyme, proceda à etapa 2.18 abaixo.
  9. Prepare 250 μL de 2% de trippsina fresca na cultura tecidual PBS e 250 μL de 10% de soro bovino fetal (FBS) na cultura tecidual PBS e armazenar no gelo.
  10. Coloque uma segunda gota pequena de aproximadamente 30 μL de 2% de trippsina na placa de Petri de 35 mm separada da primeira gota pequena da histologia PBS contendo os processos maxilais. Transfira o par de processos maxilarários para a pequena gota de 2% de trippsina usando a pipet Pasteur (Figura 2D).
  11. Incubar o prato no gelo por 15 minutos.
  12. Retire a placa de Petri de 35 mm do gelo e coloque sob o microscópio de dissecação.
  13. Utilizando as fórceps finas, retire lentamente e cuidadosamente a camada de ectoderm de cada processo maxilar (Figura 2E).
    NOTA: Se o ectoderme não estiver se separando do mesenquime em uma folha intacta, incubar em 2% a trippsina à temperatura ambiente (RT) por até 5 minutos adicionais antes de continuar com a separação. Se o tecido começar a se desintegrar na trippsina de 2%, mova os processos maxilais para o FBS de 10%, como descrito abaixo para neutralizar a trippsina e terminar a separação do ectoderme e do mesenquime.
  14. Uma vez separados o ectoderme do processo maxilar e o mesenquime (Figura 2F), transfira os tecidos desejados do par de processos maxilarianos para uma terceira gotícula pequena de aproximadamente 30 μL de 10% FBS - separada das duas gotículas pequenas anteriores - usando o tubo Pasteur (Figura 2D).
  15. Coloque a placa de Petri de 35 mm no gelo para parar a trippsinização.
  16. Incubar os tecidos do processo maxilar no gelo em 10% FBS por 1-2 min, e depois transferir os tecidos de ambos os processos maxilarianos para uma quarta gota pequena de aproximadamente 30 μL de histologia pré-aplacida PBS no gelo - separada das três gotículas pequenas anteriores - usando o tubo Pasteur (Figura 2D).
  17. Incubar os tecidos de processo maxilar na histologia PBS por 1 min enquanto gira suavemente a histologia PBS em torno dos tecidos de processo maxilar com a ponta da tubulação Pasteur para garantir que todo fbs seja enxaguado do tecido.
  18. Transfira o par de tecidos de processo maxilar para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL rotulado no gelo usando o tubo Pasteur, minimizando a transferência da histologia PBS. Remova qualquer excesso de histologia PBS no tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL com a tubulação Pasteur.
  19. Siga os passos acima para dissecar os processos maxilarários de cada embrião na ninhada.
  20. Processe as amostras imediatamente para isolar as proteínas celulares inteiras (abaixo) ou armazenar a -80 °C a longo prazo. Antes do armazenamento a longo prazo, congele o tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL em um banho de EtOH 100% em gelo seco por 5 minutos.

3. Isolar proteínas celulares inteiras de processos maxilares de camundongos

  1. Se os processos maxilarários foram previamente congelados a -80 °C, descongele-os no gelo.
  2. Adicione 0,1 mL de tampão de lise NP-40 gelado (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; armazenado a 4 °C) com inibidores de protease e fosfatase (1x coquetel inibidor de mini-protease completo [dissolvido em água; armazenado a -20 °C], 1 mM PMSF [dissolvido em isopropanol; armazenado a 4 °C], 10 mM NaF [armazenado a -20 °C; evite congelar/descongelar], 1 mM Na3VO4 [armazenado a -20 °C], 25 mM β-glicerofofofesfato [armazenado a 4 °C]) adicionado imediatamente antes do uso no gelo.
    NOTA: O fracionamento celular pode ser realizado alternativamente para isolar frações citoplasmáticas, nucleares, membranas ou proteínas mitocondriais.
  3. Pipet para cima e para baixo 10 vezes com um pipetman de 200 μL.
  4. Vórtice para 10 s, e depois pipet para cima e para baixo 10 vezes com um pipetman de 200 μL. Evite gerar bolhas.
  5. Incubar a 4 °C por 2h enquanto gira a extremidade sobre a extremidade usando uma raquete de 1,5 mL/2 mL com um revólver de tubo.
  6. Centrifugar as amostras a 13.500 × g por 20 min a 4 °C.
  7. Colete o supernatante a um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL no gelo com um pipetman de 200 mL.
  8. Quantifique a concentração de proteína com o kit de ensaio proteico, utilizando 10 μL de proteína lysate + 10 μL de tampão de lise NP-40 para amostras experimentais e 3-5 diluições de albumina de soro bovino (fração V) (BSA) em NP-40 lysis buffer em uma faixa de 0,25-2,0 mg/mL como padrão de proteína.
  9. Proceda com a eletroforese de gel de sulfato-poliacrilamida de sódio de sódio (SDS-PAGE) (passo 5) ou congele rapidamente os demais lises em gelo seco e armazene a -80 °C a longo prazo.

4. Isolar as células inteiras de proteínas celulares das células primárias e/ou imortalizadas do mesenquime palatal do camundongo (MEPM)

NOTA: O isolamento e a cultura das células mepm primárias dos embriões de camundongos E13.5 e das células MEPM imortalizadas foram descritos anteriormente 32,33,34. A estimulação de células com fator de crescimento (etapas 4.1-4.7) pode ser realizada antes da lise celular. Se forem desejadas células não estimuladas, siga para a etapa 4.8 abaixo.

  1. Aspire o meio de crescimento [O meio de Águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 10% FBS] das células MEPM a ~70% de confluência em um prato de cultura celular de 6 cm usando um tubo pasteur de 5,75" anexado a um sistema de vácuo.
  2. Lave as células com 1 mL de cultura tecidual PBS.
  3. Adicione 3 mL de meio de fome sárica [DMEM com 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 0,1% FBS] pré-enlagada em um banho de água de 37 °C.
  4. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 23 h.
  5. Substitua o meio de fome de soro por 3 mL de meio de fome de soro fresco e pré-armado.
  6. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 1h.
  7. Estimule as células com o fator de crescimento escolhido em uma concentração empiricamente determinada pelo tempo desejado.
  8. Aspire o meio das células MEPM a 80%-100% de confluência usando uma tubulação Pasteur de 5,75" ligada a um sistema de vácuo.
  9. Lave as células duas vezes com cultura de tecido gelado PBS (1 mL para um prato de cultura celular de 6 cm); incline a placa para o lado durante a última lavagem para garantir que toda a cultura do tecido PBS seja aspirada.
  10. Lise as células adicionando tampão de lise NP-40 gelado com inibidores de protease e fosfatase adicionados imediatamente antes do uso (0,1 mL para um prato de cultura celular de 6 cm) no gelo.
  11. Incubar a placa no gelo por 5 minutos com rotação aproximadamente cada minuto para garantir a cobertura completa da placa.
  12. Raspe as células da placa usando um levantador de células pré-cozido e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge pré-cozido de 1,5 mL no gelo.
  13. Incubar a suspensão da célula a 4 °C por 30 min enquanto gira a extremidade sobre a extremidade usando uma pás de 1,5 mL/2 mL com um revólver de tubo.
  14. Prossiga com as etapas 3.6-3.9 descritas acima.

5. Mancha ocidental de lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de camundongos e/ou células MEPM para fosfoproteínas

  1. Prepare amostras inteiras de proteína celular para SDS-PAGE.
    1. Determinar a quantidade de proteína a ser carregada, dependendo da abundância de proteínas no tecido/célula; 12,5 μg é geralmente suficiente para proteínas robustamente expressas em proteínas celulares inteiras.
    2. Adicione um volume igual de tampão laemmli 2x [20% glicerol, 4% SDS, 0,004% azul bromofenol, 0,125 M Tris HCl pH 6.8] com 10% β-mercaptoetanol adicionado imediatamente antes do uso.
      ATENÇÃO: β-mercaptoetanol é corrosivo de pele ou olho corrosivo, tóxico, perigoso se engolido, e tem toxicidade aquática. Manuseie luvas, um casaco de laboratório, escudo facial e óculos de segurança em um capuz de fumaça química. Descarte de acordo com as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental.
    3. Misture por vórtice.
    4. Aqueça as amostras a 100 °C por 5 min em um mini banho seco.
    5. Misture por vórtice e coloque as amostras no gelo.
    6. Centrifugar a 9.400 × g por 5 min a 4 °C.
    7. Coloque as amostras brevemente no gelo antes de carregar em gel SDS-PAGE ou armazene a -20 °C a longo prazo.
  2. Execute o SDS-PAGE usando uma célula de eletroforese com um gel de proteína pré-moldado de 4%-15% e tampão de eletroforese35.
  3. Eletrotransfera as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinida (PVDF) utilizando tampão de transferência com 0%-20% de metanol (0%-10% para proteínas superiores a 100 kDa; 20% para proteínas inferiores a 100 kDa) adicionadas imediatamente antes do uso35.
  4. Bloqueie a membrana e a sonda para fosfoproteína de interesse.
    1. Após a transferência, lave a membrana em 1x trifás-tampão (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7.6] por 5 min em uma caixa de mancha ocidental.
    2. Incubar a membrana em 5 mL de tampão de bloqueio [1x TBS, 0,1% Interpol 20, 5% c/v BSA; misturado bem e filtrado através de um filtro de seringa de 25 mm com poros de 0,2 μm usando uma seringa de 10 mL com ponta de lunte] por 1 h em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um shaker orbital.
      NOTA: Não use o leite como agente de bloqueio ao caracterizar fosfoproteínas, pois contém a fosfoproteína caseína, que pode causar um sinal de fundo alto e não específico.
    3. Lave a membrana três vezes por 5 min cada em TBS-T [1x TBS, 0,1% Interpol 20] em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    4. Incubar a membrana em 5 mL de anticorpo primário diluído no tampão de bloqueio a 4 °C durante a noite em um tubo cônico de 50 mL usando uma pá de 50 mL com um revólver de tubo.
      NOTA: Consulte a ficha técnica de anticorpos para obter a concentração adequada para a mancha ocidental.
    5. Lave a membrana três vezes em RT por 5 min cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    6. Incubar a membrana em 5 mL de peroxidase de rabanete apropriada (HRP) anticorpo secundário conjugado diluído em tampão de bloqueio por 1 h em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    7. Lave a membrana três vezes por 5 minutos cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    8. Incubar a membrana em substrato de manchas ocidentais de chemiluminescência aprimorada (ECL) ocidental [misturando volumes iguais das garrafas 1 e 2; 0,5 mL de cada para membranas grandes (8,6 cm x 6,7 cm) por 1 min, garantindo que toda a membrana esteja continuamente exposta ao substrato de manchas ocidentais da ECL.
    9. Escorra a membrana do substrato de manchas ocidentais ECL em excesso e desenvolva-se imediatamente usando um imager de quimiomina.
  5. Retire a membrana e a reprovação para a proteína total de interesse.
    1. Coloque a membrana PVDF em uma bolsa transparente com revestimento de polietileno contendo 5 mL de tampão de descascamento [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6.8] com 8 μL/mL de β-mercaptoetanol adicionado imediatamente antes do uso.
    2. Incubar a 50 °C por 30 min com balanço em forno de hibridização a 11 revoluções por minuto.
    3. Lave a membrana três vezes em RT por 5 min cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    4. Prossiga com as etapas 5.4.2-5.4.9 descritas acima.
  6. Quantitam as densidades de banda de blot ocidental usando o software ImageJ, normalizando os níveis da proteína fosfoilada de interesse para os níveis da proteína total de interesse36.

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Representative Results

Ao tentar caracterizar a fosforilação de proteínas isoladas dos processos faciais do camundongo e/ou células de mesenquima palatal cultivadas, os resultados representativos revelarão idealmente uma faixa distinta e reprodutível após a mancha ocidental com um anticorpo antifosfoproteína que corre na altura ou perto da altura da faixa de proteína total correspondente (Figura 3 ). No entanto, se ocorrer uma fosforilação extensiva da proteína, pode haver uma ligeira mudança ascendente da banda de fosfoproteína em comparação com a da faixa proteica total. Além disso, se existem isoformes múltiplos de uma proteína em um tecido, cada um dos quais é fosforilado, ou a proteína é variadamente submetida a PTMs adicionais, várias bandas podem aparecer na mancha ocidental com um anticorpo anti-fosfoproteína. Se não for observado nenhum sinal para a fosfoproteína de interesse, apesar da detecção da proteína total de interesse, a proteína pode não ser fosforilada no contexto escolhido, ou uma questão técnica pode ter surgido com o protocolo. Neste último caso, a mancha ocidental de lises celulares inteiras pode ser realizada com anticorpos antifosforina/threonina e/ou anti-fosfotyrosina para indicar se o protocolo funcionou como esperado. Como a fosforilação de proteínas é abundante em tecidos craniofaciais25,37, a presença de múltiplas bandas de fosfoproteína indicará a conclusão bem sucedida do protocolo e resultados precisos da triagem inicial.

É frequentemente útil comparar os níveis de fosfoproteína entre tecidos de embrião selvagem e mutante ou em resposta ao tratamento de células cultivadas. No primeiro caso, uma diferença nos níveis de fosfoproteína entre genótipos apareceria como uma diferença nas intensidades da banda para a fosfoproteína de interesse com níveis semelhantes da proteína total de interesse27. Neste último caso, os desfechos representativos revelariam o aumento das intensidades da banda de fosfoproteína em comparação com as de células não tratadas após o tratamento com, por exemplo, um fator de crescimento (Figura 3) e diminuição da intensidade da banda após o tratamento com um inibidor de quinase27,37. Para a quantificação dessas diferenças, os níveis da fosfoproteína de interesse seriam normalizados para níveis da proteína total de interesse. Espera-se que os níveis da proteína total de interesse sejam relativamente iguais entre as amostras, um achado que deve ser confirmado por manchas ocidentais separadas usando um ou mais anticorpos contra o carregamento e proteínas de controle de expressão, como β-tubulina, β-actina e/ou GAPDH (Figura 3). Para o tratamento do fator de crescimento das células cultivadas, os resultados positivos provavelmente mostrarão um aumento nos níveis de fosfoproteína em um período de tempo relativamente curto de 2-15 minutos após a estimulação (Figura 3). Deve haver pouca ou nenhuma fosforilação na ausência de tratamento de fator de crescimento, a menos que haja outros fatores em jogo resultando na fosforilação da proteína, exemplos dos quais incluem expressão endógena de fatores de crescimento pelas células, fosforilação da proteína por outra molécula de sinalização expressa pelas células, e/ou uma mutação que leva à fosforilação constitutiva da proteína na ausência de tratamento de fator de crescimento. Esses fatores devem ser considerados na interpretação dos resultados. Os resultados negativos não incluem nenhuma alteração na fosforilação em resposta a um curso de tempo de tratamento do fator de crescimento, nesse caso o protocolo deve ser avaliado para manutenção de fosfoproteínas conforme detalhado acima. Além disso, o processo de descascamento de membranas pode ocasionalmente afetar e reduzir os níveis totais de proteína. Neste caso, seriam observadas tendências opostas para a quantidade de fosfoproteína de interesse versus a proteína total de interesse. Isso é subótimo, uma vez que os níveis totais de proteína devem ser relativamente iguais entre as amostras, assumindo o carregamento igual e a expressão da proteína, com alterações ocorrendo apenas nos níveis de fosfoproteína.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho para isolamento de lisestos de proteínas celulares inteiras de processos faciais de camundongos e células de mesenquime palatal cultivadas para análise de fosfoproteína. Os processos maxilarias são dissecados a partir de embriões de camundongos E11.5 no gelo, e/ou o meio é aspirado a partir de células MEPM cultivadas a 80%-100% de confluência, que são posteriormente lavadas duas vezes com PBS gelado. Os lises proteicos celulares inteiros são isolados utilizando tampão de lise com inibidores de protease e fosfatase, seguidos de SDS-PAGE, eletrotransferência para uma membrana PVDF, bloqueio da membrana com BSA, probabilização para a fosfoproteína, descascamento da membrana, repreensão para proteína total e quantitação de intensidades de banda. Abreviaturas: LNP = processo nasal lateral; MxP = processo maxilar; MdP = processo mandibular; PA2 = arco faringeal secundário; PBS = soro fisiológico tamponado por fosfato; FBS = soro bovino fetal; PS = prateleira palatal; MEPM = mesenquime palatal embrionário do camundongo; SDS-PAGE = sulfato de sódio-poliacrilamida eletroforese de gel; PVDF = fluoreto de polivinilidene; p-P = proteína fosfoilada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Dissecção de processos maxilarários. (A) Visão lateral de um embrião de camundongoS E11.5 com os três cortes (rotulados 1-3) necessários para separar o MxP do rosto indicado por linhas coloridas. (B) Visão lateral de um embrião de camundongos E11.5 após a remoção de MxP delineado com uma linha preta tracejada. (C) MxP dissecado (D) Uma configuração de placa de Petri de 35 mm com pequenas gotículas de PBS, 2% de trippsina e 10% FBS para separação opcional de ectoderme MxP e mesenquime. (E) MxP com Ect parcialmente separado de Mes. (F) Separados MxP Ect e Mes. Barras de escala: 1 mm (A-C,E,F), 10 mm (D). Abreviaturas: LNP = processo nasal lateral; MxP = processo maxilar; MdP = processo mandibular; PA2 = arco faringeal secundário; PBS = soro fisiológico tamponado por fosfato; FBS = soro bovino fetal; Mes = mesenchyme; Ect = ectoderm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: PDGFRβ e efeito MAPK Erk1/2 fosforilação em resposta ao tratamento de ligantes PDGF-BB de células MEPM imortalizadas. Análise de manchas ocidentais de lises celulares inteiras de células MEPM imortalizadas após um curso de tempo de estimulação de ligantes PDGF-BB de 10 ng/mL de 2 min a 15 min com anti-phospho-PDGFR, anticorpos anti-PDGFRβ, anti-phospho-Erk1/2, anti-Erk1/2 e anticorpos anti-β-tubulin (E7). Várias bandas em blot anti-PDGFRβ representam proteínas glicosiladas diferencialmente. Abreviaturas: PDGF = fator de crescimento derivado de plaquetas; WCL = lise celular inteira; kD = kilodalton; WB = mancha ocidental; p-PDGFR = PDGFR fosfolato; PDGFR = receptor PDGF; p-Erk = Erk fosforylated; Erk = quinase extracelular regulada por sinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo descrito aqui permite que os pesquisadores testem eventos críticos de sinalização dependentes de fosforilação durante o desenvolvimento craniofacial de forma robusta e reprodutível. Existem várias etapas críticas neste protocolo que garantem a coleta adequada de dados e análise dos resultados. Seja isolando fosfoproteínas de processos faciais de camundongos e/ou células de mesenquime palatal cultivadas, é imperativo mover-se de forma rápida e eficiente, mantendo todos os reagentes e materiais no gelo quando indicado. A baixa temperatura do gelo retarda a atividade metabólica nas células, protegendo assim proteínas fosfoiladas da atividade fosfatase38 e mantendo um alto rendimento proteico. O uso de três placas de Petri separadas de 10 cm durante a dissecção de processos maxilarias garante que todas as dissecções ocorram em histologia suficientemente pré-alígia PBS. Relacionado, um componente adicional e essencial deste protocolo de isolamento de proteínas é o uso de inibidores de fosfatase em todos os tampões de lise. Esses reagentes também protegem grupos de fosfato na proteína de interesse39,40 e mantêm a integridade da proteína fosfoilada para análise posterior por manchas ocidentais.

Este protocolo também introduz modificações que permitem análises mais específicas de fosfoproteínas em tecidos e células cultivadas. No processo de dissecação dos processos faciais, foram adicionadas etapas opcionais para a separação do ectoderme do processo maxilar e do mesenquime para permitir o estudo da fosforilação proteica específica com compartimento27. Para testar o isolamento eficiente dessas camadas teciduais, os usuários podem avaliar a expressão de genes enriquecidos no ectoderme, como Gabrp, Trim29, Esrp1 e Mpzl2, e/ou genes enriquecidos no mesenchyme, como Aldh1a2 e AW55198441. Para o isolamento de fosfoproteínas de células de mesenquime palatais cultivadas, foram adicionados passos opcionais para a estimulação de fatores de crescimento. Neste caso, as células devem passar fome em meio contendo 0,0%-0,1% de soro. Soros padrão como fbs contêm numerosos fatores de crescimento42 que podem convolutar resultados da estimulação do fator de crescimento exógeno. Assim, a fome temporária de soro prepara as células para responder ao tratamento agudo do fator de crescimento.

Este protocolo também fornece métodos otimizados para quantificar com precisão a fosforilação proteica. Nas etapas de manchas ocidentais, é importante bloquear a membrana PVDF usando BSA em vez de leite, que é usado em muitas técnicas padrão de mancha ocidental. Este interruptor é imperativo, pois o leite contém a fosfoproteína caseína43 e leva a um alto sinal de fundo na análise de outras fosfoproteínas. Além disso, é importante que os níveis da proteína fosfoilada de interesse sejam quantificados em relação aos níveis da proteína total de interesse, em vez dos níveis de uma proteína padrão de controle de carga. Dessa forma, qualquer alteração na expressão da proteína total de interesse pode ser contabilizada na quantificação dos níveis de fosfoproteína. Se o rendimento da proteína em geral for muito baixo para detecção precisa de fosfoproteína, amostras de tecido do mesmo estágio e genótipo podem ser agrupadas27, e/ou células podem ser cultivadas em vasos de cultura celular maiores do que os descritos aqui para experimentos futuros. Alternativamente, se a desmontagem consistentemente parece alterar os níveis totais de proteína, duas abordagens podem ser tomadas para modificar o protocolo descrito para alcançar resultados reprodutíveis: 1) uso de um esquema de anticorpos que emprega anticorpos antifosfoproteína e anti-proteína gerados em diferentes espécies hospedeiras combinadas com dois anticorpos secundários específicos da espécie e separados (se usar anticorpos secundários conjugados pelo HRP) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários fluoroforo-conjugados) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou simultâneos (se usar anticorpos secundários conjugados por fluoroforo) ou sim desenvolvimento das manchas; ou 2) processamento simultâneo de duas membranas idênticas - a primeira incubada com um anticorpo antifosfoproteína, a segunda com um anticorpo anti-proteína. Em ambas as abordagens alternativas, os níveis da proteína fosfoilada de interesse ainda devem ser quantificados em relação aos níveis da proteína total de interesse. Finalmente, como a fosforilação é um processo dinâmico, os níveis de fosfoproteína devem ser avaliados em pelo menos três réplicas biológicas por condição. Tecido de processo facial do rato ou células mepm primárias derivadas de um embrião individual ou de um grupo individual de embriões do mesmo estágio e genótipo constituiria uma única réplica biológica. Da mesma forma, células MEPM imortalizadas de diferentes passagens constituiriam réplicas biológicas. Se as células cultivadas forem tratadas com fator de crescimento, o tratamento de réplicas biológicas deve ocorrer em dias diferentes usando alíquotas separadas de fator de crescimento.

Existem duas limitações da abordagem aqui apresentadas, que são discutidas abaixo e devem ser consideradas antes de iniciar o protocolo. O primeiro envolve o alcance dinâmico da ECL. O substrato de manchas ocidentais da ECL recomendado neste protocolo tem uma ampla gama dinâmica, com baixa sensibilidade ao picograma. No entanto, empiricamente, proteínas de baixa abundância ou baixo estado de fosforilação podem ser difíceis de detectar usando esses métodos. Se as proteínas fosfoiladas forem indetectáveis após 20 minutos de incubação de substratos da ECL, recomenda-se lavar a membrana em TBS-T como descrito e, em vez disso, incubar a membrana em um substrato ocidental de alta sensibilidade ECL com baixa sensibilidade ao femtograma. Alternativamente, podem ser usados anticorpos secundários conjugados por fluoróforos, que oferecem uma gama dinâmica mais ampla do que abordagens baseadas em enzimas, como a ECL44. Uma segunda limitação surge do procedimento de normalização. Como descrito extensivamente, recomenda-se que o sinal da fosfoproteína de interesse seja normalizado ao sinal da proteína total de interesse. No entanto, esse processo baseia-se no pressuposto de que os níveis da proteína total de interesse não mudam entre as amostras, o que muitas vezes é confirmado por manchas ocidentais separadas usando anticorpos contra uma ou mais proteínas de limpeza. Uma consideração importante, porém, é que os níveis de proteínas de limpeza podem mudar entre as amostras devido ao carregamento irregular, transferência incompleta para a membrana e/ou diferenças na expressão proteica. Assim, para aumentar a precisão durante a normalização, os pesquisadores podem considerar a mudança para implementar uma verdadeira mancha de proteína total, como a Ponceau S45, que detecta todas as proteínas em cada pista da membrana e responde por essas limitações técnicas.

No geral, este protocolo supera o problema da desfosforilação proteica que geralmente ocorre durante o isolamento proteico. A análise precisa da fosforilação proteica ajudará os pesquisadores a obter uma compreensão mais precisa do papel das proteínas fosforilalatadas durante o desenvolvimento craniofacial. Além disso, este protocolo oferece métodos robustos e eficientes para analisar os níveis de proteína fosfoilado em contextos fisiologicamente relevantes, cada um com seus próprios benefícios. Enquanto os licosatos proteicos de tecidos embrionários fornecem um instantâneo estático de fosforilação proteica in vivo, a implementação de células cultivadas fornece dados sobre respostas dinâmicas de fosforilação a tratamentos agudos. Este protocolo tem a capacidade de confirmar e expandir diretamente sobre resultados e hipóteses decorrentes de grandes conjuntos de dados, por exemplo, espectrometria de massa37 e sequenciamentode RNA 27, para descobrir novas interações dentro de redes de sinalização. É importante ressaltar que este protocolo pode ser usado para sondar como perturbações na fosforilação influenciam diretamente a sinalização intracelular, a expressão genética e a atividade celular em contextos craniofaciais. Essas diversas aplicações aumentarão muito a compreensão dos efeitos da fosforilação proteica no desenvolvimento craniofacial.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os ratos 129S4 foram um presente do Dr. Philippe Soriano, da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai. Este trabalho foi apoiado com recursos dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH)/Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 para K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 para B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

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Biologia do Desenvolvimento Questão 182 Desenvolvimento Craniofacial fosforilação fosfoproteínas camundongos processos maxilarários células de mesenchyme palatal embrionário do rato
Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína
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Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

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