Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering av helcellsproteinlysater från musens ansiktsprocesser och odlade palatala mesenkymceller för fosfoproteinanalys

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

Protokollet presenterar en metod för att isolera helcellsproteinlysater från dissekerade ansiktsprocesser för musembryon eller odlade musembryonala palatala mesenkymceller och utföra efterföljande western blotting för att bedöma fosforylerade proteinnivåer.

Abstract

Däggdjurs kraniofacial utveckling är en komplex morfologisk process under vilken flera cellpopulationer koordineras för att generera det frontonasala skelettet. Dessa morfologiska förändringar initieras och upprätthålls genom olika signalinteraktioner, som ofta inkluderar proteinfosforylering av kinaser. Här ges två exempel på fysiologiskt relevanta sammanhang för att studera fosforylering av proteiner under däggdjurs kraniofacial utveckling: musens ansiktsprocesser, särskilt E11.5 maxillära processer, och odlade musembryonala palatala mesenkymceller härledda från E13.5 sekundära palatala hyllor. För att övervinna den gemensamma barriären för defosforylering under proteinisolering diskuteras anpassningar och modifieringar av standardlaboratoriemetoder som möjliggör isolering av fosfoproteiner. Dessutom tillhandahålls bästa praxis för korrekt analys och kvantifiering av fosfoproteiner efter western blotting av helcellsproteinlysater. Dessa tekniker, särskilt i kombination med farmakologiska hämmare och/eller murina genetiska modeller, kan användas för att få större insikt i dynamiken och rollerna hos olika fosfoproteiner som är aktiva under kraniofacial utveckling.

Introduction

Däggdjurs kraniofacial utveckling är en komplex morfologisk process under vilken flera cellpopulationer koordineras för att generera det frontonasala skelettet. I musen börjar denna process vid embryonal dag (E) 9,5 med bildandet av frontonasal framträdande och par av maxillära och mandibulära processer, som var och en innehåller post-migrerande kranial neurala vapenceller. De laterala och mediala nasala processerna härrör från frontonasal framträdande med utseendet på näsgroparna och så småningom smälter samman för att bilda näsborrarna. Vidare smälter de mediala nasala processerna och maxillära processer samman för att generera överläppen. Samtidigt initieras palatogenes med bildandet av distinkta utväxter - de sekundära palatala hyllorna - från den orala sidan av maxillära processer vid E11.5. Med tiden växer de palatala hyllorna nedåt på vardera sidan av tungan, lyfter till en motsatt position ovanför tungan och smälter så småningom samman vid mittlinjen för att bilda en kontinuerlig gom som skiljer näs- och munhålan med E16.51.

Dessa morfologiska förändringar under hela kraniofacial utveckling initieras och upprätthålls genom olika signalinteraktioner, som ofta inkluderar proteinfosforylering av kinaser. Till exempel är cellmembranreceptorer, såsom underfamiljer av transformerande tillväxtfaktor (TGF) -β receptorer, inklusive benmorfogenetiska proteinreceptorer (BMPR) och olika receptortyrosinkinas (RTK) -familjer, autofosforylerade vid ligandbindning och aktivering i kranial neurala vapenceller 2,3,4 . Dessutom blir den G-proteinkopplade transmembranreceptorn Smoothened fosforylerad i kranial neurala vapenceller och kraniofacial ektoderm nedströms Sonic hedgehog (SHH) ligandbindning till Patched1-receptorn, vilket resulterar i utjämnad ackumulering vid ciliary membranet och SHH-vägaktivering5. Sådana ligand-receptorinteraktioner kan ske genom autokrin, parakrin och/eller juxtacrinsignalering i kraniofaciala sammanhang. Till exempel är BMP6 känt för att signalera på ett autokrint sätt under kondrocytdifferentiering6, medan fibroblasttillväxtfaktor (FGF) 8 uttrycks i faryngealbågens ektoderm och binder till medlemmar av FGF-familjen av RTK uttryckt i faryngebågens mesenkym på ett parakrint sätt för att initiera mönstring och utväxt av faryngeala bågar7, 8,9,10. Dessutom aktiveras Notch-signalering i både kondrocyter och osteoblaster under kraniofacial skelettutveckling genom juxtacrinsignalering när transmembran delta och / eller Jagged ligander binder till transmembrana Notch-receptorer på angränsande celler, som därefter klyvs och fosforyleras11. Det finns dock andra ligand- och receptorpar som är viktiga för kraniofacial utveckling som har flexibiliteten att fungera i både autokrin och parakrin signalering. Som ett exempel, under murin tandmorfogenes, har trombocyt-härledd tillväxtfaktor (PDGF) -AA-ligand visat sig signalera på ett autokrint sätt för att aktivera RTK PDGFRα i emaljorganepitelet12. Däremot, i murina ansiktsprocesser under mitten av graviditeten, uttrycks transkript som kodar för liganderna PDGF-AA och PDGF-CC i kraniofacial ektoderm, medan PDGFRα-receptorn uttrycks i det underliggande kraniala neurala crest-härledda mesenkymet, vilket resulterar i parakrinsignalering 13,14,15,16,17 . Oavsett signalmekanism resulterar dessa receptorfosforyleringshändelser ofta i rekrytering av adapterproteiner och / eller signalmolekyler, som ofta fosforyleras själva för att initiera intracellulära kinaskaskader såsom den mitogenaktiverade proteinkinasvägen (MAPK)18,19.

De terminala intracellulära effektorerna för dessa kaskader kan sedan fosforylera en rad substrat, såsom transkriptionsfaktorer, RNA-bindande, cytoskelettala och extracellulära matrisproteiner. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 och Sox926 är bland transkriptionsfaktorerna fosforylerade i samband med kraniofacial utveckling. Denna post-translationella modifiering (PTM) kan direkt påverka mottagligheten för alternativa PTM, dimerisering, stabilitet, klyvning och / eller DNA-bindande affinitet, bland andra aktiviteter 20,21,25,26. Dessutom fosforyleras det RNA-bindande proteinet Srsf3 i samband med kraniofacial utveckling, vilket leder till dess kärntranslokation27. I allmänhet har fosforylering av RNA-bindande proteiner visat sig påverka deras subcellulära lokalisering, protein-proteininteraktioner, RNA-bindning och / eller sekvensspecificitet28. Vidare kan fosforylering av aktomyosin leda till cytoskelettomläggningar under hela kraniofacial utveckling29,30, och fosforylering av extracellulära matrisproteiner, såsom små integrinbindande ligand N-länkade glykoproteiner, bidrar till biomineralisering under skelettutveckling31. Genom ovanstående och många andra exempel är det uppenbart att det finns stora konsekvenser för proteinfosforylering under kraniofacial utveckling. Genom att lägga till en ytterligare regleringsnivå moduleras proteinfosforylering ytterligare av fosfataser, vilket motverkar kinaser genom att avlägsna fosfatgrupper.

Dessa fosforyleringshändelser på både receptor- och effektormolekylnivåer är avgörande för utbredningen av signalvägar och resulterar i slutändan i förändringar i genuttryck i kärnan, vilket driver specifika cellaktiviteter, såsom migration, proliferation, överlevnad och differentiering, vilket resulterar i korrekt bildning av däggdjurets ansikte. Med tanke på kontextspecificiteten hos proteininteraktioner med kinaser och fosfataser, de resulterande förändringarna i PTM och deras effekter på cellaktivitet är det viktigt att dessa parametrar studeras i en fysiologiskt relevant miljö för att få fullständig förståelse för bidraget från fosforyleringshändelser till kraniofacial utveckling. Här ges exempel på två sammanhang för att studera fosforylering av proteiner och därmed aktivering av signalvägar under däggdjurs kraniofacial utveckling: mus ansiktsprocesser, i synnerhet E11.5 maxillära processer, och odlade musembryonala palatala mesenkymceller härledda från E13.5 sekundära palatala hyllor - både primära32 och odödliga33 . Vid E11.5 håller maxillära processer på att smälta samman med de laterala och mediala nasala processerna1, vilket representerar en kritisk tidpunkt under musens kraniofaciala utveckling. Vidare valdes maxillära processer och celler härledda från palatala hyllor här eftersom de senare strukturerna är derivat av den förra, vilket ger forskare möjlighet att förhöra proteinfosforylering in vivo och in vitro i relaterade sammanhang. Detta protokoll är dock också tillämpligt på alternativa ansiktsprocesser och utvecklingstider.

Ett kritiskt problem med att studera fosforylerade proteiner är att de lätt defosforyleras under proteinisolering av rikliga miljöfosfataser. För att övervinna denna barriär diskuteras anpassningar och modifieringar av standardlaboratoriemetoder som möjliggör isolering av fosforylerade proteiner. Dessutom tillhandahålls bästa praxis för korrekt analys och kvantifiering av fosforylerade proteiner. Dessa tekniker, särskilt i kombination med farmakologiska hämmare och/eller murina genetiska modeller, kan användas för att få större insikt i dynamiken och rollerna hos olika signalvägar som är aktiva under kraniofacial utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer som involverar djur godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Colorado Anschutz Medical Campus och utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och föreskrifter. Kvinnliga 129S4-möss vid 1,5-6 månaders ålder och inrymda vid en sub-termoneutral temperatur på 21-23 ° C användes för embryoskördar. Ett schematiskt arbetsflöde för protokollet visas i bild 1. Se materialförteckningen för detaljer om allt material, utrustning, programvara, reagenser och djur som används i detta protokoll.

1. Skörda E11.5 musembryon

  1. Avliva gravid kvinnlig mus 11,5 dagar efter upptäckt av vaginalplugg under tidsinställd parning i en CO2-kammare med IACUC-godkänd CO2-flödeshastighet som krävs för cirka 50% förskjutning (2,95 l / min i en 360 i3 kammare) och exponeringstid (se materialtabell). Utför cervikal dislokation som en sekundär metod för eutanasi. Fortsätt omedelbart till dissektion.
  2. Lägg muskroppen på ett dissekeringskort med den ventrala sidan uppåt. Spraya musens buk med 70% etanol.
  3. Öppna bukhålan genom att klämma och lyfta huden främre till vaginalöppningen med raka Semken-pincett och skära den lyfta huden och underliggande lager med rak bladkirurgisk sax i 45 ° vinkel på vardera sidan för att generera en "V" -form som sträcker sig till varje sidoyta ungefär halvvägs mellan frambenen och bakbenen.
  4. Använd Semken-tången, greppa ett av livmoderhornen och skär under äggledaren och ovanför livmoderhalsen med den kirurgiska saxen. Skär bort mesometrium för att möjliggöra fullständigt avlägsnande av livmoderhornet.
  5. Överför det dissekerade livmoderhornet till 10 ml histologifosfatbuffrad saltlösning (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasisk, 10,14 mM Na2HPO4 dibasisk, pH 7,4] i en 10 cm petriskål.
  6. Ta bort det andra livmoderhornet på den motsatta sidan av bukhålan med samma procedur som beskrivs i steg 1.4-1.5.
  7. Placera 10 cm petriskål som innehåller båda livmoderhornen på is om du inte omedelbart fortsätter till dissektion av enskilda embryon (dvs. om en andra kvinnlig mus kommer att dissekeras).
  8. Under ett dissekerande stereomikroskop dissekerar du försiktigt ut varje embryo från livmoderhornen med Dumont #5 fina pincett. Dra långsamt bort myometrium, decidua och chorion. Riv och ta bort den relativt transparenta amnionen som omger embryot och skär av navelsträngen som förbinder embryot med moderkakan.
  9. Överför varje dissekerat embryo till 2,5 ml histologi PBS i en individuell brunn av en 12-brunns cellodlingsplatta på is med hjälp av en skuren plastöverföringspipett eller en embryosked.
    OBS: Om du arbetar med en kull som kan innehålla embryon av mer än en genotyp, spara amnionen som omger varje embryo för genotypning genom att placera var och en i sitt eget förmärkta 0,5 ml mikrocentrifugrör på is.

2. Dissekera maxillära processer från E11.5 musembryon

  1. Förbered tre 10 cm petriskålar som innehåller 10 ml histologi PBS och förvara dem på is för att användas i rotation mellan embryon.
  2. Överför ett embryo från en enskild brunn i 12-brunnscellodlingsplattan till en av de 10 cm petriskålarna med histologi PBS på is med en skuren plastöverföringspipett eller en embryosked.
  3. Under dissekeringsmikroskopet separerar du varje maxillär process från ansiktet med hjälp av de fina pincetten. Skär först den främre sidan av en maxillär process längs den naturliga indragningen som skiljer den laterala nasala processen och maxillärprocessen (figur 2A).
  4. För det andra, skär den bakre sidan av maxillärprocessen längs den naturliga indragningen som skiljer maxillärprocessen och den mandibulära processen (figur 2A).
  5. För det tredje, för att helt separera maxillärprocessen, gör ett vertikalt snitt från de främre till bakre sidorna av maxillärprocessen på ögonsidan av maxillärprocessen där de naturliga indragningarna som refereras ovan slutar (figur 2A-C).
  6. Upprepa dessa tre snitt för maxillärprocessen på den motsatta sidan av ansiktet.
  7. Använd en 9 " Pasteur pipett med en 2 ml liten latexlampa, överför det dissekerade paret maxillära processer och en liten droppe på cirka 30 μL histologi PBS till en märkt 35 mm petriskål på is (figur 2D).
  8. Följ steg 2.3-2.7 för varje embryo och rotera de tre 10 cm petriskålarna som innehåller histologi PBS på is mellan embryon. Placera enskilda par dissekerade maxillära processer i separata 35 mm petriskålar på is.
    OBS: Separation av maxillärprocessen ectoderm och mesenkym (steg 2.9-2.17) kan utföras efter dissekering av maxillära processer för alla embryon i kullen. Om intakta maxillära processer som innehåller både ektoderm och mesenkym önskas, fortsätt till steg 2.18 nedan.
  9. Förbered 250 μl färskt 2% trypsin i vävnadsodling PBS och 250 μl 10% fetalt bovint serum (FBS) i vävnadsodling PBS och förvara på is.
  10. Placera en andra liten droppe på cirka 30 μl 2% trypsin i 35 mm petriskålen separat från den första, lilla droppen av histologi PBS som innehåller maxillära processer. Överför paret av maxillära processer till den lilla droppen på 2% trypsin med Pasteur-pipetten (figur 2D).
  11. Inkubera skålen på is i 15 min.
  12. Ta bort 35 mm petriskålen från isen och placera under dissekeringsmikroskopet.
  13. Använd de fina tångarna och dra långsamt och försiktigt av lagret av ektoderm från varje maxillär process (figur 2E).
    OBS: Om ektodermen inte separerar från mesenkymet i ett intakt ark, inkubera i 2% trypsin vid rumstemperatur (RT) i upp till 5 ytterligare minuter innan du fortsätter med separationen. Om vävnaden börjar sönderfalla i 2% trypsin, flytta maxillära processer till 10% FBS enligt beskrivningen nedan för att neutralisera trypsinet och avsluta separationen av ektoderm och mesenkym.
  14. När maxillärprocessen ectoderm och mesenkym har separerats (figur 2F), överför de önskade vävnaderna från paret av maxillära processer till en tredje, liten droppe på cirka 30 μl 10% FBS - separat från de två tidigare små dropparna - med hjälp av Pasteur-pipetten (figur 2D).
  15. Lägg 35 mm petriskålen på is för att stoppa trypsiniseringen.
  16. Inkubera de maxillära processvävnaderna på is i 10% FBS i 1-2 minuter och överför sedan vävnaderna från båda maxillära processerna till en fjärde, liten droppe på cirka 30 μL prechilled histologi PBS på is - separat från de tre tidigare små dropparna - med hjälp av Pasteur-pipetten (figur 2D).
  17. Inkubera de maxillära processvävnaderna i histologi PBS i 1 min medan du försiktigt virvlar histologin PBS runt maxillära processvävnader med spetsen på Pasteur-pipetten för att säkerställa att all FBS sköljs av vävnaden.
  18. Överför paret av maxillära processvävnader till ett märkt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is med Pasteur-pipetten, vilket minimerar överföringen av histologi PBS. Ta bort eventuellt överskott av histologi PBS i 1,5 ml mikrocentrifugröret med Pasteur-pipetten.
  19. Följ stegen ovan för att dissekera maxillära processer från varje embryo i kullen.
  20. Bearbeta proverna omedelbart för att isolera helcellsproteinlysater (nedan) eller förvara vid -80 °C på lång sikt. Före långvarig lagring, snäppfrys 1,5 ml mikrocentrifugrör i ett bad på 100% EtOH på torris i 5 minuter.

3. Isolera helcellsproteinlysater från musmaxillära processer

  1. Om maxillära processer tidigare frystes vid -80 °C, tina dem på is.
  2. Tillsätt 0,1 ml iskall NP-40-lysbuffert (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; lagrad vid 4 °C) med proteas- och fosfatashämmare (1x komplett miniproteashämmarecocktail [upplöst i vatten; lagrad vid -20 °C], 1 mM PMSF [upplöst i isopropanol; lagrad vid 4 °C], 10 mM NaF [lagrad vid -20 °C; undvik frysning/upptining], 1 mM Na3VO4 [lagrad vid -20 °C], 25 mM β-glycerofosfat [lagrad vid 4 °C]) tillsatt omedelbart före användning på is.
    OBS: Cellfraktionering kan alternativt utföras för att isolera cytoplasmatiska, nukleära, membran- eller mitokondriella proteinfraktioner.
  3. Pipet upp och ner 10 gånger med en 200 μL pipetman.
  4. Vortex i 10 s, och sedan pipet upp och ner 10 gånger med en 200 μL pipetman. Undvik att generera bubblor.
  5. Inkubera vid 4 °C i 2 timmar medan du roterar ände över ände med en 1,5 ml/2 ml paddel med en rörrevolver.
  6. Centrifugera proverna vid 13 500 × g i 20 minuter vid 4 °C.
  7. Samla supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is med en 200 ml pipetman.
  8. Kvantifiera proteinkoncentrationen med proteinanalyssatsen med hjälp av 10 μL proteinlysat + 10 μL NP-40-lysbuffert för experimentella prover och 3-5 utspädningar av bovint serumalbumin (fraktion V) (BSA) i NP-40-lysbuffert i intervallet 0,25-2,0 mg / ml som proteinstandarder.
  9. Fortsätt med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) (steg 5) eller frys snabbt de återstående lysaterna på torris och förvara vid -80 °C på lång sikt.

4. Isolering av helcellsproteinlysater från primära och/eller odödliga musembryonala palatmekceller (MEPM)

OBS: Isolering och odling av primära MEPM-celler från E13.5 musembryon och odödliga MEPM-celler har tidigare beskrivits 32,33,34. Stimulering av celler med tillväxtfaktor (steg 4.1-4.7) kan utföras före celllys. Om icke-stimulerade celler önskas, fortsätt till steg 4.8 nedan.

  1. Aspirera tillväxtmediet [Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) med 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 10% FBS] från MEPM-cellerna vid ~70% sammanflöde i en 6 cm cellodlingsskål med hjälp av en 5,75" Pasteur-pipett fäst vid ett vakuumsystem.
  2. Tvätta cellerna med 1 ml vävnadsodling PBS.
  3. Tillsätt 3 ml serumsvältmedium [DMEM med 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 0,1 % FBS] förvärmt i ett vattenbad på 37 °C.
  4. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 23 timmar.
  5. Byt ut serumsvältsmediet mot 3 ml färskt, förvärmt serumsvältmedium.
  6. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 1 timme.
  7. Stimulera cellerna med den valda tillväxtfaktorn vid en empiriskt bestämd koncentration under önskad tid.
  8. Aspirera mediet från MEPM-cellerna vid 80% -100% sammanflöde med hjälp av en 5.75 " Pasteur-pipett fäst vid ett vakuumsystem.
  9. Tvätta cellerna två gånger med iskall vävnadsodling PBS (1 ml för en 6 cm cellodlingsskål); luta plattan åt sidan under den sista tvätten för att säkerställa att all vävnadsodling PBS aspireras.
  10. Lysa cellerna genom att tillsätta iskall NP-40-lysbuffert med proteas- och fosfatashämmare tillsatta omedelbart före användning (0,1 ml för en 6 cm cellodlingsskål) på is.
  11. Inkubera plattan på is i 5 min med rotation ungefär varje min för att säkerställa fullständig täckning av plattan.
  12. Skrapa cellerna från plattan med en förkyld celllyftare och överför cellsuspensionen till ett förkylt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is.
  13. Inkubera cellsuspensionen vid 4 °C i 30 minuter medan du roterar ände över ände med en 1,5 ml/2 ml paddel med en rörrevolver.
  14. Fortsätt med steg 3.6-3.9 som beskrivs ovan.

5. Western blotting av helcellsproteinlysater från ansiktsprocesser hos mus och/eller MEPM-celler för fosfoproteiner

  1. Förbered helcellsproteinlysatprover för SDS-PAGE.
    1. Bestäm mängden protein som ska laddas, beroende på protein överflöd i vävnaden / cellen; 12,5 μg är vanligtvis tillräckligt för robust uttryckta proteiner i helcellsproteinlysater.
    2. Tillsätt en lika stor volym 2x Laemmli-buffert [20% glycerol, 4% SDS, 0,004% bromfenolblå, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] med 10% β-merkaptoetanol tillsatt omedelbart före användning.
      VARNING: β-merkaptoetanol är frätande på huden eller ögat, giftigt, farligt vid förtäring och har toxicitet i vattenmiljö. Hantera med handskar, laboratorierock, ansiktsskydd och skyddsglasögon i en kemisk dragskåp. Kassera enligt miljöhälso- och säkerhetsriktlinjerna.
    3. Blanda genom virvel.
    4. Värm proverna vid 100 °C i 5 min i ett mini-torrt bad.
    5. Blanda genom virvel och lägg proverna på is.
    6. Centrifugera vid 9 400 × g i 5 minuter vid 4 °C.
    7. Placera proverna en kort stund på is innan de laddas i SDS-PAGE gel, eller förvaras vid -20 °C på lång sikt.
  2. Utför SDS-PAGE med hjälp av en elektroforescell med en 4% -15% prefabricerad proteingel och elektroforesbuffert35.
  3. Elektro överför proteinerna till ett polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) med användning av överföringsbuffert med 0% -20% metanol (0% -10% för proteiner större än 100 kDa; 20% för proteiner mindre än 100 kDa) tillsatt omedelbart före användning35.
  4. Blockera membranet och sonden för fosfoprotein av intresse.
    1. Tvätta membranet i 1x tris-buffrad saltlösning (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] i 5 min i en western blot-låda.
    2. Inkubera membranet i 5 ml blockerande buffert [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w / v BSA; blandas väl och filtreras genom ett 25 mm sprutfilter med 0,2 μm porer med en 10 ml spruta med luerspets] i 1 timme i en western blotbox med omrörning på en orbital shaker.
      OBS: Använd inte mjölk som ett blockerande medel när du karakteriserar fosfoproteiner eftersom det innehåller fosfoproteinkasein, vilket kan orsaka en hög, ospecifik bakgrundssignal.
    3. Tvätta membranet tre gånger i 5 minuter vardera i TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] i en western blot box med omrörning på en orbital shaker.
    4. Inkubera membranet i 5 ml primär antikropp utspädd i blockerande buffert vid 4 °C över natten i ett 50 ml koniskt rör med en 50 ml paddel med en rörrevolver.
      OBS: Se antikroppsdatabladet för lämplig koncentration för western blotting.
    5. Tvätta membranet tre gånger vid RT i 5 minuter vardera i TBS-T i en western blot-låda med omrörning på en orbital shaker.
    6. Inkubera membranet i 5 ml lämpligt pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerat sekundärt antikropp utspätt i blockerande buffert i 1 timme i en western blot-låda med omrörning på en orbitalskakare.
    7. Tvätta membranet tre gånger i 5 minuter vardera i TBS-T i en western blot-låda med omrörning på en orbital shaker.
    8. Inkubera membranet i förbättrat kemiluminescens (ECL) western blotting-substrat [blanda lika stora volymer från flaskor 1 och 2; 0,5 ml vardera för stora (8,6 cm x 6,7 cm) membran] i 1 min, vilket säkerställer att hela membranet kontinuerligt exponeras för ECL western blotting-substratet.
    9. Töm membranet på överskott av ECL western blotting substrat och utveckla omedelbart med hjälp av en kemiluminescensbildare.
  5. Remsa membranet och reprobe för totalt protein av intresse.
    1. Placera PVDF-membranet i en genomskinlig påse med polyetenfoder som innehåller 5 ml strippbuffert [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] med 8 μl/ml β-merkaptoetanol tillsatt omedelbart före användning.
    2. Inkubera vid 50 °C i 30 min med gungning i en hybridiseringsugn med 11 varv per minut.
    3. Tvätta membranet tre gånger vid RT i 5 minuter vardera i TBS-T i en western blot-låda med omrörning på en orbital shaker.
    4. Fortsätt med steg 5.4.2-5.4.9 som beskrivs ovan.
  6. Kvantifiera västerländska blotbandtätheter med hjälp av ImageJ-programvara, normalisera nivåerna av det fosforylerade proteinet av intresse till nivåerna av det totala proteinet av intresse36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När man försöker karakterisera fosforyleringen av proteiner isolerade från musens ansiktsprocesser och /eller odlade palatala mesenkymceller, kommer de representativa resultaten idealiskt att avslöja ett distinkt, reproducerbart band efter western blotting med en antifosfoproteinantikropp som löper på eller nära höjden av motsvarande totala proteinband (figur 3 ). Om emellertid omfattande fosforylering av proteinet inträffar kan det finnas en liten uppåtgående förskjutning av fosfoproteinbandet jämfört med det totala proteinbandet. Vidare, om flera isoformer av ett protein existerar i en vävnad, som var och en fosforyleras, eller om proteinet varierande utsätts för ytterligare PTM, kan flera band förekomma i den västra fläcken med en antifosfoproteinantikropp. Om ingen signal observeras för fosfoproteinet av intresse, trots detektion av det totala proteinet av intresse, kan proteinet inte fosforyleras i det valda sammanhanget, eller ett tekniskt problem kan ha uppstått med protokollet. I det senare fallet kan western blotting av helcellslysater utföras med antifosfoserin/treonin och/eller antifosfotyrosinantikroppar för att indikera om protokollet fungerade som förväntat. Eftersom fosforylering av proteiner är riklig i kraniofaciala vävnader25,37, kommer närvaron av flera fosfoproteinband att indikera framgångsrikt slutförande av protokollet och exakta resultat från den initiala screeningen.

Det är ofta användbart att jämföra fosfoproteinnivåer mellan vildtyp och muterade embryovävnader eller som svar på behandling av odlade celler. I det förra fallet skulle en skillnad i fosfoproteinnivåer mellan genotyper framstå som en skillnad i bandintensiteter för fosfoproteinet av intresse med liknande nivåer av det totala proteinet av intresse27. I det senare fallet skulle representativa resultat avslöja ökade fosfoproteinbandintensiteter jämfört med obehandlade celler vid behandling med till exempel en tillväxtfaktor (figur 3) och minskade bandintensiteter efter behandling med en kinashämmare27,37. För kvantifiering av dessa skillnader skulle nivåerna av fosfoproteinet av intresse normaliseras till nivåer av det totala proteinet av intresse. Nivåerna av det totala proteinet av intresse förväntas vara relativt lika mellan proverna, ett fynd som bör bekräftas genom separat western blotting med användning av en eller flera antikroppar mot laddnings- och uttryckskontrollproteiner såsom β-tubulin, β-aktin och / eller GAPDH (Figur 3). För tillväxtfaktorbehandling av odlade celler kommer positiva resultat sannolikt att visa en ökning av fosfoproteinnivåerna inom en relativt kort tidsram på 2-15 minuter efter stimulering (Figur 3). Det bör finnas liten eller ingen fosforylering i avsaknad av tillväxtfaktorbehandling, såvida det inte finns andra faktorer som spelar in som resulterar i fosforylering av proteinet, exempel på vilka inkluderar endogent uttryck av tillväxtfaktorer av cellerna, fosforylering av proteinet av en annan signalmolekyl uttryckt av cellerna och / eller en mutation som leder till konstitutiv fosforylering av proteinet i avsaknad av tillväxtfaktorbehandling. Dessa faktorer bör beaktas vid tolkningen av resultaten. Negativa resultat inkluderar ingen förändring i fosforylering som svar på en tidskurs för tillväxtfaktorbehandling, i vilket fall protokollet bör utvärderas för underhåll av fosfoproteiner som beskrivs ovan. Dessutom kan processen med membranavlägsnande ibland påverka och minska de totala proteinnivåerna. I detta fall skulle motsatta trender för mängden fosfoprotein av intresse kontra det totala proteinet av intresse observeras. Detta är suboptimalt, eftersom de totala proteinnivåerna förväntas vara relativt lika mellan proverna, förutsatt lika belastning och uttryck av proteinet, med förändringar som endast sker i fosfoproteinnivåer.

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för isolering av helcellsproteinlysater från musens ansiktsprocesser och odlade palatala mesenkymceller för fosfoproteinanalys. Maxillära processer dissekeras från E11.5 musembryon på is, och /eller mediet aspireras från odlade MEPM-celler vid 80% -100% sammanflöde, som därefter tvättas två gånger med iskall PBS. Helcellsproteinlysater isoleras med användning av lysbuffert med proteas- och fosfatashämmare, följt av SDS-PAGE, elektrotransfer till ett PVDF-membran, blockering av membranet med BSA, sondering för fosfoproteinet, strippning av membranet, förebråelse för totalt protein och kvantifiering av bandintensiteter. Förkortningar: LNP = lateral nasal process; MxP = maxillär process; MdP = mandibulär process; PA2 = andra svalgbågen; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; FBS = fetalt bovint serum; PS = palatal hylla; MEPM = musembryonal palatal mesenkym; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores; PVDF = polyvinylidenfluorid; p-P = fosforylerat protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Dissektion av maxillära processer. (A) Sidovy av ett E11.5-musembryo med de tre snitt (märkta 1-3) som krävs för att separera MxP från ansiktet som indikeras av färgade linjer. (B) Sidovy av ett E11.5-musembryo efter avlägsnande av MxP skisserat med en streckad svart linje. (C) Dissekerad MxP. (D) En 35 mm petriskåluppsättning med små droppar PBS, 2% trypsin och 10% FBS för valfri separation av MxP ectoderm och mesenkym. (E) MxP med Ect delvis separerad från Mes. (F) Separerad MxP Ect och Mes. Skalstänger: 1 mm (A-C,E,F), 10 mm (D). Förkortningar: LNP = lateral nasal process; MxP = maxillär process; MdP = mandibulär process; PA2 = andra svalgbågen; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; FBS = fetalt bovint serum; Mes = mesenkym; Ect = ektoderm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: PDGFRβ- och MAPK-effektor Erk1/2 fosforylering som svar på PDGF-BB-ligandbehandling av odödliga MEPM-celler. Western blot-analys av helcellslysater från odödliga MEPM-celler efter en tidskurs på 10 ng / ml PDGF-BB-ligandstimulering från 2 min till 15 min med anti-fosfo-PDGFR, anti-PDGFRβ, anti-fosfo-Erk1/2, anti-Erk1/2 och anti-β-tubulin (E7) antikroppar. Flera band i anti-PDGFRβ-fläck representerar differentiellt glykosylerade proteiner. Förkortningar: PDGF = trombocyt-härledd tillväxtfaktor; WCL = helcellslysat; kD = kilodalton; WB = västra fläcken; p-PDGFR = fosforylerad PDGFR; PDGFR = PDGF-receptor; p-Erk = fosforylerad Erk; Erk = extracellulärt signalreglerat kinas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som beskrivs här gör det möjligt för forskare att undersöka kritiska fosforyleringsberoende signalhändelser under kraniofacial utveckling på ett robust och reproducerbart sätt. Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som säkerställer korrekt insamling av data och analys av resultat. Oavsett om det isolerar fosfoproteiner från musens ansiktsprocesser och / eller odlade palatala mesenkymceller, är det absolut nödvändigt att röra sig snabbt och effektivt samtidigt som alla reagenser och material hålls på is när de indikeras. Isens låga temperatur saktar ner metabolisk aktivitet i cellerna och skyddar därmed fosforylerade proteiner från fosfatasaktivitet38 och upprätthåller ett högt proteinutbyte. Användningen av tre separata 10 cm petriskålar under dissektion av maxillära processer säkerställer att alla dissektioner sker i tillräckligt prechilled histologi PBS. Relaterat är en ytterligare, väsentlig komponent i detta proteinisoleringsprotokoll användningen av fosfatashämmare i alla lysbuffertar. Dessa reagenser skyddar också fosfatgrupper på proteinet av intresse39,40 och upprätthåller integriteten hos det fosforylerade proteinet för vidare analys genom western blotting.

Detta protokoll introducerar dessutom modifieringar som möjliggör mer specifika analyser av fosfoproteiner i vävnad och odlade celler. I processen att dissekera ansiktsprocesser har valfria steg lagts till för separation av maxillärprocessen ectoderm och mesenkym för att möjliggöra studier av fackspecifik proteinfosforylering27. För att testa för effektiv isolering av dessa vävnadsskikt kan användare bedöma uttrycket av gener berikade i ektodermen, såsom Gabrp, Trim29, Esrp1 och Mpzl2, och / eller gener berikade i mesenkymet, såsom Aldh1a2 och AW55198441. För isolering av fosfoproteiner från odlade palatala mesenkymceller har valfria steg lagts till för tillväxtfaktorstimulering. I detta fall bör cellerna serum svältas i medium innehållande 0,0% -0,1% serum. Standardserum som FBS innehåller många tillväxtfaktorer42 som kan konvolvera resultat från exogen tillväxtfaktorstimulering. Således primerar tillfällig serumsvält celler för att svara på akut tillväxtfaktorbehandling.

Detta protokoll ger också optimerade metoder för att exakt kvantifiera proteinfosforylering. I de västra blottingstegen är det viktigt att blockera PVDF-membranet med BSA snarare än mjölk, som används i många vanliga västerländska blottningstekniker. Denna omkopplare är absolut nödvändig, eftersom mjölk innehåller fosfoproteinkasein43 och leder till hög bakgrundssignal vid analys av andra fosfoproteiner. Vidare är det viktigt att nivåerna av det fosforylerade proteinet av intresse kvantifieras mot nivåer av det totala proteinet av intresse snarare än nivåer av ett standardbelastningskontrollprotein. På detta sätt kan eventuella förändringar i uttrycket av det totala proteinet av intresse redovisas i kvantifieringen av fosfoproteinnivåer. Om proteinutbytet i allmänhet är för lågt för exakt fosfoproteindetektering kan vävnadsprover från samma stadium och genotyp slås samman27, och / eller celler kan odlas i större cellodlingskärl än de som beskrivs här för framtida experiment. Alternativt, om strippning konsekvent verkar förändra de totala proteinnivåerna, kan två metoder vidtas för att modifiera det beskrivna protokollet för att uppnå reproducerbara resultat: 1) användning av ett antikroppsschema som använder antifosfoprotein- och antiproteinantikroppar som genereras i olika värdarter i kombination med två artspecifika sekundära antikroppar och separera (om man använder HRP-konjugerade sekundära antikroppar) eller samtidigt (om man använder fluoroforkonjugerade sekundära antikroppar) utveckling av blottarna; eller 2) samtidig bearbetning av två identiska membran - den första inkuberad med en antifosfoproteinantikropp, den andra med en antiproteinantikropp. I båda alternativa metoderna bör nivåerna av det fosforylerade proteinet av intresse fortfarande kvantifieras mot nivåerna av det totala proteinet av intresse. Slutligen, eftersom fosforylering är en dynamisk process, bör fosfoproteinnivåerna bedömas i minst tre biologiska replikat per tillstånd. Ansiktsprocessvävnad från möss eller primära MEPM-celler som härrör från ett enskilt embryo eller en enskild pool av embryon från samma stadium och genotyp skulle utgöra en enda biologisk replikat. På samma sätt skulle odödliga MEPM-celler med olika passager utgöra biologiska replikat. Om odlade celler behandlas med tillväxtfaktor bör behandling av biologiska replikat ske på olika dagar med separata alikvoter av tillväxtfaktor.

Två begränsningar av det tillvägagångssätt som presenteras här finns, som diskuteras nedan och bör övervägas innan protokollet initieras. Den första handlar om det dynamiska området för ECL. ECL western blotting-substratet som rekommenderas i detta protokoll har ett brett dynamiskt omfång med låg pikogramkänslighet. Empiriskt kan dock proteiner med låg förekomst eller låg fosforyleringsstatus vara svåra att upptäcka med hjälp av dessa metoder. Om fosforylerade proteiner inte kan upptäckas efter 20 minuters ECL-substratinkubation rekommenderas att membranet tvättas i TBS-T enligt beskrivningen och istället inkubera membranet i ett högkänsligt ECL western blotting-substrat med låg femtogramkänslighet. Alternativt kan fluoroforkonjugerade sekundära antikroppar användas, som erbjuder ett bredare dynamiskt omfång än enzymbaserade metoder som ECL44. En andra begränsning uppstår från normaliseringsförfarandet. Som beskrivits utförligt rekommenderas att signal från fosfoproteinet av intresse normaliseras till signalen från det totala proteinet av intresse. Denna process bygger emellertid på antagandet att nivåerna av det totala proteinet av intresse inte förändras mellan proverna, vilket ofta bekräftas av separat western blotting med antikroppar mot ett eller flera hushållningsproteiner. Ett viktigt övervägande är dock att nivåerna av hushållningsproteiner kan förändras mellan prover på grund av ojämn belastning, ofullständig överföring till membranet och / eller skillnader i proteinuttryck. För att förbättra noggrannheten under normalisering kan forskare överväga att flytta för att implementera en sann total proteinfläck, såsom Ponceau S45, som upptäcker alla proteiner i varje membranfält och står för dessa tekniska begränsningar.

Sammantaget övervinner detta protokoll problemet med proteindefosforylering som vanligtvis uppstår under proteinisolering. Noggrann analys av proteinfosforylering kommer att hjälpa forskare att få en mer exakt förståelse för rollen som fosforylerade proteiner under kraniofacial utveckling. Dessutom erbjuder detta protokoll robusta och effektiva metoder för att analysera fosforylerade proteinnivåer i fysiologiskt relevanta sammanhang, var och en med sina egna fördelar. Medan proteinlysater från embryovävnader ger en statisk ögonblicksbild av proteinfosforylering in vivo, ger implementeringen av odlade celler data om dynamiska fosforyleringssvar på akuta behandlingar. Detta protokoll har förmågan att direkt bekräfta och utöka resultat och hypoteser som härrör från stora datamängder, t.ex. masspektrometri37 och RNA-sekvensering27, för att upptäcka nya interaktioner inom signalnätverk. Viktigt är att detta protokoll kan användas för att undersöka hur störningar i fosforylering direkt påverkar intracellulär signalering, genuttryck och cellulär aktivitet i kraniofaciala sammanhang. Dessa olika tillämpningar kommer i hög grad att öka förståelsen för effekterna av proteinfosforylering i kraniofacial utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

129S4 möss var en gåva från Dr Philippe Soriano, Icahn School of Medicine vid Mount Sinai. Detta arbete stöddes med medel från National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 och K02 DE028572 till K.A.F., F31 DE029976 till M.A.R. och F31 DE029364 till B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 182 Kraniofacial utveckling fosforylering fosfoproteiner mus maxillära processer musembryonala palatala mesenkymceller
Isolering av helcellsproteinlysater från musens ansiktsprocesser och odlade palatala mesenkymceller för fosfoproteinanalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter