Summary
该协议提出了一种从解剖的小鼠胚胎面部过程或培养的小鼠胚胎腭间充质细胞中分离全细胞蛋白裂解物并随后进行蛋白质免疫印迹以评估磷酸化蛋白水平的方法。
Abstract
哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态学过程，在此期间，多个细胞群协调以产生额鼻骨骼。这些形态学变化是通过各种信号传导相互作用开始和维持的，其中通常包括激酶的蛋白质磷酸化。这里，提供了两个生理相关上下文的例子，其中研究了哺乳动物颅面发育过程中蛋白质的磷酸化：小鼠面部过程，特别是E11.5上颌骨过程，以及来自E13.5次级腭架的培养小鼠胚胎腭间充质细胞。为了克服蛋白质分离过程中去磷酸化的常见障碍，讨论了对允许分离磷酸化蛋白的标准实验室方法的适应性和修饰。此外，还提供了在全细胞蛋白裂解物进行蛋白质免疫印迹后对磷酸化蛋白进行适当分析和定量的最佳实践。这些技术，特别是与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型相结合，可用于更深入地了解颅面发育过程中活性的各种磷酸化蛋白的动力学和作用。
Introduction
哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态学过程，在此期间，多个细胞群协调以产生额鼻骨骼。在小鼠中，该过程始于胚胎日（E）9.5，形成额鼻突出和成对的上颌骨和下颌过程，每个过程都包含迁移后颅神经嵴细胞。外侧和内侧鼻突起源于额鼻突出，伴有鼻坑的出现，最终融合形成鼻孔。此外，内侧鼻突和上颌突融合以产生上唇。同时，腭生成始于E11.5时从上颌过程的口腔侧形成不同的生长 - 次级腭架。随着时间的推移，腭架在舌头的两侧向下生长，上升到舌头上方的相反位置，并最终在中线融合形成连续的腭，将鼻腔和口腔分开E16.51。
这些在整个颅面发育过程中的形态变化是通过各种信号传导相互作用开始和维持的，其中通常包括激酶的蛋白质磷酸化。例如，细胞膜受体，例如转化生长因子（TGF）-β受体的亚家族，包括骨形态发生蛋白受体（BMPRs）和各种受体酪氨酸激酶（RTK）家族，在颅神经嵴细胞中的配体结合和激活时自磷酸化2，3，4.此外，G蛋白偶联的跨膜受体平滑在颅神经嵴细胞和颅面外胚层中磷酸化，声波刺猬（SHH）配体与Patched1受体结合，导致睫状膜处平滑积聚和SHH途径激活5。这种配体-受体相互作用可以通过颅面环境中的自分泌、旁分泌和/或并列子碱信号传导发生。例如，已知BMP6在软骨细胞分化6期间以自分泌方式发出信号，而成纤维细胞生长因子（FGF）8在咽弓外胚层中表达，并与以旁分泌方式在咽弓间充质中表达的RTK家族的FGF家族成员结合，以启动咽弓的图案化和生长7，8，9，10.此外，当跨膜Delta和/或锯齿状配体与邻近细胞上的跨膜Notch受体结合时，在颅面骨骼发育过程中，通过并列他克林信号传导在软骨细胞和成骨细胞中激活Notch信号传导，随后被切割和磷酸化11。然而，还有其他配体和受体对对颅面发育很重要，它们具有在自身分泌和旁分泌信号传导中起作用的灵活性。例如，在鼠牙形态发生期间，血小板衍生生长因子（PDGF）-AA配体已被证明以自分泌方式发出信号以激活牙釉质器官上皮12中的RTK PDGFRα。相反，在妊娠中期的鼠面部过程中，编码配体PDGF-AA和PDGF-CC的转录本在颅面外胚层中表达，而PDGFRα受体在潜在的颅神经嵴衍生的间充质中表达，导致旁分泌信号传导13，14，15，16，17.无论信号传导机制如何，这些受体磷酸化事件通常导致接合蛋白和/或信号分子的募集，这些分子经常自身被磷酸化以引发细胞内激酶级联反应，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径18，19。
然后，这些级联的末端细胞内效应子可以磷酸化一系列底物，例如转录因子，RNA结合，细胞骨架和细胞外基质蛋白。Runx220，Hand121，Dlx3 / 522，23，24，Gli1-325和Sox926 是颅面发育中磷酸化的转录因子之一。这种翻译后修饰（PTM）可以直接影响对替代PTM的敏感性，二聚化，稳定性，裂解和/或DNA结合亲和力，以及其他活性20，21，25，26。此外，RNA结合蛋白Srsf3在颅面发育的背景下被磷酸化，导致其核易位27。一般而言，RNA结合蛋白的磷酸化已被证明会影响其亚细胞定位，蛋白质 - 蛋白质相互作用，RNA结合和/或序列特异性28。此外，肌动肌肽的磷酸化可导致整个颅面发育过程中的细胞骨架重排29，30，并且细胞外基质蛋白的磷酸化，例如小的整合素结合配体N-连接的糖蛋白，有助于骨骼发育过程中的生物矿化31。通过上述和许多其他例子，很明显，在颅面发育过程中，蛋白质磷酸化具有广泛的意义。添加额外的调节水平，蛋白质磷酸化通过磷酸酶进一步调节，其通过去除磷酸基团来抵消激酶。
受体和效应分子水平上的这些磷酸化事件对于信号通路的传播至关重要，并最终导致细胞核中基因表达的变化，驱动特定的细胞活动，如迁移，增殖，存活和分化，从而导致哺乳动物面部的适当形成。鉴于蛋白质与激酶和磷酸酶相互作用的背景特异性，PTMs的变化及其对细胞活性的影响，在生理相关环境中研究这些参数以完全了解磷酸化事件对颅面发育的贡献至关重要。这里提供了研究蛋白质磷酸化并因此在哺乳动物颅面发育过程中信号通路激活的两种情况的示例：小鼠面部过程，特别是E11.5上颌过程，以及来自E13.5次级腭架的培养小鼠胚胎腭间充质细胞 - 主要32 和永生化33.在E11.5中，上颌突处于与外侧和内侧鼻突1融合的过程中，从而代表了小鼠颅面发育过程中的关键时间点。此外，这里选择了上颌骨过程和来自腭架的细胞，因为后者的结构是前者的衍生物，从而为研究人员提供了在相关背景下 在体内 和 体外 询问蛋白质磷酸化的机会。然而，该协议也适用于替代面部过程和发育时间点。
研究磷酸化蛋白质的一个关键问题是，在蛋白质分离过程中，它们很容易被丰富的环境磷酸酶去磷酸化。为了克服这一障碍，讨论了允许分离磷酸化蛋白质的标准实验室方法的适应性和修改。此外，还提供了对磷酸化蛋白质进行正确分析和定量的最佳实践。这些技术，特别是与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型结合使用，可用于更深入地了解颅面发育过程中活跃的各种信号通路的动力学和作用。
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Protocol
所有涉及动物的程序均由科罗拉多大学安舒茨医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照机构指南和法规进行。雌性129S4小鼠在1.5-6月龄下饲养在21-23°C的亚热中性温度下用于胚胎收获。该协议的工作流程示意图如图 1所示。有关本方案中使用的所有材料、设备、软件、试剂和动物的详细信息，请参阅材料 表 。
1. 收获E11.5小鼠胚胎
- 在使用IACUC批准的CO 2流速在CO2室中定时交配期间检测到阴道栓后11.5天对怀孕的雌性小鼠实施安乐死，所需的约50%位移（3室中360室中为2.95 L / min）和暴露持续时间（见材料表）。进行宫颈脱位作为安乐死的次要方法。立即进行解剖。
- 将小鼠身体放在解剖板上，腹侧朝上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部。
- 用直的Semken镊子捏住并抬起阴道口前方的皮肤，然后用直刀片手术剪刀以45°角切割抬起的皮肤和下层，以产生“V”形，该形状延伸到前肢和后肢之间大致一半的每个侧表面，从而打开腹腔。
- 使用Semken镊子，抓住其中一个子宫角，并用手术剪刀切开输卵管下方和子宫颈上方。切除子宫中膜，以便完全切除子宫角。
- 将解剖的子宫角转移到10cm培养皿中的10mL组织学磷酸盐缓冲盐水（PBS）[0.137M NaCl，2.68mM KCl，1.76mM KH2PO4 单基，10.14mM Na2HPO4 二元盐水，pH 7.4]中。
- 使用步骤1.4-1.5中描述的相同程序切除腹腔另一侧的第二个子宫角。
- 将含有两个子宫角的10厘米培养皿放在冰上，如果没有立即解剖单个胚胎（即，如果将解剖第二只雌性小鼠）。
- 在解剖体视显微镜下，用Dumont #5细镊子小心地从子宫角中解剖出每个胚胎。慢慢拉开子宫肌层、蜕膜和脉络膜。撕裂并去除胚胎周围相对透明的羊膜，并切断连接胚胎和胎盘的脐带。
- 使用切割的塑料移液管或胚胎勺将每个解剖的胚胎转移到冰上12孔细胞培养板的单个孔中，将2.5mL组织学PBS中。
注意：如果处理可能含有多种基因型胚胎的凋落物，请将每个胚胎周围的羊膜放置在冰上预先标记的0.5 mL微量离心管中以进行基因分型。
2. 从E11.5小鼠胚胎中解剖上颌过程
- 准备三个含有10毫升组织学PBS的10厘米培养皿，并将它们保存在冰上，以便在胚胎之间旋转。
- 使用切割的塑料移植移液管或胚胎勺将一个胚胎从12孔细胞培养板的单个孔转移到具有组织学PBS的10厘米培养皿之一。
- 在解剖显微镜下，使用细镊子将每个上颌骨过程与面部分开。首先，沿着分隔鼻外侧过程和上颌过程的自然压痕切割上颌骨过程的前侧（图2A）。
- 其次，沿着自然压痕切割上颌突的后侧，将上颌突和下颌突分开（图2A）。
- 第三，为了完全分离上颌突，在上颌突的眼侧从上颌突的前后侧垂直切割，其中上面提到的自然压痕结束（图2A-C）。
- 对脸部另一侧的上颌突重复这三个切口。
- 使用带有2 mL小乳胶球的9“巴斯德移液管，将解剖的上颌骨过程和约30μL组织学PBS的小液滴转移到标记的35mm培养皿中（图2D）。
- 对每个胚胎执行步骤2.3-2.7，在胚胎之间的冰上旋转三个含有组织学PBS的10厘米培养皿。将每对解剖的上颌骨过程放在冰上单独的35毫米培养皿中。
注意：上颌骨外胚层和间充质的分离（步骤2.9-2.17）可以在解剖窝中所有胚胎的上颌过程后进行。如果需要同时包含外胚层和间充质的完整上颌骨过程，请继续执行下面的步骤2.18。 - 在组织培养PBS中制备250μL新鲜2%胰蛋白酶，在组织培养PBS中制备250μL10%胎牛血清（FBS）并储存在冰上。
- 将第二个约30μL2%胰蛋白酶的小液滴放入35mm培养皿中，与含有上颌过程的第一个小组织学PBS小液滴分开。使用巴斯德移液管将一对上颌突转移到2%胰蛋白酶的小液滴中（图2D）。
- 将培养皿在冰上孵育15分钟。
- 从冰上取下35毫米培养皿，放在解剖显微镜下。
- 使用细镊子，缓慢而小心地从每个上颌过程中拔下外胚层（图2E）。
注意：如果外胚层没有从完整的片中分离出间充质，请在室温（RT）下在2%胰蛋白酶中孵育长达5分钟，然后再继续分离。如果组织开始在2%胰蛋白酶中分解，则如下所述将上颌过程移至10%FBS以中和胰蛋白酶并完成外胚层和间充质的分离。 - 一旦上颌突外胚层和间充质分离（图2F），使用巴斯德移液管将所需组织从上颌突转移到约30μL的10%FBS的第三个小液滴中 - 与前两个小液滴分离（图2D）。
- 将35毫米培养皿放在冰上以阻止胰蛋白酶消化。
- 将上颌过程组织在10%FBS中在冰上孵育1-2分钟，然后将组织从两个上颌过程转移到冰上第四个约30μL预先秦组织学PBS的小液滴中 - 与之前的三个小液滴分开 - 使用巴斯德移液管（图2D）。
- 在组织学PBS中孵育上颌过程组织1分钟，同时用巴斯德移液管的尖端轻轻旋转上颌过程组织周围的组织学PBS，以确保所有FBS都冲洗掉组织。
- 使用巴斯德移液管将一对上颌骨工艺组织转移到冰上标记的1.5 mL微量离心管中，从而最大限度地减少组织学PBS的转移。用巴斯德移液管去除1.5 mL微量离心管中任何多余的组织学PBS。
- 按照上述步骤剖析窝中每个胚胎的上颌骨过程。
- 立即处理样品以分离全细胞蛋白裂解物（下图）或长期储存在-80°C。在长期储存之前，将1.5mL微量离心管在干冰上100%EtOH的浴中速冻5分钟。
3. 从小鼠上颌骨过程中分离全细胞蛋白裂解物
- 如果上颌过程先前在-80°C下冷冻，则在冰上解冻。
- 加入0.1mL冰冷NP-40裂解缓冲液（20mM Tris HCl pH 8，150mM NaCl，10%甘油，1%Nonidet P-40，2mM EDTA;储存在4°C）与蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1x完全迷你蛋白酶抑制剂[溶解在水中;在-20°C下储存]，1mM PMSF [溶解在异丙醇中;储存在4°C]， 在冰上使用之前，立即加入10 mM NaF [储存在-20°C;避免冻融]，1 mM Na3VO4 [储存在-20°C]，25 mM β甘油磷酸盐[储存在4°C]）。
注意：也可以进行细胞分级分离以分离细胞质，核，膜或线粒体蛋白质级分。 - 用200μL移液器上下移液10次。
- 涡旋10秒，然后用200μL移液器上下移液10次。避免产生气泡。
- 在4°C下孵育2小时，同时使用带有管式左轮手枪的1.5 mL / 2 mL桨叶进行端对端旋转。
- 将样品在4°C下以13，500× g 离心20分钟。
- 用200 mL移液管将上清液收集到冰上新的1.5 mL微量离心管中。
- 使用10μL蛋白质裂解物+ 10μLNP-40裂解缓冲液用于实验样品，并在NP-40裂解缓冲液中使用3-5稀释的牛血清白蛋白（第V分）（BSA）在NP-40裂解缓冲液中以0.25-2.0mg / mL的范围作为蛋白质标准品，用蛋白质测定试剂盒定量蛋白质浓度。
- 继续使用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（步骤5）或将剩余的裂解物快速冷冻在干冰上并在-80°C下长期储存。
4. 从原代和/或永生化小鼠胚胎腭间充质（MEPM）细胞中分离全细胞蛋白裂解物
注：从E13.5小鼠胚胎和永生MEPM细胞中分离和培养原代MEPM细胞的先前已描述32，33，34。用生长因子刺激细胞（步骤4.1-4.7）可以在细胞裂解之前进行。如果需要未受刺激的细胞，请继续执行下面的步骤4.8。
- 使用连接到真空系统的5.75“巴斯德移液管从MEPM细胞中以约70%汇合的6cm细胞培养皿从MEPM细胞中吸取生长培养基[Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）与50U / mL青霉素，50μg/ mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺，10%FBS]。
- 用1mL组织培养PBS洗涤细胞。
- 加入3 mL血清饥饿培养基[DMEM与50 U / mL青霉素，50μg/ mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺，0.1%FBS]在37°C水浴中预热。
- 在37°C和5%CO2 下孵育23小时。
- 用 3 mL 新鲜、预热的血清饥饿培养基替换血清饥饿培养基。
- 在37°C和5%CO2 下孵育1小时。
- 用选择的生长因子以经验确定的浓度刺激细胞，持续所需的时间长度。
- 使用连接到真空系统的5.75“巴斯德移液管以80%-100%汇合率从MEPM细胞中吸出培养基。
- 用冰冷的组织培养PBS洗涤细胞两次（6cm细胞培养皿为1mL）;在最后一次洗涤过程中将板向一侧倾斜，以确保所有组织培养PBS都被抽吸。
- 通过在冰上加入冰冷的NP-40裂解缓冲液，在使用前立即加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（对于6cm细胞培养皿为0.1mL）来裂解细胞。
- 将板在冰上孵育5分钟，大约每分钟旋转一次，以确保板完全覆盖。
- 使用预冷的细胞提升器将细胞从板上刮下，并将细胞悬浮液转移到冰上的预冷1.5 mL微量离心管中。
- 将细胞悬浮液在4°C下孵育30分钟，同时使用带有管左轮手枪的1.5 mL / 2 mL桨叶进行端对端旋转。
- 继续执行上述步骤 3.6-3.9。
5. 蛋白质印迹来自小鼠面部过程和/或MEPM细胞的全细胞蛋白裂解物以用于磷酸化蛋白
- 为SDS-PAGE制备全细胞蛋白质裂解物样品。
- 确定要上样的蛋白质量，这取决于组织/细胞中的蛋白质丰度;12.5μg通常足以在全细胞蛋白质裂解物中稳定表达的蛋白质。
- 加入等体积的2x Laemmli缓冲液[20%甘油，4%SDS，0.004%溴酚蓝，0.125 M Tris HCl pH 6.8]，并在使用前立即加入10%β-巯基乙醇。
注意：β巯基乙醇对皮肤或眼睛有腐蚀性、毒性、吞咽有害，并具有水生毒性。在化学通风橱中处理戴着手套，实验室外套，面罩和安全玻璃的人。根据环境健康和安全指南进行处置。 - 通过涡旋混合。
- 在迷你干浴中将样品在100°C下加热5分钟。
- 通过涡旋混合并将样品放在冰上。
- 在4°C下以9，400× g 离心5分钟。
- 在上样到SDS-PAGE凝胶中之前，将样品短暂地放在冰上，或长期储存在-20°C下。
- 使用具有4%-15%预制蛋白质凝胶和电泳缓冲液35的电泳池执行SDS-PAGE。
- 使用转移缓冲液将蛋白质电转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜中，该转印缓冲液在使用前立即加入0%-20%甲醇（对于大于100 kDa的蛋白质为0%-10%，对于小于100 kDa的蛋白质为20%）35。
- 阻断膜并探针感兴趣的磷酸化蛋白。
- 转移后，在蛋白质印迹盒中用1x三缓冲盐水（TBS）[20mM Tris，0.137M NaCl，pH 7.6]洗涤膜5分钟。
- 将膜在5 mL封闭缓冲液[1x TBS，0.1%吐温20，5%w / v BSA;混合均匀，并使用10mL带鲁尔尖端的注射器通过具有0.2μm孔的25mm注射器过滤器过滤]中1小时，并在轨道振荡器上搅拌。
注意：在表征磷酸蛋白时，不要使用牛奶作为封闭剂，因为它含有磷酸化蛋白酪蛋白，这可能导致高的非特异性背景信号。 - 在蛋白质印迹盒中，在 TBS-T [1x TBS，0.1% 吐温 20] 中洗涤膜 3 次，每次 5 分钟，并在轨道振荡器上进行搅拌。
- 使用带有管左轮手枪的50 mL桨叶，将膜在4°C的封闭缓冲液中稀释的5mL一抗中孵育5 mL锥形管中过夜。
注意：请查阅抗体数据表，了解蛋白质印迹的适当浓度。 - 在室温下在TBS-T中用蛋白质印迹盒洗涤膜三次，每次5分钟，并在眼眶振荡器上搅拌。
- 将膜在5mL适当的辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗中孵育，该二抗在封闭缓冲液中稀释，在蛋白质印迹盒中孵育1小时，并在眼眶振荡器上搅拌。
- 在蛋白质印迹盒中将膜在TBS-T中洗涤三次，每次5分钟，并在轨道振荡器上搅拌。
- 将膜在增强化学发光（ECL）蛋白质印迹底物中孵育1分钟[从瓶子1和2中混合等体积;对于大（8.6 cm x 6.7cm）膜，每个0.5 mL]1分钟，确保整个膜持续暴露于ECL蛋白质印迹底物。
- 排出多余的ECL蛋白质印迹底物的膜，并使用化学发光成像仪立即显影。
- 剥离膜并重新探针感兴趣的总蛋白。
- 将PVDF膜放入带有聚乙烯衬里的透明袋中，其中含有5mL剥离缓冲液[2%SDS，62.5mM Tris HCl pH 6.8]，并在使用前立即加入8μL / mL β巯基乙醇。
- 在50°C下孵育30分钟，在杂交炉中以每分钟11转的速度摇摆。
- 在室温下在TBS-T中用蛋白质印迹盒洗涤膜三次，每次5分钟，并在眼眶振荡器上搅拌。
- 继续执行上述步骤 5.4.2-5.4.9。
- 使用ImageJ软件定量蛋白质印迹带密度，将感兴趣的磷酸化蛋白的水平归一化为感兴趣的总蛋白的水平36。
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Representative Results
当试图表征从小鼠面部过程和/或培养的腭间充质细胞中分离的蛋白质的磷酸化时，理想的结果将在蛋白质印迹后显示一个独特的，可重复的条带，该抗体在相应总蛋白带的高度或附近运行（图3).然而，如果发生蛋白质的广泛磷酸化，与总蛋白质条带相比，磷酸蛋白条带可能会有轻微的向上移动。此外，如果一个组织中存在蛋白质的多个亚型，每个亚型都被磷酸化，或者该蛋白质可变地受到额外的PTM的影响，则蛋白质印迹中可能出现具有抗磷酸化蛋白抗体的多个条带。如果没有观察到感兴趣的磷酸化蛋白的信号，尽管检测到感兴趣的总蛋白，该蛋白可能不会在所选上下文中磷酸化，或者方案可能出现了技术问题。在后一种情况下，可以使用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸和/或抗磷酸酪氨酸抗体进行全细胞裂解物的蛋白质印迹，以表明方案是否按预期工作。由于蛋白质的磷酸化在颅面组织中含量丰富25，37，因此多个磷酸化蛋白条带的存在将表明方案的成功完成和初始筛选的准确结果。
比较野生型和突变型胚胎组织之间的磷酸化蛋白水平或响应培养细胞的治疗通常是有用的。在前一种情况下，基因型之间磷酸化蛋白水平的差异将显示为具有相似水平的感兴趣磷酸化蛋白的条带强度差异27。在后一种情况下，与使用例如生长因子（图3）治疗时未经治疗的细胞相比，代表性结局将显示磷酸蛋白条带强度增加，并且用激酶抑制剂27，37治疗后条带强度降低。为了量化这些差异，感兴趣的磷酸蛋白的水平将被归一化为目标总蛋白的水平。预计样品之间总蛋白的水平相对相等，这一发现应通过使用一种或多种针对上样和表达控制蛋白（如β-微管蛋白，β-肌动蛋白和/或GAPDH）的单独蛋白质免疫印迹来证实（图3）。对于培养细胞的生长因子治疗，阳性结果可能会显示磷酸化蛋白水平在刺激后相对较短的2-15分钟内增加（图3）。在没有生长因子处理的情况下，应该很少或没有磷酸化，除非有其他因素在起作用导致蛋白质的磷酸化，其实例包括细胞内源性表达生长因子，蛋白质由细胞表达的另一个信号分子磷酸化，和/或在没有生长因子处理的情况下导致蛋白质组成性磷酸化的突变。在解释结果时应考虑这些因素。阴性结果包括磷酸化响应于生长因子治疗的时间过程没有变化，在这种情况下，应评估方案以维持磷酸化蛋白，如上所述。此外，膜剥离过程偶尔会影响并降低总蛋白质水平。在这种情况下，将观察到感兴趣的磷酸化蛋白的量与感兴趣的总蛋白质的相反趋势。这是次优的，因为假设蛋白质的上样和表达相等，预计样品之间的总蛋白质水平相对相等，变化仅发生在磷酸蛋白水平上。
图1：从小鼠面部过程和培养的腭间充质细胞中分离全细胞蛋白裂解物以进行磷酸化蛋白分析的工作流程。 从冰上的E11.5小鼠胚胎中解剖上颌骨过程，和/或从培养的MEPM细胞中以80%-100%汇合度抽吸培养基，随后用冰冷的PBS洗涤两次。使用带有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液分离全细胞蛋白裂解物，然后使用SDS-PAGE，电转移到PVDF膜，用BSA阻断膜，探测磷酸蛋白，剥离膜，重测总蛋白，并定量条带强度。缩写：LNP = 外侧鼻腔过程;MxP = 上颌骨过程;MdP = 下颌突;PA2 = 第二咽弓;PBS =磷酸盐缓冲盐水;FBS = 胎牛血清;PS = 腭架;MEPM = 小鼠胚胎腭间充质;SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳;PVDF = 聚偏二氟乙烯;p-P = 磷酸化蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图2：上颌骨过程的解剖。 （A）E11.5小鼠胚胎的侧视图，具有将MxP与彩色线条指示的面部分开所需的三个切口（标记为1-3）。（B）去除带有黑色虚线的MxP后E11.5小鼠胚胎的侧视图。（C）解剖的MxP.（D）一种35毫米培养皿设置，带有PBS小液滴，2%胰蛋白酶和10%FBS，用于选择性分离MxP外胚层和间充质。（E） MxP，其中 Ect 与 Mes 部分分离。（F） 分离的 MxP Ect 和 Mes。比例尺：1毫米（A-C，E，F），10毫米（深）。缩写：LNP = 外侧鼻腔过程;MxP = 上颌骨过程;MdP = 下颌突;PA2 = 第二咽弓;PBS =磷酸盐缓冲盐水;FBS = 胎牛血清;Mes = 间充质;Ect = 外胚层。请点击此处查看此图的大图。
图3：PDGFRβ和MAPK效应子Erk1/2磷酸化响应于永生化MEPM细胞的PDGF-BB配体处理。 使用抗磷酸化 PDGFR、抗 PDGFRβ、抗磷酸化-Erk1/2、抗 Erk1/2 和抗β-微管蛋白 （E7） 抗体对永生化 MEPM 细胞的全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，该酶促性 10 ng/mL PDGF-BB 配体刺激 2 分钟至 15 分钟。抗PDGFRβ印迹中的多个条带代表差异糖基化的蛋白质。缩写：PDGF =血小板衍生的生长因子;WCL = 全细胞裂解物;kD = 千道尔顿;WB = 免疫印迹;p-PDGFR = 磷酸化的PDGFR;PDGFR = PDGF受体;p-Erk = 磷酸化的Erk;Erk = 细胞外信号调节激酶。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里描述的方案允许研究人员以稳健和可重复的方式探测颅面发育过程中的关键磷酸化依赖性信号传导事件。该协议中有几个关键步骤可以确保正确收集数据和分析结果。无论是从小鼠面部过程和/或培养的腭间充质细胞中分离磷酸化蛋白，都必须快速有效地移动，同时在需要时将所有试剂和材料保持在冰上。冰的低温减慢了细胞中的代谢活性，从而保护磷酸化蛋白质免受磷酸酶活性38 的侵害并保持高蛋白质产量。在上颌骨解剖过程中使用三个单独的10厘米培养皿可确保所有解剖在足够预先形成的组织学PBS中进行。与此相关的是，该蛋白质分离方案的另一个基本组成部分是在所有裂解缓冲液中使用磷酸酶抑制剂。这些试剂还保护目标蛋白39，40 上的磷酸基团，并保持磷酸化蛋白的完整性，以便通过蛋白质免疫印迹进一步分析。
该协议还引入了修饰，允许对组织和培养细胞中的磷酸化蛋白进行更特异性的分析。在解剖面部过程的过程中，增加了用于上颌骨外胚层和间充质分离的可选步骤，以允许研究区室特异性蛋白质磷酸化27。为了测试这些组织层的有效分离，用户可以评估外胚层中富集的基因的表达，例如 Gabrp，Trim29，Esrp1 和 Mpzl2，和/或富含间充质的基因，例如 Aldh1a2和AW55198441。为了从培养的腭间充质细胞中分离磷酸化蛋白，增加了用于生长因子刺激的可选步骤。在这种情况下，细胞应该在含有0.0%-0.1%血清的培养基中缺乏血清。标准血清如FBS含有许多生长因子42 ，可以卷积外源性生长因子刺激的结果。因此，暂时的血清饥饿使细胞对急性生长因子治疗作出反应。
该协议还提供了精确量化蛋白质磷酸化的优化方法。在蛋白质印迹步骤中，重要的是使用BSA而不是牛奶来阻断PVDF膜，牛奶在许多标准的蛋白质印迹技术中使用。这种转换是必要的，因为牛奶含有磷酸化蛋白酪蛋白43 ，并且在分析其他磷酸蛋白时导致高背景信号。此外，重要的是，根据感兴趣的总蛋白的水平而不是标准负载对照蛋白的水平来量化感兴趣的磷酸化蛋白的水平。这样，目标总蛋白表达的任何变化都可以在磷酸化蛋白水平的定量中解释。如果蛋白质产量通常太低，无法准确检测磷酸化蛋白，则来自同一阶段和基因型的组织样品可以合并27个，并且/或者细胞可以在比此处描述的更大的细胞培养容器中生长，以备将来实验使用。或者，如果剥离始终似乎改变了总蛋白水平，则可以采取两种方法来修改所述方案以获得可重复的结果：1）使用抗体方案，该方案采用不同宿主物种中产生的抗磷酸蛋白和抗蛋白抗体与两种物种特异性二抗结合并分离（如果使用HRP偶联二抗）或同时（如果使用荧光团偶联二抗） 印迹的发展;或2）同时处理两个相同的膜 - 第一个与抗磷酸蛋白抗体一起孵育，第二个与抗蛋白抗体一起孵育。在这两种替代方法中，仍应根据感兴趣的总蛋白质的水平来量化感兴趣的磷酸化蛋白质的水平。最后，由于磷酸化是一个动态过程，因此应在每种情况下至少三次生物重复中评估磷酸化蛋白水平。来自单个胚胎的小鼠面部过程组织或原代MEPM细胞或来自同一阶段和基因型的单个胚胎池将构成单个生物复制。同样，不同传代的永生MEPM细胞将构成生物复制品。如果用生长因子处理培养的细胞，则应在不同的日期使用单独的生长因子等分试样处理生物重复。
这里介绍的方法存在两个限制，下面将讨论这些限制，在启动协议之前应考虑这些限制。第一个涉及ECL的动态范围。该方案中推荐的ECL蛋白质印迹底物具有宽动态范围，具有低皮克灵敏度。然而，根据经验，使用这些方法可能难以检测低丰度或低磷酸化状态的蛋白质。如果在ECL底物孵育20分钟后无法检测到磷酸化蛋白，建议按照所述在TBS-T中洗涤膜，并将膜在具有低飞秒灵敏度的高灵敏度ECL蛋白质印迹底物中孵育。或者，可以使用荧光团偶联二抗，其动态范围比基于酶的方法（如ECL44）更宽。第二个限制来自规范化过程。如广泛描述的那样，建议将来自目标磷酸蛋白的信号归一化为来自目标总蛋白的信号。然而，该过程依赖于以下假设：感兴趣的总蛋白水平在样品之间不会变化，这通常通过使用针对一种或多种管家蛋白的抗体进行单独的蛋白质印迹来证实。然而，一个重要的考虑因素是，由于上样不均匀，转移到膜的不完全和/或蛋白质表达的差异，管家蛋白的水平可能会在样品之间发生变化。因此，为了提高归一化过程中的准确性，研究人员可以考虑实施真正的总蛋白染色，例如Ponceau S45，它可以检测膜的每个泳道中的所有蛋白质并解释这些技术限制。
总体而言，该方案克服了蛋白质分离过程中通常发生的蛋白质脱磷酸化问题。蛋白质磷酸化的准确分析将有助于研究人员更精确地了解磷酸化蛋白质在颅面发育中的作用。此外，该协议提供了强大而有效的方法来分析生理相关环境中的磷酸化蛋白水平，每种方法都有自己的益处。虽然来自胚胎组织的蛋白质裂解物提供了 体内蛋白质磷酸化的静态快照，但培养细胞的实施提供了对急性治疗的动态磷酸化反应的数据。该协议能够直接确认和扩展来自大型数据集的结果和假设，例如质谱37 和RNA测序27，以发现信号网络内的新相互作用。重要的是，该协议可用于探究磷酸化中的扰动如何直接影响颅面环境中的细胞内信号传导，基因表达和细胞活性。这些不同的应用将大大增强对蛋白质磷酸化在颅面发育中的作用的理解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
129S4只老鼠是西奈山伊坎医学院Philippe Soriano博士的礼物。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）/美国国立牙科和颅面研究所（NIDCR）R01 DE027689和K02 DE028572至K.A.F.，F31 DE029976至M.A.R.和F31 DE029364至B.J.C.D.的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P.
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
- Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
- Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
- MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
- Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
- Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
- Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
- Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
- Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
- Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
- Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
- Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
- Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
- Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
- Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
- Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
- Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
- Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
- Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
- Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
- Szabo, A., Mayor, R.
- Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
- Faundes, V., et al.
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
- Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
- Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
- Swaisgood, H. E.
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
- Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).
