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Developmental Biology

Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

Das Protokoll stellt eine Methode zur Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus sezierten Gesichtsbehandlungen von Mausembryonen oder kultivierten embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus und zur Durchführung eines anschließenden Western Blotting zur Beurteilung des phosphorylierten Proteinspiegels vor.

Abstract

Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Diese morphologischen Veränderungen werden durch verschiedene Signalwechselwirkungen initiiert und aufrechterhalten, zu denen häufig die Proteinphosphorylierung durch Kinasen gehört. Hier werden zwei Beispiele für physiologisch relevante Kontexte zur Untersuchung der Phosphorylierung von Proteinen während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren gegeben: Gesichtsprozesse der Maus, insbesondere E11.5-Oberkieferprozesse, und kultivierte embryonale Gaumendickkörperzellen der Maus, die aus E13.5 sekundären palatalen Regalen stammen. Um die übliche Barriere der Dephosphorylierung während der Proteinisolierung zu überwinden, werden Anpassungen und Modifikationen an Standardlabormethoden diskutiert, die eine Isolierung von Phosphoproteinen ermöglichen. Darüber hinaus werden Best Practices für die ordnungsgemäße Analyse und Quantifizierung von Phosphoproteinen nach dem westlichen Blotting von Ganzzellproteinlysaten bereitgestellt. Diese Techniken, insbesondere in Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren und/oder murinen genetischen Modellen, können verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle verschiedener Phosphoproteine zu erhalten, die während der kraniofazialen Entwicklung aktiv sind.

Introduction

Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Bei der Maus beginnt dieser Prozess am embryonalen Tag (E) 9,5 mit der Bildung der frontonasalen Prominenz und Paaren von Oberkiefer- und Unterkieferprozessen, von denen jeder postmigratorische kraniale Neuralleistenzellen enthält. Die lateralen und medialen Nasenfortsätze entstehen aus der frontonasalen Prominenz mit dem Auftreten der Nasengruben und verschmelzen schließlich zu den Nasenlöchern. Darüber hinaus verschmelzen die medialen Nasenfortsätze und Oberkieferfortsätze zur Erzeugung der Oberlippe. Gleichzeitig wird die Palatogenese mit der Bildung von deutlichen Auswüchsen - den sekundären palatalen Regalen - von der oralen Seite der Oberkieferprozesse bei E11.5 eingeleitet. Im Laufe der Zeit wachsen die Gaumenböden auf beiden Seiten der Zunge nach unten, heben sich in eine entgegengesetzte Position über der Zunge und verschmelzen schließlich an der Mittellinie, um einen kontinuierlichen Gaumen zu bilden, der die Nasen- und Mundhöhle durch E16.51 trennt.

Diese morphologischen Veränderungen während der kraniofazialen Entwicklung werden durch verschiedene Signalwechselwirkungen initiiert und aufrechterhalten, zu denen häufig die Proteinphosphorylierung durch Kinasen gehört. Zum Beispiel werden Zellmembranrezeptoren, wie Unterfamilien von TGF)-β-Rezeptoren (transforming growth factor), einschließlich knochenmorphogenetischer Proteinrezeptoren (BMPRs), und verschiedener Rezeptortyrosinkinase (RTK) -Familien, bei Ligandenbindung und Aktivierung in kranialen Neuralleistenzellen autophosphoryliert 2,3,4 . Darüber hinaus wird der G-Protein-gekoppelte Transmembranrezeptor Smoothened in kranialen Neuralleistenzellen und kraniofazialen Ektoderm stromabwärts des Sonic Hedgehog (SHH) -Liganden, der an den Patched1-Rezeptor bindet, phosphoryliert, was zu einer geglätteten Akkumulation an der Ziliarmembran und SHH-Signalwegaktivierungführt 5. Solche Liganden-Rezeptor-Interaktionen können durch autokrine, parakrine und/oder juxtacrine Signalgebung in kraniofazialen Kontexten auftreten. Zum Beispiel ist bekannt, dass BMP6 während der Chondrozytendifferenzierung6 autokrin signalisiert, während der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) 8 im Rachenbogenektoderm exprimiert wird und an Mitglieder der FGF-Familie von RTKs bindet, die im Pharynxbogenmesenchym parakrin ausgedrückt werden, um die Strukturierung und das Auswachsen der Pharynxbögeneinzuleiten 7, 8,9,10 Darüber hinaus wird die Notch-Signalgebung sowohl in Chondrozyten als auch in Osteoblasten während der kraniofazialen Skelettentwicklung durch Juxtacrin-Signalisierung aktiviert, wenn Transmembran-Delta- und/oder Jagged-Liganden an Transmembran-Notch-Rezeptoren auf benachbarten Zellen binden, die anschließend gespalten und phosphoryliertwerden 11. Es gibt jedoch andere Liganden- und Rezeptorpaare, die für die kraniofaziale Entwicklung wichtig sind und die Flexibilität haben, sowohl bei der autokrinen als auch bei der parakrinen Signalgebung zu funktionieren. Als Beispiel wurde während der Morphogenese des murinen Zahns gezeigt, dass der von Plättchen abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF)-AA-Ligand autokrin signalisiert, den RTK PDGFRα im Schmelzorganepithel12 zu aktivieren. Im Gegensatz dazu werden bei murinen Gesichtsprozessen während der mittleren Schwangerschaft Transkripte, die für die Liganden PDGF-AA und PDGF-CC kodieren, im kraniofazialen Ektoderm exprimiert, während der PDGFRα-Rezeptor im zugrunde liegenden Schädelneuralkamm-abgeleiteten Mesenchym exprimiert wird, was zu einer parakrinen Signalgebung 13,14,15,16,17 führt. . Unabhängig vom Signalmechanismus führen diese Rezeptorphosphorylierungsereignisse häufig zur Rekrutierung von Adapterproteinen und/oder Signalmolekülen, die häufig selbst phosphoryliert werden, um intrazelluläre Kinasekaskaden wie den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) -Signalweg18,19 zu initiieren.

Die terminalen intrazellulären Effektoren dieser Kaskaden können dann eine Reihe von Substraten phosphorylieren, wie Transkriptionsfaktoren, RNA-bindende, zytoskelettale und extrazelluläre Matrixproteine. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 und Sox9 26 gehören zu den Transkriptionsfaktoren, die im Rahmen der kraniofazialen Entwicklung phosphoryliert werden. Diese posttranslationale Modifikation (PTM) kann sich unter anderem direkt auf die Anfälligkeit für alternative PTMs, Dimerisierung, Stabilität, Spaltung und/oder DNA-bindende Affinität auswirken20,21,25,26. Zusätzlich wird das RNA-bindende Protein Srsf3 im Rahmen der kraniofazialen Entwicklung phosphoryliert, was zu seiner Kerntranslokation27 führt. Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung von RNA-bindenden Proteinen ihre subzelluläre Lokalisation, Protein-Protein-Interaktionen, RNA-Bindung und / oder Sequenzspezifität beeinflusst28. Darüber hinaus kann die Phosphorylierung von Actomyosin während der kraniofazialen Entwicklung zu zytoskelettalen Umlagerungen führen 29,30, und die Phosphorylierung extrazellulärer Matrixproteine, wie kleine integrinbindende Liganden-N-verknüpfte Glykoproteine, trägt zur Biomineralisierung während der Skelettentwicklungbei 31. Durch die oben genannten und zahlreiche andere Beispiele ist es offensichtlich, dass es weitreichende Implikationen für die Proteinphosphorylierung während der kraniofazialen Entwicklung gibt. Durch Hinzufügen einer zusätzlichen Regulierungsebene wird die Proteinphosphorylierung durch Phosphatasen weiter moduliert, die Kinasen entgegenwirken, indem sie Phosphatgruppen entfernen.

Diese Phosphorylierungsereignisse sowohl auf Rezeptor- als auch auf Effektormolekülebene sind entscheidend für die Ausbreitung von Signalwegen und führen letztendlich zu Veränderungen der Genexpression im Zellkern, die spezifische Zellaktivitäten wie Migration, Proliferation, Überleben und Differenzierung vorantreiben, die zu einer ordnungsgemäßen Bildung des Säugetiergesichts führen. Angesichts der Kontextspezifität von Proteininteraktionen mit Kinasen und Phosphatasen, der daraus resultierenden Veränderungen der PTMs und ihrer Auswirkungen auf die Zellaktivität ist es wichtig, dass diese Parameter in einem physiologisch relevanten Umfeld untersucht werden, um ein vollständiges Verständnis des Beitrags von Phosphorylierungsereignissen zur kraniofazialen Entwicklung zu erhalten. Hier werden Beispiele für zwei Kontexte geliefert, in denen die Phosphorylierung von Proteinen und damit die Aktivierung von Signalwegen während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren untersucht werden kann: Gesichtsprozesse der Maus, insbesondere E11.5-Oberkieferprozesse, und kultivierte embryonale palatale Mesenchymzellen der Maus, die aus E13.5 sekundären palatalen Regalen stammen - sowohl primär32 als auch immortalisiert33 . Bei E11.5 verschmelzen die Oberkieferfortsätze mit den lateralen und medialen Nasenfortsätzen1 und stellen damit einen kritischen Zeitpunkt während der kraniofazialen Entwicklung der Maus dar. Darüber hinaus wurden hier Oberkieferprozesse und Zellen aus den palatalen Regalen ausgewählt, da letztere Strukturen Derivate der ersteren sind, was den Forschern die Möglichkeit bietet, die Proteinphosphorylierung in vivo und in vitro in verwandten Kontexten zu untersuchen. Dieses Protokoll gilt jedoch auch für alternative Gesichtsprozesse und Entwicklungszeitpunkte.

Ein kritisches Problem bei der Untersuchung phosphorylierter Proteine besteht darin, dass sie während der Proteinisolierung durch reichlich vorhandene Umweltphosphatasen leicht dephosphoryliert werden können. Um diese Barriere zu überwinden, werden Anpassungen und Modifikationen an Standardlabormethoden diskutiert, die eine Isolierung phosphorylierter Proteine ermöglichen. Darüber hinaus werden Best Practices für die ordnungsgemäße Analyse und Quantifizierung phosphorylierter Proteine bereitgestellt. Diese Techniken, insbesondere in Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren und/oder murinen genetischen Modellen, können verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle verschiedener Signalwege zu gewinnen, die während der kraniofazialen Entwicklung aktiv sind.

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Protocol

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Anschutz Medical Campus der University of Colorado genehmigt und in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Weibliche 129S4-Mäuse im Alter von 1,5-6 Monaten, die bei einer subthermoneutralen Temperatur von 21-23 ° C untergebracht waren, wurden für die Embryonenernte verwendet. Ein schematischer Workflow des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten, Software, Reagenzien und Tieren, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Ernte von E11.5 Mausembryonen

  1. Euthanasie schwangere weibliche Maus 11,5 Tage nach dem Nachweis eines Vaginalpfropfens während der zeitgesteuerten Paarung in einer CO 2-Kammer unter Verwendung der IACUC-zugelassenen CO 2-Flussrate, die für eine Verschiebung von etwa 50% (2,95 l / min ineiner 360 in 3 Kammer) und die Dauer der Exposition erforderlich ist (siehe Materialtabelle). Führen Sie Zervixdislokationen als sekundäre Methode der Euthanasie durch. Fahren Sie sofort mit der Sezierung fort.
  2. Legen Sie den Mauskörper mit der Bauchseite nach oben auf ein Sezierbrett. Besprühen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol.
  3. Öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie die Haut annektieren und anheben Sie sie mit gerader Semken-Pinzette zur Vaginalöffnung und schneiden Sie die angehobene Haut und die darunter liegenden Schichten mit einer geraden chirurgischen Schere in einem Winkel von 45 ° auf beiden Seiten, um eine "V" -Form zu erzeugen, die sich etwa auf halbem Weg zwischen den Vorder- und Hinterbeinen auf jede laterale Oberfläche erstreckt.
  4. Mit der Semken-Pinzette eines der Gebärmutterhörner greifen und mit der chirurgischen Schere unterhalb des Eileiters und oberhalb des Gebärmutterhalses schneiden. Schneiden Sie das Mesometrium weg, um eine vollständige Entfernung des Gebärmutterhorns zu ermöglichen.
  5. Überführen Sie das sezierte Uterushorn auf 10 ml histologische phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4 monobasic, 10,14 mM Na2HPO 4 dibasic, pH7,4] in einer 10 cm Petrischale.
  6. Entfernen Sie das zweite Uterushorn auf der gegenüberliegenden Seite der Bauchhöhle mit dem gleichen Verfahren, das in den Schritten 1.4-1.5 beschrieben ist.
  7. Legen Sie die 10 cm große Petrischale mit beiden Uterushörnern auf Eis, wenn Sie nicht sofort mit der Sezierung einzelner Embryonen fortfahren (d.h. wenn eine zweite weibliche Maus seziert wird).
  8. Sezieren Sie unter einem sezierenden Stereomikroskop vorsichtig jeden Embryo mit einer feinen Pinzette von Dumont #5 aus den Gebärmutterhörnern. Ziehen Sie das Myometrium, die Dezidua und das Chorion langsam weg. Reißen und entfernen Sie das relativ durchsichtige Amnion, das den Embryo umgibt, und durchtrennen Sie die Nabelschnur, die den Embryo mit der Plazenta verbindet.
  9. Transfer jedes sezierten Embryos auf 2,5 ml Histologie PBS in einem individuellen Brunnen einer 12-Well-Zellkulturplatte auf Eis mit einer geschnittenen Plastiktransferpipette oder einem Embryolöffel.
    HINWEIS: Wenn Sie mit einem Wurf arbeiten, der Embryonen von mehr als einem Genotyp enthalten kann, bewahren Sie das Amnion, das jeden Embryo umgibt, für die Genotypisierung auf, indem Sie jeden in sein eigenes vorbeschriftetes 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis legen.

2. Sezieren von Oberkieferfortsätzen aus E11.5-Mausembryonen

  1. Bereiten Sie drei 10-cm-Petrischalen mit 10 ml Histologie-PBS vor und bewahren Sie sie auf Eis auf, um sie in Rotation zwischen Embryonen zu verwenden.
  2. Übertragen Sie einen Embryo aus einer individuellen Vertiefung der 12-Well-Zellkulturplatte auf eine der 10 cm Petrischalen mit Histologie-PBS auf Eis mit einer geschnittenen Plastiktransferpipette oder einem Embryolöffel.
  3. Trennen Sie unter dem Seziermikroskop jeden Oberkieferfortsatz mit der feinen Pinzette vom Gesicht. Schneiden Sie zunächst die vordere Seite eines Oberkieferfortsatzes entlang der natürlichen Vertiefung ab, die den lateralen Nasenfortsatz und den Oberkieferfortsatz trennt (Abbildung 2A).
  4. Zweitens schneiden Sie die hintere Seite des Oberkieferfortsatzes entlang der natürlichen Einkerbung, die den Oberkieferfortsatz und den Unterkieferfortsatz trennt (Abbildung 2A).
  5. Drittens, um den Oberkieferprozess vollständig zu trennen, machen Sie einen vertikalen Schnitt von der vorderen zur hinteren Seite des Oberkieferfortsatzes auf der Augenseite des Oberkieferfortsatzes, wo die oben genannten natürlichen Einkerbungen enden (Abbildung 2A-C).
  6. Wiederholen Sie diese drei Schnitte für den Oberkieferfortsatz auf der gegenüberliegenden Seite des Gesichts.
  7. Übertragen Sie das sezierte Paar von Oberkieferfortsätzen und einen kleinen Tröpfchen von etwa 30 μL Histologie-PBS mit einer 9-Zoll-Pasteur-Pipette mit einer kleinen 2-ml-Latexflasche auf eine beschriftete 35-mm-Petrischale auf Eis (Abbildung 2D).
  8. Befolgen Sie die Schritte 2.3-2.7 für jeden Embryo und drehen Sie die drei 10 cm langen Petrischalen mit Histologie-PBS auf Eis zwischen den Embryonen. Legen Sie einzelne Paare von sezierten Oberkieferfortsätzen in separate 35 mm Petrischalen auf Eis.
    HINWEIS: Die Trennung des Oberkieferfortsatzes Ektoderm und Mesenchym (Schritte 2.9-2.17) kann nach der Sezierung der Oberkieferfortsätze aller Embryonen im Wurf durchgeführt werden. Wenn intakte Oberkieferfortsätze, die sowohl das Ektoderm als auch den Mesenchym enthalten, erwünscht sind, fahren Sie mit Schritt 2.18 fort.
  9. Bereiten Sie 250 μL frisches 2% Trypsin in Gewebekultur PBS und 250 μL 10% fetales Rinderserum (FBS) in Gewebekultur PBS vor und lagern Sie es auf Eis.
  10. Geben Sie ein zweites, kleines Tröpfchen von etwa 30 μL 2% Trypsin in die 35-mm-Petrischale, getrennt von dem ersten, kleinen Tröpfchen der Histologie PBS, das die Oberkieferprozesse enthält. Übertragen Sie das Paar der Oberkieferfortsätze mit der Pasteur-Pipette auf das kleine Tröpfchen von 2% Trypsin (Abbildung 2D).
  11. Die Schale 15 min auf Eis ausbrüten.
  12. Die 35 mm Petrischale aus dem Eis nehmen und unter das Seziermikroskop stellen.
  13. Mit der feinen Pinzette ziehen Sie langsam und vorsichtig die Schicht des Ektoderms von jedem Oberkieferprozess ab (Abbildung 2E).
    HINWEIS: Wenn sich das Ektoderm in einer intakten Schicht nicht vom Mesenchym trennt, inkubieren Sie 2% Trypsin bei Raumtemperatur (RT) für bis zu 5 weitere Minuten, bevor Sie mit der Trennung fortfahren. Wenn das Gewebe im 2% igen Trypsin zu zerfallen beginnt, bewegen Sie die Oberkieferprozesse wie unten beschrieben auf das 10% FBS, um das Trypsin zu neutralisieren und die Trennung von Ektoderm und Mesenchym zu beenden.
  14. Sobald der Oberkieferfortsatz Ektoderm und Mesenchym getrennt sind (Abbildung 2F), übertragen Sie die gewünschten Gewebe aus dem Paar der Oberkieferprozesse mit der Pasteur-Pipette auf ein drittes, kleines Tröpfchen von etwa 30 μL von 10% FBS - getrennt von den beiden vorherigen kleinen Tröpfchen - (Abbildung 2D).
  15. Stellen Sie die 35 mm Petrischale auf Eis, um die Trypsinisierung zu stoppen.
  16. Inkubieren Sie das Oberkieferprozessgewebe auf Eis in 10% FBS für 1-2 min und übertragen Sie dann das Gewebe aus beiden Oberkieferprozessen auf ein viertes, kleines Tröpfchen von etwa 30 μL vorgekühlter Histologie PBS auf Eis - getrennt von den drei vorherigen kleinen Tröpfchen - mit der Pasteur-Pipette (Abbildung 2D).
  17. Inkubieren Sie das Oberkieferprozessgewebe in Histologie PBS für 1 Minute, während Sie das Histologie-PBS vorsichtig um das Oberkieferprozessgewebe mit der Spitze der Pasteur-Pipette wirbeln, um sicherzustellen, dass alle FBS vom Gewebe abgespült werden.
  18. Übertragen Sie das Paar Oberkieferprozessgewebe mit der Pasteur-Pipette auf ein markiertes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, wodurch der Transfer von Histologie-PBS minimiert wird. Entfernen Sie überschüssiges Histologie-PBS im 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit der Pasteur-Pipette.
  19. Befolgen Sie die obigen Schritte, um die Oberkieferprozesse von jedem Embryo im Wurf zu sezieren.
  20. Verarbeiten Sie die Proben sofort, um Ganzzellproteinlysate (unten) zu isolieren oder langfristig bei -80 °C zu lagern. Vor der Langzeitlagerung das 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem Bad mit 100% EtOH auf Trockeneis für 5 min einfrieren.

3. Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Oberkieferprozessen der Maus

  1. Waren Oberkiefer zuvor bei -80 °C eingefroren, tauen Sie sie auf Eis auf.
  2. 0,1 ml eiskalten NP-40-Lysepuffer (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; gelagert bei 4 °C) mit Protease- und Phosphataseinhibitoren (1x kompletter Mini-Proteaseinhibitor-Cocktail [in Wasser gelöst; gelagert bei -20 °C], 1 mM PMSF [gelöst in Isopropanol; gelagert bei 4 °C], 10 mM NaF [gelagert bei -20 °C; Frost/Tauwetter vermeiden], 1 mMNa3VO 4 [gelagert bei -20 °C], 25 mM β-Glycerophosphat [gelagert bei4 °C]) unmittelbar vor der Verwendung auf Eis hinzugefügt.
    HINWEIS: Die Zellfraktionierung kann alternativ durchgeführt werden, um zytoplasmatische, nukleare, Membran- oder mitochondriale Proteinfraktionen zu isolieren.
  3. Mit einem 200 μL Pipetman 10 Mal auf und ab pipettieren.
  4. Wirbeln Sie für 10 s und pipettieren Sie dann 10 Mal mit einem 200-μL-Pipetman auf und ab. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen.
  5. Inkubieren Sie bei 4 °C für 2 h und drehen Sie sich Ende über Ende mit einem 1,5 ml/2 ml Paddel mit einem Rohrrevolver.
  6. Die Proben werden bei 13.500 × g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.
  7. Sammeln Sie den Überstand zu einem neuen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mit einem 200-ml-Pipetten.
  8. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Proteinassay-Kit unter Verwendung von 10 μL Proteinlysat + 10 μL NP-40-Lysepuffer für experimentelle Proben und 3-5 Verdünnungen von Rinderserumalbumin (Fraktion V) (BSA) im NP-40-Lysepuffer in einem Bereich von 0,25-2,0 mg / ml als Proteinstandards.
  9. Fahren Sie mit der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) fort (Schritt 5) oder frieren Sie die restlichen Lysate schnell auf Trockeneis ein und lagern Sie sie langfristig bei -80 °C.

4. Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus primären und/oder immortalisierten embryonalen mesenchymzellen (MEPM) der Maus

HINWEIS: Die Isolierung und Kultur von primären MEPM-Zellen aus E13.5-Mausembryonen und immortalisierten MEPM-Zellen wurde zuvorbeschrieben 32,33,34. Die Stimulation von Zellen mit Wachstumsfaktor (Schritte 4.1-4.7) kann vor der Zelllyse durchgeführt werden. Wenn nicht stimulierte Zellen gewünscht werden, fahren Sie mit Schritt 4.8 unten fort.

  1. Aspirieren Sie das Wachstumsmedium [Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 10% FBS] aus den MEPM-Zellen bei ~70% Zusammenfluss in einer 6 cm Zellkulturschale mit einer 5,75" Pasteur-Pipette, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist.
  2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml Gewebekultur-PBS.
  3. 3 ml Serumhungermedium [DMEM mit 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 0,1% FBS] in einem 37 °C warmen Wasserbad zugeben.
  4. Inkubieren bei 37 °C und 5% CO2 für 23 h.
  5. Ersetzen Sie das Serumhungermedium durch 3 ml frisches, vorgewärmtes Serumhungermedium.
  6. Inkubieren bei 37 °C und 5% CO2 für 1 h.
  7. Stimulieren Sie die Zellen mit dem Wachstumsfaktor Ihrer Wahl in einer empirisch bestimmten Konzentration für die gewünschte Zeitspanne.
  8. Aspirieren Sie das Medium aus den MEPM-Zellen bei 80% -100% Konfluenz mit einer 5,75" Pasteur-Pipette, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist.
  9. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Gewebekultur-PBS (1 ml für eine 6 cm Zellkulturschale); Kippen Sie die Platte während der letzten Wäsche zur Seite, um sicherzustellen, dass das gesamte PBS der Gewebekultur abgesaugt wird.
  10. Lysieren Sie die Zellen, indem Sie einen eiskalten NP-40-Lysepuffer mit Protease- und Phosphatasehemmern hinzufügen, die unmittelbar vor dem Gebrauch hinzugefügt werden (0,1 ml für eine 6 cm Zellkulturschale) auf Eis.
  11. Inkubieren Sie die Platte für 5 Minuten auf Eis mit einer Rotation von etwa jeder Minute, um eine vollständige Abdeckung der Platte zu gewährleisten.
  12. Kratzen Sie die Zellen mit einem vorgekühlten Zelllifter von der Platte und übertragen Sie die Zellsuspension auf ein vorgekühltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
  13. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 4 °C für 30 Minuten, während Sie sich Ende über Ende mit einem 1,5 ml/2 ml Paddel mit einem Rohrrevolver drehen.
  14. Fahren Sie mit den oben beschriebenen Schritten 3.6-3.9 fort.

5. Westliches Blotting von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder MEPM-Zellen für Phosphoproteine

  1. Bereiten Sie Ganzzellprotein-Lysatproben für SDS-PAGE vor.
    1. Bestimmen Sie die Menge des zu ladenden Proteins, abhängig von der Proteinhäufigkeit im Gewebe / in der Zelle; 12,5 μg reichen in der Regel für robust exprimierte Proteine in Ganzzellproteinlysaten.
    2. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Laemmli-Puffer [20% Glycerin, 4% SDS, 0,004% Bromphenolblau, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] mit 10% β-Mercaptoethanol hinzu, das unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt wird.
      ACHTUNG: β-Mercaptoethanol ist haut- oder augenätzend, giftig, gefährlich, wenn es verschluckt wird, und hat aquatische Toxizität. Behandeln Sie Handschuhe, einen Laborkittel, einen Gesichtsschutz und eine Schutzbrille in einer chemischen Abzugshaube. Entsorgen Sie gemäß den Richtlinien für Umweltgesundheit und Sicherheit.
    3. Mischen durch Wirbeln.
    4. Erhitzen Sie die Proben bei 100 °C für 5 min in einem Mini-Trockenbad.
    5. Mischen Sie durch Vortexing und legen Sie die Proben auf Eis.
    6. Zentrifuge bei 9.400 × g für 5 min bei 4 °C.
    7. Die Proben vor dem Einlegen in SDS-PAGE Gel kurz auf Eis legen oder bei -20 °C langfristig lagern.
  2. Führen Sie SDS-PAGE mit einer Elektrophoresezelle mit einem 4%-15% vorgefertigten Proteingel und Elektrophoresepuffer35 durch.
  3. Elektrotransfer der Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran unter Verwendung eines Transferpuffers mit 0%-20% Methanol (0%-10% für Proteine größer als 100 kDa; 20% für Proteine unter 100 kDa), die unmittelbar vor der Verwendung35 zugegeben werden.
  4. Blockieren Sie die Membran und Sonde für Phosphoprotein von Interesse.
    1. Nach dem Transfer waschen Sie die Membran in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] für 5 min in einer westlichen Blot-Box.
    2. Inkubieren Sie die Membran in 5 ml Sperrpuffer [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; gut gemischt und durch einen 25 mm Spritzenfilter mit 0,2 μm Poren mit einer 10 ml Spritze mit Luerspitze] für 1 h in einer Western Blot Box mit Rührung auf einem Orbitalschüttler filtriert.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei der Charakterisierung von Phosphoproteinen keine Milch als Blockiermittel, da sie das Phosphoprotein Casein enthält, das ein hohes, unspezifisches Hintergrundsignal verursachen kann.
    3. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 min in TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] in einer Western Blot-Box mit Rührung auf einem Orbitalschüttler.
    4. Inkubieren Sie die Membran in 5 ml primärem Antikörper, verdünnt im blockierenden Puffer bei 4 ° C über Nacht in einem 50 ml konischen Röhrchen mit einem 50 ml Paddel mit einem Röhrenrevolver.
      HINWEIS: Die geeignete Konzentration für Western Blotting finden Sie im Antikörper-Datenblatt.
    5. Waschen Sie die Membran dreimal bei RT für jeweils 5 min in TBS-T in einer westlichen Blot-Box mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler.
    6. Inkubieren Sie die Membran in 5 ml geeigneter Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierter sekundärer Antikörper, verdünnt im Blockpuffer für 1 h in einer westlichen Blot-Box mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler.
    7. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 min in TBS-T in einer westlichen Blot-Box mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler.
    8. Inkubieren Sie die Membran in ECL-Western-Blotting-Substrat (Enhanced Chemiluminescence) [Mischen gleicher Volumina aus den Flaschen 1 und 2; jeweils 0,5 ml für große (8,6 cm x 6,7 cm) Membranen] für 1 min und stellen Sie sicher, dass die gesamte Membran kontinuierlich dem ECL-Western-Blotting-Substrat ausgesetzt wird.
    9. Entwässern Sie die Membran des überschüssigen ECL-Western-Blotting-Substrats und entwickeln Sie sich sofort mit einem Chemilumineszenz-Imager.
  5. Entfernen Sie die Membran und resonde für das gesamte Protein von Interesse.
    1. Legen Sie die PVDF-Membran in einen transparenten Beutel mit Polyethylenauskleidung, der 5 ml Stripping-Puffer [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] enthält, wobei unmittelbar vor Gebrauch 8 μL/ml β-Mercaptoethanol hinzugefügt werden.
    2. Inkubieren bei 50 °C für 30 min mit Schaukeln in einem Hybridisierungsofen bei 11 Umdrehungen pro Minute.
    3. Waschen Sie die Membran dreimal bei RT für jeweils 5 min in TBS-T in einer westlichen Blot-Box mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler.
    4. Fahren Sie mit den oben beschriebenen Schritten 5.4.2-5.4.9 fort.
  6. Quantitieren Sie die Western-Blot-Banddichten mit der ImageJ-Software und normalisieren Sie die Spiegel des phosphorylierten Proteins von Interesse auf die Spiegel des Gesamtproteinsvon Interesse 36.

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Representative Results

Beim Versuch, die Phosphorylierung von Proteinen zu charakterisieren, die aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder kultivierten palatalen Mesenchymzellen isoliert wurden, zeigen die repräsentativen Ergebnisse idealerweise eine deutliche, reproduzierbare Bande nach westlichem Blotting mit einem Anti-Phosphoprotein-Antikörper, der auf oder nahe der Höhe der entsprechenden Gesamtproteinbande verläuft (Abbildung 3 ). Wenn jedoch eine ausgedehnte Phosphorylierung des Proteins auftritt, kann es zu einer leichten Aufwärtsverschiebung der Phosphoproteinbande im Vergleich zur Gesamtproteinbande kommen. Wenn in einem Gewebe mehrere Isoformen eines Proteins existieren, von denen jede phosphoryliert ist, oder wenn das Protein variabel zusätzlichen PTMs ausgesetzt ist, können mehrere Banden im westlichen Blot mit einem Anti-Phosphoprotein-Antikörper auftreten. Wenn trotz des Detekts des interessierenden Gesamtproteins kein Signal für das interessierende Phosphoprotein beobachtet wird, ist das Protein möglicherweise nicht im gewählten Kontext phosphoryliert, oder es kann ein technisches Problem mit dem Protokoll aufgetreten sein. Im letzteren Fall kann das westliche Blotting von Ganzzelllysaten mit Anti-Phosphoserin/Threonin und/oder Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern durchgeführt werden, um anzuzeigen, ob das Protokoll wie erwartet funktioniert hat. Da die Phosphorylierung von Proteinen in kraniofazialen Geweben reichlich vorhanden ist25,37, zeigt das Vorhandensein mehrerer Phosphoproteinbanden den erfolgreichen Abschluss des Protokolls und genaue Ergebnisse des ersten Screenings an.

Es ist oft nützlich, Phosphoproteinspiegel zwischen Wildtyp- und mutiertem Embryonengewebe oder als Reaktion auf die Behandlung von kultivierten Zellen zu vergleichen. Im ersten Fall würde ein Unterschied in den Phosphoproteinspiegeln zwischen den Genotypen als Unterschied in den Bandintensitäten für das interessierende Phosphoprotein mit ähnlichen Spiegeln des interessierenden Gesamtproteins27 erscheinen. Im letzteren Fall würden repräsentative Ergebnisse erhöhte Phosphoproteinbandenintensitäten im Vergleich zu denen unbehandelter Zellen bei Behandlung mit beispielsweise einem Wachstumsfaktor (Abbildung 3) und verminderte Bandintensitäten nach der Behandlung mit einem Kinase-Inhibitor27,37 zeigen. Zur Quantifizierung dieser Unterschiede würden die Konzentrationen des interessierenden Phosphoproteins auf die Werte des interessierenden Gesamtproteins normalisiert. Es wird erwartet, dass die Konzentrationen des interessierenden Gesamtproteins zwischen den Proben relativ gleich sind, ein Befund, der durch separates Western Blotting mit einem oder mehreren Antikörpern gegen Belastungs- und Expressionskontrollproteine wie β-Tubulin, β-Aktin und/oder GAPDH bestätigt werden sollte (Abbildung 3). Für die Wachstumsfaktorbehandlung von kultivierten Zellen werden positive Ergebnisse wahrscheinlich einen Anstieg der Phosphoproteinspiegel in einem relativ kurzen Zeitrahmen von 2-15 Minuten nach der Stimulation zeigen (Abbildung 3). Es sollte wenig oder keine Phosphorylierung in Abwesenheit einer Wachstumsfaktorbehandlung geben, es sei denn, es spielen andere Faktoren eine Rolle, die zur Phosphorylierung des Proteins führen, Beispiele hierfür sind die endogene Expression von Wachstumsfaktoren durch die Zellen, die Phosphorylierung des Proteins durch ein anderes Signalmolekül, das von den Zellen exprimiert wird, und / oder eine Mutation, die zu einer konstitutiven Phosphorylierung des Proteins führt, wenn keine Wachstumsfaktorbehandlung erfolgt. Diese Faktoren sollten bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Zu den negativen Ergebnissen gehört keine Änderung der Phosphorylierung als Reaktion auf einen zeitlichen Verlauf der Wachstumsfaktorbehandlung, in diesem Fall sollte das Protokoll für die Aufrechterhaltung von Phosphoproteinen wie oben beschrieben bewertet werden. Darüber hinaus kann der Prozess des Membranstrippings gelegentlich den Gesamtproteinspiegel beeinflussen und reduzieren. In diesem Fall würden entgegengesetzte Trends für die Menge des interessierenden Phosphoproteins im Vergleich zum Gesamtprotein von Interesse beobachtet. Dies ist suboptimal, da erwartet wird, dass die Gesamtproteinspiegel über die Proben hinweg relativ gleich sind, vorausgesetzt, die gleiche Belastung und Expression des Proteins, wobei Änderungen nur bei den Phosphoproteinspiegeln auftreten.

Figure 1
Abbildung 1: Workflow zur Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse. Maxilläre Prozesse werden aus E11.5-Mausembryonen auf Eis seziert und/oder das Medium wird aus kultivierten MEPM-Zellen mit 80% -100% Konfluenz aspiriert, die anschließend zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen werden. Ganzzellproteinlysate werden unter Verwendung von Lysepuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren isoliert, gefolgt von SDS-PAGE, Elektrotransfer zu einer PVDF-Membran, Blockierung der Membran mit BSA, Sondierung nach dem Phosphoprotein, Abstreifen der Membran, Untersuchung nach Gesamtprotein und Quantifizierung von Bandintensitäten. Abkürzungen: LNP = lateraler Nasenfortsatz; MxP = Oberkieferfortsatz; MdP = Unterkieferprozess; PA2 = zweiter Rachenbogen; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; FBS = fetales Rinderserum; PS = palatales Regal; MEPM = Maus embryonaler palataler Mesenchym; SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; PVDF = Polyvinylidenfluorid; p-P = phosphoryliertes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Dissektion von Oberkieferfortsätzen. (A) Seitliche Ansicht eines E11.5-Mausembryos mit den drei Schnitten (gekennzeichnet mit 1-3), die erforderlich sind, um den MxP von dem durch farbige Linien gekennzeichneten Gesicht zu trennen. (B) Seitliche Ansicht eines E11.5-Mausembryos nach Entfernung von MxP, umrandet mit einer gestrichelten schwarzen Linie. (C) Sezierte MxP. (D) Eine 35-mm-Petrischale mit kleinen Tröpfchen PBS, 2% Trypsin und 10% FBS zur optionalen Trennung von MxP-Ektoderm und Mesenchym. (E) MxP mit Ect teilweise getrennt von Mes. f) getrennte MxP ect und mes. Maßstäbe: 1 mm (A-C,E,F), 10 mm (D). Abkürzungen: LNP = lateraler Nasenfortsatz; MxP = Oberkieferfortsatz; MdP = Unterkieferprozess; PA2 = zweiter Rachenbogen; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; FBS = fetales Rinderserum; Mes = Mesenchym; Ect = Ektoderm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: PDGFRβ und MAPK-Effektor Erk1/2-Phosphorylierung als Reaktion auf die PDGF-BB-Ligandenbehandlung von immortalisierten MEPM-Zellen. Western Blot-Analyse von Ganzzelllysaten aus immortalisierten MEPM-Zellen nach einem Zeitverlauf von 10 ng/mL PDGF-BB-Ligandenstimulation von 2 min bis 15 min mit Anti-Phospho-PDGFR-, Anti-PDGFRβ-, Anti-Phospho-Erk1/2-, Anti-Erk1/2- und Anti-β-Tubulin (E7)-Antikörpern. Mehrere Banden in Anti-PDGFRβ-Blot repräsentieren differentiell glykosylierte Proteine. Abkürzungen: PDGF = Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor; WCL = Ganzzelllysat; kD = Kilodalton; WB = Western Blot; p-PDGFR = phosphoryliertes PDGFR; PDGFR = PDGF-Rezeptor; p-Erk = phosphoryliertes Erk; Erk = extrazelluläre signalregulierte Kinase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es den Forschern, kritische phosphorylierungsabhängige Signalereignisse während der kraniofazialen Entwicklung robust und reproduzierbar zu untersuchen. Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll, die eine ordnungsgemäße Erfassung von Daten und die Analyse der Ergebnisse sicherstellen. Unabhängig davon, ob Phosphoproteine aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder kultivierten palatalen Mesenchymzellen isoliert werden, ist es unerlässlich, sich schnell und effizient zu bewegen, während alle Reagenzien und Materialien auf Eis gehalten werden, wenn dies angezeigt ist. Die niedrige Temperatur des Eises verlangsamt die Stoffwechselaktivität in den Zellen, wodurch phosphorylierte Proteine vor Phosphataseaktivität38 geschützt werden und eine hohe Proteinausbeute aufrechterhalten wird. Die Verwendung von drei separaten 10 cm Petrischalen während der Dissektion von Oberkieferprozessen stellt sicher, dass alle Dissektionen in ausreichend vorgekühlter Histologie PBS stattfinden. In diesem Zusammenhang ist ein zusätzlicher, wesentlicher Bestandteil dieses Proteinisolationsprotokolls die Verwendung von Phosphatase-Inhibitoren in allen Lysepuffern. Diese Reagenzien schützen auch Phosphatgruppen auf dem interessierenden Protein39,40 und erhalten die Integrität des phosphorylierten Proteins für die weitere Analyse durch Western Blotting.

Dieses Protokoll führt zusätzlich Modifikationen ein, die spezifischere Analysen von Phosphoproteinen in Gewebe und kultivierten Zellen ermöglichen. Bei der Sezierung von Gesichtsprozessen wurden optionale Schritte zur Trennung des Oberkieferfortsatzes Ektoderm und Mesenchym hinzugefügt, um die Untersuchung der kompartimentspezifischen Proteinphosphorylierungzu ermöglichen 27. Um eine effiziente Isolierung dieser Gewebeschichten zu testen, können Benutzer die Expression von Genen beurteilen, die im Ektoderm angereichert sind, wie Gabrp, Trim29, Esrp1 und Mpzl2, und / oder von Genen, die im Mesenchym angereichert sind, wie Aldh1a2 und AW55198441. Zur Isolierung von Phosphoproteinen aus kultivierten palatalen Mesenchymzellen wurden optionale Schritte zur Stimulation des Wachstumsfaktors hinzugefügt. In diesem Fall sollten die Zellen in einem Medium, das 0,0% -0,1% Serum enthält, ausgehungert werden. Standardseren wie FBS enthalten zahlreiche Wachstumsfaktoren42, die die Ergebnisse der exogenen Wachstumsfaktorstimulation verwickeln können. So bereitet vorübergehender Serummangel die Zellen darauf vor, auf eine akute Wachstumsfaktorbehandlung zu reagieren.

Dieses Protokoll bietet auch optimierte Methoden zur genauen Quantifizierung der Proteinphosphorylierung. In den westlichen Blotting-Schritten ist es wichtig, die PVDF-Membran mit BSA anstelle von Milch zu blockieren, die in vielen westlichen Standard-Blotting-Techniken verwendet wird. Dieser Wechsel ist zwingend erforderlich, da Milch das Phosphoprotein Casein43 enthält und zu einem hohen Hintergrundsignal bei der Analyse anderer Phosphoproteine führt. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Konzentrationen des phosphorylierten Proteins von Interesse gegen die Spiegel des gesamten interessierenden Proteins quantifiziert werden und nicht gegen die Spiegel eines Standard-Belastungskontrollproteins. Auf diese Weise können alle Veränderungen in der Expression des gesamten interessierenden Proteins bei der Quantifizierung der Phosphoproteinspiegel berücksichtigt werden. Wenn die Proteinausbeute im Allgemeinen zu niedrig für einen genauen Phosphoproteinnachweis ist, können Gewebeproben aus demselben Stadium und Genotyp27 gepoolt werden, und / oder Zellen können in größeren Zellkulturgefäßen als den hier beschriebenen für zukünftige Experimente gezüchtet werden. Alternativ, wenn das Stripping die Gesamtproteinspiegel konsequent zu verändern scheint, können zwei Ansätze gewählt werden, um das beschriebene Protokoll zu modifizieren, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen: 1) Verwendung eines Antikörperschemas, das Anti-Phosphoprotein- und Antiprotein-Antikörper verwendet, die in verschiedenen Wirtsspezies erzeugt werden, kombiniert mit zwei speziesspezifischen sekundären Antikörpern und getrennt (bei Verwendung von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern) oder gleichzeitig (bei Verwendung von fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpern) Entwicklung der Blots; oder 2) gleichzeitige Verarbeitung von zwei identischen Membranen - die erste inkubiert mit einem Anti-Phosphoprotein-Antikörper, die zweite mit einem Anti-Protein-Antikörper. In beiden alternativen Ansätzen sollten die Gehalte des phosphorylierten Proteins von Interesse noch gegen die Konzentrationen des gesamten interessierenden Proteins quantifiziert werden. Da die Phosphorylierung ein dynamischer Prozess ist, sollten die Phosphoproteinspiegel in mindestens drei biologischen Replikaten pro Zustand beurteilt werden. Gesichtsbehandlungsgewebe der Maus oder primäre MEPM-Zellen, die aus einem einzelnen Embryo oder einem individuellen Pool von Embryonen aus demselben Stadium und Genotyp stammen, würden eine einzige biologische Replikation darstellen. In ähnlicher Weise würden unsterbliche MEPM-Zellen verschiedener Passagen biologische Replikate darstellen. Wenn kultivierte Zellen mit Wachstumsfaktor behandelt werden, sollte die Behandlung biologischer Replikate an verschiedenen Tagen unter Verwendung separater Aliquots des Wachstumsfaktors erfolgen.

Es gibt zwei Einschränkungen des hier vorgestellten Ansatzes, die im Folgenden erörtert werden und vor Beginn des Protokolls berücksichtigt werden sollten. Die erste betrifft den Dynamikbereich von ECL. Das in diesem Protokoll empfohlene ECL-Western-Blotting-Substrat hat einen großen Dynamikbereich mit einer geringen Pikogrammempfindlichkeit. Empirisch können jedoch Proteine mit geringer Häufigkeit oder niedrigem Phosphorylierungsstatus mit diesen Methoden schwer nachzuweisen sein. Wenn phosphorylierte Proteine nach 20 Minuten ECL-Substratinkubation nicht nachweisbar sind, wird empfohlen, die Membran wie beschrieben in TBS-T zu waschen und stattdessen die Membran in einem hochempfindlichen ECL-Western-Blotting-Substrat mit geringer Femtogrammempfindlichkeit zu inkubieren. Alternativ können fluorophorkonjugierte Sekundärantikörper verwendet werden, die einen größeren Dynamikumfang bieten als enzymbasierte Ansätze wie ECL44. Eine zweite Einschränkung ergibt sich aus dem Normalisierungsverfahren. Wie ausführlich beschrieben, wird empfohlen, das Signal des interessierenden Phosphoproteins auf das Signal des gesamten interessierenden Proteins zu normalisieren. Dieser Prozess beruht jedoch auf der Annahme, dass sich die Konzentrationen des gesamten interessierenden Proteins zwischen den Proben nicht ändern, was oft durch separates Western Blotting unter Verwendung von Antikörpern gegen ein oder mehrere Haushaltsproteine bestätigt wird. Eine wichtige Überlegung ist jedoch, dass sich die Gehalte an Haushaltsproteinen zwischen den Proben aufgrund ungleichmäßiger Belastung, unvollständiger Übertragung auf die Membran und / oder Unterschieden in der Proteinexpression ändern können. Um die Genauigkeit während der Normalisierung zu verbessern, können Forscher erwägen, eine echte Gesamtproteinfärbung wie Ponceau S45 zu implementieren, die alle Proteine in jeder Gasse der Membran nachweist und diese technischen Einschränkungen berücksichtigt.

Insgesamt überwindet dieses Protokoll das Problem der Proteindephosphorylierung, das häufig während der Proteinisolierung auftritt. Eine genaue Analyse der Proteinphosphorylierung wird den Forschern helfen, die Rolle phosphorylierter Proteine während der kraniofazialen Entwicklung genauer zu verstehen. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll robuste und effiziente Methoden zur Analyse des phosphorylierten Proteingehalts in physiologisch relevanten Kontexten, die jeweils ihre eigenen Vorteile haben. Während Proteinlysate aus embryonalem Gewebe eine statische Momentaufnahme der Proteinphosphorylierung in vivo liefern, liefert die Implementierung kultivierter Zellen Daten über dynamische Phosphorylierungsreaktionen auf akute Behandlungen. Dieses Protokoll ist in der Lage, Ergebnisse und Hypothesen, die aus großen Datensätzen stammen, z. B. Massenspektrometrie37 und RNA-Sequenzierung27, direkt zu bestätigen und zu erweitern, um neue Wechselwirkungen innerhalb von Signalnetzwerken zu entdecken. Wichtig ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um zu untersuchen, wie Störungen bei der Phosphorylierung die intrazelluläre Signalgebung, Genexpression und zelluläre Aktivität in kraniofazialen Kontexten direkt beeinflussen. Diese vielfältigen Anwendungen werden das Verständnis der Auswirkungen der Proteinphosphorylierung bei der kraniofazialen Entwicklung erheblich verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

129S4-Mäuse waren ein Geschenk von Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine am Mount Sinai. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 und K02 DE028572 bis K.A.F., F31 DE029976 bis M.A.R. und F31 DE029364 bis B.J.C.D. unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

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References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 182 Kraniofaziale Entwicklung Phosphorylierung Phosphoproteine Maus Oberkieferprozesse Maus embryonale palatale mesenchymzellen
Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse
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Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

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