Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

Protokol, disseke edilmiş fare embriyo yüz süreçlerinden veya kültürlenmiş fare embriyonik palatal mezenkim hücrelerinden tüm hücre protein lizatlarını izole etmek ve fosforile protein seviyelerini değerlendirmek için müteakip batı lekelemesini gerçekleştirmek için bir yöntem sunar.

Abstract

Memeli kraniyofasiyal gelişimi, çoklu hücre popülasyonlarının frontonazal iskeleti oluşturmak için koordine olduğu karmaşık bir morfolojik süreçtir. Bu morfolojik değişiklikler, genellikle kinazlar tarafından protein fosforilasyonunu içeren çeşitli sinyal etkileşimleri yoluyla başlatılır ve sürdürülür. Burada, memeli kraniyofasiyal gelişimi sırasında proteinlerin fosforilasyonunu incelemek için fizyolojik olarak ilgili bağlamların iki örneği verilmiştir: fare yüz süreçleri, özellikle E11.5 maksiller süreçler ve E13.5 ikincil damak raflarından türetilen kültürlenmiş fare embriyonik damak mezenkimi hücreleri. Protein izolasyonu sırasında ortak defosforilasyon bariyerini aşmak için, fosfoproteinlerin izolasyonuna izin veren standart laboratuvar yöntemlerine adaptasyonlar ve modifikasyonlar tartışılmaktadır. Ek olarak, tüm hücre protein lizatlarının batı lekelenmesini takiben fosfoproteinlerin uygun analizi ve nicelleştirilmesi için en iyi uygulamalar sağlanmaktadır. Bu teknikler, özellikle farmakolojik inhibitörler ve / veya murin genetik modelleri ile kombinasyon halinde, kraniyofasiyal gelişim sırasında aktif olan çeşitli fosfoproteinlerin dinamikleri ve rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir.

Introduction

Memeli kraniyofasiyal gelişimi, çoklu hücre popülasyonlarının frontonazal iskeleti oluşturmak için koordine olduğu karmaşık bir morfolojik süreçtir. Farede, bu süreç embriyonik günde (E) 9.5'te, frontonazal belirginliğin oluşumu ve her biri göç sonrası kraniyal nöral krest hücreleri içeren maksiller ve mandibuler süreçlerin çiftleri ile başlar. Lateral ve medial burun süreçleri, burun çukurlarının görünümü ile frontonazal belirginlikten kaynaklanır ve sonunda burun deliklerini oluşturmak için kaynaşır. Ayrıca, medial burun süreçleri ve maksiller süreçler üst dudağı oluşturmak için kaynaşır. Aynı zamanda, palatogenez, E11.5'teki maksiller süreçlerin oral tarafından farklı çıkıntıların - ikincil damak raflarının - oluşumu ile başlatılır. Zamanla, damak rafları dilin her iki tarafında aşağı doğru büyür, dilin üzerinde zıt bir konuma yükselir ve sonunda burun ve ağız boşluklarını E16.51 ile ayıran sürekli bir damak oluşturmak için orta hatta kaynaşır.

Kraniofasiyal gelişim boyunca bu morfolojik değişiklikler, genellikle kinazlar tarafından protein fosforilasyonunu içeren çeşitli sinyal etkileşimleri yoluyla başlatılır ve sürdürülür. Örneğin, kemik morfogenetik protein reseptörleri (BMPR'ler) ve çeşitli reseptör tirozin kinaz (RTK) aileleri de dahil olmak üzere dönüştürücü büyüme faktörü (TGF)-β reseptörlerinin alt aileleri gibi hücre zarı reseptörleri, kranial nöral krest hücrelerinde ligand bağlanması ve aktivasyonu üzerine otofosforile edilir 2,3,4 . Ek olarak, G proteinine bağlı transmembran reseptörü Smoothized, kraniyal nöral krest hücrelerinde fosforile olur ve Patched1 reseptörüne bağlanan Sonik kirpi (SHH) ligandının aşağı yönünde kraniyofasiyal ektoderm haline gelir ve siliyer membranda Düzgünleştirilmiş birikim ve SHH yolu aktivasyonu5 ile sonuçlanır. Bu tür ligand-reseptör etkileşimleri, kraniyofasiyal bağlamlarda otokrin, parakrin ve / veya jukstacrin sinyalizasyonu yoluyla ortaya çıkabilir. Örneğin, BMP6'nın kondrosit farklılaşması6 sırasında otokrin bir şekilde sinyal verdiği bilinirken, fibroblast büyüme faktörü (FGF) 8, faringeal ark ektoderminde ifade edilir ve faringeal ark mezenkiminde eksprese edilen FGF RTK ailesinin üyelerine parakrin bir şekilde bağlanır7, 8,9,10. Ayrıca, Kraniofasiyal iskelet gelişimi sırasında hem kondrositlerde hem de osteoblastlarda, transmembran Delta ve / veya Pürüzlü ligandlar komşu hücrelerdeki transmembran Çentik reseptörlerine bağlandığında, daha sonra parçalanan ve fosforile edilen yan yana takrin sinyallemesi yoluyla aktive edilir11. Bununla birlikte, hem otokrin hem de parakrin sinyallemede işlev görme esnekliğine sahip kraniyofasiyal gelişim için önemli olan başka ligand ve reseptör çiftleri de vardır. Örnek olarak, murin diş morfogenezi sırasında, trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF)-AA ligandının, emaye organ epiteli12'deki RTK PDGFRa'yı aktive etmek için otokrin bir şekilde sinyal verdiği gösterilmiştir. Buna karşılık, gebeliğin ortasındaki murin fasiyal süreçlerinde, PDGF-AA ve PDGF-CC ligandlarını kodlayan transkriptler kraniyofasiyal ektodermde eksprese edilirken, PDGFRα reseptörü altta yatan kranial nöral krest kaynaklı mezenkimde eksprese edilir ve parakrin sinyalizasyonu13,14,15,16,17 ile sonuçlanır. . Sinyal mekanizmasından bağımsız olarak, bu reseptör fosforilasyon olayları genellikle mitojenle aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) yolu18,19 gibi hücre içi kinaz kaskadlarını başlatmak için sıklıkla fosforile haline gelen adaptör proteinlerinin ve / veya sinyal moleküllerinin işe alınmasıyla sonuçlanır.

Bu kaskadların terminal hücre içi efektörleri daha sonra transkripsiyon faktörleri, RNA bağlanması, hücre iskeleti ve hücre dışı matriks proteinleri gibi bir dizi substratı fosforile edebilir. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24,Gli1-3 25 ve Sox9 26, kraniyofasiyal gelişim bağlamında fosforile edilen transkripsiyon faktörleri arasındadır. Bu translasyonel sonrası modifikasyon (PTM), diğer aktivitelerin yanı sıra alternatif PTM'lere duyarlılığı, dimerizasyonu, stabiliteyi, bölünmeyi ve / veya DNA bağlayıcı afiniteyi doğrudan etkileyebilir20,21,25,26. Ek olarak, RNA bağlayıcı protein Srsf3, kraniyofasiyal gelişim bağlamında fosforile edilir ve nükleer translokasyonuna yol açar27. Genel olarak, RNA bağlayıcı proteinlerin fosforilasyonunun, hücre altı lokalizasyonlarını, protein-protein etkileşimlerini, RNA bağlanmasını ve / veya dizi özgüllüğünü etkilediği gösterilmiştir28. Ayrıca, aktomiyozinin fosforilasyonu, kraniyofasiyal gelişim boyunca sitoiskelet yeniden düzenlemelerine yol açabilir29,30 ve küçük integrin bağlayıcı ligand N'ye bağlı glikoproteinler gibi hücre dışı matriks proteinlerinin fosforilasyonu, iskelet gelişimi sırasında biyomineralizasyona katkıda bulunur 31. Yukarıdaki ve diğer birçok örnekle, kraniyofasiyal gelişim sırasında protein fosforilasyonu için geniş etkileri olduğu açıktır. Ek bir düzenleme seviyesi ekleyerek, protein fosforilasyonu, fosfat gruplarını çıkararak kinazlara karşı koyan fosfatazlar tarafından daha da modüle edilir.

Hem reseptör hem de efektör molekül seviyelerindeki bu fosforilasyon olayları, sinyal yolaklarının yayılması için kritik öneme sahiptir ve sonuçta çekirdekteki gen ekspresyonunda değişikliklere neden olarak, göç, proliferasyon, hayatta kalma ve farklılaşma gibi spesifik hücre aktivitelerini yönlendirerek memeli yüzünün düzgün oluşumuna neden olur. Kinazlar ve fosfatazlarla protein etkileşimlerinin bağlam özgüllüğü, PTM'lerde ortaya çıkan değişiklikler ve bunların hücre aktivitesi üzerindeki etkileri göz önüne alındığında, fosforilasyon olaylarının kraniyofasiyal gelişime katkısının tam olarak anlaşılması için bu parametrelerin fizyolojik olarak ilgili bir ortamda incelenmesi kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin fosforilasyonunu ve dolayısıyla memeli kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyal yolaklarının aktivasyonunu incelemek için iki bağlam örneği verilmiştir: fare yüz süreçleri, özellikle E11.5 maksiller süreçler ve E13.5 ikincil damak raflarından türetilen kültürlenmiş fare embriyonik damak mezenkimi hücreleri - hem birincil32 hem de ölümsüzleştirilmiş33 . E11.5'te, maksiller süreçler lateral ve medial nazal süreçler1 ile kaynaşma sürecindedir, böylece fare kraniyofasiyal gelişimi sırasında kritik bir zaman noktasını temsil eder. Ayrıca, maksiller süreçler ve damak raflarından türetilen hücreler burada seçilmiştir, çünkü ikinci yapılar birincisinin türevleridir, böylece araştırmacılara protein fosforilasyonunu in vivo ve in vitro olarak ilgili bağlamlarda sorgulama fırsatı sunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol alternatif yüz süreçleri ve gelişimsel zaman noktaları için de geçerlidir.

Fosforile proteinlerin incelenmesinde kritik bir sorun, protein izolasyonu sırasında bol miktarda çevresel fosfatazlar tarafından kolayca fosforilden arındırılmalarıdır. Bu engelin üstesinden gelmek için, fosforile proteinlerin izolasyonuna izin veren standart laboratuvar yöntemlerine adaptasyonlar ve modifikasyonlar tartışılmaktadır. Ek olarak, fosforile proteinlerin uygun analizi ve nicelleştirilmesi için en iyi uygulamalar sağlanmaktadır. Bu teknikler, özellikle farmakolojik inhibitörler ve / veya murin genetik modelleri ile kombinasyon halinde, kraniyofasiyal gelişim sırasında aktif olan çeşitli sinyal yolaklarının dinamikleri ve rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanları içeren tüm prosedürler, Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve kurumsal kılavuzlara ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Embriyo hasadı için 1.5-6 aylıkken ve 21-23 ° C'lik bir termonötr sıcaklıkta barındırılan dişi 129S4 fareler kullanıldı. Protokolün şematik iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar, yazılımlar, reaktifler ve hayvanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. E11.5 fare embriyolarının toplanması

  1. Hamile kadın fareyi, yaklaşık% 50 yer değiştirme (3 odada360'ta 2.95 L / dak) ve maruz kalma süresi için gerekli olan IACUC onaylı CO 2 akış hızı kullanılarak bir CO2 odasında zamanlanmış çiftleşme sırasında vajinal tıkaç tespitinden 11.5 gün sonra ötenazi yapın. İkincil bir ötenazi yöntemi olarak servikal çıkık gerçekleştirin. Hemen diseksiyona devam edin.
  2. Fare gövdesini, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon tahtasına yerleştirin. Fare karnına% 70 etanol püskürtün.
  3. Düz Semken forseps ile cildi vajinal açıklığa kadar sıkıştırıp kaldırarak karın boşluğunu açın ve kaldırılan cildi ve altta yatan katmanları düz bıçak cerrahi makasla her iki tarafta 45 ° açıyla keserek, ön ayaklar ve arka bacaklar arasında kabaca yarı yolda her bir yanal yüzeye uzanan bir "V" şekli oluşturun.
  4. Semken forsepslerini kullanarak, uterus boynuzlarından birini tutun ve cerrahi makasla yumurta kanalının altına ve serviksin üstüne kesin. Rahim boynuzunun tamamen çıkarılmasına izin vermek için mezometriyumu kesin.
  5. Disseke uterus boynuzunu 10 cm'lik bir Petri kabında 10 mL histoloji fosfat tamponlu saline (PBS) [0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH 2 PO 4 monobazik, 10.14 mM Na2HPO 4 dibasic, pH7.4] aktarın.
  6. Karın boşluğunun karşı tarafındaki ikinci uterus boynuzunu 1.4-1.5. adımlarda açıklanan aynı prosedürü kullanarak çıkarın.
  7. Her iki uterus boynuzunu içeren 10 cm'lik Petri kabını, bireysel embriyoların diseksiyonuna hemen ilerlemiyorsa (yani, ikinci bir dişi fare diseke edilecekse) buz üzerine yerleştirin.
  8. Diseksiyon stereo mikroskop altında, her embriyoyu uterus boynuzlarından Dumont # 5 ince forseps ile dikkatlice diseke edin. Miyometriyumu, deciduayı ve koryonu yavaşça çekin. Embriyoyu çevreleyen nispeten şeffaf amniyonun yırtılıp çıkarılması ve embriyonun plasentaya bağlanması göbek kordonunun kesilmesi.
  9. Her disseke edilmiş embriyoyu, kesilmiş bir plastik transfer pipeti veya bir embriyo kaşığı kullanarak buz üzerinde 12 delikli bir hücre kültürü plakasının ayrı bir kuyucuğunda 2.5 mL histoloji PBS'ye aktarın.
    NOT: Birden fazla genotipte embriyo içerebilen bir çöple çalışıyorsanız, her embriyoyu çevreleyen amniyonu, her birini buz üzerinde önceden etiketlenmiş 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirerek genotipleme için saklayın.

2. E11.5 fare embriyolarından maksiller süreçlerin diseksiyonu

  1. 10 mL histoloji PBS içeren üç adet 10 cm'lik Petri kabı hazırlayın ve embriyolar arasında rotasyonda kullanılmak üzere buz üzerinde tutun.
  2. Bir embriyoyu, 12 kuyucuklu hücre kültürü plakasının bireysel bir kuyucuğundan, kesilmiş bir plastik transfer pipeti veya bir embriyo kaşığı kullanarak buz üzerinde histoloji PBS'li 10 cm'lik Petri kaplarından birine aktarın.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında, ince forsepsleri kullanarak her maksiller işlemi yüzden ayırın. İlk olarak, lateral burun sürecini ve maksiller süreci ayıran doğal girinti boyunca bir maksiller işlemin ön tarafını kesin (Şekil 2A).
  4. İkincisi, maksiller sürecin arka tarafını, maksiller süreci ve mandibuler süreci ayıran doğal girinti boyunca kesin (Şekil 2A).
  5. Üçüncüsü, maksiller süreci tamamen ayırmak için, maksiller sürecin göz tarafında, maksiller sürecin ön tarafından arka taraflarına, yukarıda belirtilen doğal girintilerin sona erdiği dikey bir kesim yapın (Şekil 2A-C).
  6. Yüzün karşı tarafındaki maksiller işlem için bu üç kesimi tekrarlayın.
  7. 2 mL küçük lateks ampul ile 9" Pasteur pipet kullanarak, disseke edilmiş maksiller işlem çiftini ve yaklaşık 30 μL histoloji PBS'den oluşan küçük bir damlacığı buz üzerinde etiketli 35 mm Petri kabına aktarın (Şekil 2D).
  8. Her embriyo için 2.3-2.7 adımlarını izleyin, embriyolar arasında buz üzerinde histoloji PBS içeren üç adet 10 cm'lik Petri kabını döndürün. Disseke edilmiş maksiller işlemlerin bireysel çiftlerini buz üzerine ayrı 35 mm Petri kaplarına yerleştirin.
    NOT: Maksiller proses ektodermi ve mezenkimin ayrılması (adım 2.9-2.17), çöpteki tüm embriyoların maksiller süreçlerinin diseksiyonundan sonra gerçekleştirilebilir. Hem ektoderm hem de mezenkimi içeren sağlam maksiller işlemler isteniyorsa, aşağıdaki adım 2.18'e geçin.
  9. Doku kültürü PBS'de 250 μL taze% 2 tripsin ve doku kültürü PBS'de 250 μL% 10 fetal sığır serumu (FBS) hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
  10. 35 mm Petri kabına, maksiller süreçleri içeren ilk, küçük histoloji PBS damlacığından ayrı olarak, yaklaşık 30 μL% 2 tripsin ikinci, küçük bir damlacık yerleştirin. Maksiller işlem çiftini, Pasteur pipet kullanarak %2'lik tripsin küçük damlacığına aktarın (Şekil 2D).
  11. Yemeği 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  12. 35 mm Petri kabını buzdan çıkarın ve diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
  13. İnce forsepsleri kullanarak, her maksiller işlemden ektoderm tabakasını yavaşça ve dikkatlice çıkarın (Şekil 2E).
    NOT: Ektoderm sağlam bir tabakada mezenkimden ayrılmıyorsa, ayırmaya devam etmeden önce oda sıcaklığında (RT) %2 tripsin içinde 5 dakikaya kadar inkübe edin. Doku% 2 tripsinde parçalanmaya başlarsa, tripsini nötralize etmek ve ektoderm ve mezenkimin ayrılmasını bitirmek için maksiller süreçleri aşağıda açıklandığı gibi% 10 FBS'ye taşıyın.
  14. Maksiller proses ektodermi ve mezenkim ayrıldıktan sonra (Şekil 2F), istenen dokuları maksiller işlem çiftinden Pasteur pipet kullanarak yaklaşık 30 μL% 10 FBS'lik üçüncü, küçük bir damlacığa aktarın (Şekil 2D).
  15. Tripsinizasyonu durdurmak için 35 mm'lik Petri kabını buzun üzerine yerleştirin.
  16. Maksiller proses dokularını buz üzerinde% 10 FBS'de 1-2 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra dokuları her iki maksiller işlemden Pasteur pipet kullanarak buz üzerinde yaklaşık 30 μL önceden soğutulmuş histoloji PBS'nin dördüncü, küçük bir damlacığına aktarın (Şekil 2D).
  17. Histoloji PBS'deki maksiller proses dokularını 1 dakika boyunca inkübe ederken, tüm FBS'nin dokudan durulanmasını sağlamak için histoloji PBS'yi maksiller proses dokularının etrafında Pasteur pipetinin ucuyla hafifçe döndürün.
  18. Maksiller proses dokularının çiftini, Pasteur pipet kullanarak buz üzerinde etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve histoloji PBS'nin transferini en aza indirin. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpündeki fazla histoloji PBS'sini Pasteur pipet ile çıkarın.
  19. Maksiller süreçleri çöpteki her embriyodan ayırmak için yukarıdaki adımları izleyin.
  20. Tüm hücre protein lizatlarını izole etmek için numuneleri hemen işleyin (aşağıda) veya -80 ° C'de uzun süreli saklayın. Uzun süreli depolamadan önce, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünü kuru buz üzerinde% 100 EtOH'luk bir banyoda 5 dakika boyunca anında dondurun.

3. Tüm hücre proteini lizatlarının fare maksiller süreçlerinden izole edilmesi

  1. Maksiller işlemler daha önce -80 ° C'de dondurulmuşsa, bunları buz üzerinde çözün.
  2. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri (1x tam mini proteaz inhibitörü kokteyli [suda çözülmüş; -20 °C'de depolanmış], 1 mM PMSF [suda çözülmüş; -20 °C'de depolanmış], 1 mM PMSF [izopropanolde çözülmüş; 4 °C'de depolanmış], 0,1 mL buz gibi soğuk NP-40 lizis tamponu (20 mM NaCl, %10 gliserol, %1 Nonidet P-40, 2 mM EDTA; 4 °C'de depolanmış) ekleyin, 10 mM NaF [-20 °C'de depolanır; donma/çözülmeden kaçının], 1 mM Na3VO 4 [-20 °C'de depolanır], 25 mM β-gliserofosfat [4 °C'de depolanır]) buz üzerinde kullanılmadan hemen önce eklenir.
    NOT: Hücre fraksiyonasyonu alternatif olarak sitoplazmik, nükleer, membran veya mitokondriyal protein fraksiyonlarını izole etmek için yapılabilir.
  3. Pipet, 200 μL pipetman ile 10 kez yukarı ve aşağı indir.
  4. 10 sn boyunca vorteks yapın ve ardından 200 μL pipetman ile 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Kabarcık oluşturmaktan kaçının.
  5. Bir tüp tabanca ile 1,5 mL/2 mL kürek kullanarak uçtan uca dönerken 2 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  6. Numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.500 × g'de santrifüj yapın.
  7. Süpernatantı 200 mL'lik bir pipetman ile buz üzerinde yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
  8. Deneysel numuneler için 10 μL protein lizat + 10 μL NP-40 lizis tamponu ve protein standartları olarak 0.25-2.0 mg / mL aralığında NP-40 lizis tamponunda 3-5 seyreltilmiş sığır serum albümini (fraksiyon V) (BSA) kullanarak protein konsantrasyonunu protein tahlil kiti ile ölçün.
  9. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) (adım 5) ile devam edin veya kalan lizatları kuru buz üzerinde hızlı bir şekilde dondurun ve -80 ° C'de uzun süre saklayın.

4. Tüm hücre proteini lizatlarının birincil ve / veya ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik palatal mezenkimi (MEPM) hücrelerinden izole edilmesi

NOT: E13.5 fare embriyolarından ve ölümsüzleştirilmiş MEPM hücrelerinden primer MEPM hücrelerinin izolasyonu ve kültürü daha önce32,33,34 olarak tanımlanmıştır. Hücrelerin büyüme faktörü ile uyarılması (adım 4.1-4.7) hücre lizisinden önce yapılabilir. Uyarılmamış hücreler isteniyorsa, aşağıdaki adım 4.8'e geçin.

  1. Bir vakum sistemine bağlı 5.75" Pasteur pipet kullanarak, büyüme ortamını [Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) 50 U / mL penisilin, 50 μg / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin,% 10 FBS] ile MEPM hücrelerinden ~% 70 birleşimde aspire edin.
  2. Hücreleri 1 mL doku kültürü PBS ile yıkayın.
  3. 37 °C su banyosunda önceden ısıtılmış 3 mL serum açlık ortamı [50 U / mL penisilin, 50 μg / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin,% 0.1 FBS içeren DMEM] ekleyin.
  4. 37 °C'de ve 23 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  5. Serum açlık ortamını 3 mL taze, önceden ısıtılmış serum açlık ortamı ile değiştirin.
  6. 37 °C'de ve 1 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  7. Hücreleri, istenen süre boyunca ampirik olarak belirlenmiş bir konsantrasyonda tercih edilen büyüme faktörü ile uyarın.
  8. Bir vakum sistemine bağlı 5,75" Pasteur pipet kullanarak ortamı MEPM hücrelerinden %80-%100 birleşimde aspire edin.
  9. Hücreleri buz gibi soğuk doku kültürü PBS (6 cm'lik bir hücre kültürü kabı için 1 mL) ile iki kez yıkayın; Tüm doku kültürü PBS'nin aspire edildiğinden emin olmak için son yıkama sırasında plakayı yana doğru eğin.
  10. Buz üzerinde kullanımdan hemen önce eklenen proteaz ve fosfataz inhibitörleri (6 cm'lik bir hücre kültürü kabı için 0.1 mL) ile buz gibi soğuk NP-40 lizis tamponu ekleyerek hücreleri lize edin.
  11. Plakanın tam olarak kaplanmasını sağlamak için plakayı yaklaşık her dakika dönerek 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  12. Önceden soğutulmuş bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri plakadan kazıyın ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  13. Tüp tabancalı 1,5 mL/2 mL'lik bir kürek kullanarak uçtan uca dönerken, hücre süspansiyonunu 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  14. Yukarıda açıklanan 3.6-3.9 arası adımlarla devam edin.

5. Fosfoproteinler için fare yüz işlemlerinden ve / veya MEPM hücrelerinden tüm hücre proteini lizatlarının batı lekelenmesi

  1. SDS-PAGE için tüm hücre proteini lizat örnekleri hazırlayın.
    1. Dokudaki/hücredeki protein bolluğuna bağlı olarak yüklenecek protein miktarını belirlemek; 12.5 μg, tüm hücre protein lizatlarındaki sağlam eksprese proteinler için genellikle yeterlidir.
    2. Kullanımdan hemen önce eklenen% 10 β-merkaptoetanol eklenmiş eşit hacimli 2x Laemmli tamponu [% 20 gliserol,% 4 SDS,% 0.004 bromofenol mavisi, 0.125 M Tris HCl pH 6.8] ekleyin.
      DİKKAT: β-merkaptoetanol cilt veya göz aşındırıcıdır, toksiktir, yutulduğunda tehlikelidir ve suda toksik toksisiteye sahiptir. Eldiven, laboratuvar önlüğü, yüz siperliği ve kimyasal duman başlığında güvenlik gözlükleri giyin. Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine göre bertaraf edin.
    3. Vorteks yaparak karıştırın.
    4. Numuneleri mini kuru banyoda 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
    5. Vorteksleme ile karıştırın ve örnekleri buzun üzerine yerleştirin.
    6. 4 °C'de 5 dakika boyunca 9.400 × g'da santrifüj.
    7. SDS-PAGE jeline yüklemeden önce numuneleri kısa bir süre buz üzerine yerleştirin veya -20 °C'de uzun süre saklayın.
  2. SDS-PAGE'i% 4 -% 15 prekast protein jeli ve elektroforez tamponu 35 içeren bir elektroforez hücresi kullanarakgerçekleştirin.
  3. Kullanımdan hemen önce eklenen %0-20 metanol (100 kDa'dan büyük proteinler için %0-%10; 100 kDa'dan küçük proteinler için %20) içeren transfer tamponu kullanarak proteinleri bir poliviniliden florür (PVDF) membranına elektrotransferedin 35.
  4. Membranı bloke edin ve ilgilenilen fosfoprotein için prob.
    1. Aktarımı takiben, membranı batı leke kutusunda 5 dakika boyunca 1x tris tamponlu salin (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] içinde yıkayın.
    2. Membranı 5 mL bloke tamponunda [1x TBS,% 0.1 Ara 20,% 5 w / v BSA; iyice karıştırılır ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda 1 saat boyunca luer uçlu 10 mL'lik bir şırınga kullanılarak 0,2 μm gözenekli 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzülür].
      NOT: Fosfoproteinleri karakterize ederken sütü bloke edici bir ajan olarak kullanmayın, çünkü fosfoprotein kazein içerir, bu da yüksek, spesifik olmayan bir arka plan sinyaline neden olabilir.
    3. Membranı TBS-T [1x TBS, %0,1 Tween 20] içinde her biri 5 dakika boyunca üç kez, yörüngesel çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda yıkayın.
    4. Membranı, tüp tabancalı 50 mL'lik bir kürek kullanarak 50 mL'lik bir konik tüp içinde gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tamponda seyreltilmiş 5 mL birincil antikor içinde inkübe edin.
      NOT: Batı lekelenmesi için uygun konsantrasyon için antikor veri sayfasına bakın.
    5. Membranı RT'de her biri 5 dakika boyunca üç kez, bir orbital çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda TBS-T'de yıkayın.
    6. Membranı, orbital çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda 1 saat boyunca bloke edici tamponda seyreltilmiş 5 mL'lik uygun yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikoru içinde inkübe edin.
    7. Membranı, TBS-T'de her biri 5 dakika boyunca üç kez, yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda yıkayın.
    8. Membranı 1 dakika boyunca gelişmiş kemilüminesans (ECL) batı lekeleme substratında [1 ve 2 numaralı şişelerden eşit hacimlerde karıştırma; büyük (8,6 cm x 6,7 cm) membranlar için her birinin 0,5 mL'si] içinde inkübe ederek tüm membranın sürekli olarak ECL batı lekeleme substratına maruz kalmasını sağlayın.
    9. Fazla ECL batı lekeleme substratının zarını boşaltın ve hemen bir kemilüminesans görüntüleyici kullanarak geliştirin.
  5. Zarı sıyırın ve ilgilenilen toplam protein için problayın.
    1. PVDF membranını, kullanımdan hemen önce 8 μL/mL β-merkaptoetanol eklenmiş 5 mL sıyırma tamponu [% 2 SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] içeren polietilen astarlı şeffaf bir torbaya yerleştirin.
    2. Dakikada 11 devirde hibridizasyon fırınında sallanarak 30 dakika boyunca 50 °C'de inkübe edin.
    3. Membranı RT'de her biri 5 dakika boyunca üç kez, bir orbital çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda TBS-T'de yıkayın.
    4. Yukarıda açıklanan 5.4.2-5.4.9 adımlarıyla devam edin.
  6. ImageJ yazılımını kullanarak batı leke bandı yoğunluklarını sayısallaştırın, ilgilenilen fosforile proteinin seviyelerini ilgilenilen toplam proteinin seviyelerine normalleştirin36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare yüz süreçlerinden ve / veya kültürlenmiş damak mezenkim hücrelerinden izole edilen proteinlerin fosforilasyonunu karakterize etmeye çalışırken, temsili sonuçlar ideal olarak, karşılık gelen toplam protein bandının yüksekliğinde veya yakınında çalışan bir anti-fosfoprotein antikoru ile batı lekelenmesini takiben farklı, tekrarlanabilir bir bant ortaya çıkaracaktır (Şekil 3 ). Bununla birlikte, proteinin geniş fosforilasyonu meydana gelirse, fosfoprotein bandının toplam protein bandına kıyasla hafif bir yukarı doğru kayması olabilir. Ayrıca, her biri fosforile edilmiş bir dokuda bir proteinin çoklu izoformları varsa veya protein değişken olarak ek PTM'lere maruz kalırsa, batı lekesinde bir anti-fosfoprotein antikoru ile birden fazla bant görünebilir. İlgilenilen fosfoprotein için herhangi bir sinyal gözlenmezse, ilgilenilen toplam proteinin tespitine rağmen, protein seçilen bağlamda fosforile edilmemiş olabilir veya protokolle ilgili teknik bir sorun ortaya çıkmış olabilir. İkinci durumda, protokolün beklendiği gibi çalışıp çalışmadığını göstermek için tüm hücre lizatlarının batı lekelenmesi, anti-foserin / treonin ve / veya anti-fosfotirozin antikorları ile gerçekleştirilebilir. Kraniofasiyal dokularda proteinlerin fosforilasyonu bol miktarda bulunduğundan25,37, çoklu fosfoprotein bantlarının varlığı, protokolün başarıyla tamamlandığını ve ilk taramadan doğru sonuçları gösterecektir.

Fosfoprotein seviyelerini vahşi tip ve mutant embriyo dokuları arasında veya kültürlenmiş hücrelerin tedavisine yanıt olarak karşılaştırmak genellikle yararlıdır. İlk durumda, genotipler arasındaki fosfoprotein düzeylerindeki bir fark, ilgilenilen toplam proteinin benzer seviyeleri ile ilgilenilen fosfoprotein için bant yoğunluklarında bir fark olarak görünecektir27. İkinci durumda, temsili sonuçlar, örneğin bir büyüme faktörü (Şekil 3) ile tedavi edildiğinde tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla artmış fosfoprotein bant yoğunluklarını ve bir kinaz inhibitörü27,37 ile tedaviyi takiben azalmış bant yoğunluklarını ortaya koyacaktır. Bu farklılıkların nicelleştirilmesi için, ilgilenilen fosfoprotein seviyeleri, ilgilenilen toplam protein seviyelerine normalleştirilecektir. İlgilenilen toplam proteinin seviyelerinin numuneler arasında nispeten eşit olması beklenmektedir; bu, β-tübülin, β-aktin ve / veya GAPDH gibi yükleme ve ekspresyon kontrol proteinlerine karşı bir veya daha fazla antikor kullanılarak ayrı batı lekelenmesi ile doğrulanması gereken bir bulgudur (Şekil 3). Kültürlenmiş hücrelerin büyüme faktörü tedavisi için, pozitif sonuçlar muhtemelen stimülasyondan sonra 2-15 dakikalık nispeten kısa bir zaman diliminde fosfoprotein seviyelerinde bir artış gösterecektir (Şekil 3). Büyüme faktörü tedavisinin yokluğunda, proteinin fosforilasyonuna neden olan başka faktörler olmadıkça, örnekleri, büyüme faktörlerinin hücreler tarafından endojen ekspresyonu, proteinlerin hücreler tarafından eksprese edilen başka bir sinyal molekülü tarafından fosforilasyonu ve / veya büyüme faktörü tedavisinin yokluğunda proteinin kurucu fosforilasyonuna yol açan bir mutasyon gibi başka faktörler olmadığı sürece, çok az fosforilasyon olmalı veya hiç olmamalıdır. Sonuçların yorumlanmasında bu faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. Negatif sonuçlar, büyüme faktörü tedavisinin bir zaman dilimine yanıt olarak fosforilasyonda herhangi bir değişiklik içermez, bu durumda protokol yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi fosfoproteinlerin bakımı için değerlendirilmelidir. Ek olarak, membran sıyırma işlemi bazen toplam protein seviyelerini etkileyebilir ve azaltabilir. Bu durumda, ilgilenilen fosfoprotein miktarına karşı toplam ilgi proteini için zıt eğilimler gözlenecektir. Bu, optimal değildir, çünkü toplam protein seviyelerinin, proteinin eşit yüklenmesi ve ekspresyonu varsayılarak, numuneler arasında nispeten eşit olması beklenir, değişiklikler sadece fosfoprotein seviyelerinde meydana gelir.

Figure 1
Şekil 1: Fosfoprotein analizi için fare yüz işlemlerinden ve kültürlenmiş damak mezenkim hücrelerinden tüm hücre proteini lizatlarının izolasyonu için iş akışı. Maksiller prosesler buz üzerindeki E11.5 fare embriyolarından diseke edilir ve / veya ortam, daha sonra buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkanan kültürlenmiş MEPM hücrelerinden% 80-100 birleşimde aspire edilir. Tüm hücre protein lizatları, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile lizis tamponu kullanılarak izole edilir, bunu SDS-PAGE, bir PVDF membranına elektrotransfer, membranın BSA ile bloke edilmesi, fosfoprotein için problama, zarın sıyrılması, toplam protein için reprobing ve bant yoğunluklarının kantitasyonu takip edilir. Kısaltmalar: LNP = lateral nazal süreç; MxP = maksiller süreç; MdP = mandibuler süreç; PA2 = ikinci faringeal ark; PBS = fosfat tamponlu salin; FBS = fetal sığır serumu; PS = damak rafı; MEPM = fare embriyonik palatal mezenkim; SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi; PVDF = poliviniliden florür; p-P = fosforile protein. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Maksiller süreçlerin diseksiyonu. (A) MxP'yi renkli çizgilerle gösterilen yüzden ayırmak için gereken üç kesimli (1-3 etiketli) bir E11.5 fare embriyosunun yanal görünümü. (B) MxP'nin çıkarılmasından sonra bir E11.5 fare embriyosunun kesikli siyah bir çizgi ile özetlenen yanal görünümü. (C) Disseke MxP. (D) MxP ektodermi ve mezenkiminin isteğe bağlı olarak ayrılması için küçük PBS damlacıkları, %2 tripsin ve %10 FBS içeren 35 mm'lik bir Petri kabı kurulumu. (E) Ect ile MxP, Mes'den kısmen ayrılmıştır. (F) ayrılmış mxP ect ve mes. Ölçek çubukları: 1 mm (A-C,E,F), 10 mm (D). Kısaltmalar: LNP = lateral nazal süreç; MxP = maksiller süreç; MdP = mandibuler süreç; PA2 = ikinci faringeal ark; PBS = fosfat tamponlu salin; FBS = fetal sığır serumu; Mes = mezenkim; Ect = ektoderm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Ölümsüzleştirilmiş MEPM hücrelerinin PDGF-BB ligand tedavisine yanıt olarak PDGFRβ ve MAPK efektör Erk1/2 fosforilasyonu. Anti-fosfo-PDGFR, anti-PDGFRβ, anti-fosfo-Erk1/2, anti-Erk1/2 ve anti-β-tübülin (E7) antikorları ile 2 dakikadan 15 dakikaya kadar 10 ng / mL PDGF-BB ligand stimülasyonunu takiben ölümsüzleştirilmiş MEPM hücrelerinden tüm hücre lizatlarının batı lekesi analizi. Anti-PDGFRβ lekesindeki çoklu bantlar diferansiyel glikozile proteinleri temsil eder. Kısaltmalar: PDGF = trombosit kaynaklı büyüme faktörü; WCL = tüm hücre lizatı; kD = kilodalton; Dünya Bankası = batı lekesi; p-PDGFR = fosforile PDGFR; PDGFR = PDGF reseptörü; p-Erk = fosforile Erk; Erk = hücre dışı sinyal düzenlemeli kinaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokol, araştırmacıların kraniyofasiyal gelişim sırasında kritik fosforilasyona bağımlı sinyal olaylarını sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde araştırmalarını sağlar. Bu protokolde, verilerin uygun şekilde toplanmasını ve sonuçların analizini sağlayan birkaç kritik adım vardır. Fosfoproteinleri fare yüz süreçlerinden ve / veya kültürlenmiş damak mezenkim hücrelerinden izole etmek olsun, tüm reaktifleri ve malzemeleri belirtildiğinde buz üzerinde tutarken hızlı ve verimli bir şekilde hareket etmek zorunludur. Buzun düşük sıcaklığı, hücrelerdeki metabolik aktiviteyi yavaşlatır, böylece fosforile proteinleri fosfataz aktivitesinden korur38 ve yüksek protein verimini korur. Maksiller işlemlerin diseksiyonu sırasında üç ayrı 10 cm Petri kabının kullanılması, tüm diseksiyonların yeterince önceden soğutulmuş histoloji PBS'de gerçekleşmesini sağlar. Buna bağlı olarak, bu protein izolasyon protokolünün ek, temel bir bileşeni, tüm lizis tamponlarında fosfataz inhibitörlerinin kullanılmasıdır. Bu reaktifler ayrıca39,40 ilgilenilen protein üzerindeki fosfat gruplarını korur ve batı lekelenmesi ile daha fazla analiz için fosforile proteinin bütünlüğünü korur.

Bu protokol ayrıca doku ve kültürlenmiş hücrelerde fosfoproteinlerin daha spesifik analizlerine izin veren modifikasyonlar sunar. Yüz süreçlerinin diseksiyonu sürecinde, maksiller proses ektodermi ve mezenkimin ayrılması için, bölmeye özgü protein fosforilasyonunun incelenmesine izin vermek için isteğe bağlı adımlar eklenmiştir27. Bu doku katmanlarının verimli izolasyonunu test etmek için, kullanıcılar Gabrp, Trim29, Esrp1 ve Mpzl2 gibi ektodermde zenginleştirilmiş genlerin ekspresyonunu ve / veya Aldh1a2 ve AW551984 41 gibi mezenkimde zenginleştirilmiş genleri değerlendirebilirler. Fosfoproteinlerin kültürlenmiş damak mezenkim hücrelerinden izolasyonu için, büyüme faktörü stimülasyonu için isteğe bağlı adımlar eklenmiştir. Bu durumda, hücreler% 0.0 -% 0.1 serum içeren ortamda serum aç bırakılmalıdır. FBS gibi standart serumlar, eksojen büyüme faktörü stimülasyonundan kaynaklanan sonuçları kıvrımlı hale getirebilen çok sayıda büyüme faktörü42 içerir. Böylece, geçici serum açlığı, hücreleri akut büyüme faktörü tedavisine yanıt vermeye hazırlar.

Bu protokol aynı zamanda protein fosforilasyonunu doğru bir şekilde ölçmek için optimize edilmiş yöntemler sağlar. Batı lekeleme adımlarında, PVDF membranının süt yerine BSA kullanılarak bloke edilmesi önemlidir, bu da birçok standart batı lekeleme tekniğinde kullanılır. Bu anahtar zorunludur, çünkü süt fosfoprotein kazein43'ü içerir ve diğer fosfoproteinlerin analizinde yüksek arka plan sinyaline yol açar. Ayrıca, fosforile edilmiş protein seviyelerinin, standart bir yükleme kontrol proteininin seviyelerinden ziyade, ilgilenilen toplam protein seviyelerine karşı ölçülmesi önemlidir. Bu şekilde, ilgilenilen toplam proteinin ifadesindeki herhangi bir değişiklik, fosfoprotein seviyelerinin miktarında açıklanabilir. Genel olarak protein verimi doğru fosfoprotein tespiti için çok düşükse, aynı aşamadan ve genotipten doku örnekleri27 havuza alınabilir ve / veya hücreler, gelecekteki deneyler için burada açıklananlardan daha büyük hücre kültürü damarlarında yetiştirilebilir. Alternatif olarak, sıyırma tutarlı bir şekilde toplam protein seviyelerini değiştiriyor gibi görünüyorsa, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tarif edilen protokolü değiştirmek için iki yaklaşım benimsenebilir: 1) farklı konakçı türlerde üretilen anti-fosfoprotein ve anti-protein antikorlarını, iki türe özgü ikincil antikor ile birleştirilmiş ve ayrı (HRP konjuge ikincil antikorlar kullanılıyorsa) veya eşzamanlı (florofor konjuge ikincil antikorlar kullanılıyorsa) kullanan bir antikor şemasının kullanılması. lekelerin gelişimi; veya 2) iki özdeş zarın eşzamanlı olarak işlenmesi - ilki bir anti-fosfoprotein antikoru ile inkübe edilmiş, ikincisi bir anti-protein antikoru ile. Her iki alternatif yaklaşımda da, ilgilenilen fosforile proteinin seviyeleri, ilgilenilen toplam proteinin seviyelerine karşı hala ölçülmelidir. Son olarak, fosforilasyon dinamik bir süreç olduğundan, fosfoprotein seviyeleri durum başına en az üç biyolojik kopyada değerlendirilmelidir. Fare yüz işleme dokusu veya bireysel bir embriyodan veya aynı aşama ve genotipten bireysel bir embriyo havuzundan türetilen birincil MEPM hücreleri, tek bir biyolojik replikasyonu oluşturacaktır. Benzer şekilde, farklı pasajların ölümsüzleştirilmiş MEPM hücreleri biyolojik replikalar oluşturacaktır. Kültürlenmiş hücreler büyüme faktörü ile tedavi edilirse, biyolojik replikaların tedavisi, ayrı büyüme faktörü alikotları kullanılarak farklı günlerde yapılmalıdır.

Burada sunulan yaklaşımın, aşağıda tartışılan ve protokolü başlatmadan önce göz önünde bulundurulması gereken iki sınırlaması vardır. Birincisi, ECL'nin dinamik aralığını içerir. Bu protokolde önerilen ECL batı lekelenme substratı, düşük pikogram hassasiyetine sahip geniş bir dinamik aralığa sahiptir. Bununla birlikte, ampirik olarak, düşük bolluk veya düşük fosforilasyon durumundaki proteinlerin bu yöntemleri kullanarak tespit edilmesi zor olabilir. Fosforile proteinler 20 dakikalık ECL substrat inkübasyonundan sonra tespit edilemezse, membranın tarif edildiği gibi TBS-T'de yıkanması ve bunun yerine membranın düşük femtogram hassasiyetine sahip yüksek hassasiyetli bir ECL batı lekelenme substratında inkübe edilmesi önerilir. Alternatif olarak, ECL44 gibi enzim bazlı yaklaşımlardan daha geniş bir dinamik aralık sunan florofor konjuge ikincil antikorlar kullanılabilir. İkinci bir sınırlama normalleştirme prosedüründen kaynaklanmaktadır. Kapsamlı bir şekilde açıklandığı gibi, ilgilenilen fosfoproteinden gelen sinyalin, ilgilenilen toplam proteinden gelen sinyale normalleştirilmesi önerilir. Bununla birlikte, bu süreç, ilgilenilen toplam protein seviyelerinin numuneler arasında değişmediği varsayımına dayanır; bu, genellikle bir veya daha fazla temizlik proteinine karşı antikorlar kullanılarak ayrı batı lekelenmesi ile doğrulanır. Bununla birlikte, önemli bir husus, temizlik proteinlerinin seviyelerinin, düzensiz yükleme, membrana eksik transfer ve / veya protein ekspresyonundaki farklılıklar nedeniyle numuneler arasında değişebileceğidir. Bu nedenle, normalizasyon sırasında doğruluğu artırmak için araştırmacılar, membranın her şeridindeki tüm proteinleri tespit eden ve bu teknik sınırlamaları hesaba katan Ponceau S45 gibi gerçek bir toplam protein lekesi uygulamak için hareket etmeyi düşünebilirler.

Genel olarak, bu protokol, protein izolasyonu sırasında yaygın olarak ortaya çıkan protein defosforilasyonu sorununun üstesinden gelir. Protein fosforilasyonunun doğru analizi, araştırmacıların kraniyofasiyal gelişim sırasında fosforile proteinlerin rolünü daha kesin bir şekilde anlamalarına yardımcı olacaktır. Ayrıca, bu protokol, fosforile protein seviyelerini fizyolojik olarak ilgili bağlamlarda analiz etmek için sağlam ve etkili yöntemler sunar ve her biri kendi yararına sahiptir. Embriyo dokularından protein lizatları, protein fosforilasyonunun in vivo statik bir görüntüsünü sağlarken, kültürlenmiş hücrelerin uygulanması, akut tedavilere dinamik fosforilasyon yanıtları hakkında veri sağlar. Bu protokol, sinyal ağları içindeki yeni etkileşimleri keşfetmek için büyük veri kümelerinden kaynaklanan sonuçları ve hipotezleri, örneğin kütle spektrometresi 37 ve RNA dizilimi27'yi doğrudan doğrulama ve genişletme kapasitesine sahiptir. Önemli olarak, bu protokol, fosforilasyondaki pertürbasyonların kraniyofasiyal bağlamlarda hücre içi sinyallemeyi, gen ekspresyonunu ve hücresel aktiviteyi doğrudan nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir. Bu çeşitli uygulamalar, protein fosforilasyonunun kraniyofasiyal gelişimdeki etkilerinin anlaşılmasını büyük ölçüde artıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

129S4 fareleri, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'nden Dr. Philippe Soriano'nun bir hediyesiydi. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) / Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIDCR) R01 DE027689 ve K02 DE028572'den K.A.F.'ye, F31 DE029976'dan M.A.R.'ye ve F31 DE029364'ten B.J.C.D.'ye sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 182 Kraniofasiyal gelişim fosforilasyon fosfoproteinler fare maksiller süreçler fare embriyonik damak mezenkimi hücreleri
Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter