Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול מציג שיטה לבידוד ליזאטים של חלבונים של תאים שלמים מתהליכי פנים של עוברי עכברים שנותחו או מתאי מזנכים עובריים של עכברים שעברו תרבית, וביצוע כתמים מערביים לאחר מכן כדי להעריך את רמות החלבון שעבר זרחן.

Abstract

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. כאן מסופקות שתי דוגמאות להקשרים פיזיולוגיים-רלוונטיים שבאמצעותם ניתן לחקור זרחון של חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכבר תרבית שמקורם במדפי פלטה משניים E13.5. כדי להתגבר על המחסום הנפוץ של דה-פוספורילציה במהלך בידוד חלבונים, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של פוספופרוטאינים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות ניתנות לניתוח וכימות נכונים של פוספופרוטאינים בעקבות כתמים מערביים של ליזאטים של חלבון של תאים שלמים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של פוספופרוטאינים שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.

Introduction

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. בעכבר, תהליך זה מתחיל ביום העוברי (E) 9.5 עם היווצרות הבולטות הקדמית וזוגות של תהליכים מקסילריים ומנדיבולריים, שכל אחד מהם מכיל תאי פסגה עצביים גולגולתיים לאחר נדידה. תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים נובעים מהבולטות הקדמית עם הופעת בורות האף ובסופו של דבר מתמזגים ליצירת הנחיריים. יתר על כן, תהליכי האף המדיאליים והתהליכים המקסילריים מתמזגים ליצירת השפה העליונה. במקביל, palatogenesis הוא יזם עם היווצרות של outgrowths מובהקים - מדפי palatal המשני - מן הצד האוראלי של התהליכים maxillary ב E11.5. עם הזמן, מדפי הפלטה גדלים כלפי מטה משני צדי הלשון, מתרוממים למצב מנוגד מעל הלשון, ובסופו של דבר מתמזגים בקו האמצע ויוצרים חיך רציף המפריד בין חללי האף והפומיה על ידי E16.51.

שינויים מורפולוגיים אלה במהלך ההתפתחות הקרניופציאלית מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. לדוגמה, קולטני קרום התא, כגון תת-קבוצות של קולטני β גורם גדילה משתנה (TGF) β, כולל קולטני חלבון מורפוגנטיים של העצם (BMPRs), ומשפחות שונות של קולטנים טירוזין קינאז (RTK), עוברים אוטופוספוריה עם קשירת ליגנד והפעלתם בתאי צמרת עצביים גולגולתיים 2,3,4 . בנוסף, קולטן הטרנס-ממברנה המצומד לחלבון G מוחלק הופך לזרחני בתאי קרסט עצביים גולגולתיים ובאקטודרם קרניופציאלי במורד הזרם של ליגנד הקיפודים של סוניק (SHH) הנקשר לקולטן Patched1, וכתוצאה מכך הצטברות מוחלקה בקרום הציליארי והפעלת מסלול SHH5. אינטראקציות כאלה בין קולטני ליגנד יכולות להתרחש באמצעות איתות אוטוקרין, פרקרין ו/או ג'וקסטקרין בהקשרים קרניופציאליים. לדוגמה, ידוע כי BMP6 מאותת באופן אוטוקריני במהלך התמיינות כונדרוציטים6, בעוד שגורם גדילה פיברובלסט (FGF) 8 מתבטא באקטודרם קשת הלוע ונקשר לחברי משפחת FGF של RTKs המתבטאים בקשת הלוע מזנכימה באופן פאראקריני כדי ליזום דפוסים וצמיחה של קשתות הלוע7, 8,9,10. יתר על כן, איתות Notch מופעל הן בכונדרוציטים והן באוסטאובלסטים במהלך התפתחות השלד הקרניופציאלי באמצעות איתות ג'וקסטקרין כאשר דלתא טרנס-ממברנה ו/או ליגנדות משוננות נקשרות לקולטני חריץ טרנס-ממברנה על תאים שכנים, אשר לאחר מכן נבקעים וזרחנים11. עם זאת, ישנם זוגות אחרים של ליגנד וקולטנים החשובים להתפתחות קרניופציאלית שיש להם את הגמישות לתפקד הן באיתות אוטוקרין והן באיתות פרקרין. לדוגמה, במהלך מורפוגנזה של שן מורין, הודגם כי גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF)-AA ligand מאותת באופן אוטוקריני להפעלת RTK PDGFRα באפיתל איבר האמייל12. לעומת זאת, בתהליכי פנים של מורין במהלך אמצע ההיריון, תעתיקים המקודדים את הליגנדות PDGF-AA ו-PDGF-CC באים לידי ביטוי באקטודרם הקרניופציאלי, בעוד שקולטן ה-PDGFRα מתבטא במזנכים הנגזרים מהפסגה העצבית הגולגולתית הבסיסית, וכתוצאה מכך ה-paracrine מאותת 13,14,15,16,17 . ללא קשר למנגנון האיתות, אירועי זרחון קולטן אלה גורמים לעתים קרובות לגיוס חלבונים מתאמים ו/או מולקולות איתות, שלעתים קרובות הופכים לזרחניים בעצמם כדי ליזום מפלים תוך-תאיים של קינאז כגון מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK)18,19.

האפקטים התוך-תאיים הסופיים של מפלים אלה יכולים לאחר מכן לזרחן מערך של מצעים, כגון גורמי שעתוק, חלבוני RNA קושרי RNA, ציטוסקליטים ומטריצות חוץ-תאיות. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25, ו-Sox926 הם בין גורמי השעתוק הזרחניים בהקשר של התפתחות קרניופציאלית. שינוי פוסט-תרגומי זה (PTM) יכול להשפיע ישירות על הרגישות ל-PTMs חלופיים, דימריזציה, יציבות, מחשוף ו/או זיקה לקשירת DNA, בין פעילויות אחרות 20,21,25,26. בנוסף, החלבון קושר ה-RNA Srsf3 עובר זרחון בהקשר של התפתחות קרניופציאלית, מה שמוביל לטרנסלוקציה הגרעיניתשלו 27. באופן כללי, הודגם כי זרחון של חלבונים קושרי RNA משפיע על הלוקליזציה התת-תאית שלהם, על האינטראקציות בין חלבונים לחלבון, על קשירת הרנ"א ו/או על ספציפיות הרצף28. יתר על כן, פוספורילציה של אקטומיוזין יכולה להוביל לסידור מחדש של השלד הציטוסקטלי במהלך התפתחות קרניופציאלית29,30, וזרחון של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, כגון גליקופרוטאינים קטנים המקושרים לליגנד N, הקושרים אינטגרין, תורם לביומינרליזציה במהלך התפתחות השלד31. באמצעות הנ"ל ודוגמאות רבות אחרות, ניכר כי קיימות השלכות רחבות על זרחון חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית. הוספת רמה נוספת של ויסות, פוספורילציה של חלבונים מווסתת עוד יותר על ידי פוספטזות, אשר מנטרלות קינאזות על ידי הסרת קבוצות פוספטים.

אירועי זרחון אלה הן ברמת הקולטן והן ברמת המולקולטור הם קריטיים להפצת מסלולי איתות ובסופו של דבר גורמים לשינויים בביטוי הגנים בגרעין, המניעים פעילויות תאיות ספציפיות, כגון נדידה, התפשטות, הישרדות והתמיינות, המביאות להיווצרות נכונה של פני היונקים. בהתחשב בספציפיות ההקשר של אינטראקציות חלבונים עם קינאזות ופוספטזות, השינויים הנובעים מכך ב-PTMs והשפעתם על פעילות התאים, חשוב מאוד שהפרמטרים האלה ייחקרו בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי להשיג הבנה מלאה של התרומה של אירועי זרחון להתפתחות קרניופציאלית. כאן, מסופקות דוגמאות לשני הקשרים שבהם ניתן לחקור זרחון של חלבונים, ולפיכך, הפעלה של מסלולי איתות במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכברים מתורבתים שמקורם במדפים פאלטליים משניים E13.5 - הן ראשוניים32 והןמונצחים 33 . ב- E11.5, התהליכים המקסילריים נמצאים בתהליך של התמזגות עם תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים1, ובכך מייצגים נקודת זמן קריטית במהלך התפתחות קרניופציאלית של עכבר. יתר על כן, תהליכים מקסילריים ותאים שמקורם במדפי הפלטה נבחרו כאן מכיוון שהמבנים האחרונים הם נגזרות של הראשונים, ובכך מספקים לחוקרים את ההזדמנות לחקור את זרחון החלבון in vivo ו - in vitro בהקשרים קשורים. עם זאת, פרוטוקול זה חל גם על תהליכי פנים חלופיים ונקודות זמן התפתחותיות.

בעיה קריטית בחקר חלבונים זרחניים היא שהם עוברים דה-פוספורילציה בקלות במהלך בידוד חלבונים על-ידי שפע של פוספטזות סביבתיות. כדי להתגבר על מחסום זה, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של חלבונים זרחניים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות מסופקות לניתוח נכון וכימות של חלבונים זרחניים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של מסלולי איתות שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של הקמפוס הרפואי אנשוץ של אוניברסיטת קולורדו ובוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות המוסדיות. נקבות 129S4 עכברים בגיל 1.5-6 חודשים ושוכנו בטמפרטורה תת-תרמונוטריאלית של 21-23 מעלות צלזיוס שימשו לקצירת עוברים. זרימת עבודה סכמטית של הפרוטוקול מיוצגת באיור 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי כל החומרים, הציוד, התוכנה, הריאגנטים ובעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. קצירת עוברי עכבר E11.5

  1. המתת ממתת עכברה הרה 11.5 ימים לאחר זיהוי תקע הנרתיק במהלך הזדווגות מתוזמנת בתא CO2 באמצעות קצב זרימת CO2 המאושר על ידי IACUC הנדרש לכ-50% תזוזה (2.95 ליטר לדקה בתא 360ב-3 ) ומשך החשיפה (ראו טבלת חומרים). בצע פריקה צווארית כשיטה משנית של המתת חסד. המשך מיד לנתיחה.
  2. הניחו את גוף העכבר על לוח ניתוח כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. מרססים את בטן העכבר ב-70% אתנול.
  3. פתח את חלל הבטן על ידי צביטה והרמת העור הקדמי לפתח הנרתיק עם מלקחיים ישרים של Semken וחיתוך העור המורם ושכבות הבסיס עם מספריים כירורגיים בעלי להב ישר בזווית של 45° משני הצדדים כדי ליצור צורת "V" המשתרעת על כל משטח לרוחב בערך באמצע הדרך בין הקדמיים והאחוריים.
  4. באמצעות מלקחיים Semken, לאחוז באחת מקרני הרחם ולחתוך מתחת לאובידוקט ומעל צוואר הרחם עם המספריים הכירורגיים. חותכים את המסומטריום כדי לאפשר הסרה מלאה של קרן הרחם.
  5. העבר את קרן הרחם המנותקת ל-10 מ"ל של היסטולוגיה מלוחים עם חיץ פוספט (PBS) [0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 מונובסי, 10.14 mM Na2HPO4 dibasic, pH 7.4] בצלחת פטרי 10 ס"מ.
  6. הסר את קרן הרחם השנייה בצד הנגדי של חלל הבטן באמצעות אותו הליך המתואר בשלבים 1.4-1.5.
  7. מניחים את צלחת הפטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה את שתי קרני הרחם על קרח אם לא ממשיכים מיד לניתוח של עוברים בודדים (כלומר, אם נקבת עכבר שנייה תנותח).
  8. תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח, נתחו בזהירות כל עובר מקרני הרחם עם מלקחיים עדינים של Dumont #5. לאט לאט משכו את המיומטריום, את ההחלטה ואת הכוריאון. קורעים ומסירים את השחרטום השקוף יחסית המקיף את העובר, וחותכים את חבל הטבור המחבר את העובר לשליה.
  9. מעבירים כל עובר מנותח ל-2.5 מ"ל של היסטולוגיה PBS בבאר בודדת של צלחת תרבית תאים בת 12 בארות על קרח באמצעות פיפטת העברת פלסטיק חתוכה או כף עובר.
    הערה: אם אתם עובדים עם המלטה שעשויה להכיל עוברים של יותר מגנוטיפ אחד, שמרו את השן המקיף כל עובר לצורך גנוטיפ על ידי הצבת כל אחד מהם בצינור מיקרו-צנטריפוגה בעל תווית מוקדמת של 0.5 מ"ל על קרח.

2. ניתוח תהליכים מקסילריים מעוברי עכבר E11.5

  1. הכינו שלוש צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילות 10 מ"ל של PBS היסטולוגי ושמרו אותן על קרח לשימוש בסיבוב בין עוברים.
  2. העבירו עובר אחד מבאר בודדת של צלחת תרבית התאים בת 12 הבארות לאחת מצורות הפטרי בקוטר 10 ס"מ עם PBS היסטולוגי על קרח באמצעות פיפטת העברת פלסטיק חתוכה או כפית עובר.
  3. תחת מיקרוסקופ הניתוח, להפריד כל תהליך מקסילרי מהפנים באמצעות המלקחיים העדינים. ראשית, חתכו את הצד הקדמי של תהליך מקסילרי אחד לאורך הכניסה הטבעית המפרידה בין תהליך האף הצדדי לבין התהליך המקסילרי (איור 2A).
  4. שנית, חותכים את הצד האחורי של התהליך המקסילרי לאורך ההזחה הטבעית המפרידה בין התהליך המקסילרי לבין התהליך המנדיבולרי (איור 2A).
  5. שלישית, כדי להפריד לחלוטין את התהליך המקסילרי, בצע חיתוך אנכי מהצדדים הקדמיים לאחוריים של התהליך המקסילרי בצד העין של התהליך המקסילרי שבו ההזחות הטבעיות שהוזכרו לעיל מסתיימות (איור 2A-C).
  6. חזור על שלושת החתכים הללו עבור התהליך המקסילרי בצד הנגדי של הפנים.
  7. באמצעות פיפטת פסטר בגודל 9 אינץ' עם נורת לטקס קטנה של 2 מ"ל, מעבירים את זוג התהליכים המקסילריים המנותחים ואת טיפתה קטנה של כ-30 מיקרול' של PBS היסטולוגי לצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ על קרח (איור 2D).
  8. בצע את השלבים 2.3-2.7 עבור כל עובר, תוך סיבוב שלוש צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילות PBS היסטולוגי על קרח בין עוברים. הניחו זוגות בודדים של תהליכים מקסילריים מנותחים בצלחות פטרי נפרדות בקוטר 35 מ"מ על קרח.
    הערה: ניתן לבצע הפרדה בין התהליך המקסילרי אקטודרם ומזנכים (שלבים 2.9-2.17) לאחר ניתוח התהליכים המקסילריים של כל העוברים בהמלטה. אם רצויים תהליכים מקסילריים שלמים המכילים הן את האקטודרם והן את המזנכים, המשך לשלב 2.18 להלן.
  9. הכינו 250 μL של 2% טריפסין טרי בתרבית רקמה PBS ו-250 μL של 10% סרום בקר עוברי (FBS) בתרבית רקמה PBS ואחסנו על קרח.
  10. מניחים טיפה שנייה, קטנה, של כ-30 μL של 2% טריפסין בצלחת פטרי 35 מ"מ בנפרד מהטיפה הראשונה, הקטנה, של PBS היסטולוגי המכילה את התהליכים המקסילריים. העבר את זוג התהליכים המקסילריים לטיפה הקטנה של 2% טריפסין באמצעות פיפט הפסטר (איור 2D).
  11. דגירה של המנה על קרח למשך 15 דקות.
  12. מוציאים את צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ מהקרח ומניחים מתחת למיקרוסקופ הניתוח.
  13. באמצעות המלקחיים העדינים, משכו באיטיות ובזהירות את שכבת האקטודרם מכל תהליך מקסילרי (איור 2E).
    הערה: אם האקטודרם אינו נפרד מהמזנכים ביריעה שלמה, יש לדוג ב-2% טריפסין בטמפרטורת החדר (RT) למשך עד 5 דקות נוספות לפני שתמשיכו בהפרדה. אם הרקמה מתחילה להתפורר ב-2% טריפסין, העבירו את התהליכים המקסילריים ל-10% FBS כמתואר להלן כדי לנטרל את הטריפסין ולסיים את ההפרדה בין האקטודרם למזנכים.
  14. לאחר שהתהליך המקסילרי אקטודרם ומזנכים מופרדים (איור 2F), העבירו את הרקמות הרצויות מזוג התהליכים המקסילריים לטיפה שלישית, קטנה, של כ-30 מיקרול' של כ-10% FBS - בנפרד משתי הטיפות הקטנות הקודמות - באמצעות פיפטת הפסטר (איור 2D).
  15. הניחו את צלחת הפטרי 35 מ"מ על קרח כדי לעצור את הטריפסיניזציה.
  16. דגירו את רקמות התהליך המקסילרי על קרח ב-10% FBS למשך דקה-שתיים, ולאחר מכן העבירו את הרקמות משני התהליכים המקסילריים לטיפה רביעית, קטנה, של כ-30 μL של PBS היסטולוגיה קדם-צ'ילית על קרח - בנפרד משלוש הטיפות הקטנות הקודמות - באמצעות צינור הפסטר (איור 2D).
  17. דגירה של רקמות התהליך המקסילרי בהיסטולוגיה PBS למשך דקה אחת תוך סיבוב עדין של ההיסטולוגיה PBS סביב רקמות התהליך המקסילרי עם קצה פיפטת הפסטר כדי להבטיח שכל ה- FBS נשטף מהרקמה.
  18. העבר את זוג רקמות התהליך המקסילרי לצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן 1.5 מ"ל על קרח באמצעות צינור פסטר, ובכך למזער את העברת ההיסטולוגיה PBS. הסר כל עודף היסטולוגיה PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עם צינור פסטר.
  19. בצע את השלבים לעיל כדי לנתח את התהליכים המקסילריים מכל עובר בהמלטה.
  20. לעבד את הדגימות באופן מיידי כדי לבודד את החלבון של התא השלם lysates (להלן) או לאחסן ב -80 °C (80 °C) לטווח ארוך. לפני אחסון לטווח ארוך, הקפיאו את צינור המיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל באמבטיה של 100% EtOH על קרח יבש למשך 5 דקות.

3. בידוד חלבון של תאים שלמים ליאסטים מתהליכים מקסילריים של עכברים

  1. אם תהליכים מקסילריים הוקפאו בעבר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, הפשירו אותם על קרח.
  2. הוסף 0.1 מ"ל של חיץ ליזה NP-40 קר כקרח (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% גליצרול, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; מאוחסן ב-4 °C) עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (1x קוקטייל מעכב מיני פרוטאז מלא [מומס במים; מאוחסן בטמפרטורה של -20 °C], 1 mM PMSF [מומס באיזופרופנול; מאוחסן ב-4 °C], 10 mM NaF [מאוחסן ב-20°C-; הימנע מהקפאה/הפשרה], 1 mM Na3VO4 [מאוחסן ב-20°C-], 25 mM β-גליצרופוספט [מאוחסן ב-4 °C]) שנוספו מיד לפני השימוש בקרח.
    הערה: לחלופין ניתן לבצע פיצול תאים כדי לבודד שברים ציטופלסמיים, גרעיניים, ממברנה או חלבונים מיטוכונדריאליים.
  3. פיפט למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטמן 200 μL.
  4. מערבולת במשך 10 שניות, ולאחר מכן פיפט למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטמן 200 μL. הימנעו מיצירת בועות.
  5. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות תוך סיבוב הקצה מעל הקצה באמצעות משוט 1.5 מ"ל/2 מ"ל עם אקדח צינור.
  6. צנטריפוגה הדגימות ב 13,500 × גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (74 °F).
  7. אספו את ה-supernatant לצינור מיקרו-סנטריפוג' חדש בגודל 1.5 מ"ל על קרח עם פיפטמן של 200 מ"ל.
  8. כימתו את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת החלבון, באמצעות 10 μL של חלבון lysate + 10 μL של מאגר ליזה NP-40 עבור דגימות ניסיוניות ו-3-5 דילולים של אלבומין בסרום בקר (שבר V) (BSA) במאגר ליזה NP-40 בטווח של 0.25-2.0 מ"ג/מ"ל כתקני חלבון.
  9. המשך עם נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) (שלב 5) או להקפיא במהירות את הליזאטים הנותרים על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך.

4. בידוד חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתאי מזנכים ראשוניים ו/או מונצחים של עכברים עובריים (MEPM)

הערה: בידוד ותרבית של תאי MEPM ראשוניים מעוברי עכבר E13.5 ותאי MEPM מונצחים תוארו בעבר 32,33,34. גירוי של תאים עם גורם גדילה (שלבים 4.1-4.7) יכול להתבצע לפני תזה תאית. אם רצוי תאים שאינם מגורה, המשך לשלב 4.8 להלן.

  1. שאפו למדיום הגדילה [מדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM) עם 50 U/mL של פניצילין, 50 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, 10% FBS] מתאי MEPM במפגש של כ-70% בצלחת תרבית תאים בגודל 6 ס"מ באמצעות פיפטת פסטר בגודל 5.75 אינץ' המחוברת למערכת ואקום.
  2. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של תרבית רקמה PBS.
  3. הוסיפו 3 מ"ל של מדיום הרעבה בסרום [DMEM עם 50 U/mL של פניצילין, 50 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, 0.1% FBS] מתוכנן מראש באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  4. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 23 שעות.
  5. החליפו את מדיום הרעב בסרום ב-3 מ"ל של מדיום רעב טרי ומתוכנן מראש בסרום.
  6. אינקובציה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעה אחת.
  7. לעורר את התאים עם גורם הגדילה המועדף בריכוז שנקבע אמפירית למשך הזמן הרצוי.
  8. שאפו את המדיום מתאי MEPM במפגש של 80%-100% באמצעות צינור פסטר בגודל 5.75 אינץ' המחובר למערכת ואקום.
  9. לשטוף את התאים פעמיים עם תרבית רקמה קרה כקרח PBS (1 מ"ל עבור צלחת תרבית תאים 6 ס"מ); הטה את הצלחת הצידה במהלך הכביסה האחרונה כדי להבטיח שכל תרבית הרקמה PBS שואפת.
  10. להפוך את התאים על ידי הוספת חיץ ליזה NP-40 קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז שנוספו מיד לפני השימוש (0.1 מ"ל לצלחת תרבית תאים של 6 ס"מ) על קרח.
  11. דגירה של הצלחת על קרח למשך 5 דקות עם סיבוב בערך כל דקה כדי להבטיח כיסוי מלא של הצלחת.
  12. גרד את התאים מהצלחת באמצעות מרים תאים מקדים והעביר את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל על קרח.
  13. דגירה של מתלי התא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך סיבוב הקצה על הקצה באמצעות משוט 1.5 מ"ל/2 מ"ל עם אקדח צינור.
  14. המשך עם שלבים 3.6-3.9 שתוארו לעיל.

5. כתם מערבי של חלבון תאי שלם ליסאט מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי MEPM עבור פוספופרוטאינים

  1. הכן דגימות ליזט של חלבון תא שלם עבור SDS-PAGE.
    1. קבעו את כמות החלבון שיש לטעון, בהתאם לשפע החלבון ברקמה/תא; 12.5 מיקרוגרם מספיקים בדרך כלל לחלבונים בעלי ביטוי חזק בליזאטים של חלבונים בתאים שלמים.
    2. הוסיפו נפח שווה של 2x מאגר לאמלי [20% גליצרול, 4% SDS, 0.004% ברומופנול כחול, 0.125 M Tris HCl pH 6.8] עם 10% β-מרקפטואתנול שנוספו מיד לפני השימוש.
      אזהרה: β-mercaptoethanol הוא עור או עיניים קורוזיבי, רעיל, מסוכן אם נבלע, ויש לו רעילות מימית. ידית לבישת כפפות, מעיל מעבדה, מגן פנים ומשקפי בטיחות במכסה אדים כימי. להיפטר על פי הנחיות בריאות ובטיחות הסביבה.
    3. מערבבים על ידי מערבולות.
    4. מחממים את הדגימות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבטיה יבשה קטנה.
    5. מערבבים על ידי מערבולת ומניחים את הדגימות על קרח.
    6. צנטריפוגה ב 9,400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    7. הניחו את הדגימות לזמן קצר על קרח לפני טעינתם לג'ל SDS-PAGE, או אחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך.
  2. בצע SDS-PAGE באמצעות תא אלקטרופורזה עם ג'ל חלבון משודר מראש של 4%-15% ובופר אלקטרופורזה35.
  3. אלקטרו-טרנספר את החלבונים לממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) באמצעות מאגר העברה עם 0%-20% מתנול (0%-10% לחלבונים הגדולים מ-100 kDa; 20% לחלבונים פחות מ-100 kDa) שנוספו מיד לפני השימושב-35.
  4. לחסום את הממברנה ולחקור עבור פוספופרוטאין של עניין.
    1. לאחר ההעברה, שטפו את הממברנה בתמיסת מלח משולשת אחת (TBS) [20 mM Tris, 0.137 M NaCl, pH 7.6] למשך 5 דקות בקופסת כתם מערבית.
    2. דגירה של הממברנה ב-5 מ"ל של מאגר חוסם [1x TBS, 0.1% Tween 20, 5% w/v BSA; מעורבב היטב ומסונן דרך מסנן מזרקים 25 מ"מ עם נקבוביות של 0.2 מיקרומטר באמצעות מזרק 10 מ"ל עם קצה פיתוי] במשך שעה אחת בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
      הערה: אין להשתמש בחלב כחומר חוסם בעת אפיון פוספופרוטאינים מכיוון שהוא מכיל את קזאין הפוספופרוטאין, מה שעלול לגרום לאות רקע גבוה ולא ספציפי.
    3. שטפו את הממברנה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת ב-TBS-T [1x TBS, 0.1% Tween 20] בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    4. דגירה של הממברנה ב-5 מ"ל של נוגדן ראשוני מדולל בחסימת חיץ בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בצינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות משוט 50 מ"ל עם אקדח צינור.
      הערה: עיין בגיליון נתוני הנוגדנים לקבלת הריכוז המתאים לכתם מערבי.
    5. שטפו את הממברנה שלוש פעמים ב-RT במשך 5 דקות כל אחת ב-TBS-T בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    6. דגירה של הממברנה ב-5 מ"ל של נוגדן משני מצומד חזרת מתאים (HRP) מדולל במאגר חוסם למשך שעה אחת בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    7. שטפו את הממברנה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת ב-TBS-T בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    8. דגירה של הממברנה במצע כתם מערבי משופר (ECL) [ערבוב נפחים שווים מבקבוקים 1 ו-2; 0.5 מ"ל מכל אחד מהם עבור ממברנות גדולות (8.6 ס"מ x 6.7 ס"מ) למשך דקה אחת, מה שמבטיח שהממברנה כולה חשופה ללא הרף למצע הכתם המערבי של ECL.
    9. לנקז את הקרום של עודף ECL מצע כתם מערבי ולהתפתח מיד באמצעות תמונה chemiluminescence.
  5. מפשיטים את הממברנה ומחפשים מחדש את סך החלבון המעניין.
    1. הניחו את קרום ה-PVDF בשקית שקופה עם ציפוי פוליאתילן המכיל 5 מ"ל של חיץ הפשטה [2% SDS, 62.5 mM Tris HCl pH 6.8] עם 8 μL/mL של β-mercaptoethanol שנוספו מיד לפני השימוש.
    2. דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנדה בתנור הכלאה ב-11 סיבובים לדקה.
    3. שטפו את הממברנה שלוש פעמים ב-RT במשך 5 דקות כל אחת ב-TBS-T בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    4. המשך עם שלבים 5.4.2-5.4.9 שתוארו לעיל.
  6. צפיפות רצועת הכתמים המערבית הכמותית באמצעות תוכנת ImageJ, מנרמלת את רמות החלבון הזרחני המעניין לרמות של החלבון הכולל בעל העניין36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר מנסים לאפיין את הזרחון של חלבונים שבודדו מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכיים פאלטליים בתרבית, התוצאות הייצוגיות יחשפו באופן אידיאלי פס מובחן וניתן לשחזור בעקבות כתם מערבי עם נוגדן אנטי-פוספופרוטאין הפועל בגובה או בסמוך לגובה רצועת החלבון הכוללת המתאימה (איור 3) ). עם זאת, אם מתרחשת זרחון נרחב של החלבון, ייתכן שתהיה תזוזה קלה כלפי מעלה של רצועת הפוספופרוטאין בהשוואה לזו של רצועת החלבון הכוללת. יתר על כן, אם קיימים איזופורמים מרובים של חלבון ברקמה, שכל אחד מהם הוא זרחן, או שהחלבון נתון באופן משתנה ל-PTMs נוספים, רצועות מרובות עשויות להופיע בכתם המערבי עם נוגדן אנטי-פוספופרוטאין. אם לא נצפה אות לפוספופרוטאין המעניין, למרות זיהוי החלבון הכולל המעניין, ייתכן שהחלבון לא יהיה זרחני בהקשר הנבחר, או שייתכן שהתעוררה בעיה טכנית עם הפרוטוקול. במקרה האחרון, ניתן לבצע כתם מערבי של ליזאטים של תאים שלמים עם נוגדנים נגד פוספוסרין/תראונין ו/או אנטי-פוספוטירוזין כדי לציין אם הפרוטוקול עבד כצפוי. מכיוון שזרחון של חלבונים נפוץ ברקמות קרניופציאליות25,37, נוכחותן של רצועות פוספופרוטאין מרובות תצביע על השלמה מוצלחת של הפרוטוקול ועל תוצאות מדויקות מההקרנה הראשונית.

לעתים קרובות כדאי להשוות את רמות הפוספופרוטאין בין רקמות עובריות מסוג בר ומוטנטיות או בתגובה לטיפול בתאים בתרבית. במקרה הראשון, הבדל ברמות הפוספופרוטאין בין הגנוטיפים יופיע כהבדל בעוצמות הפסים עבור הפוספופרוטאין בעל העניין עם רמות דומות של סך החלבון בעל העניין27. במקרה האחרון, תוצאות מייצגות יחשפו עוצמות מוגברות של רצועות פוספופרוטאין בהשוואה לאלה של תאים לא מטופלים בעת הטיפול, למשל, בגורם גדילה (איור 3) וירידה בעוצמות הרצועה לאחר טיפול במעכב קינאז27,37. עבור הכמות של הבדלים אלה, רמות של phosphoprotein של עניין יהיה מנורמל לרמות של חלבון הכולל של עניין. הרמות של החלבון הכולל בעל העניין צפויות להיות שוות יחסית בין הדגימות, ממצא שיש לאשרו על ידי כתם מערבי נפרד באמצעות נוגדן אחד או יותר נגד חלבוני בקרת העמסה וביטוי כגון β-טובולין, β-אקטין ו/או GAPDH (איור 3). עבור טיפול בגורמי גדילה של תאים בתרבית, תוצאות חיוביות צפויות להראות עלייה ברמות הפוספופרוטאין בפרק זמן קצר יחסית של 2-15 דקות לאחר הגירוי (איור 3). צריכה להיות מעט או ללא זרחון בהיעדר טיפול בגורם גדילה, אלא אם כן ישנם גורמים אחרים הפועלים וכתוצאה מכך פוספורילציה של החלבון, שדוגמאותיהם כוללות ביטוי אנדוגני של גורמי גדילה על ידי התאים, פוספורילציה של החלבון על ידי מולקולת איתות אחרת המבוטאת על ידי התאים, ו/או מוטציה המובילה לזרחון מכונן של החלבון בהיעדר טיפול בגורם גדילה. גורמים אלה צריכים להילקח בחשבון בפרשנות של התוצאות. התוצאות השליליות כוללות ללא שינוי בזרחון בתגובה למסלול הזמן של טיפול בגורם גדילה, ובמקרה זה יש להעריך את הפרוטוקול לצורך שמירה על פוספופרוטאינים כמפורט לעיל. בנוסף, תהליך הפשטת הממברנה יכול להשפיע מדי פעם על רמות החלבון הכוללות ולהפחית אותן. במקרה זה, נצפו מגמות מנוגדות לכמות הפוספופרוטאין המעניין לעומת סך החלבון המעניין. זה לא אופטימלי, שכן רמות החלבון הכוללות צפויות להיות שוות יחסית בין דגימות, בהנחה שהעמסה וביטוי שווים של החלבון, כאשר השינויים מתרחשים רק ברמות הפוספופרוטאין.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה לבידוד של ליאסטים של חלבון תאי שלם מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין. תהליכים מקסילריים מנותחים מעוברי עכברים E11.5 על קרח, ו/או המדיום שואף מתאי MEPM בתרבית במפגש של 80%-100%, שלאחר מכן נשטפים פעמיים עם PBS קר כקרח. ליזטים של חלבון שלם של תאים מבודדים באמצעות חיץ ליזה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז, ואחריהם SDS-PAGE, אלקטרו-טרנספר לממברנה PVDF, חסימת הממברנה עם BSA, בדיקה של הפוספופרוטאין, הפשטת הממברנה, תוכחה על סך החלבון וכמות עוצמות הפסים. קיצורים: LNP = תהליך האף הלטרלי; MxP = תהליך מקסילרי; MdP = תהליך מנדיבולרי; PA2 = קשת הלוע השנייה; PBS = מלוחים בעלי מאגר פוספט; FBS = סרום בקר עוברי; נ.ב. = מדף פאלטלי; MEPM = עכבר עוברי palatal mesenchyme; SDS-PAGE = נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה; PVDF = פוליווינילידן פלואוריד; p-P = חלבון זרחני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח של תהליכים מקסילריים. (A) תצוגה רוחבית של עובר עכבר E11.5 עם שלושת החתכים (המסומנים 1-3) הנדרשת כדי להפריד את ה-MxP מהפנים המסומנות בקווים צבעוניים. (B) מבט לרוחב על עובר עכבר E11.5 לאחר הסרת MxP עם קו שחור מקווקו. (C) MxP. (D) מערך צלחת פטרי 35 מ"מ עם טיפות קטנות של PBS, 2% טריפסין ו-10% FBS להפרדה אופציונלית של אקטודרם MxP ומזנכים. (E) MxP עם Ect מופרד חלקית ממס. (F) מופרדים MxP Ect ו Mes. סרגלי קנה מידה: 1 מ"מ (A-C, E, F), 10 מ"מ (D). קיצורים: LNP = תהליך האף הלטרלי; MxP = תהליך מקסילרי; MdP = תהליך מנדיבולרי; PA2 = קשת הלוע השנייה; PBS = מלוחים בעלי מאגר פוספט; FBS = סרום בקר עוברי; Mes = mesenchyme; Ect = ectoderm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: זרחון PDGFRβ ו-MAPK Erk1/2 phosphorylation בתגובה לטיפול בליגנד PDGF-BB בתאי MEPM מונצחים. ניתוח כתמים מערביים של ליסאטים של תאים שלמים מתאי MEPM מונצחים לאחר טווח זמן של 10 ננוגרם/מ"ל PDGF-BB גירוי ליגנד מ-2 דקות עד 15 דקות עם נוגדנים נגד פוספו-PDGFR, אנטי-PDGFRβ, אנטי-פוספו-ארק1/2, אנטי-ארק1/2 ונוגדנים נגד β-טובולין (E7). פסים מרובים בכתם נגד PDGFRβ מייצגים חלבונים בעלי גליקוזילציה דיפרנציאלית. קיצורים: PDFGF = גורם גדילה שמקורו בטסיות דם; WCL = ליזט תא שלם; kD = קילודלטון; WB = כתם מערבי; p-PDGFR = PDGFR זרחני; PDGFR = קולטן PDGF; p-Erk = Erk זרחני; Erk = קינאז חוץ-תאי מווסת אותות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים לחקור אירועי איתות קריטיים התלויים בזרחון במהלך התפתחות קרניופציאלית באופן חזק וניתן לשחזור. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה המבטיחים איסוף נכון של נתונים וניתוח תוצאות. בין אם מבודדים פוספופרוטאינים מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכים פאלטליים בתרבית, חובה לנוע במהירות וביעילות תוך שמירה על כל הריאגנטים והחומרים על הקרח כאשר הם מסומנים. הטמפרטורה הנמוכה של הקרח מאטה את הפעילות המטבולית בתאים, ובכך מגנה על חלבונים זרחניים מפני פעילות פוספטאז38 ושומרת על תפוקת חלבון גבוהה. השימוש בשלוש צלחות פטרי נפרדות בקוטר 10 ס"מ במהלך כריתת תהליכים מקסילריים מבטיח שכל הניתוחים יתקיימו בהיסטולוגיה מוקדמת מספיק PBS. באופן דומה, מרכיב נוסף וחיוני בפרוטוקול בידוד חלבונים זה הוא השימוש במעכבי פוספטאז בכל מאגרי הליזיס. ריאגנטים אלה גם מגנים על קבוצות פוספטים על החלבון בעל העניין39,40 ושומרים על שלמות החלבון הזרחני לניתוח נוסף על ידי כתם מערבי.

פרוטוקול זה מציג גם שינויים המאפשרים ניתוחים ספציפיים יותר של פוספופרוטאינים ברקמות ובתאים בתרבית. בתהליך של ניתוח תהליכי פנים, נוספו שלבים אופציונליים להפרדת התהליך המקסילרי אקטודרם ומזנכים כדי לאפשר מחקר של זרחון חלבון ספציפי לתא27. כדי לבדוק בידוד יעיל של שכבות רקמה אלה, משתמשים יכולים להעריך את הביטוי של גנים מועשרים באקטודרם, כגון Gabrp, Trim29, Esrp1 ו - Mpzl2, ו / או גנים מועשרים במזנכים, כגון Aldh1a2 ו- AW55198441. לבידוד של פוספופרוטאינים מתאי מזנכיים פאלטליים בתרבית, נוספו שלבים אופציונליים לגירוי גורמי גדילה. במקרה זה, התאים צריכים להיות מורעבים בסרום בינוני המכיל 0.0%-0.1% סרום. סרומים סטנדרטיים כגון FBS מכילים גורמי גדילה רבים42 שיכולים להתפתל כתוצאה מגירוי גורם גדילה אקסוגני. לפיכך, הרעבה זמנית בסרום גורמת לתאים להגיב לטיפול בגורם גדילה חריף.

פרוטוקול זה מספק גם שיטות ממוטבות לכימות מדויק של זרחון חלבונים. בשלבי הכתם המערביים, חשוב לחסום את קרום ה-PVDF באמצעות BSA ולא בחלב, המשמש בטכניקות רבות של כתם מערבי סטנדרטי. מתג זה הוא הכרחי, שכן חלב מכיל את הפוספופרוטאין קזאין43 ומוביל לאות רקע גבוה בניתוח של פוספופרוטאינים אחרים. יתר על כן, חשוב כי רמות החלבון הזרחני המעניין יכומתו כנגד רמות החלבון הכולל בעל העניין ולא נגד רמות של חלבון בקרת העמסה סטנדרטי. בדרך זו, כל שינוי בביטוי של החלבון הכולל של עניין יכול להיות אחראי בכימות של רמות phosphoprotein. אם תפוקת החלבון באופן כללי נמוכה מדי לזיהוי מדויק של פוספופרוטאין, דגימות רקמות מאותו שלב וגנוטיפ עשויות להיות מאוגדות27, ו/או ניתן לגדל תאים בכלי תרבית תאים גדולים יותר מאלה שתוארו כאן לניסויים עתידיים. לחלופין, אם נראה כי הפשטה משנה באופן עקבי את רמות החלבון הכוללות, ניתן לנקוט בשתי גישות כדי לשנות את הפרוטוקול המתואר כדי להשיג תוצאות ניתנות לשחזור: 1) שימוש בסכמת נוגדנים המשתמשת בנוגדנים אנטי-פוספופרוטאין ואנטי-חלבוניים הנוצרים במינים מארחים שונים בשילוב עם שני נוגדנים משניים ספציפיים למין ונפרדים (אם משתמשים בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP) או בו זמנית (אם משתמשים בנוגדנים משניים מצומדים בפלואורופור) התפתחות הכתמים; או 2) עיבוד סימולטני של שתי ממברנות זהות - הראשונה דגירה עם נוגדן אנטי-פוספופרוטאין, השנייה עם נוגדן אנטי-חלבון. בשתי הגישות החלופיות, עדיין יש לכמת את רמות החלבון הזרחני המעניין כנגד רמות החלבון הכולל המעניין. לבסוף, מכיוון שזרחון הוא תהליך דינמי, יש להעריך את רמות הפוספופרוטאין בשלושה שכפולים ביולוגיים לפחות בכל מצב. רקמת תהליך פנים של עכבר או תאי MEPM ראשוניים שמקורם בעובר בודד או במאגר בודד של עוברים מאותו שלב וגנוטיפ יהוו שכפול ביולוגי יחיד. באופן דומה, תאי MEPM מונצחים של מעברים שונים יהוו שכפול ביולוגי. אם תאים בתרבית מטופלים עם גורם גדילה, הטיפול בשכפולים ביולוגיים צריך להתרחש בימים שונים באמצעות אליקוטים נפרדים של גורם גדילה.

קיימות שתי מגבלות של הגישה המוצגת כאן, אשר יידונו להלן ויש לשקול אותן לפני תחילת הפרוטוקול. הראשון כולל את הטווח הדינמי של ECL. למצע הכתם המערבי ECL המומלץ בפרוטוקול זה יש טווח דינמי רחב, עם רגישות פיקוגרמה נמוכה. עם זאת, מבחינה אמפירית, חלבונים בעלי שפע נמוך או מצב זרחן נמוך עשויים להיות קשים לזיהוי בשיטות אלה. אם חלבונים זרחניים אינם ניתנים לגילוי לאחר 20 דקות של דגירה של מצע ECL, מומלץ לשטוף את הממברנה ב- TBS-T כמתואר ובמקום זאת לדגום את הממברנה במצע כתם מערבי ECL בעל רגישות גבוהה עם רגישות נמוכה לפמטוגרמה. לחלופין, ניתן להשתמש בנוגדנים משניים מצומדים לפלואורופור, המציעים טווח דינמי רחב יותר מאשר גישות מבוססות אנזימים כגון ECL44. מגבלה שנייה נובעת מהליך הנורמליזציה. כפי שתואר בהרחבה, מומלץ לנרמל את האות מהפוספופרוטאין של העניין לאות מהחלבון הכולל של העניין. עם זאת, תהליך זה מסתמך על ההנחה כי רמות החלבון הכולל של העניין אינן משתנות בין דגימות, אשר מאושר לעתים קרובות על ידי כתם מערבי נפרד באמצעות נוגדנים נגד אחד או יותר חלבונים משק בית. עם זאת, שיקול חשוב הוא שרמות החלבונים הביתיים עשויות להשתנות בין דגימות עקב העמסה לא אחידה, העברה לא מלאה לממברנה ו/או הבדלים בביטוי החלבון. לכן, כדי לשפר את הדיוק במהלך הנורמליזציה, חוקרים יכולים לשקול לעבור ליישם כתם חלבון כולל אמיתי, כגון Ponceau S45, אשר מזהה את כל החלבונים בכל נתיב של הממברנה ומתחשב במגבלות טכניות אלה.

באופן כללי, פרוטוקול זה מתגבר על הבעיה של דה-פוספורילציה של חלבונים המתרחשת בדרך כלל במהלך בידוד חלבונים. ניתוח מדויק של זרחון חלבונים יסייע לחוקרים להבין בצורה מדויקת יותר את תפקידם של חלבונים זרחניים במהלך התפתחות קרניופציאלית. יתר על כן, פרוטוקול זה מציע שיטות חזקות ויעילות לניתוח רמות חלבון זרחניות בהקשרים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, שלכל אחד מהם יתרונות משלו. בעוד שליזטים של חלבונים מרקמות העובר מספקים תמונת מצב סטטית של זרחון חלבונים in vivo, יישום של תאים בתרבית מספק נתונים על תגובות זרחון דינמיות לטיפולים אקוטיים. לפרוטוקול זה יש את היכולת לאשר ולהרחיב באופן ישיר את התוצאות וההשערות הנובעות ממערכי נתונים גדולים, למשל, ספקטרומטריית מסה37 וריצוף RNA27, כדי לגלות אינטראקציות חדשות בתוך רשתות איתות. חשוב לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור כיצד הפרעות בזרחון משפיעות ישירות על איתות תוך-תאי, ביטוי גנים ופעילות תאית בהקשרים קרניופציאליים. יישומים מגוונים אלה ישפרו מאוד את ההבנה של ההשפעות של זרחון חלבונים בהתפתחות קרניופציאלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

129S4 עכברים היו מתנה מד"ר פיליפ סוריאנו, בית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני. עבודה זו נתמכה בכספים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)/המכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי (NIDCR) R01 DE027689 ו- K02 DE028572 ל- K.A.F., F31 DE029976 ל- M.A.R. ו- F31 DE029364 ל- B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 182 התפתחות קרניופציאלית זרחון פוספופרוטאינים עכבר תהליכים מקסילריים תאי מזנכים פאלטליים עובריים של עכברים
בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter