Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Выделение лизатов цельноклеточного белка из процессов лица мыши и культивируемых клеток небной мезенхимы для анализа фосфопротеинов

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

В протоколе представлен метод выделения лизатов цельноклеточного белка из рассеченных лицевых процессов эмбриона мыши или культивируемых эмбриональных клеток мезенхимы неба мыши и выполнения последующего вестерн-блоттинга для оценки уровней фосфорилированного белка.

Abstract

Черепно-лицевое развитие млекопитающих представляет собой сложный морфологический процесс, в ходе которого несколько клеточных популяций координируются для создания фронтоназального скелета. Эти морфологические изменения инициируются и поддерживаются посредством различных сигнальных взаимодействий, которые часто включают фосфорилирование белка киназами. Здесь приведены два примера физиологически значимых контекстов, в которых можно изучать фосфорилирование белков во время черепно-лицевого развития млекопитающих: лицевые процессы мыши, в частности верхнечелюстные процессы E11.5, и культивируемые эмбриональные клетки небного мезенхима мыши, полученные из вторичных небных полок E13.5. Для преодоления общего барьера дефосфорилирования при выделении белка обсуждаются адаптации и модификации к стандартным лабораторным методам, позволяющим выделять фосфопротеины. Кроме того, предоставляются лучшие практики для надлежащего анализа и количественной оценки фосфопротеинов после западного блоттирования лизатов цельноклеточного белка. Эти методы, особенно в сочетании с фармакологическими ингибиторами и/или мышиными генетическими моделями, могут быть использованы для получения более глубокого понимания динамики и роли различных фосфопротеинов, активных во время черепно-лицевого развития.

Introduction

Черепно-лицевое развитие млекопитающих представляет собой сложный морфологический процесс, в ходе которого несколько клеточных популяций координируются для создания фронтоназального скелета. У мышей этот процесс начинается в эмбриональный день (Е) 9,5 с образования фронтоназального протуберанца и пар верхнечелюстного и нижнечелюстного отростков, каждый из которых содержит постмигрирующие черепно-нервные гребневые клетки. Боковые и медиальные носовые процессы возникают из фронтоназального протуберанца с появлением носовых ямок и в конечном итоге сливаются с образованием ноздрей. Кроме того, медиальные носовые процессы и верхнечелюстные процессы сливаются с образованием верхней губы. Одновременно начинается палатогенез с образованием отчетливых выростов — вторичных небных полок — с ротовой стороны верхнечелюстных отростков при Е11,5. Со временем небные полки растут вниз по обе стороны языка, поднимаются в противоположное положение над языком и в конечном итоге сливаются на средней линии, образуя непрерывное небо, которое разделяет носовую и ротовую полости E16.51.

Эти морфологические изменения на протяжении всего черепно-лицевого развития инициируются и поддерживаются посредством различных сигнальных взаимодействий, которые часто включают фосфорилирование белка киназами. Например, рецепторы клеточной мембраны, такие как подсемейства трансформирующего фактора роста (TGF)-β рецепторов, включая костные морфогенетические белковые рецепторы (BMPR), и различные семейства рецепторов тирозинкиназы (RTK), автофосфорилируются при связывании лигандов и активации в клетках нервного гребня черепа 2,3,4 . Кроме того, Сглаженный трансмембранный рецептор, связанный с G-белком, фосфорилируется в клетках черепного нервного гребня и черепно-лицевой эктодерме после связывания лиганда Sonic hedgehog (SHH) с рецептором Patched1, что приводит к сглаженному накоплению на цилиарной мембране и активации пути SHH5. Такие лиганд-рецепторные взаимодействия могут происходить через аутокринную, паракринную и/или юкстакринную передачу сигналов в черепно-лицевом контексте. Например, известно, что BMP6 сигнализирует аутокринным способом во время дифференцировки хондроцитов6, тогда как фактор роста фибробластов (FGF) 8 экспрессируется в эктодерме глоточной дуги и связывается с членами семейства FGF RTK, выраженными в мезенхиме глоточной дуги паракринным образом, чтобы инициировать паттернирование и рост глоточных дуг7, 8,9,10. Кроме того, передача сигналов Notch активируется как в хондроцитах, так и в остеобластах во время развития черепно-лицевого скелета посредством юкстакринной сигнализации, когда трансмембранные дельта и/или зубчатые лиганды связываются с трансмембранными рецепторами Notch на соседних клетках, которые впоследствии расщепляются и фосфорилируются11. Тем не менее, существуют и другие пары лигандов и рецепторов, важные для черепно-лицевого развития, которые обладают гибкостью для функционирования как в аутокринной, так и в паракринной сигнализации. Например, во время морфогенеза зуба мышей было продемонстрировано, что тромбоцитарный фактор роста (PDGF)-AA лиганд сигнализирует аутокринным способом для активации RTK PDGFRα в эпителии12 эмалированного органа. Напротив, в мышиных лицевых процессах в середине беременности транскрипты, кодирующие лиганды PDGF-AA и PDGF-CC, экспрессируются в черепно-лицевой эктодерме, в то время как рецептор PDGFRα экспрессируется в подлежащей мезенхиме, полученной из черепного нервного гребня, в результате чего паракрин сигнализирует 13,14,15,16,17 . Независимо от сигнального механизма, эти события фосфорилирования рецепторов часто приводят к набору адапторных белков и/или сигнальных молекул, которые часто фосфорилируются сами по себе, чтобы инициировать каскады внутриклеточной киназы, такие как митоген-активированный протеинкиназный путь (MAPK)18,19.

Концевые внутриклеточные эффекторы этих каскадов могут затем фосфорилировать массив субстратов, таких как факторы транскрипции, РНК-связывающие, цитоскелетные и внеклеточные матриксные белки. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 и Sox926 относятся к числу факторов транскрипции, фосфорилированных в контексте черепно-лицевого развития. Эта посттрансляционная модификация (PTM) может непосредственно влиять на восприимчивость к альтернативным PTM, димеризацию, стабильность, расщепление и/или сродство связывания ДНК, среди других видов деятельности 20,21,25,26. Кроме того, РНК-связывающий белок Srsf3 фосфорилируется в контексте черепно-лицевого развития, что приводит к его ядерной транслокации27. В целом, было показано, что фосфорилирование РНК-связывающих белков влияет на их субклеточную локализацию, белково-белковые взаимодействия, связывание РНК и/или специфичность последовательности28. Кроме того, фосфорилирование актомиозина может привести к цитоскелетным перестройкам на протяжении всего черепно-лицевого развития29,30, а фосфорилирование белков внеклеточного матрикса, таких как небольшие интегрин-связывающие лиганд N-связанные гликопротеины, способствует биоминерализации во время развития скелета31. Из приведенных выше и многих других примеров очевидно, что существуют широкие последствия для фосфорилирования белка во время черепно-лицевого развития. Добавляя дополнительный уровень регуляции, фосфорилирование белка дополнительно модулируется фосфатазами, которые противодействуют киназам, удаляя фосфатные группы.

Эти события фосфорилирования как на уровне рецептора, так и на уровне эффекторной молекулы имеют решающее значение для распространения сигнальных путей и в конечном итоге приводят к изменениям в экспрессии генов в ядре, стимулируя специфические клеточные активности, такие как миграция, пролиферация, выживание и дифференцировка, которые приводят к правильному формированию лица млекопитающих. Учитывая контекстную специфичность белковых взаимодействий с киназами и фосфатазами, результирующие изменения в ПТМ и их влияние на активность клеток, крайне важно, чтобы эти параметры были изучены в физиологически значимых условиях, чтобы получить полное представление о вкладе событий фосфорилирования в черепно-лицевое развитие. Здесь приведены примеры двух контекстов, в которых изучаются фосфорилирование белков и, таким образом, активация сигнальных путей во время черепно-лицевого развития млекопитающих: лицевые процессы мыши, в частности верхнечелюстные процессы E11.5, и культивируемые эмбриональные клетки небной мезенхимы мыши, полученные из вторичных небных полок E13.5 - как первичных32 , так и увековеченных33 . При E11.5 верхнечелюстные отростки находятся в процессе слияния с боковыми и медиальными носовыми отростками1, тем самым представляя собой критическую временную точку во время черепно-лицевого развития мыши. Кроме того, здесь были выбраны верхнечелюстные процессы и клетки, полученные из небных полок, потому что последние структуры являются производными первых, тем самым предоставляя исследователям возможность исследовать фосфорилирование белка in vivo и in vitro в смежных контекстах. Однако этот протокол также применим к альтернативным процесскам лица и временным точкам развития.

Критическая проблема в изучении фосфорилированных белков заключается в том, что они легко дефосфорилируются во время выделения белка обильными фосфатазами окружающей среды. Для преодоления этого барьера обсуждаются адаптации и модификации стандартных лабораторных методов, позволяющих выделять фосфорилированные белки. Кроме того, предоставляется передовая практика для надлежащего анализа и количественной оценки фосфорилированных белков. Эти методы, особенно в сочетании с фармакологическими ингибиторами и/или мышиными генетическими моделями, могут быть использованы для получения более глубокого представления о динамике и роли различных сигнальных путей, активных во время черепно-лицевого развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского кампуса Университета Колорадо Аншутц и выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами и правилами. Для сбора эмбрионов использовали самок мышей 129S4 в возрасте 1,5-6 месяцев, размещенных при субтермнейтральной температуре 21-23 °C. Схематический рабочий процесс протокола представлен на рисунке 1. В Таблице материалов приведена подробная информация обо всех материалах, оборудовании, программном обеспечении, реагентах и животных, используемых в этом протоколе.

1. Сбор эмбрионов мышей E11.5

  1. Усыплите беременную самку мыши через 11,5 дней после обнаружения влагалищной пробки во время временного спаривания в камере CO2 с использованием одобренного IACUC скорости потока CO2 , необходимой для примерно 50% смещения (2,95 л / мин в 360 в3 камере) и продолжительности воздействия (см. Таблицу материалов). Выполняют вывих шейки матки как вторичный метод эвтаназии. Немедленно приступайте к рассечению.
  2. Положите тело мыши на рассекательную доску вентральной стороной вверх. Опрыскивайте брюшко мыши 70% этанолом.
  3. Откройте брюшную полость, защемляя и поднимая кожу спереди к влагалищному отверстию с помощью прямых щипцов Семкена и разрезая приподнятую кожу и нижележащие слои с помощью хирургических ножниц с прямым лезвием под углом 45 ° с обеих сторон, чтобы создать форму «V», которая распространяется на каждую боковую поверхность примерно на полпути между передними конечностями и задними конечностями.
  4. Используя щипцы Семкена, захватите один из рогов матки и срежьте хирургическими ножницами ниже яйцевода и над шейкой матки. Отрежьте мезометрий, чтобы обеспечить полное удаление рога матки.
  5. Перенесите рассеченный рог матки на 10 мл гистологического фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 мМ KCl, 1,76 мМ KH2PO4 моноосновного, 10,14 мМ Na2HPO4 двухосновного, рН 7,4] в чашку Петри 10 см.
  6. Удалите второй рог матки на противоположной стороне брюшной полости, используя ту же процедуру, описанную в шагах 1.4-1.5.
  7. Поместите 10 см чашку Петри, содержащую оба маточных рога, на лед, если не приступайте сразу к рассечению отдельных эмбрионов (т. Е. Если вторая самка мыши будет рассечена).
  8. Под рассекающим стереомикроскопом тщательно рассекните каждый эмбрион из рогов матки тонкими щипцами Дюмона No5. Медленно оттягивайте миометрий, децидууа и хорион. Разорвите и удалите относительно прозрачный амнион, окружающий эмбрион, и разорвите пуповину, соединяющую эмбрион с плацентой.
  9. Перенесите каждый рассеченный эмбрион на 2,5 мл гистологической PBS в индивидуальную лунку из 12-луночной клеточной культуральной пластины на льду с помощью разрезанной пластиковой переносной пипетки или ложки для эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с пометом, который может содержать эмбрионы более одного генотипа, сохраните амнион, окружающий каждый эмбрион, для генотипирования, поместив каждый из них в свою собственную предварительно маркированную микроцентрифужную трубку объемом 0,5 мл на льду.

2. Рассечение верхнечелюстных отростков из эмбрионов мышей E11.5

  1. Приготовьте три 10 см чашки Петри, содержащие 10 мл гистологического PBS, и держите их на льду для использования при вращении между эмбрионами.
  2. Перенесите один эмбрион из индивидуального колодца 12-луночной пластины для культивирования клеток в одну из 10-сантиметровых чашек Петри с гистологической PBS на льду с помощью разрезанной пластиковой переносной пипетки или ложки для эмбрионов.
  3. Под рассекающим микроскопом отделите каждый верхнечелюстной процесс от лица с помощью тонких щипцов. Сначала разрезают переднюю сторону одного верхнечелюстного отростка вдоль естественного углубления, разделяющего боковой носовой отросток и верхнечелюстной отросток (рисунок 2А).
  4. Во-вторых, разрезайте заднюю сторону верхнечелюстного отростка вдоль естественного углубления, разделяющего верхнечелюстной отросток и нижнечелюстной отросток (рисунок 2А).
  5. В-третьих, чтобы полностью отделить верхнечелюстной отросток, сделайте вертикальный разрез от передней до задней стороны верхнечелюстного отростка на глазной стороне верхнечелюстного отростка, где естественные углубления, упомянутые выше, заканчиваются (рисунок 2A-C).
  6. Повторите эти три разреза для верхнечелюстного отростка на противоположной стороне лица.
  7. Используя 9-дюймовую пипетку Пастера с небольшой латексной колбой объемом 2 мл, перенесите рассеченную пару верхнечелюстных отростков и небольшую каплю приблизительно 30 мкл гистологического PBS в меченую 35-миллиметровую чашку Петри на льду (рисунок 2D).
  8. Выполните шаги 2.3-2.7 для каждого эмбриона, вращая три 10-сантиметровые чашки Петри, содержащие гистологию PBS на льду между эмбрионами. Поместите отдельные пары рассеченных верхнечелюстных отростков в отдельные 35 мм чашки Петри на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отделение эктодермы верхнечелюстного отростка и мезенхимы (этапы 2.9-2.17) может быть выполнено после рассечения верхнечелюстных отростков всех эмбрионов в подстилке. Если желательны интактные верхнечелюстные отростки, содержащие как эктодерму, так и мезенхиму, перейдите к шагу 2.18 ниже.
  9. Готовят 250 мкл свежего 2% трипсина в культуре тканей PBS и 250 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в культуре тканей PBS и хранят на льду.
  10. Поместите вторую, небольшую каплю примерно 30 мкл 2% трипсина в 35-миллиметровую чашку Петри отдельно от первой, небольшой капли гистологического PBS, содержащего верхнечелюстные отростки. Переведите пару верхнечелюстных отростков в маленькую каплю 2% трипсина с помощью пипетки Пастера (рисунок 2D).
  11. Инкубировать блюдо на льду в течение 15 мин.
  12. Извлеките 35-миллиметровую чашку Петри изо льда и поместите под рассекающий микроскоп.
  13. Используя тонкие щипцы, медленно и осторожно стягивайте слой эктодермы с каждого верхнечелюстного отростка (рисунок 2Е).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эктодерма не отделяется от мезенхимы в неповрежденном листе, инкубируйте в 2% трипсина при комнатной температуре (RT) в течение дополнительного 5 мин перед продолжением разделения. Если ткань начинает распадаться в 2% трипсина, переместите верхнечелюстные отростки на 10% FBS, как описано ниже, чтобы нейтрализовать трипсин и закончить отделение эктодермы и мезенхимы.
  14. Как только эктодерма верхнечелюстного отростка и мезенхима разделены (рисунок 2F), перенесите желаемые ткани из пары верхнечелюстных отростков в третью, небольшую каплю примерно 30 мкл 10% FBS - отдельно от двух предыдущих мелких капель - с помощью пипетки Пастера (рисунок 2D).
  15. Поместите 35-миллиметровую чашку Петри на лед, чтобы остановить трипсинизацию.
  16. Инкубируют ткани верхнечелюстного процесса на льду в 10% FBS в течение 1-2 мин, а затем переносят ткани из обоих верхнечелюстных отростков в четвертую, небольшую капельку примерно 30 мкл предварительно охлажденной гистологии PBS на льду - отдельно от трех предыдущих мелких капель - с помощью пипетки Пастера (рисунок 2D).
  17. Инкубируют ткани верхнечелюстного процесса в гистологии PBS в течение 1 мин, осторожно закручивая гистологический PBS вокруг тканей верхнечелюстного отростка кончиком пипетки Пастера, чтобы гарантировать, что все FBS смывается с ткани.
  18. Перенесите пару тканей верхнечелюстного процесса в меченую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду с помощью пипетки Пастера, минимизируя перенос гистологии PBS. Удалите все излишки гистологической PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл с помощью пипетки Пастера.
  19. Следуйте приведенным выше шагам, чтобы рассечь верхнечелюстные отростки от каждого эмбриона в помете.
  20. Немедленно обработайте образцы, чтобы выделить лизаты цельноклеточного белка (ниже) или хранить при -80 °C в течение длительного времени. Перед длительным хранением заморозьте микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл в ванне со 100% EtOH на сухом льду в течение 5 минут.

3. Выделение лизатов цельноклеточного белка из верхнечелюстных процессов мыши

  1. Если верхнечелюстные отростки ранее замерзали при -80 °С, разморозьте их на льду.
  2. Добавьте 0,1 мл ледяного буфера лизиса NP-40 (20 мМ Tris HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 1% Nonidet P-40, 2 мМ ЭДТА; хранить при 4 °C) с ингибиторами протеазы и фосфатазы (1x полный коктейль ингибитора мини-протеазы [растворенный в воде; хранящийся при -20 °C], 1 мМ PMSF [растворенный в изопропаноле; хранящийся при 4 °C], 10 мМ NaF [хранить при -20 °C; избегать замораживания/оттаивания], 1 мМ Na3VO4 [хранить при -20 °C], 25 мМ β-глицерофосфата [хранить при 4 °C]), добавляемого непосредственно перед использованием на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фракционирование клеток может быть выполнено альтернативно для выделения цитоплазматических, ядерных, мембранных или митохондриальных белковых фракций.
  3. Пипетка вверх и вниз 10 раз с помощью пипетмана 200 мкл.
  4. Вихрь в течение 10 с, а затем пипетка вверх и вниз 10 раз с пипетманом 200 мкл. Избегайте образования пузырьков.
  5. Инкубировать при 4 °C в течение 2 ч, вращая конец за концом, используя весло 1,5 мл / 2 мл с трубчатым револьвером.
  6. Центрифугируйте образцы при 13 500 × г в течение 20 мин при 4 °C.
  7. Соберите супернатант в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду с пипетманом объемом 200 мл.
  8. Количественно оценить концентрацию белка с помощью набора для анализа белка, используя 10 мкл лизата белка + 10 мкл буфера лизиса NP-40 для экспериментальных образцов и 3-5 разведений бычьего сывороточного альбумина (фракция V) (BSA) в буфере лизиса NP-40 в диапазоне 0,25-2,0 мг / мл в качестве стандартов белка.
  9. Продолжайте электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия (SDS-PAGE) (этап 5) или быстро заморозьте оставшиеся лизаты на сухом льду и храните при -80 °C в течение длительного времени.

4. Выделение лизатов цельноклеточного белка из первичных и/или увековеченных клеток эмбриональной небной мезенхимы мыши (MEPM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение и культивирование первичных клеток MEPM из эмбрионов мышей E13.5 и увековеченных клеток MEPM были ранее описаны 32,33,34. Стимуляция клеток фактором роста (этапы 4.1-4.7) может быть выполнена до лизиса клеток. Если желательны нестимулированные клетки, перейдите к шагу 4.8 ниже.

  1. Аспирировать питательную среду [модифицированную среду Dulbecco Eagle's (DMEM) с 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 10% FBS] из клеток MEPM при слиянии ~70% в чашке для культивирования клеток 6 см с помощью 5,75-дюймовой пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумной системе.
  2. Промыть клетки 1 мл культуры тканей PBS.
  3. Добавьте 3 мл сывороточной голодной среды [DMEM с 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 0,1% FBS], предварительно приготовленной на водяной бане с температурой 37 °C.
  4. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 23 ч.
  5. Замените среду для голодания сыворотки 3 мл свежей, предварительно приготовленной среды для голодания сыворотки.
  6. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч.
  7. Стимулируют клетки с помощью фактора роста выбора в эмпирически определенной концентрации в течение желаемого периода времени.
  8. Аспирировать среду из ячеек MEPM при 80%-100% слиянии с помощью 5,75-дюймовой пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумной системе.
  9. Дважды промыть клетки ледяной культурой тканей PBS (1 мл для чашки для культивирования клеток 6 см); наклоните пластину в сторону во время последней промывки, чтобы убедиться, что вся культура тканей PBS аспирирована.
  10. Лизируйте клетки путем добавления ледяного буфера лизиса NP-40 с ингибиторами протеазы и фосфатазы, добавленными непосредственно перед использованием (0,1 мл для чашки для культуры клеток 6 см) на льду.
  11. Инкубируйте плиту на льду в течение 5 минут с вращением примерно каждые минуты, чтобы обеспечить полное покрытие плиты.
  12. Соскоблите ячейки с пластины с помощью предварительно охлажденного подъемника клеток и перенесите клеточную суспензию в предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду.
  13. Инкубируйте клеточную суспензию при 4 °C в течение 30 мин, вращая конец за концом, используя весло 1,5 мл / 2 мл с трубчатым револьвером.
  14. Перейдите к шагам 3.6-3.9, описанным выше.

5. Вестерн-блоттинг лизатов цельноклеточного белка из лицевых процессов мыши и/или клеток MEPM для фосфопротеинов

  1. Подготовьте образцы лизата цельноклеточного белка для SDS-PAGE.
    1. Определить количество белка, подлежащего загрузке, в зависимости от обилия белка в ткани/клетке; 12,5 мкг обычно достаточно для надежно экспрессируемых белков в лизатах цельноклеточных белков.
    2. Добавьте равный объем 2x буфера Laemmli [20% глицерина, 4% SDS, 0,004% бромфенола синего, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] с 10% β-меркаптоэтанола, добавленного непосредственно перед использованием.
      ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол является коррозионным для кожи или глаз, токсичен, опасен при проглатывании и обладает водной токсичностью. Наденьте перчатки, лабораторное пальто, лицевой щиток и защитные очки в химическом вытяжном капюшоне. Утилизируйте в соответствии с руководящими принципами гигиены и безопасности окружающей среды.
    3. Перемешивать путем вихря.
    4. Нагревайте образцы при 100 °C в течение 5 минут в мини-сухой ванне.
    5. Перемешайте путем вихря и поместите образцы на лед.
    6. Центрифуга при 9 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    7. Поместите образцы ненадолго на лед перед загрузкой в гель SDS-PAGE или храните при -20 °C в течение длительного времени.
  2. Выполняют SDS-PAGE с использованием ячейки электрофореза с 4%-15% сборным белковым гелем и буфером35 электрофореза.
  3. Электротрансферите белки на мембрану поливинилиденфторида (PVDF) с использованием буфера переноса с 0%-20% метанола (0%-10% для белков более 100 кДа; 20% для белков менее 100 кДа), добавленного непосредственно перед применением35.
  4. Блокируйте мембрану и зонд для интересующих фосфопротеинов.
    1. После переноса промывайте мембрану 1x трис-буферным физиологическим раствором (TBS) [20 мМ Tris, 0,137 M NaCl, рН 7,6] в течение 5 мин в вестерн-блот-боксе.
    2. Инкубируют мембрану в 5 мл блокирующего буфера [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; хорошо перемешивают и фильтруют через шприцевой фильтр 25 мм с порами 0,2 мкм с использованием шприца 10 мл с наконечником люера] в течение 1 ч в западной блоточной коробке с перемешиванием на орбитальном шейкере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте молоко в качестве блокирующего агента при характеристике фосфопротеинов, поскольку оно содержит фосфопротеин казеин, который может вызвать высокий, неспецифический фоновый сигнал.
    3. Промывайте мембрану три раза в течение 5 мин каждый в TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] в вестерн-блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    4. Инкубируют мембрану в 5 мл первичного антитела, разбавленного в блокирующем буфере при 4 °C в течение ночи в конической трубке объемом 50 мл с использованием весла 50 мл с трубчатым револьвером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к техническому описанию антител для получения соответствующей концентрации для вестерн-блоттинга.
    5. Промыть мембрану три раза при РТ в течение 5 мин каждый в TBS-T в вестерн-блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    6. Инкубируют мембрану в 5 мл соответствующей пероксидазы хрена (HRP)-конъюгированного вторичного антитела, разбавленного в блокирующем буфере в течение 1 ч в западной блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    7. Промыть мембрану три раза в течение 5 мин каждый в TBS-T в вестерн-блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    8. Инкубируйте мембрану в усиленной хемилюминесцентной (ECL) западной блоттинговой подложке [смешивание равных объемов из бутылок 1 и 2; по 0,5 мл каждой для больших (8,6 см х 6,7 см) мембран] в течение 1 мин, гарантируя, что вся мембрана постоянно подвергается воздействию западного блоттингового субстрата ECL.
    9. Слейте мембрану избыточного ECL западного блоттингового субстрата и немедленно развивайте с помощью хемилюминесцентного тепловизора.
  5. Снимите мембрану и повторно прозондите для общего белка, представляющего интерес.
    1. Поместите мембрану PVDF в прозрачный мешочек с полиэтиленовой подкладкой, содержащий 5 мл буфера для зачистки [2% SDS, 62,5 мМ Tris HCl pH 6,8] с 8 мкл/мл β-меркаптоэтанола, добавленного непосредственно перед использованием.
    2. Инкубировать при 50 °C в течение 30 мин с раскачиванием в гибридизационной печи со скоростью 11 оборотов в минуту.
    3. Промыть мембрану три раза при РТ в течение 5 мин каждый в TBS-T в вестерн-блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    4. Перейдите к этапам 5.4.2-5.4.9, описанным выше.
  6. Количественно оцените плотность полосы вестерн-блот с помощью программного обеспечения ImageJ, нормализовав уровни фосфорилированного белка, представляющего интерес, до уровней общего белка, представляющего интерес36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При попытке охарактеризовать фосфорилирование белков, выделенных из лицевых процессов мыши и / или культивируемых клеток небной мезенхимы, репрезентативные результаты в идеале выявят отчетливую, воспроизводимую полосу после западного блоттинга антифосфопротеиновым антителом, которое проходит на высоте или около высоты соответствующей общей белковой полосы (рисунок 3). ). Однако, если происходит обширное фосфорилирование белка, может наблюдаться небольшой сдвиг вверх фосфопротеиновой полосы по сравнению с общей белковой полосой. Кроме того, если в ткани существует несколько изоформ белка, каждая из которых фосфорилирована, или белок по-разному подвергается дополнительным ПТМ, в западном пятне может появиться несколько полос с антифосфопротеиновым антителом. Если для интересующего фосфопротеина не наблюдается сигнала, несмотря на обнаружение общего белка, представляющего интерес, белок может не фосфорилироваться в выбранном контексте или может возникнуть техническая проблема с протоколом. В последнем случае западное промокание цельноклеточных лизатов может быть выполнено антифосфосериновыми/треониновыми и/или антифосфотирозиновыми антителами, чтобы указать, сработал ли протокол так, как ожидалось. Поскольку фосфорилирование белков в черепно-лицевых тканях в изобилии25,37, наличие нескольких фосфопротеиновых полос будет указывать на успешное завершение протокола и точные результаты первоначального скрининга.

Часто полезно сравнивать уровни фосфопротеинов между тканями дикого типа и мутантными эмбриональными тканями или в ответ на лечение культивируемых клеток. В первом случае разница в уровнях фосфопротеинов между генотипами будет выглядеть как разница в интенсивности полосы для интересующего фосфопротеина с аналогичными уровнями общего белка, представляющего интерес27. В последнем случае репрезентативные исходы выявят повышенную интенсивность фосфопротеинового диапазона по сравнению с интенсивностью необработанных клеток при лечении, например, фактором роста (рисунок 3) и снижение интенсивности полосы после лечения ингибитором киназы27,37. Для количественного определения этих различий уровни интересующего фосфопротеина будут нормализованы до уровней общего белка, представляющего интерес. Ожидается, что уровни общего белка, представляющего интерес, будут относительно равными между образцами, что должно быть подтверждено отдельным западным блоттингом с использованием одного или нескольких антител против нагрузочных и экспрессионных контрольных белков, таких как β-тубулин, β-актин и / или GAPDH (рисунок 3). Для лечения культивируемыми клетками факторами роста положительные результаты, вероятно, покажут повышение уровня фосфопротеинов в относительно короткие сроки в 2-15 мин после стимуляции (рисунок 3). Фосфорилирование должно быть незначительным или вообще отсутствовать при отсутствии лечения фактором роста, если только нет других факторов, приводящих к фосфорилированию белка, примеры которых включают эндогенную экспрессию факторов роста клетками, фосфорилирование белка другой сигнальной молекулой, экспрессируемой клетками, и/или мутацию, которая приводит к конститутивному фосфорилированию белка в отсутствие лечения фактором роста. Эти факторы следует учитывать при интерпретации результатов. Отрицательные результаты включают отсутствие изменений фосфорилирования в ответ на временной курс лечения фактором роста, и в этом случае протокол должен быть оценен для поддержания фосфопротеинов, как описано выше. Кроме того, процесс удаления мембран может иногда влиять и снижать общий уровень белка. В этом случае наблюдались бы противоположные тенденции по количеству интересующего фосфопротеина по сравнению с общим интересующим белком. Это неоптимально, так как ожидается, что общие уровни белка будут относительно равными в разных образцах, предполагая одинаковую нагрузку и экспрессию белка, причем изменения происходят только в уровнях фосфопротеинов.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс выделения лизатов цельноклеточного белка из лицевых процессов мыши и культивируемых клеток небной мезенхимы для анализа фосфопротеинов. Верхнечелюстные процессы рассекают из эмбрионов мышей E11.5 на льду и/или среду аспирируют из культивируемых клеток MEPM при 80%-100% слиянии, которые впоследствии дважды промывают ледяным PBS. Лизаты цельноклеточного белка выделяют с помощью лизисного буфера с ингибиторами протеазы и фосфатазы, за которыми следуют SDS-PAGE, электротрансфер на мембрану PVDF, блокирование мембраны BSA, зондирование фосфопротеина, удаление мембраны, исследование общего белка и количественное определение интенсивности полосы. Сокращения: LNP = боковой носовой отросток; MxP = верхнечелюстной процесс; MdP = нижнечелюстной отросток; PA2 = вторая глотка; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; FBS = фетальная бычья сыворотка; PS = небная полка; MEPM = эмбриональная небная мезенхима мыши; SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия; PVDF = поливинилиденфторид; p-P = фосфорилированный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Рассечение верхнечелюстных отростков. (A) Боковой вид эмбриона мыши E11.5 с тремя разрезами (маркированными 1-3), необходимыми для отделения MxP от лица, обозначенного цветными линиями. (B) Боковой вид эмбриона мыши E11.5 после удаления MxP, очерченный пунктирной черной линией. (C) Рассеченный MxP. (D) 35-миллиметровая чашка Петри с небольшими каплями PBS, 2% трипсина и 10% FBS для дополнительного разделения эктодермы MxP и мезенхимы. (E) MxP с Ect частично отделен от Mes. (F) Разделенные MxP Ect и Mes. Шкала стержней: 1 мм (A-C,E,F), 10 мм (D). Сокращения: LNP = боковой носовой отросток; MxP = верхнечелюстной процесс; MdP = нижнечелюстной отросток; PA2 = вторая глотка; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; FBS = фетальная бычья сыворотка; Мес = мезенхима; Ect = эктодерма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: PDGFRβ и MAPK эффекторное фосфорилирование Erk1/2 в ответ на обработку лигандами PDGF-BB увековеченных клеток MEPM. Вестерн-блотт-анализ лизатов цельных клеток из увековеченных клеток MEPM после временного интервала стимуляции лигандов PDGF-BB 10 нг/мл от 2 мин до 15 мин антифосфо-PDGFR, анти-PDGFRβ, антифосфо-Erk1/2, анти-Erk1/2 и анти-β-тубулиновых (E7) антител. Множественные полосы в анти-PDGFRβ блот представляют собой дифференциально гликозилированные белки. Сокращения: PDGF = фактор роста, полученный из тромбоцитов; WCL = лизат целых клеток; kD = килодальтон; WB = вестерн блот; p-PDGFR = фосфорилированный PDGFR; PDGFR = рецептор PDGF; p-Erk = фосфорилированный Erk; Erk = внеклеточная регулируемая сигналом киназа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанный здесь, позволяет исследователям исследовать критические сигнальные события, зависящие от фосфорилирования, во время черепно-лицевого развития надежным и воспроизводимым образом. В этом протоколе есть несколько важных шагов, которые обеспечивают надлежащий сбор данных и анализ результатов. Независимо от того, выделяют ли фосфопротеины из лицевых процессов мышей и / или культивируемых клеток небной мезенхимы, крайне важно двигаться быстро и эффективно, сохраняя все реагенты и материалы на льду, когда это указано. Низкая температура льда замедляет метаболическую активность в клетках, тем самым защищая фосфорилированные белки от активности фосфатазы38 и поддерживая высокий выход белка. Использование трех отдельных 10 см чашек Петри во время рассечения верхнечелюстных процессов гарантирует, что все рассечения проходят в достаточно предварительной гистологии PBS. Соответственно, дополнительным, важным компонентом этого протокола выделения белка является использование ингибиторов фосфатазы во всех буферах лизиса. Эти реагенты также защищают фосфатные группы на интересующем белке 39,40 и поддерживают целостность фосфорилированного белка для дальнейшего анализа путем вестерн-блоттинга.

Этот протокол дополнительно вводит модификации, которые позволяют проводить более специфический анализ фосфопротеинов в тканях и культивируемых клетках. В процессе рассечения лицевых процессов были добавлены факультативные этапы для разделения эктодермы верхнечелюстного процесса и мезенхимы, чтобы обеспечить изучение компартмент-специфического фосфорилирования белка27. Чтобы проверить эффективную изоляцию этих тканевых слоев, пользователи могут оценить экспрессию генов, обогащенных в эктодерме, таких как Gabrp, Trim29, Esrp1 и Mpzl2, и / или генов, обогащенных мезенхимой, таких как Aldh1a2 и AW55198441. Для выделения фосфопротеинов из культивируемых клеток небной мезенхимы были добавлены дополнительные шаги для стимуляции фактора роста. В этом случае клетки сыворотки следует заготавливать в среде, содержащей 0,0%-0,1% сыворотки. Стандартные сыворотки, такие как FBS, содержат многочисленные факторы роста42 , которые могут свертывать результаты экзогенной стимуляции фактора роста. Таким образом, временное сывороточное голодание стимулирует клетки реагировать на лечение острым фактором роста.

Этот протокол также предоставляет оптимизированные методы для точной количественной оценки фосфорилирования белка. На западных этапах блоттинга важно блокировать мембрану PVDF с использованием BSA, а не молока, которое используется во многих стандартных методах западного блоттинга. Этот переключатель является обязательным, так как молоко содержит фосфопротеин казеин43 и приводит к высокому фоновому сигналу при анализе других фосфопротеинов. Кроме того, важно, чтобы уровни фосфорилированного белка, представляющего интерес, количественно оценивались по уровням общего белка, представляющего интерес, а не по уровням стандартного контролирующего белка нагрузки. Таким образом, любые изменения в экспрессии общего белка, представляющего интерес, могут быть учтены при количественной оценке уровней фосфопротеинов. Если выход белка в целом слишком низок для точного обнаружения фосфопротеинов, образцы тканей одной стадии и генотипа могут быть объединены27, и/или клетки могут быть выращены в более крупных сосудах клеточной культуры, чем те, которые описаны здесь для будущих экспериментов. В качестве альтернативы, если удаление последовательно изменяет общие уровни белка, можно использовать два подхода для модификации описанного протокола для достижения воспроизводимых результатов: 1) использование схемы антител, в которой используются антифосфопротеиновые и антибелковые антитела, генерируемые у разных видов хозяев, в сочетании с двумя видоспецифическими вторичными антителами и отдельные (при использовании HRP-конъюгированных вторичных антител) или одновременные (при использовании флуорофор-конъюгированных вторичных антител) развитие пятен; или 2) одновременная обработка двух одинаковых мембран – первая инкубирована с антифосфопротеиновым антителом, вторая с антибелковым антителом. В обоих альтернативных подходах уровни фосфорилированного белка, представляющего интерес, по-прежнему должны быть количественно оценены по сравнению с уровнями общего белка, представляющего интерес. Наконец, поскольку фосфорилирование является динамическим процессом, уровни фосфопротеинов должны оцениваться по крайней мере в трех биологических репликатах в каждом состоянии. Ткань лицевого процесса мыши или первичные клетки MEPM, полученные из отдельного эмбриона или индивидуального пула эмбрионов из той же стадии и генотипа, будут представлять собой единую биологическую репликату. Точно так же увековеченные клетки MEPM различных проходов будут представлять собой биологические реплики. Если культивируемые клетки обрабатываются фактором роста, обработка биологических реплик должна происходить в разные дни с использованием отдельных аликвот фактора роста.

Существуют два ограничения представленного здесь подхода, которые обсуждаются ниже и должны быть рассмотрены до начала протокола. Первый включает в себя динамический диапазон ECL. Вестерн-блоттинговая подложка ECL, рекомендуемая в этом протоколе, имеет широкий динамический диапазон с низкой чувствительностью пикограммы. Однако эмпирически белки с низким содержанием или низким статусом фосфорилирования может быть трудно обнаружить с помощью этих методов. Если фосфорилированные белки не обнаруживаются после 20 мин инкубации субстрата ECL, рекомендуется промыть мембрану в TBS-T, как описано, и вместо этого инкубировать мембрану в высокочувствительном ECL западном блоттинговом субстрате с низкой чувствительностью фемтограммы. Альтернативно, могут быть использованы флуорофорно-конъюгированные вторичные антитела, которые предлагают более широкий динамический диапазон, чем подходы на основе ферментов, такие как ECL44. Второе ограничение связано с процедурой нормализации. Как подробно описано, рекомендуется, чтобы сигнал от интересующего фосфопротеина был нормализован до сигнала от общего белка, представляющего интерес. Однако этот процесс основан на предположении, что уровни общего белка, представляющего интерес, не изменяются между образцами, что часто подтверждается отдельным западным блоттингом с использованием антител против одного или нескольких белков домашнего хозяйства. Важным соображением, однако, является то, что уровни домашних белков могут изменяться между образцами из-за неравномерной нагрузки, неполного переноса на мембрану и / или различий в экспрессии белка. Таким образом, чтобы повысить точность во время нормализации, исследователи могут рассмотреть возможность реализации истинного общего белкового пятна, такого как Ponceau S45, которое обнаруживает все белки в каждой полосе мембраны и учитывает эти технические ограничения.

В целом, этот протокол преодолевает проблему дефосфорилирования белка, которая обычно происходит во время выделения белка. Точный анализ фосфорилирования белка поможет исследователям получить более точное представление о роли фосфорилированных белков в черепно-лицевом развитии. Кроме того, этот протокол предлагает надежные и эффективные методы анализа уровней фосфорилированного белка в физиологически значимых контекстах, каждый из которых имеет свои преимущества. В то время как лизаты белка из тканей эмбриона обеспечивают статический снимок фосфорилирования белка in vivo, реализация культивируемых клеток предоставляет данные о динамических реакциях фосфорилирования на острые методы лечения. Этот протокол обладает способностью непосредственно подтверждать и расширять результаты и гипотезы, вытекающие из больших наборов данных, например, масс-спектрометрии37 и секвенирования РНК27, для обнаружения новых взаимодействий в сигнальных сетях. Важно отметить, что этот протокол может быть использован для исследования того, как возмущения в фосфорилировании непосредственно влияют на внутриклеточную сигнализацию, экспрессию генов и клеточную активность в черепно-лицевых контекстах. Эти разнообразные приложения значительно улучшат понимание эффектов фосфорилирования белка на черепно-лицевое развитие.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мыши 129S4 были подарком от доктора Филиппа Сориано, Медицинской школы Икана на горе Синай. Эта работа была поддержана средствами Национальных институтов здравоохранения (NIH)/Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR) R01 DE027689 и K02 DE028572 для K.A.F., F31 DE029976 для M.A.R. и F31 DE029364 для B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

Биология развития выпуск 182 Черепно-лицевое развитие фосфорилирование фосфопротеины мышиные верхнечелюстные процессы эмбриональные клетки мезенхимы небной массы мыши
Выделение лизатов цельноклеточного белка из процессов лица мыши и культивируемых клеток небной мезенхимы для анализа фосфопротеинов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter