Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

عزل تحلل بروتين الخلية الكاملة عن عمليات وجه الماوس وخلايا اللحمة المتوسطة الحنكية المستزرعة لتحليل البروتين الفوسفوبروتين

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

يقدم البروتوكول طريقة لعزل محللات بروتين الخلية الكاملة عن عمليات الوجه الجنينية للفئران التشريحية أو خلايا اللحمة الحنكية الجنينية للفئران المستزرعة وإجراء النشاف الغربي اللاحق لتقييم مستويات البروتين المفسفر.

Abstract

التطور القحفي الوجهي للثدييات هو عملية مورفولوجية معقدة تنسق خلالها مجموعات متعددة من الخلايا لتوليد الهيكل العظمي الجبهي الأنفي. تبدأ هذه التغيرات المورفولوجية وتستمر من خلال تفاعلات الإشارات المتنوعة ، والتي غالبا ما تشمل فسفرة البروتين بواسطة الكينازات. هنا ، يتم تقديم مثالين على السياقات ذات الصلة الفسيولوجية التي يمكن من خلالها دراسة فسفرة البروتينات أثناء التطور القحفي الوجهي للثدييات: عمليات وجه الفأر ، وخاصة عمليات الفك العلوي E11.5 ، وخلايا اللحمة الحنكية الجنينية للفئران المستزرعة المشتقة من أرفف الحنك الثانوية E13.5. للتغلب على الحاجز المشترك لإزالة الفسفرة أثناء عزل البروتين ، تتم مناقشة التعديلات والتعديلات على الطرق المختبرية القياسية التي تسمح بعزل البروتينات الفوسفورية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير أفضل الممارسات للتحليل السليم وتحديد كمية البروتينات الفوسفاتية بعد النشاف الغربي لتحلل بروتين الخلية الكاملة. يمكن استخدام هذه التقنيات ، خاصة بالاقتران مع المثبطات الدوائية و / أو النماذج الجينية الفئرانية ، لاكتساب نظرة ثاقبة أكبر على ديناميكيات وأدوار مختلف البروتينات الفوسفاتية النشطة أثناء التطور القحفي الوجهي.

Introduction

التطور القحفي الوجهي للثدييات هو عملية مورفولوجية معقدة تنسق خلالها مجموعات متعددة من الخلايا لتوليد الهيكل العظمي الجبهي الأنفي. في الفأر ، تبدأ هذه العملية في اليوم الجنيني (E) 9.5 مع تكوين البروز الجبهي الأنفي وأزواج من العمليات الفكية والفك السفلي ، كل منها يحتوي على خلايا القمة العصبية القحفية بعد الهجرة. تنشأ العمليات الأنفية الجانبية والإنسية من البروز الجبهي الأنفي مع ظهور حفر الأنف وتندمج في النهاية لتشكيل الخياشيم. علاوة على ذلك ، تندمج العمليات الأنفية الإنسية والعمليات الفكية لتوليد الشفة العليا. في الوقت نفسه ، يبدأ تكوين الحنك بتكوين نتوءات متميزة - الأرفف الحنكية الثانوية - من الجانب الفموي لعمليات الفك العلوي عند E11.5. بمرور الوقت ، تنمو الأرفف الحنكية لأسفل على جانبي اللسان ، وترتفع إلى وضع معاكس فوق اللسان ، وفي النهاية تندمج عند خط الوسط لتشكيل حنك مستمر يفصل بين تجاويف الأنف والفم بواسطة E16.51.

تبدأ هذه التغيرات المورفولوجية في جميع أنحاء التطور القحفي الوجهي وتستمر من خلال تفاعلات الإشارات المتنوعة ، والتي غالبا ما تشمل فسفرة البروتين بواسطة الكينازات. على سبيل المثال ، مستقبلات غشاء الخلية ، مثل العائلات الفرعية لمستقبلات عامل النمو المحول (TGF) β ، بما في ذلك مستقبلات البروتين المورفوجيني العظمي (BMPRs) ، وعائلات مستقبلات التيروزين كيناز (RTK) المختلفة ، يتم فسفرها ذاتيا عند ربط الليغاند وتنشيطه في خلايا القمة العصبية القحفية 2,3,4 . بالإضافة إلى ذلك ، يصبح مستقبل الغشاء المقترن بالبروتين G Smoothized مفسفرا في خلايا القمة العصبية القحفية والأديم الخارجي القحفي الوجهي في اتجاه مجرى النهر من ارتباط رباط القنفذ الصوتي (SHH) بمستقبل Patched1 ، مما يؤدي إلى تراكم سلس في الغشاء الهدبي وتنشيط مسار SHH5. يمكن أن تحدث مثل هذه التفاعلات بين مستقبلات الليغاند من خلال إشارات الأوتوكرين و / أو الباراكرين و / أو التجاور في السياقات القحفية الوجهية. على سبيل المثال ، من المعروف أن BMP6 يشير بطريقة أوتوكرين أثناء تمايز الخلايا الغضروفية6 ، في حين يتم التعبير عن عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) 8 في الأديم الخارجي لقوس البلعوم ويرتبط بأعضاء عائلة FGF من RTKs المعبر عنها في اللحمة المتوسطة قوس البلعوم بطريقة باراكرين لبدء نقش ونمو أقواس البلعوم7 ، 8,9,10. علاوة على ذلك ، يتم تنشيط إشارات Notch في كل من الخلايا الغضروفية والخلايا العظمية أثناء تطور الهيكل العظمي الوجهي من خلال إشارات juxtacrine عندما ترتبط Delta عبر الغشاء و / أو الأربطة الخشنة بمستقبلات Notch عبر الغشاء على الخلايا المجاورة ، والتي يتم شقها لاحقا وفسفوريلاتيد11. ومع ذلك ، هناك أزواج أخرى من الليغاند والمستقبلات مهمة للنمو القحفي الوجهي التي تتمتع بالمرونة للعمل في كل من إشارات الأوتوكرين والباراكرين. على سبيل المثال ، أثناء تكوين أسنان الفئران ، ثبت أن عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF)-AA ligand يشير بطريقة أوتوكرين لتنشيط RTK PDGFRα في ظهارة عضو المينا12. في المقابل ، في عمليات الوجه الفئرانية أثناء منتصف الحمل ، يتم التعبير عن النصوص التي تشفر الأربطة PDGF-AA و PDGF-CC في الأديم الخارجي القحفي الوجهي ، في حين يتم التعبير عن مستقبل PDGFRα في اللحمة المتوسطة المشتقة من القمة العصبية القحفية الأساسية ، مما يؤدي إلى إشارات باراكرين13،14،15،16،17 . بغض النظر عن آلية الإشارة، غالبا ما تؤدي أحداث فسفرة المستقبلات هذه إلى توظيف بروتينات محولة و / أو جزيئات إشارة، والتي غالبا ما تصبح مفسفرة نفسها لبدء شلالات كيناز داخل الخلايا مثل مسار كيناز البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK)18,19.

يمكن للمستجيبات الطرفية داخل الخلايا لهذه الشلالات بعد ذلك أن تفسر مجموعة من الركائز ، مثل عوامل النسخ ، وربط الحمض النووي الريبي ، وبروتينات المصفوفة الهيكلية الخلوية وخارج الخلية. Runx220 و Hand1 21 و Dlx3/5 22,23,24 وGli1-3 25 و Sox9 26 هي من بين عوامل النسخ المفسفرة في سياق التطور القحفي الوجهي. يمكن أن يؤثر هذا التعديل اللاحق للترجمة (PTM) بشكل مباشر على القابلية لل PTMs البديلة ، و dimerization ، والاستقرار ، والانقسام ، و / أو تقارب ربط الحمض النووي ، من بين أنشطة أخرى20،21،25،26. بالإضافة إلى ذلك ، يتم فسفرة البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي Srsf3 في سياق التطور القحفي الوجهي ، مما يؤدي إلى نقله النووي27. بشكل عام ، ثبت أن فسفرة البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي تؤثر على توطينها تحت الخلوي ، وتفاعلات البروتين والبروتين ، وربط الحمض النووي الريبي ، و / أو خصوصية التسلسل28. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي فسفرة الأكتوميوزين إلى إعادة ترتيب الهيكل الخلوي في جميع أنحاء التطور القحفي الوجهي29,30 ، وتساهم فسفرة بروتينات المصفوفة خارج الخلية ، مثل البروتينات السكرية الصغيرة المرتبطة ب ligand N المرتبطة ب integrin ، في التمعدن الحيوي أثناء تطور الهيكل العظمي31. من خلال الأمثلة المذكورة أعلاه والعديد من الأمثلة الأخرى ، من الواضح أن هناك آثارا واسعة على فسفرة البروتين أثناء التطور القحفي الوجهي. إضافة إلى مستوى إضافي من التنظيم ، يتم تعديل فسفرة البروتين بواسطة الفوسفاتيز ، الذي يتصدى للكينازات عن طريق إزالة مجموعات الفوسفات.

تعد أحداث الفسفرة هذه على كل من مستويات المستقبلات والجزيئات المستجيبة حاسمة لانتشار مسارات الإشارات وتؤدي في النهاية إلى تغييرات في التعبير الجيني في النواة ، مما يؤدي إلى أنشطة خلوية محددة ، مثل الهجرة والانتشار والبقاء والتمايز ، مما يؤدي إلى تكوين مناسب لوجه الثدييات. بالنظر إلى خصوصية سياق تفاعلات البروتين مع الكينازات والفوسفاتيز ، والتغيرات الناتجة في PTMs ، وآثارها على نشاط الخلايا ، فمن الأهمية بمكان أن تتم دراسة هذه المعلمات في بيئة ذات صلة فسيولوجيا لاكتساب فهم كامل لمساهمة أحداث الفسفرة في التطور القحفي الوجهي. هنا ، يتم تقديم أمثلة على سياقين لدراسة فسفرة البروتينات ، وبالتالي تنشيط مسارات الإشارات أثناء التطور القحفي الوجهي للثدييات: عمليات وجه الفأر ، وخاصة عمليات E11.5 الفكية ، وخلايا اللحمة المتوسطة الحنكية الجنينية للفئران المستزرعة المشتقة من الأرفف الحنكية الثانوية E13.5 - كلاهما أساسي32 وخلد33 . في E11.5 ، تكون العمليات الفكية في طور الاندماج مع العمليات الأنفية الجانبية والإنسية1 ، وبالتالي تمثل نقطة زمنية حرجة أثناء التطور القحفي الوجهي للفأر. علاوة على ذلك ، تم اختيار العمليات الفكية والخلايا المشتقة من الأرفف الحنكية هنا لأن الهياكل الأخيرة هي مشتقات من الأولى ، مما يوفر للباحثين الفرصة لاستجواب فسفرة البروتين في الجسم الحي وفي المختبر في السياقات ذات الصلة. ومع ذلك ، ينطبق هذا البروتوكول أيضا على عمليات الوجه البديلة والنقاط الزمنية التنموية.

هناك مشكلة حرجة في دراسة البروتينات المفسفرة وهي أنه يمكن إزالتها بسهولة أثناء عزل البروتين بواسطة الفوسفاتيز البيئي الوفير. للتغلب على هذا الحاجز ، تتم مناقشة التعديلات والتعديلات على الأساليب المختبرية القياسية التي تسمح بعزل البروتينات المفسفرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير أفضل الممارسات للتحليل السليم وتحديد كمية البروتينات المفسفرة. يمكن استخدام هذه التقنيات ، خاصة بالاقتران مع المثبطات الدوائية و / أو النماذج الجينية الفئرانية ، لاكتساب نظرة ثاقبة أكبر على ديناميكيات وأدوار مسارات الإشارات المختلفة النشطة أثناء التطور القحفي الوجهي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لحرم جامعة كولورادو أنشوتز الطبي وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية. تم استخدام إناث الفئران 129S4 في عمر 1.5-6 أشهر والموجودة في درجة حرارة شبه محايدة حراريا من 21-23 درجة مئوية لحصاد الأجنة. يتم تمثيل سير عمل تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات والبرامج والكواشف والحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. حصاد أجنة الفئران E11.5

  1. القتل الرحيم للفأر الأنثوي الحامل بعد 11.5 يوما من اكتشاف القابس المهبلي أثناء التزاوج الموقوت في غرفة CO 2 باستخدام معدل تدفق CO 2 المعتمد من IACUC المطلوب لإزاحة 50٪ تقريبا (2.95 لتر / دقيقة في 360 في3 غرف) ومدة التعرض (انظر جدول المواد). إجراء خلع عنق الرحم كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم. المضي قدما على الفور إلى تشريح.
  2. ضع جسم الماوس على لوح تشريح مع توجيه الجانب البطني لأعلى. رش بطن الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  3. افتح تجويف البطن عن طريق قرص ورفع الجلد الأمامي إلى فتحة المهبل باستخدام ملقط Semken المستقيم وقطع الجلد المرفوع والطبقات السفلية باستخدام مقص جراحي مستقيم بزاوية 45 درجة على كلا الجانبين لتوليد شكل "V" يمتد إلى كل سطح جانبي في منتصف الطريق تقريبا بين الأطراف الأمامية والخلفية.
  4. باستخدام ملقط Semken ، أمسك بأحد قرون الرحم وقطعه أسفل قناة البيض وفوق عنق الرحم باستخدام المقص الجراحي. قطع الميزوميتريوم للسماح بالإزالة الكاملة لقرن الرحم.
  5. انقل قرن الرحم المشوه إلى 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) [0.137 M NaCl ، 2.68 mM KCl ، 1.76 mM KH 2 PO 4 أحادي القاعدة ، 10.14 mM Na2HPO 4 ثنائي الأساس ،الرقم الهيدروجيني7.4] في طبق بتري 10 سم.
  6. قم بإزالة قرن الرحم الثاني على الجانب الآخر من تجويف البطن باستخدام نفس الإجراء الموضح في الخطوات 1.4-1.5.
  7. ضع طبق بتري 10 سم الذي يحتوي على قرني الرحم على الجليد إذا لم يشرع على الفور في تشريح الأجنة الفردية (أي إذا تم تشريح أنثى فأر ثانية).
  8. تحت مجهر ستيريو تشريحي ، قم بتشريح كل جنين بعناية من قرون الرحم باستخدام ملقط Dumont # 5 الدقيق. اسحب ببطء عضل الرحم و decidua و chorion. تمزيق وإزالة السلى الشفاف نسبيا المحيط بالجنين، وقطع الحبل السري الذي يربط الجنين بالمشيمة.
  9. انقل كل جنين تم تشريحه إلى 2.5 مل من الأنسجة PBS في بئر فردي من صفيحة زراعة خلية مكونة من 12 بئرا على الجليد باستخدام ماصة نقل بلاستيكية مقطوعة أو ملعقة جنين.
    ملاحظة: إذا كنت تعمل مع القمامة التي قد تحتوي على أجنة من أكثر من نمط وراثي واحد، احفظ السلى المحيطة بكل جنين للتنميط الجيني عن طريق وضع كل منها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الخاص به المسمى مسبقا 0.5 مل على الجليد.

2. تشريح عمليات الفك العلوي من أجنة الفئران E11.5

  1. تحضير ثلاثة أطباق بتري 10 سم تحتوي على 10 مل من الأنسجة PBS والاحتفاظ بها على الجليد لاستخدامها في التناوب بين الأجنة.
  2. انقل جنينا واحدا من بئر فردي من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا إلى أحد أطباق بتري التي يبلغ طولها 10 سم مع علم الأنسجة PBS على الجليد باستخدام ماصة نقل بلاستيكية مقطوعة أو ملعقة جنين.
  3. تحت المجهر تشريح ، افصل كل عملية فكية عن الوجه باستخدام الملقط الدقيق. أولا ، قم بقطع الجانب الأمامي من عملية الفك العلوي على طول المسافة البادئة الطبيعية التي تفصل بين عملية الأنف الجانبية وعملية الفك العلوي (الشكل 2A).
  4. ثانيا ، قطع الجانب الخلفي من عملية الفك العلوي على طول المسافة البادئة الطبيعية التي تفصل بين العملية الفكية وعملية الفك السفلي (الشكل 2A).
  5. ثالثا ، لفصل العملية الفكية تماما ، قم بعمل قطع رأسي من الجانبين الأمامي إلى الخلفي للعملية الفكية على جانب العين من العملية الفكية حيث المسافات البادئة الطبيعية المشار إليها أعلاه (الشكل 2A-C).
  6. كرر هذه الجروح الثلاثة لعملية الفك العلوي على الجانب الآخر من الوجه.
  7. باستخدام ماصة باستور مقاس 9 بوصات مع لمبة لاتكس صغيرة سعة 2 مل ، انقل الزوج التشريحي من العمليات الفكية وقطرة صغيرة تبلغ حوالي 30 ميكرولتر من الأنسجة PBS إلى طبق بتري 35 مم على الجليد (الشكل 2D).
  8. اتبع الخطوات 2.3-2.7 لكل جنين ، وقم بتدوير أطباق بتري الثلاثة التي يبلغ طولها 10 سم والتي تحتوي على الأنسجة PBS على الجليد بين الأجنة. ضع أزواجا فردية من عمليات الفك العلوي المشوهة في أطباق بتري منفصلة مقاس 35 مم على الجليد.
    ملاحظة: يمكن إجراء فصل الأديم الفك العلوي واللحمة المتوسطة (الخطوات 2.9-2.17) بعد تشريح العمليات الفكية لجميع الأجنة في القمامة. إذا كانت هناك حاجة إلى عمليات الفك العلوي السليمة التي تحتوي على كل من الأديم الخارجي واللحمة المتوسطة ، فانتقل إلى الخطوة 2.18 أدناه.
  9. تحضير 250 ميكرولتر من التربسين الطازج 2٪ في زراعة الأنسجة PBS و 250 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني 10٪ (FBS) في زراعة الأنسجة PBS وتخزينها على الجليد.
  10. ضع قطرة صغيرة ثانية تبلغ حوالي 30 ميكرولتر من التربسين بنسبة 2٪ في طبق بتري 35 مم منفصل عن أول قطرة صغيرة من الأنسجة PBS تحتوي على عمليات الفك العلوي. انقل زوج العمليات الفكية إلى قطرة صغيرة من التربسين بنسبة 2٪ باستخدام ماصة باستور (الشكل 2D).
  11. احتضن الطبق على الثلج لمدة 15 دقيقة.
  12. أزل طبق بتري 35 مم من الجليد وضعه تحت المجهر التشريحي.
  13. باستخدام الملقط الناعم ، اسحب ببطء وبعناية طبقة الأديم الخارجي من كل عملية فكية (الشكل 2E).
    ملاحظة: إذا لم ينفصل الأديم الخارجي عن اللحمة المتوسطة في ورقة سليمة، فقم باحتضان التربسين بنسبة 2٪ في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة تصل إلى 5 دقائق إضافية قبل الاستمرار في الفصل. إذا بدأ النسيج في التفكك في التربسين بنسبة 2٪ ، فقم بنقل العمليات الفكية إلى FBS بنسبة 10٪ كما هو موضح أدناه لتحييد التربسين وإنهاء فصل الأديم الخارجي واللحمة المتوسطة.
  14. بمجرد فصل الأديم الخارجي لعملية الفك العلوي واللحمة المتوسطة (الشكل 2F) ، انقل الأنسجة المطلوبة من زوج العمليات الفكية إلى قطرة ثالثة صغيرة تبلغ حوالي 30 ميكرولتر من 10٪ FBS - منفصلة عن القطرين الصغيرين السابقين - باستخدام ماصة باستور (الشكل 2D).
  15. ضع طبق بتري 35 مم على الثلج لوقف التربسين.
  16. احتضن أنسجة عملية الفك العلوي على الجليد في 10٪ FBS لمدة 1-2 دقيقة ، ثم انقل الأنسجة من كلتا العمليتين الفكيتين إلى قطرة رابعة صغيرة تبلغ حوالي 30 ميكرولتر من الأنسجة المبردة مسبقا PBS على الجليد - منفصلة عن القطرات الصغيرة الثلاث السابقة - باستخدام ماصة باستور (الشكل 2D).
  17. احتضان أنسجة العملية الفكية في الأنسجة PBS لمدة 1 دقيقة مع تدوير الأنسجة PBS بلطف حول أنسجة عملية الفك العلوي مع طرف ماصة باستور لضمان شطف جميع FBS من الأنسجة.
  18. انقل زوج أنسجة عملية الفك العلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل على الجليد باستخدام ماصة باستور ، مما يقلل من نقل الأنسجة PBS. قم بإزالة أي أنسجة زائدة PBS في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل باستخدام ماصة باستور.
  19. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه لتشريح العمليات الفكية من كل جنين في القمامة.
  20. قم بمعالجة العينات على الفور لعزل محللات بروتين الخلية الكاملة (أدناه) أو تخزينها عند -80 درجة مئوية على المدى الطويل. قبل التخزين على المدى الطويل، قم بتجميد أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل في حمام 100٪ EtOH على الثلج الجاف لمدة 5 دقائق.

3. عزل بروتين الخلية الكاملة من عمليات الفكين الفكي العلوي للفأر

  1. إذا كانت العمليات الفكية قد تم تجميدها مسبقا عند -80 درجة مئوية ، فقم بإذابتها على الجليد.
  2. أضف 0.1 مل من المخزن المؤقت لتحلل NP-40 البارد (20 ملليمتر Tris HCl pH 8 ، 150 mM NaCl ، 10٪ جليسرين ، 1٪ Nonidet P-40 ، 2 mM EDTA ؛ مخزنة عند 4 درجات مئوية) مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (1x كوكتيل مثبط للبروتياز الصغير الكامل [مذاب في الماء ؛ مخزن في -20 درجة مئوية] ، 1 mM PMSF [مذاب في الأيزوبروبانول ؛ مخزن في 4 درجات مئوية] ، 10 mM NaF [مخزنة عند -20 درجة مئوية ؛ تجنب التجميد / الذوبان] ، 1 mM Na3VO 4 [مخزنة عند -20 درجة مئوية] ، 25 mM β-glycerophosphate [مخزنة عند4 درجات مئوية]) تضاف مباشرة قبل الاستخدام على الجليد.
    ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك إجراء تجزئة الخلايا لعزل أجزاء البروتين السيتوبلازمي أو النووي أو الغشائي أو الميتوكوندريا.
  3. Pipet صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة 200 ميكرولتر.
  4. دوامة لمدة 10 ثوان ، ثم ماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات مع ماصة 200 ميكرولتر. تجنب توليد فقاعات.
  5. احتضن عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة أثناء الدوران من طرف إلى طرف باستخدام مجداف 1.5 مل / 2 مل مع مسدس أنبوبي.
  6. الطرد المركزي للعينات عند 13500 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  7. اجمع المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل على الجليد باستخدام ماصة سعة 200 مل.
  8. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة البروتين ، باستخدام 10 ميكرولتر من تحلل البروتين + 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل NP-40 للعينات التجريبية و 3-5 تخفيفات من ألبومين مصل البقر (الكسر V) (BSA) في مخزن NP-40 المخزن المؤقت للتحلل في نطاق 0.25-2.0 مجم / مل كمعايير للبروتين.
  9. تابع الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) (الخطوة 5) أو قم بتجميد الليزات المتبقية بسرعة على الثلج الجاف وتخزينها عند -80 درجة مئوية على المدى الطويل.

4. عزل بروتين الخلية الكاملة من الخلايا الأولية و / أو الخالدة من خلايا اللحمة المتوسطة الحنكية الجنينية (MEPM) الأولية و / أو الخالدة للفأر

ملاحظة: تم وصف عزل وزراعة خلايا MEPM الأولية من أجنة الفئران E13.5 وخلايا MEPM المخلدة سابقا32,33,34. يمكن إجراء تحفيز الخلايا ذات عامل النمو (الخطوات 4.1-4.7) قبل تحلل الخلايا. إذا كانت الخلايا غير المحفزة مطلوبة، فانتقل إلى الخطوة 4.8 أدناه.

  1. استنشاق وسط النمو [وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 50 U / مل من البنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 2 مللي متر L-glutamine ، و 10٪ FBS] من خلايا MEPM عند التقاء ~ 70٪ في طبق زراعة الخلايا 6 سم باستخدام ماصة باستور مقاس 5.75 بوصة متصلة بنظام فراغ.
  2. اغسل الخلايا ب 1 مل من زراعة الأنسجة PBS.
  3. أضف 3 مل من وسط تجويع المصل [DMEM مع 50 U / mL من البنسلين ، 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، 2 mM L-glutamine ، 0.1٪ FBS] تم تسخينه مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  4. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 23 ساعة.
  5. استبدل وسط تجويع المصل ب 3 مل من وسط تجويع المصل الطازج والمسخن مسبقا.
  6. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
  7. تحفيز الخلايا مع عامل النمو المفضل في تركيز محدد تجريبيا لطول الفترة الزمنية المطلوبة.
  8. قم بشفط الوسط من خلايا MEPM عند التقاء 80٪ -100٪ باستخدام ماصة باستور مقاس 5.75 بوصة متصلة بنظام تفريغ.
  9. اغسل الخلايا مرتين باستخدام زراعة الأنسجة الباردة المثلجة PBS (1 مل لطبق زراعة الخلايا 6 سم) ؛ قم بإمالة اللوحة إلى الجانب أثناء الغسيل الأخير لضمان شفط جميع زراعة الأنسجة PBS.
  10. قم بتحليل الخلايا عن طريق إضافة مخزن مؤقت لتحلل NP-40 بارد مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز المضافة مباشرة قبل الاستخدام (0.1 مل لطبق زراعة الخلايا 6 سم) على الجليد.
  11. احتضن الصفيحة على الجليد لمدة 5 دقائق مع الدوران كل دقيقة تقريبا لضمان التغطية الكاملة للصفيحة.
  12. كشط الخلايا من اللوحة باستخدام رافع خلية مبرد مسبقا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل مبرد مسبقا على الجليد.
  13. احتضن تعليق الخلية عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أثناء الدوران من طرف إلى طرف باستخدام مجداف 1.5 مل / 2 مل مع مسدس أنبوبي.
  14. تابع الخطوات من 3.6 إلى 3.9 الموضحة أعلاه.

5. النشاف الغربي لبروتين الخلية الكاملة من عمليات وجه الفأر و / أو خلايا MEPM للفوسفوبروتينات

  1. قم بإعداد عينات تحلل بروتين الخلية الكاملة ل SDS-PAGE.
    1. تحديد كمية البروتين المراد تحميلها ، اعتمادا على وفرة البروتين في الأنسجة / الخلية ؛ عادة ما يكون 12.5 ميكروغرام كافيا للبروتينات المعبر عنها بقوة في lysates بروتين الخلية الكاملة.
    2. أضف حجما متساويا من 2x Laemmli buffer [20٪ جليسرين ، 4٪ SDS ، 0.004٪ بروموفينول أزرق ، 0.125 M Tris HCl pH 6.8] مع إضافة 10٪ β-mercaptoethanol مباشرة قبل الاستخدام.
      تحذير: β-mercaptoethanol هو تآكل الجلد أو العين ، سامة ، خطرة إذا تم ابتلاعها ، ولها سمية مائية. تعامل مع ارتداء القفازات ومعطف المختبر ودرع الوجه ونظارات السلامة في غطاء الدخان الكيميائي. تخلص منها وفقا لإرشادات الصحة والسلامة البيئية.
    3. مزيج عن طريق الدوامة.
    4. سخني العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حمام جاف صغير.
    5. تخلط عن طريق الدوامة ووضع العينات على الجليد.
    6. جهاز طرد مركزي عند 9400 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. ضع العينات لفترة وجيزة على الثلج قبل تحميلها في جل SDS-PAGE ، أو قم بتخزينها على درجة حرارة -20 درجة مئوية على المدى الطويل.
  2. قم بإجراء SDS-PAGE باستخدام خلية الرحلان الكهربائي مع هلام البروتين مسبق الصب بنسبة 4٪ -15٪ والرحلان الكهربائي المؤقت35.
  3. نقل البروتينات كهربائيا إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) باستخدام مخزن مؤقت للنقل مع 0٪ -20٪ ميثانول (0٪ -10٪ للبروتينات الأكبر من 100 كيلو دالتون؛ 20٪ للبروتينات أقل من 100 كيلو دالتون) تضاف مباشرة قبل الاستخدام35.
  4. كتلة الغشاء والتحقيق للفوسفوبروتين من الفائدة.
    1. بعد النقل ، اغسل الغشاء في محلول ملحي مخزن مؤقتا 1x (TBS) [20 mM Tris ، 0.137 M NaCl ، الرقم الهيدروجيني 7.6] لمدة 5 دقائق في صندوق لطخة غربي.
    2. احتضن الغشاء في 5 مل من المخزن المؤقت المانع [1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 ، 5٪ w / v BSA ؛ مختلطة جيدا وتصفيتها من خلال مرشح حقنة 25 مم مع مسام 0.2 ميكرومتر باستخدام حقنة 10 مل مع طرف luer] لمدة 1 ساعة في صندوق لطخة غربي مع إثارة على شاكر مداري.
      ملاحظة: لا تستخدم الحليب كعامل مانع عند توصيف البروتينات الفوسفاتية لأنها تحتوي على الكازين فوسفوبروتين ، والذي يمكن أن يسبب إشارة خلفية عالية وغير محددة.
    3. اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في TBS-T [1x TBS ، 0.1٪ Tween 20] في صندوق لطخة غربي مع إثارة على شاكر مداري.
    4. احتضن الغشاء في 5 مل من الأجسام المضادة الأولية المخففة في العازل المانع عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في أنبوب مخروطي 50 مل باستخدام مجداف 50 مل مع مسدس أنبوبي.
      ملاحظة: راجع ورقة بيانات الأجسام المضادة للحصول على التركيز المناسب للنشاف الغربي.
    5. اغسل الغشاء ثلاث مرات في RT لمدة 5 دقائق لكل منها في TBS-T في صندوق لطخة غربي مع إثارة على شاكر مداري.
    6. احتضن الغشاء في 5 مل من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع بيروكسيديز الفجل المناسب (HRP) المخفف في المخزن المؤقت المانع لمدة 1 ساعة في صندوق لطخة غربي مع إثارة على شاكر مداري.
    7. اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في TBS-T في صندوق لطخة غربي مع إثارة على شاكر مداري.
    8. احتضان الغشاء في ركيزة النشاف الغربية المحسنة (ECL) [خلط كميات متساوية من الزجاجات 1 و 2 ؛ 0.5 مل من كل منها للأغشية الكبيرة (8.6 سم × 6.7 سم)] لمدة دقيقة واحدة ، مما يضمن تعرض الغشاء بأكمله باستمرار لركيزة النشاف الغربية ECL.
    9. استنزاف غشاء الركيزة الغربية ECL الزائدة النشاف وتطوير على الفور باستخدام جهاز تصوير التلألؤ الكيميائي.
  5. تجريد الغشاء وإعادة التحقيق للحصول على البروتين الكلي للاهتمام.
    1. ضع غشاء PVDF في كيس شفاف مع بطانة من البولي إيثيلين تحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت للتجريد [2٪ SDS ، 62.5 mM Tris HCl pH 6.8] مع إضافة 8 ميكرولتر / مل من β-mercaptoethanol مباشرة قبل الاستخدام.
    2. احتضن عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الهزاز في فرن التهجين بسرعة 11 دورة في الدقيقة.
    3. اغسل الغشاء ثلاث مرات في RT لمدة 5 دقائق لكل منها في TBS-T في صندوق لطخة غربي مع إثارة على شاكر مداري.
    4. تابع الخطوات 5.4.2-5.4.9 الموضحة أعلاه.
  6. قم بقياس كثافات نطاق اللطخة الغربية باستخدام برنامج ImageJ ، وتطبيع مستويات البروتين المفسفرة ذات الأهمية إلى مستويات البروتين الكلي محل الاهتمام36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عند محاولة توصيف فسفرة البروتينات المعزولة من عمليات وجه الفأر و / أو خلايا اللحمة الحنكية المستزرعة ، ستكشف النتائج التمثيلية بشكل مثالي عن شريط مميز قابل للتكرار بعد النشاف الغربي بجسم مضاد مضاد للفوسفوبروتين يعمل عند أو بالقرب من ارتفاع نطاق البروتين الكلي المقابل (الشكل 3 ). ومع ذلك ، إذا حدث فسفرة واسعة النطاق للبروتين ، فقد يكون هناك تحول تصاعدي طفيف في نطاق البروتين الفوسفوبروتيني مقارنة بنطاق البروتين الكلي. علاوة على ذلك ، إذا كانت هناك أشكال متساوية متعددة من البروتين في الأنسجة ، كل منها مفسفرة ، أو تعرض البروتين بشكل متغير ل PTMs إضافية ، فقد تظهر نطاقات متعددة في اللطخة الغربية مع جسم مضاد مضاد للفوسفوبروتين. إذا لم يتم ملاحظة أي إشارة للبروتين الفوسفوبروتيني ذي الأهمية ، على الرغم من اكتشاف البروتين الكلي محل الاهتمام ، فقد لا يتم فسفرة البروتين في السياق المختار ، أو قد تنشأ مشكلة فنية مع البروتوكول. في الحالة الأخيرة ، يمكن إجراء النشاف الغربي لمحللات الخلايا الكاملة باستخدام الأجسام المضادة المضادة للفوسفوسرين / الثريونين و / أو الأجسام المضادة للفوسفوتيروزين للإشارة إلى ما إذا كان البروتوكول يعمل كما هو متوقع. نظرا لأن فسفرة البروتينات وفيرة في الأنسجة القحفية الوجهية25,37 ، فإن وجود نطاقات فوسفوبروتين متعددة سيشير إلى الانتهاء بنجاح من البروتوكول ونتائج دقيقة من الفحص الأولي.

غالبا ما يكون من المفيد مقارنة مستويات البروتين الفوسفوبروتيني بين أنسجة الأجنة البرية والمتحولة أو استجابة لعلاج الخلايا المستزرعة. في الحالة الأولى ، يظهر اختلاف في مستويات البروتين الفوسفوبروتين بين الأنماط الجينية كاختلاف في كثافة النطاق للبروتين الفوسفوبروتيني ذي الأهمية مع مستويات مماثلة من البروتين الكلي محل الاهتمام27. في الحالة الأخيرة ، ستكشف النتائج التمثيلية عن زيادة كثافة نطاق البروتين الفوسفوبروتين مقارنة بتلك الموجودة في الخلايا غير المعالجة عند العلاج ، على سبيل المثال ، بعامل نمو (الشكل 3) وانخفاض كثافة النطاق بعد العلاج بمثبط كيناز27,37. لتحديد كمية هذه الاختلافات ، سيتم تطبيع مستويات البروتين الفوسفوبروتيني ذي الأهمية إلى مستويات البروتين الكلي محل الاهتمام. من المتوقع أن تكون مستويات البروتين الكلي محل الاهتمام متساوية نسبيا بين العينات ، وهي نتيجة يجب تأكيدها عن طريق النشاف الغربي المنفصل باستخدام واحد أو أكثر من الأجسام المضادة ضد بروتينات التحكم في التحميل والتعبير مثل β-tubulin و β-actin و / أو GAPDH (الشكل 3). بالنسبة لعلاج عامل النمو للخلايا المستزرعة ، من المرجح أن تظهر النتائج الإيجابية زيادة في مستويات البروتين الفوسفوبروتيني في إطار زمني قصير نسبيا يتراوح بين 2-15 دقيقة بعد التحفيز (الشكل 3). يجب أن يكون هناك القليل من الفسفرة أو لا يوجد على الإطلاق في غياب علاج عامل النمو ، ما لم تكن هناك عوامل أخرى تلعب دورا يؤدي إلى فسفرة البروتين ، ومن الأمثلة على ذلك التعبير الداخلي لعوامل النمو بواسطة الخلايا ، وفسفرة البروتين بواسطة جزيء إشارة آخر تعبر عنه الخلايا ، و / أو طفرة تؤدي إلى الفسفرة التأسيسية للبروتين في غياب علاج عامل النمو. وينبغي النظر في هذه العوامل عند تفسير النتائج. لا تشمل النتائج السلبية أي تغيير في الفسفرة استجابة للمسار الزمني لعلاج عامل النمو ، وفي هذه الحالة يجب تقييم البروتوكول للحفاظ على البروتينات الفوسفاتية كما هو مفصل أعلاه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لعملية تجريد الغشاء أن تؤثر أحيانا على مستويات البروتين الكلية وتختزلها. في هذه الحالة ، سيتم ملاحظة اتجاهات معاكسة لكمية بروتين الفوسفو محل الاهتمام مقابل البروتين الكلي محل الاهتمام. هذا دون المستوى الأمثل ، حيث من المتوقع أن تكون مستويات البروتين الإجمالية متساوية نسبيا عبر العينات ، بافتراض تساوي الحمل والتعبير عن البروتين ، مع حدوث تغييرات فقط في مستويات البروتين الفوسفوبروتيني.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل لعزل بروتين الخلية الكاملة من عمليات وجه الفئران وخلايا اللحمة المتوسطة الحنكية المستزرعة لتحليل بروتين الفوسفوبروتين. يتم تشريح عمليات الفك العلوي من أجنة الفئران E11.5 على الجليد ، و / أو يتم شفط الوسط من خلايا MEPM المستزرعة عند التقاء 80٪ -100٪ ، والتي يتم غسلها لاحقا مرتين باستخدام PBS البارد المثلج. يتم عزل محللات بروتين الخلية الكاملة باستخدام مخزن التحلل العازل مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز ، تليها SDS-PAGE ، والنقل الكهربائي إلى غشاء PVDF ، وحجب الغشاء باستخدام BSA ، والتحقيق في الفوسفوبروتين ، وتجريد الغشاء ، وتجديد البروتين الكلي ، وكمية كثافة النطاق. الاختصارات: LNP = عملية الأنف الجانبية; MxP = عملية الفك العلوي; MdP = عملية الفك السفلي; PA2 = قوس البلعوم الثاني; PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ FBS = مصل البقر الجنيني; PS = رف حنكي. MEPM = اللحمة المتوسطة الحنكية الجنينية الفأر. SDS-PAGE = كبريتات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد هلام الكهربائي الرحلان الكهربائي. PVDF = فلوريد البولي فينيليدين. p-P = البروتين المفسفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تشريح العمليات الفكية. (أ) منظر جانبي لجنين فأر E11.5 مع الجروح الثلاثة (المسماة 1-3) المطلوبة لفصل MxP عن الوجه المشار إليه بخطوط ملونة. (ب) منظر جانبي لجنين فأر E11.5 بعد إزالة MxP موضح بخط أسود متقطع. (C) تشريح MxP. (D) إعداد طبق بتري 35 مم مع قطرات صغيرة من PBS و 2٪ من التربسين و 10٪ FBS للفصل الاختياري للأديم الخارجي MxP واللحمة المتوسطة. (ه) MxP مع Ect منفصلة جزئيا عن Mes. (و) فصل MxP Ect و MES. قضبان الميزان: 1 مم (A-C، E، F)، 10 مم (D). الاختصارات: LNP = عملية الأنف الجانبية; MxP = عملية الفك العلوي; MdP = عملية الفك السفلي; PA2 = قوس البلعوم الثاني; PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ FBS = مصل البقر الجنيني; Mes = اللحمة المتوسطة; Ect = الأديم الخارجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: PDGFRβ و MAPK المستجيب Erk1/2 الفسفرة استجابة لعلاج PDGF-BB ligand لخلايا MEPM الخالدة. تحليل اللطخة الغربية لتحلل الخلايا الكاملة من خلايا MEPM المخلدة بعد دورة زمنية من 10 نانوغرام / مل من تحفيز الرباط PDGF-BB من دقيقتين إلى 15 دقيقة مع الأجسام المضادة للفوسفو-PDGFR ، والمضادة PDGFRβ ، والمضادة للفوسفو-Erk1/2 ، والمضادة ل Erk1/2 ، والأجسام المضادة المضادة β-tubulin (E7). تمثل النطاقات المتعددة في اللطخة المضادة ل PDGFRβ البروتينات الغليكوزيلية بشكل مختلف. الاختصارات: PDGF = عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية. WCL = محللات خلية كاملة. kD = كيلودالتون. WB = لطخة غربية; p-PDGFR = PDGFR المفسفرة. PDGFR = مستقبلات PDGF; p-Erk = Erk المفسفر. Erk = كيناز منظم بإشارة خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يسمح البروتوكول الموصوف هنا للباحثين بالتحقيق في أحداث الإشارات الحرجة المعتمدة على الفسفرة أثناء التطور القحفي الوجهي بطريقة قوية وقابلة للتكرار. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تضمن الجمع السليم للبيانات وتحليل النتائج. سواء كان عزل البروتينات الفوسفاتية عن عمليات وجه الفأر و / أو خلايا اللحمة المتوسطة الحنكية المستزرعة ، فمن الضروري التحرك بسرعة وكفاءة مع الحفاظ على جميع الكواشف والمواد على الجليد عند الإشارة إليها. تؤدي درجة الحرارة المنخفضة للجليد إلى إبطاء النشاط الأيضي في الخلايا ، وبالتالي حماية البروتينات المفسفرة من نشاط الفوسفاتيز38 والحفاظ على إنتاجية عالية من البروتين. يضمن استخدام ثلاثة أطباق بتري منفصلة مقاس 10 سم أثناء تشريح عمليات الفك العلوي أن تتم جميع عمليات التشريح في الأنسجة المبردة مسبقا بما فيه الكفاية PBS. وفي سياق متصل ، فإن أحد المكونات الإضافية والأساسية لبروتوكول عزل البروتين هذا هو استخدام مثبطات الفوسفاتيز في جميع مخازن التحلل المؤقتة. تحمي هذه الكواشف أيضا مجموعات الفوسفات على البروتين ذي الأهمية39,40 وتحافظ على سلامة البروتين المفسفرة لمزيد من التحليل بواسطة النشاف الغربي.

بالإضافة إلى ذلك ، يقدم هذا البروتوكول تعديلات تسمح بإجراء تحليلات أكثر تحديدا للبروتينات الفوسفاتية في الأنسجة والخلايا المستزرعة. في عملية تشريح عمليات الوجه ، تمت إضافة خطوات اختيارية لفصل عملية الفك العلوي الخارجية واللحمة المتوسطة للسماح بدراسة فسفرة البروتين الخاصة بالمقصورة27. لاختبار العزل الفعال لطبقات الأنسجة هذه ، يمكن للمستخدمين تقييم التعبير عن الجينات المخصب في الأديم الخارجي ، مثل Gabrp و Trim29 و Esrp1 و Mpzl2 و / أو الجينات المخصبة في اللحمة المتوسطة ، مثل Aldh1a2 و AW55198441. لعزل البروتينات الفوسفاتية عن خلايا اللحمة المتوسطة الحنكية المستزرعة ، تمت إضافة خطوات اختيارية لتحفيز عامل النمو. في هذه الحالة ، يجب تجويع الخلايا في المصل في وسط يحتوي على مصل 0.0٪ -0.1٪. تحتوي الأمصال القياسية مثل FBS على العديد من عوامل النمو42 التي يمكن أن تتراكم النتائج الناتجة عن تحفيز عامل النمو الخارجي. وبالتالي ، فإن التجويع المؤقت في المصل يهيئ الخلايا للاستجابة لعلاج عامل النمو الحاد.

يوفر هذا البروتوكول أيضا طرقا محسنة لتحديد كمية فسفرة البروتين بدقة. في خطوات النشاف الغربية ، من المهم منع غشاء PVDF باستخدام BSA بدلا من الحليب ، والذي يستخدم في العديد من تقنيات النشاف الغربية القياسية. هذا التبديل أمر حتمي ، لأن الحليب يحتوي على الكازين الفوسفوبروتين43 ويؤدي إلى إشارة خلفية عالية في تحليل البروتينات الفوسفاتية الأخرى. علاوة على ذلك ، من المهم أن يتم تحديد مستويات البروتين المفسفرة ذات الأهمية مقابل مستويات البروتين الكلي محل الاهتمام بدلا من مستويات بروتين التحكم في التحميل القياسي. بهذه الطريقة ، يمكن حساب أي تغييرات في التعبير عن البروتين الكلي للاهتمام في تحديد مستويات البروتين الفوسفوبروتيني. إذا كان إنتاج البروتين بشكل عام منخفضا جدا للكشف الدقيق عن بروتين الفوسفوبروتين ، فقد يتم تجميع عينات الأنسجة من نفس المرحلة والنمط الجيني27 ، و / أو يمكن زراعة الخلايا في أوعية زراعة الخلايا الأكبر من تلك الموضحة هنا للتجارب المستقبلية. بدلا من ذلك ، إذا بدا أن التجريد باستمرار يغير مستويات البروتين الكلية ، فيمكن اتباع نهجين لتعديل البروتوكول الموصوف لتحقيق نتائج قابلة للتكرار: 1) استخدام مخطط الأجسام المضادة الذي يستخدم الأجسام المضادة المضادة للفوسفوبروتين والبروتين المضادة المتولدة في أنواع مضيفة مختلفة جنبا إلى جنب مع اثنين من الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع ومنفصلة (إذا كنت تستخدم أجساما مضادة ثانوية مقترنة ب HRP) أو متزامنة (إذا كنت تستخدم أجساما مضادة ثانوية مقترنة بالفلوروفور) تطوير البقع ؛ أو 2) المعالجة المتزامنة لغشاءين متطابقين - الأول محتضن بجسم مضاد مضاد للفوسفوبروتين ، والثاني بجسم مضاد مضاد للبروتين. في كلا النهجين البديلين ، لا يزال ينبغي تحديد مستويات البروتين المفسفرة ذات الأهمية مقابل مستويات البروتين الكلي محل الاهتمام. وأخيرا، بما أن الفسفرة هي عملية ديناميكية، ينبغي تقييم مستويات البروتين الفوسفوبروتيني في ثلاثة تكرارات بيولوجية على الأقل لكل حالة. تشكل أنسجة عملية وجه الفأر أو خلايا MEPM الأولية المشتقة من جنين فردي أو مجموعة فردية من الأجنة من نفس المرحلة والنمط الجيني نسخة بيولوجية واحدة. وبالمثل ، فإن خلايا MEPM المخلدة من ممرات مختلفة ستشكل نسخا بيولوجية. إذا تم التعامل مع الخلايا المستزرعة بعامل النمو ، فيجب أن يحدث علاج النسخ المتماثلة البيولوجية في أيام مختلفة باستخدام أليكوت منفصل لعامل النمو.

ويوجد قيدين للنهج المعروض هنا، تجري مناقشتهما أدناه وينبغي النظر فيهما قبل الشروع في البروتوكول. الأول ينطوي على النطاق الديناميكي ل ECL. تحتوي ركيزة النشاف الغربية ECL الموصى بها في هذا البروتوكول على نطاق ديناميكي واسع ، مع حساسية بيكوغرام منخفضة. ومع ذلك ، من الناحية التجريبية ، قد يكون من الصعب اكتشاف البروتينات ذات الوفرة المنخفضة أو حالة الفسفرة المنخفضة باستخدام هذه الطرق. إذا كانت البروتينات المفسفرة غير قابلة للكشف بعد 20 دقيقة من حضانة الركيزة ECL ، فمن المستحسن غسل الغشاء في TBS-T كما هو موضح وبدلا من ذلك احتضان الغشاء في ركيزة نشاف غربية ECL عالية الحساسية مع حساسية منخفضة للفيمتوجرام. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروفور ، والتي توفر نطاقا ديناميكيا أوسع من النهج القائمة على الإنزيم مثل ECL44. ينشأ قيد ثان من إجراء التطبيع. كما هو موضح على نطاق واسع ، يوصى بتطبيع الإشارة من البروتين الفوسفوبروتين محل الاهتمام إلى الإشارة من البروتين الكلي للاهتمام. ومع ذلك ، تعتمد هذه العملية على افتراض أن مستويات البروتين الكلي محل الاهتمام لا تتغير بين العينات ، وهو ما يتم تأكيده غالبا عن طريق النشاف الغربي المنفصل باستخدام الأجسام المضادة ضد واحد أو أكثر من بروتينات التدبير المنزلي. ومع ذلك ، فإن أحد الاعتبارات المهمة هو أن مستويات بروتينات التدبير المنزلي قد تتغير بين العينات بسبب التحميل غير المتساوي ، والنقل غير الكامل إلى الغشاء ، و / أو الاختلافات في التعبير عن البروتين. وبالتالي ، لتعزيز الدقة أثناء التطبيع ، يمكن للباحثين التفكير في الانتقال إلى تنفيذ بقعة بروتين كلية حقيقية ، مثل Ponceau S45 ، الذي يكتشف جميع البروتينات في كل ممر من الغشاء ويفسر هذه القيود التقنية.

بشكل عام ، يتغلب هذا البروتوكول على مشكلة إزالة الفسفرة من البروتين التي تحدث عادة أثناء عزل البروتين. سيساعد التحليل الدقيق لفسفرة البروتين الباحثين على اكتساب فهم أكثر دقة لدور البروتينات المفسفرة أثناء التطور القحفي الوجهي. علاوة على ذلك ، يوفر هذا البروتوكول طرقا قوية وفعالة لتحليل مستويات البروتين المفسفرة في السياقات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، ولكل منها فوائدها الخاصة. في حين أن تحلل البروتين من أنسجة الجنين يوفر لقطة ثابتة لفسفرة البروتين في الجسم الحي ، فإن تنفيذ الخلايا المستزرعة يوفر بيانات عن استجابات الفسفرة الديناميكية للعلاجات الحادة. ويتمتع هذا البروتوكول بالقدرة على تأكيد النتائج والفرضيات الناشئة عن مجموعات البيانات الكبيرة والتوسع فيها مباشرة، مثل قياس الطيف الكتلي37 وتسلسل الحمض النووي الريبي27، لاكتشاف تفاعلات جديدة داخل شبكات الإشارة. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في كيفية تأثير الاضطرابات في الفسفرة بشكل مباشر على الإشارات داخل الخلايا ، والتعبير الجيني ، والنشاط الخلوي في السياقات القحفية الوجهية. هذه التطبيقات المتنوعة سوف تعزز إلى حد كبير فهم آثار فسفرة البروتين في التنمية القحفية الوجهية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

كانت فئران 129S4 هدية من الدكتور فيليب سوريانو ، كلية إيكان للطب في جبل سيناء. تم دعم هذا العمل بأموال من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) / المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والجمجمة (NIDCR) R01 DE027689 و K02 DE028572 إلى K.A.F. ، F31 DE029976 إلى M.A.R. و F31 DE029364 إلى B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 182 ، التطور القحفي الوجهي ، الفسفرة ، الفوسفوبروتينات ، الفأر ، العمليات الفكية ، خلايا اللحمة المتوسطة الحنكية الجنينية للفأر
عزل تحلل بروتين الخلية الكاملة عن عمليات وجه الماوس وخلايا اللحمة المتوسطة الحنكية المستزرعة لتحليل البروتين الفوسفوبروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter