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Developmental Biology

फॉस्फोप्रोटीन विश्लेषण के लिए माउस चेहरे की प्रक्रियाओं और सुसंस्कृत पैलेटल मेसेंकाइम कोशिकाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स का अलगाव

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल विच्छेदित माउस भ्रूण चेहरे की प्रक्रियाओं या सुसंस्कृत माउस भ्रूण तालु मेसेंकाइम कोशिकाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स को अलग करने और फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के स्तर का आकलन करने के लिए बाद में पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

स्तनधारी क्रैनियोफेशियल विकास एक जटिल रूपात्मक प्रक्रिया है जिसके दौरान कई सेल आबादी फ्रंटोनासल कंकाल उत्पन्न करने के लिए समन्वय करती है। इन रूपात्मक परिवर्तनों को विविध सिग्नलिंग इंटरैक्शन के माध्यम से शुरू और निरंतर किया जाता है, जिसमें अक्सर किनेसेस द्वारा प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन शामिल होता है। यहां, शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भों के दो उदाहरण जिसमें स्तनधारी क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन का अध्ययन करने के लिए प्रदान किए जाते हैं: माउस चेहरे की प्रक्रियाएं, विशेष रूप से ई 11.5 मैक्सिलरी प्रक्रियाओं में, और ई 13.5 माध्यमिक तालु अलमारियों से प्राप्त सुसंस्कृत माउस भ्रूण तालु मेसेंकाइमल कोशिकाएं। प्रोटीन अलगाव के दौरान डिफॉस्फोराइलेशन की सामान्य बाधा को दूर करने के लिए, मानक प्रयोगशाला विधियों के अनुकूलन और संशोधनों पर चर्चा की जाती है जो फॉस्फोप्रोटीन के अलगाव की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स के पश्चिमी सोख्ता के बाद फॉस्फोप्रोटीन के उचित विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए सर्वोत्तम प्रथाएं प्रदान की जाती हैं। ये तकनीकें, विशेष रूप से औषधीय अवरोधकों और / या मूत्र आनुवंशिक मॉडल के संयोजन में, क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान सक्रिय विभिन्न फॉस्फोप्रोटीन की गतिशीलता और भूमिकाओं में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए उपयोग की जा सकती हैं।

Introduction

स्तनधारी क्रैनियोफेशियल विकास एक जटिल रूपात्मक प्रक्रिया है जिसके दौरान कई सेल आबादी फ्रंटोनासल कंकाल उत्पन्न करने के लिए समन्वय करती है। माउस में, यह प्रक्रिया भ्रूण दिवस (ई) 9.5 पर शुरू होती है, जिसमें फ्रंटोनासल प्रमुखता और मैक्सिलरी और मैंडिबुलर प्रक्रियाओं के जोड़े के गठन के साथ, जिनमें से प्रत्येक में पोस्ट-प्रवासी कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं होती हैं। पार्श्व और औसत दर्जे का नाक प्रक्रियाएं नाक के गड्ढों की उपस्थिति के साथ फ्रंटोनासल प्रमुखता से उत्पन्न होती हैं और अंततः नथुने बनाने के लिए फ्यूज होती हैं। इसके अलावा, औसत दर्जे का नाक प्रक्रियाओं और दाढ़ की हड्डी की प्रक्रियाएं ऊपरी होंठ उत्पन्न करने के लिए फ्यूज करती हैं। समवर्ती रूप से, पैलेटोजेनेसिस को ई 11.5 पर मैक्सिलरी प्रक्रियाओं के मौखिक पक्ष से अलग-अलग आउटग्रोथ - माध्यमिक तालु अलमारियों के गठन के साथ शुरू किया जाता है। समय के साथ, तालु अलमारियां जीभ के दोनों तरफ नीचे की ओर बढ़ती हैं, जीभ के ऊपर एक विरोधी स्थिति में बढ़ जाती हैं, और अंततः एक निरंतर तालु बनाने के लिए मिडलाइन पर फ्यूज होती हैं जो ई 16.51 द्वारा नाक और मौखिक गुहाओं को अलग करती है।

क्रैनियोफेशियल विकास में इन रूपात्मक परिवर्तनों को विविध सिग्नलिंग इंटरैक्शन के माध्यम से शुरू और निरंतर किया जाता है, जिसमें अक्सर किनेसेस द्वारा प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन शामिल होता है। उदाहरण के लिए, कोशिका झिल्ली रिसेप्टर्स, जैसे हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन रिसेप्टर्स (बीएमपीआरएस), और विभिन्न रिसेप्टर टायरोसिन किनेज (आरटीके) परिवारों सहित विकास कारक (टीजीएफ) -β रिसेप्टर्स को बदलने के उप-परिवारों, लिगैंड बाइंडिंग और कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं 2,3,4 में सक्रियण पर ऑटोफॉस्फोरिलेटेड होते हैं . इसके अतिरिक्त, जी प्रोटीन-युग्मित ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर स्मूथेन्ड क्रैनियल न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाओं में फॉस्फोराइलेटेड हो जाता है और सोनिक हेजहोग (एसएचएच) लिगैंड के क्रैनियोफेशियल एक्टोडर्म डाउनस्ट्रीम पैच 1 रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी होता है, जिसके परिणामस्वरूप सिलिअरी झिल्ली और एसएचएच मार्ग सक्रियण5 पर चिकना संचय होता है। इस तरह के लिगैंड-रिसेप्टर इंटरैक्शन क्रैनियोफेशियल संदर्भों में ऑटोक्राइन, पैराक्राइन और / या जुक्स्टाक्राइन सिग्नलिंग के माध्यम से हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, बीएमपी 6 को चोंड्रोसाइट भेदभाव6 के दौरान एक ऑटोक्राइन तरीके से संकेत देने के लिए जाना जाता है, जबकि फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ) 8 को ग्रसनी आर्क एक्टोडर्म में व्यक्त किया जाता है और आरटीके के एफजीएफ परिवार के सदस्यों को बांधता है जो ग्रसनी आर्क मेसेंकाइमल में एक पैराक्राइन फैशन में व्यक्त किया जाता है ताकि ग्रसनी मेहराब 7 के पैटर्निंग और आउटग्रोथ को शुरू कियाजा सके, 8,9,10. इसके अलावा, नॉच सिग्नलिंग को क्रैनियोफेशियल कंकाल के विकास के दौरान चोंड्रोसाइट्स और ओस्टियोब्लास्ट दोनों में जुक्स्टाक्राइन सिग्नलिंग के माध्यम से सक्रिय किया जाता है जब ट्रांसमेम्ब्रेन डेल्टा और / या दांतेदार लिगैंड पड़ोसी कोशिकाओं पर ट्रांसमेम्ब्रेन नॉच रिसेप्टर्स से बंधते हैं, जो बाद में क्लीव और फॉस्फोराइलेटेड11 होते हैं। हालांकि, क्रैनियोफेशियल विकास के लिए महत्वपूर्ण अन्य लिगैंड और रिसेप्टर जोड़े हैं जिनमें ऑटोक्राइन और पैराक्राइन सिग्नलिंग दोनों में कार्य करने के लिए लचीलापन है। एक उदाहरण के रूप में, मूत्र दांत मॉर्फोजेनेसिस के दौरान, प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ) -एए लिगैंड को तामचीनी अंग उपकला12 में आरटीके पीडीजीएफआर को सक्रिय करने के लिए ऑटोक्राइन तरीके से संकेत देने के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसके विपरीत, मध्य-गर्भावस्था के दौरान मूत्र चेहरे की प्रक्रियाओं में, लिगैंड पीडीजीएफ-एए और पीडीजीएफ-सीसी को एन्कोडिंग करने वाले टेप क्रैनियोफेशियल एक्टोडर्म में व्यक्त किए जाते हैं, जबकि पीडीजीएफआर रिसेप्टर अंतर्निहित कपाल तंत्रिका शिखा-व्युत्पन्न मेसेंकाइमल में व्यक्त किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप पैराक्राइन सिग्नलिंग 13,14,15,16,17 होता है . सिग्नलिंग तंत्र के बावजूद, इन रिसेप्टर फॉस्फोराइलेशन घटनाओं के परिणामस्वरूप अक्सर एडाप्टर प्रोटीन और / या सिग्नलिंग अणुओं की भर्ती होती है, जो अक्सर माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके) मार्ग18,19 जैसे इंट्रासेल्युलर किनेज कैस्केड शुरू करने के लिए खुद को फॉस्फोराइलेटेड हो जाते हैं।

इन कैस्केड के टर्मिनल इंट्रासेल्युलर प्रभावक तब सब्सट्रेट्स की एक सरणी को फॉस्फोराइलेट कर सकते हैं, जैसे ट्रांसक्रिप्शन कारक, आरएनए-बाइंडिंग, साइटोस्केलेटल और एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन। रनएक्स 220, हैंड 121, डीएलएक्स 3/5 22,23,24, ग्लि 1-3 25, और सॉक्स 926 क्रैनियोफेशियल विकास के संदर्भ में फॉस्फोराइलेटेड ट्रांसक्रिप्शन कारकों में से हैं। यह पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) अन्य गतिविधियों20,21,25,26 के बीच वैकल्पिक पीटीएम, डिमराइजेशन, स्थिरता, दरार, और / या डीएनए-बाध्यकारी आत्मीयता के लिए संवेदनशीलता को सीधे प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन एसआरएसएफ 3 को क्रैनियोफेशियल विकास के संदर्भ में फॉस्फोराइलेट किया जाता है, जिससे इसके परमाणु स्थानान्तरण27 हो जाते हैं। सामान्य तौर पर, आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन को उनके उपकोशिकीय स्थानीयकरण, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, आरएनए बाध्यकारी, और / या अनुक्रम विशिष्टता28 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, एक्टोमायोसिन के फॉस्फोराइलेशन से क्रैनियोफेशियल विकास29,30 में साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था हो सकती है, और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का फॉस्फोराइलेशन, जैसे कि छोटे इंटीग्रिन-बाइंडिंग लिगैंड एन-लिंक्ड ग्लाइकोप्रोटीन, कंकाल के विकास के दौरान जैवखनिजीकरण में योगदान देता है31. उपर्युक्त और कई अन्य उदाहरणों के माध्यम से, यह स्पष्ट है कि क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन के लिए व्यापक निहितार्थ हैं। विनियमन के एक अतिरिक्त स्तर को जोड़ते हुए, प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन को फॉस्फेटेस द्वारा आगे संशोधित किया जाता है, जो फॉस्फेट समूहों को हटाकर किनेसेस का मुकाबला करता है।

रिसेप्टर और प्रभावक अणु दोनों स्तरों पर ये फॉस्फोराइलेशन घटनाएं सिग्नलिंग मार्गों के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण हैं और अंततः नाभिक में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के परिणामस्वरूप, विशिष्ट सेल गतिविधियों को चलाती हैं, जैसे माइग्रेशन, प्रसार, अस्तित्व और भेदभाव, जिसके परिणामस्वरूप स्तनधारी चेहरे का उचित गठन होता है। किनेसेस और फॉस्फेटेस के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन की संदर्भ विशिष्टता, पीटीएम में परिणामी परिवर्तन, और सेल गतिविधि पर उनके प्रभावों को देखते हुए, यह महत्वपूर्ण है कि इन मापदंडों का अध्ययन शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेटिंग में किया जाए ताकि क्रैनियोफेशियल विकास के लिए फॉस्फोराइलेशन घटनाओं के योगदान की पूरी समझ हासिल की जा सके। यहां, प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन का अध्ययन करने के लिए दो संदर्भों के उदाहरण और इस प्रकार, स्तनधारी क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान सिग्नलिंग मार्गों की सक्रियता प्रदान की जाती है: माउस चेहरे की प्रक्रियाएं, विशेष रूप से ई 11.5 मैक्सिलरी प्रक्रियाओं में, और ई 13.5 माध्यमिक तालु अलमारियों से व्युत्पन्न सुसंस्कृत माउस भ्रूण तालु मेसेंकाइम कोशिकाएं - दोनों प्राथमिक32 और अमर33 . ई 11.5 पर, दाढ़ की हड्डी की प्रक्रिया पार्श्व और औसत दर्जे की नाक प्रक्रियाओं1 के साथ फ्यूज करने की प्रक्रिया में होती है, जिससे माउस क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण समय बिंदु का प्रतिनिधित्व होता है। इसके अलावा, तालु अलमारियों से व्युत्पन्न मैक्सिलरी प्रक्रियाओं और कोशिकाओं को यहां चुना गया था क्योंकि बाद की संरचनाएं पूर्व के डेरिवेटिव हैं, जिससे शोधकर्ताओं को संबंधित संदर्भों में विवो और इन विट्रो में प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन से पूछताछ करने का अवसर प्रदान किया जाता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल वैकल्पिक चेहरे की प्रक्रियाओं और विकासात्मक समय बिंदुओं पर भी लागू होता है।

फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण समस्या यह है कि वे प्रचुर मात्रा में पर्यावरणीय फॉस्फेट द्वारा प्रोटीन अलगाव के दौरान आसानी से डिफॉस्फोरिलेटेड होते हैं। इस बाधा को दूर करने के लिए, मानक प्रयोगशाला विधियों के अनुकूलन और संशोधन जो फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के अलगाव की अनुमति देते हैं, पर चर्चा की जाती है। इसके अतिरिक्त, फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के उचित विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए सर्वोत्तम प्रथाएं प्रदान की जाती हैं। या मूत्र आनुवंशिक मॉडल के साथ संयोजन में, क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान सक्रिय विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों की गतिशीलता और भूमिकाओं में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को कोलोराडो एंशुट्ज़ मेडिकल कैंपस विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और संस्थागत दिशानिर्देशों और नियमों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया था। 1.5-6 महीने की उम्र में मादा 12 9 एस 4 चूहों और 21-23 डिग्री सेल्सियस के उप-थर्मोन्यूट्रल तापमान पर रखे गए भ्रूण फसल के लिए उपयोग किया गया था। प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध वर्कफ़्लो चित्रा 1 में दर्शाया गया है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों, सॉफ़्टवेयर, अभिकर्मकों और जानवरों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. कटाई E11.5 माउस भ्रूण

  1. लगभग 50% विस्थापन (3 कक्ष में360 में 2.95 एल / मिनट) के लिए आवश्यक आईएसीयूसी-अनुमोदित सीओ2 प्रवाह दर का उपयोग करके सीओ 2कक्ष में समयबद्ध संभोग के दौरान योनि प्लग का पता लगाने के 11.5 दिन बाद गर्भवती महिला माउस को यूथेनाइज करें और एक्सपोजर की अवधि ( सामग्री की तालिका देखें)। इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि के रूप में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करें। विच्छेदन के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  2. ऊपर का सामना करना पड़ उदर पक्ष के साथ एक विदारक बोर्ड पर माउस शरीर रखना. 70% इथेनॉल के साथ माउस पेट स्प्रे।
  3. सीधे सेमकेन संदंश के साथ योनि खोलने के लिए त्वचा के पूर्वकाल को चुटकी लेने और उठाने और "वी" आकार उत्पन्न करने के लिए दोनों तरफ 45 डिग्री कोण पर सीधे ब्लेड सर्जिकल कैंची के साथ उठाए गए त्वचा और अंतर्निहित परतों को काटकर पेट की गुहा खोलें जो प्रत्येक पार्श्व सतह तक फैली हुई है।
  4. सेमकेन संदंश का उपयोग करके, गर्भाशय के सींगों में से एक को पकड़ें और सर्जिकल कैंची के साथ ओविडक्ट के नीचे और गर्भाशय ग्रीवा के ऊपर काट लें। गर्भाशय सींग को पूरी तरह से हटाने की अनुमति देने के लिए मेसोमेट्रियम को काट लें।
  5. विच्छेदित गर्भाशय सींग को हिस्टोलॉजी फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) [0.137 एम एनएसीएल, 2.68 एमएम केसीएल, 1.76 एमएम केएच2पीओ 4 मोनोबेसिक, 10.14 एमएम ना2एचपीओ 4 डिबेसिक, पीएच7.4] के 10 एमएल में 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  6. चरण 1.4-1.5 में वर्णित एक ही प्रक्रिया का उपयोग करके पेट की गुहा के विरोधी पक्ष पर दूसरे गर्भाशय सींग को हटा दें।
  7. बर्फ पर दोनों गर्भाशय सींग युक्त 10 सेमी पेट्री डिश रखें यदि व्यक्तिगत भ्रूण के विच्छेदन के लिए तुरंत आगे नहीं बढ़ रहा है (यानी, यदि एक दूसरी महिला माउस विच्छेदित किया जाएगा)।
  8. एक विदारक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से ड्यूमोंट # 5 ठीक संदंश के साथ गर्भाशय सींग से प्रत्येक भ्रूण को विच्छेदित करें। धीरे-धीरे मायोमेट्रियम, डिसाइडुआ और कोरियन को दूर खींचें। भ्रूण के आस-पास के अपेक्षाकृत पारदर्शी एमनियन को फाड़ें और हटा दें, और भ्रूण को प्लेसेंटा से जोड़ने वाली गर्भनाल को तोड़ दें।
  9. एक कट प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट या एक भ्रूण चम्मच का उपयोग कर बर्फ पर एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के एक व्यक्तिगत कुएं में हिस्टोलॉजी पीबीएस के 2.5 एमएल के लिए प्रत्येक विच्छेदित भ्रूण स्थानांतरण स्थानांतरण।
    नोट: यदि एक कूड़े के साथ काम कर रहा है जिसमें एक से अधिक जीनोटाइप के भ्रूण हो सकते हैं, तो प्रत्येक भ्रूण को जीनोटाइपिंग के लिए बर्फ पर अपने स्वयं के प्रीलेबल 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखकर प्रत्येक भ्रूण के आस-पास के एमनियन को बचाएं।

2. ई 11.5 माउस भ्रूण से दाढ़ की हड्डी प्रक्रियाओं विच्छेदन

  1. हिस्टोलॉजी पीबीएस के 10 एमएल युक्त तीन 10 सेमी पेट्री डिश तैयार करें और भ्रूण के बीच रोटेशन में उपयोग करने के लिए उन्हें बर्फ पर रखें।
  2. एक कट प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट या भ्रूण चम्मच का उपयोग करके बर्फ पर हिस्टोलॉजी पीबीएस के साथ 10 सेमी पेट्री डिश में से एक के लिए 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के एक व्यक्तिगत कुएं से एक भ्रूण को स्थानांतरित करें।
  3. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक संदंश का उपयोग कर चेहरे से प्रत्येक दाढ़ की हड्डी की प्रक्रिया को अलग करें। सबसे पहले, पार्श्व नाक प्रक्रिया और दाढ़ की हड्डी प्रक्रिया (चित्रा 2 ए) को अलग करने वाले प्राकृतिक इंडेंटेशन के साथ एक मैक्सिलरी प्रक्रिया के पूर्वकाल पक्ष को काटें।
  4. दूसरा, मैक्सिलरी प्रक्रिया और मैंडिबुलर प्रक्रिया (चित्रा 2 ए) को अलग करने वाले प्राकृतिक इंडेंटेशन के साथ मैक्सिलरी प्रक्रिया के पीछे की ओर काटें।
  5. तीसरा, दाढ़ की हड्डी की प्रक्रिया को पूरी तरह से अलग करने के लिए, दाढ़ की हड्डी की प्रक्रिया के आंखों की तरफ मैक्सिलरी प्रक्रिया के पूर्वकाल से पीछे के किनारों पर एक ऊर्ध्वाधर कटौती करें जहां अंत के ऊपर संदर्भित प्राकृतिक इंडेंटेशन (चित्रा 2 ए-सी)।
  6. चेहरे के विरोधी पक्ष पर मैक्सिलरी प्रक्रिया के लिए इन तीन कटौती को दोहराएं।
  7. एक 2 एमएल छोटे लेटेक्स बल्ब के साथ एक 9 "पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, दाढ़ की हड्डी प्रक्रियाओं की विच्छेदित जोड़ी और बर्फ पर लेबल किए गए 35 मिमी पेट्री डिश (चित्रा 2 डी) के लिए हिस्टोलॉजी पीबीएस के लगभग 30 μL की एक छोटी बूंद को स्थानांतरित करें।
  8. प्रत्येक भ्रूण के लिए चरण 2.3-2.7 का पालन करें, भ्रूण के बीच बर्फ पर ऊतक विज्ञान पीबीएस युक्त तीन 10 सेमी पेट्री डिश घूर्णन। बर्फ पर अलग 35 मिमी पेट्री डिश में विच्छेदित दाढ़ की हड्डी प्रक्रियाओं के व्यक्तिगत जोड़े रखें।
    नोट: दाढ़ की हड्डी की प्रक्रिया एक्टोडर्म और मेसेंकाइमल (चरण 2.9-2.17) का पृथक्करण कूड़े में सभी भ्रूणों की मैक्सिलरी प्रक्रियाओं को विच्छेदित करने के बाद किया जा सकता है। यदि एक्टोडर्म और मेसेंकाइम दोनों युक्त बरकरार मैक्सिलरी प्रक्रियाएं वांछित हैं, तो नीचे दिए गए चरण 2.18 पर आगे बढ़ें।
  9. ऊतक संस्कृति पीबीएस में ताजा 2% ट्रिप्सिन के 250 μL और ऊतक संस्कृति पीबीएस में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 250 μL तैयार करें और बर्फ पर स्टोर करें।
  10. दाढ़ की हड्डी प्रक्रियाओं वाले हिस्टोलॉजी पीबीएस के पहले, छोटे बूंद से अलग 35 मिमी पेट्री डिश में 2% ट्रिप्सिन के लगभग 30 μL की एक दूसरी, छोटी बूंद रखें। पाश्चर पिपेट (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके 2% ट्रिप्सिन की छोटी बूंद के लिए मैक्सिलरी प्रक्रियाओं की जोड़ी को स्थानांतरित करें।
  11. 15 मिनट के लिए बर्फ पर पकवान सेते हैं।
  12. बर्फ से 35 मिमी पेट्री डिश निकालें और विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे जगह।
  13. ठीक संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे और ध्यान से प्रत्येक मैक्सिलरी प्रक्रिया (चित्रा 2 ई) से एक्टोडर्म की परत को खींचें।
    नोट: यदि एक्टोडर्म एक बरकरार शीट में मेसेंकाइमल से अलग नहीं हो रहा है, तो अलगाव के साथ जारी रखने से पहले 5 अतिरिक्त मिनट तक कमरे के तापमान (आरटी) पर 2% ट्रिप्सिन में सेते हैं। यदि ऊतक 2% ट्रिप्सिन में विघटित होना शुरू कर देता है, तो मैक्सिलरी प्रक्रियाओं को 10% एफबीएस में ले जाएं जैसा कि ट्रिप्सिन को बेअसर करने और एक्टोडर्म और मेसेंकाइम के पृथक्करण को खत्म करने के लिए नीचे वर्णित है।
  14. एक बार मैक्सिलरी प्रक्रिया एक्टोडर्म और मेसेंकाइम अलग हो जाने के बाद (चित्रा 2 एफ), मैक्सिलरी प्रक्रियाओं की जोड़ी से वांछित ऊतकों को 10% एफबीएस के लगभग 30 μL की तीसरी, छोटी बूंद में स्थानांतरित करें - दो पिछले छोटे बूंदों से अलग - पाश्चर पिपेट (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके।
  15. ट्रिप्सिनाइजेशन को रोकने के लिए बर्फ पर 35 मिमी पेट्री डिश रखें।
  16. 1-2 मिनट के लिए 10% एफबीएस में बर्फ पर दाढ़ की हड्डी प्रक्रिया के ऊतकों सेते हैं, और फिर दोनों मैक्सिलरी प्रक्रियाओं से ऊतकों को बर्फ पर पूर्ववर्ती ऊतक विज्ञान पीबीएस के लगभग 30 μL की एक चौथाई, छोटी बूंद में स्थानांतरित करें - तीन पिछले छोटे बूंदों से अलग - पाश्चर पिपेट (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके।
  17. 1 मिनट के लिए हिस्टोलॉजी पीबीएस में मैक्सिलरी प्रक्रिया ऊतकों को सेते हैं, जबकि धीरे-धीरे पाश्चर पिपेट की नोक के साथ मैक्सिलरी प्रक्रिया ऊतकों के चारों ओर हिस्टोलॉजी पीबीएस को घुमाते हुए यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी एफबीएस ऊतक से धोया जाता है।
  18. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके बर्फ पर लेबल किए गए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मैक्सिलरी प्रक्रिया ऊतकों की जोड़ी को स्थानांतरित करें, हिस्टोलॉजी पीबीएस के हस्तांतरण को कम करें। पाश्चर पिपेट के साथ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में किसी भी अतिरिक्त हिस्टोलॉजी पीबीएस को हटा दें।
  19. कूड़े में प्रत्येक भ्रूण से मैक्सिलरी प्रक्रियाओं को विच्छेदन करने के लिए उपरोक्त चरणों का पालन करें।
  20. पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स (नीचे) को अलग करने के लिए नमूनों को तुरंत संसाधित करें या -80 डिग्री सेल्सियस दीर्घकालिक पर स्टोर करें। दीर्घकालिक भंडारण से पहले, 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर 100% ईटीओएच के स्नान में 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को स्नैप-फ्रीज करें।

3. माउस मैक्सिलरी प्रक्रियाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स को अलग करना

  1. यदि मैक्सिलरी प्रक्रियाओं को पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए थे, तो उन्हें बर्फ पर पिघलाएं।
  2. प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों (1x पूर्ण मिनी प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल [पानी में भंग; -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत], 1 एमएम पीएमएसएफ [पानी में भंग; -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत], 1 एमएम पीएमएसएफ [आइसोप्रोपेनोल में भंग; 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत] के साथ बर्फ-ठंडे एनपी -40 लाइसिस बफर (20 एमएम ट्रिस एचसीएल पीएच 8, 150 एमएम एनएसीएल, 10% ग्लिसरॉल, 1% नोनिडेट पी -40, 2 एमएम ईडीटीए; 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के 0.1 एमएल जोड़ें। पिघलना से बचें], 1 एमएम ना3वीओ4 [-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत], 25 एमएम β-ग्लिसरोफॉस्फेट [4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत]) बर्फ पर उपयोग से तुरंत पहले जोड़ा गया।
    नोट: सेल विभाजन वैकल्पिक रूप से साइटोप्लाज्मिक, परमाणु, झिल्ली, या माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन अंशों को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
  3. 200 μL पाइपमैन के साथ 10 बार ऊपर और नीचे पाइप करें।
  4. 10 एस के लिए भंवर, और फिर 200 μL पिपेटमैन के साथ 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। बुलबुले पैदा करने से बचें।
  5. 2 एमएल पैडल एक ट्यूब रिवॉल्वर के साथ एक 1.5 एमएल / 2 एमएल पैडल का उपयोग करके अंत में घूर्णन करते हुए 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 13,500 × ग्राम पर नमूनों को अपकेंद्रित्र।
  7. एक 200 मिलीलीटर पिपेटमैन के साथ बर्फ पर एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
  8. प्रोटीन परख किट के साथ प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें, प्रयोगात्मक नमूनों के लिए एनपी -40 लाइसिस बफर के प्रोटीन लाइसेट + 10 μL के 10 μL और प्रोटीन मानकों के रूप में 0.25-2.0 मिलीग्राम / एमएल की एक सीमा पर एनपी -40 लाइसिस बफर में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (अंश वी) (बीएसए) के 3-5 कमजोर पड़ने का उपयोग करके।
  9. सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) (चरण 5) के साथ आगे बढ़ें या सूखी बर्फ पर शेष लाइसेट्स को जल्दी से फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस दीर्घकालिक पर स्टोर करें।

4. प्राथमिक और / या अमर माउस भ्रूण तालु मेसेंकाइम (एमईपीएम) कोशिकाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स को अलग करना

नोट: अलगाव और E13.5 माउस भ्रूण और अमर एमईपीएम कोशिकाओं से प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं की संस्कृति पहले32,33,34 वर्णित किया गया है। विकास कारक (चरण 4.1-4.7) के साथ कोशिकाओं की उत्तेजना सेल लिसिस से पहले किया जा सकता है। यदि गैर-उत्तेजित कोशिकाएं वांछित हैं, तो नीचे दिए गए चरण 4.8 पर आगे बढ़ें।

  1. एमएल पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 50 μg / एमएल, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 10% एफबीएस] के साथ विकास माध्यम [डुल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) को एक वैक्यूम सिस्टम से जुड़े 5.75 "पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 6 सेमी सेल संस्कृति पकवान में ~ 70% संगम पर एमईपीएम कोशिकाओं से एस्पिरेट करें।
  2. ऊतक संस्कृति पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  3. सीरम भुखमरी माध्यम के 3 एमएल जोड़ें [डीएमईएम पेनिसिलिन के 50 यू / एमएल के साथ, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 50 μg / एमएल, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 0.1% एफबीएस] 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में प्रीवार्म किया गया।
  4. 23 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेते हैं।
  5. ताजा, पूर्ववर्ती सीरम भुखमरी माध्यम के 3 एमएल के साथ सीरम भुखमरी माध्यम को बदलें।
  6. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेते हैं।
  7. समय की वांछित लंबाई के लिए एक अनुभवजन्य रूप से निर्धारित एकाग्रता पर पसंद के विकास कारक के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
  8. एक वैक्यूम सिस्टम से जुड़े 5.75 "पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 80% -100% संगम पर एमईपीएम कोशिकाओं से माध्यम को एस्पिरेट करें।
  9. बर्फ-ठंडे ऊतक संस्कृति पीबीएस (6 सेमी सेल संस्कृति पकवान के लिए 1 एमएल) के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं; सभी ऊतक संस्कृति पीबीएस आकांक्षित है सुनिश्चित करने के लिए पिछले धोने के दौरान पक्ष के लिए थाली झुकाव।
  10. बर्फ पर उपयोग से तुरंत पहले जोड़े गए प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ बर्फ-ठंडे एनपी -40 लाइसिस बफर को जोड़कर कोशिकाओं को लाइस करें (6 सेमी सेल संस्कृति पकवान के लिए 0.1 एमएल)।
  11. प्लेट के पूर्ण कवरेज को सुनिश्चित करने के लिए लगभग हर मिनट रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए बर्फ पर प्लेट को सेते हैं।
  12. एक प्रीकोल्ड सेल लिफ्टर का उपयोग करके प्लेट से कोशिकाओं को स्क्रैप करें और सेल निलंबन को बर्फ पर एक प्रीकोल्ड 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  13. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन सेते हैं, जबकि एक ट्यूब रिवॉल्वर के साथ 1.5 एमएल /
  14. ऊपर वर्णित चरण 3.6-3.9 के साथ आगे बढ़ें।

5. फॉस्फोप्रोटीन के लिए माउस चेहरे की प्रक्रियाओं और / या एमईपीएम कोशिकाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स का पश्चिमी सोख्ता

  1. एसडीएस-पेज के लिए पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट नमूने तैयार करें।
    1. कोशिका में प्रोटीन बहुतायत के आधार पर लोड होने के लिए प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें; 12.5 μg आमतौर पर पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स में मजबूत रूप से व्यक्त प्रोटीन के लिए पर्याप्त है।
    2. उपयोग से तुरंत पहले जोड़े गए 10% β-मर्केप्टोइथेनॉल के साथ 2 एक्स लैम्ली बफर [20% ग्लिसरॉल, 4% एसडीएस, 0.004% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 0.125 एम ट्रिस एचसीएल पीएच 6.8] की समान मात्रा जोड़ें।
      चेतावनी: β-मर्केप्टोइथेनॉल त्वचा या आंख संक्षारक, विषाक्त, खतरनाक है यदि निगल लिया जाता है, और जलीय विषाक्तता है। एक रासायनिक धूआं हुड में दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, चेहरा ढाल, और सुरक्षा चश्मा पहने हुए संभालें। पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार निपटान करें।
    3. भंवर द्वारा मिलाएं।
    4. एक मिनी सूखी स्नान में 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को गर्म करें।
    5. भंवर द्वारा मिलाएं और बर्फ पर नमूनों को रखें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 9,400 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    7. एसडीएस-पेज जेल में लोड होने से पहले नमूनों को बर्फ पर संक्षेप में रखें, या -20 डिग्री सेल्सियस दीर्घकालिक पर स्टोर करें।
  2. 4% -15% प्रीकास्ट प्रोटीन जेल और वैद्युतकणसंचलन बफर35 के साथ एक वैद्युतकणसंचलन सेल का उपयोग करके एसडीएस-पेज करें।
  3. इलेक्ट्रोट्रांसफर प्रोटीन को पॉलीविनाइलिडेन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में 0% -20% मेथनॉल (100 केडीए से अधिक प्रोटीन के लिए 0% -10%; 100 केडीए से कम प्रोटीन के लिए 20%) के साथ स्थानांतरण बफर का उपयोग करके प्रोटीन को उपयोग करने से तुरंत पहले जोड़ा गया35 का उपयोग करें।
  4. ब्याज के फॉस्फोप्रोटीन के लिए झिल्ली और जांच को अवरुद्ध करें।
    1. स्थानांतरण के बाद, एक पश्चिमी धब्बा बॉक्स में 5 मिनट के लिए 1 एक्स ट्रिस-बफर खारा (टीबीएस) [20 एमएम ट्रिस, 0.137 एम एनएसीएल, पीएच 7.6] में झिल्ली को धो लें।
    2. अवरुद्ध बफर के 5 एमएल में झिल्ली को सेते हैं [1x टीबीएस, 0.1% ट्वीन 20, 5% डब्ल्यू / वी बीएसए; अच्छी तरह से मिश्रित और 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया 0.2 μm छिद्रों के साथ एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके लुएर टिप के साथ 10 एमएल सिरिंज] एक कक्षीय शेकर पर आंदोलन के साथ एक पश्चिमी धब्बा बॉक्स में 1 घंटे के लिए।
      नोट: फॉस्फोप्रोटीन की विशेषता के दौरान दूध को अवरुद्ध एजेंट के रूप में उपयोग न करें क्योंकि इसमें फॉस्फोप्रोटीन कैसिइन होता है, जो उच्च, गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत का कारण बन सकता है।
    3. एक कक्षीय शेकर पर आंदोलन के साथ एक पश्चिमी धब्बा बॉक्स में टीबीएस-टी [1 एक्स टीबीएस, 0.1% ट्वीन 20] में प्रत्येक 5 मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोएं।
    4. एक ट्यूब रिवॉल्वर के साथ एक 50 एमएल पैडल का उपयोग कर एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर को अवरुद्ध करने में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 5 एमएल में झिल्ली सेते हैं।
      नोट: पश्चिमी सोख्ता के लिए उपयुक्त एकाग्रता के लिए एंटीबॉडी डेटाशीट परामर्श करें।
    5. एक कक्षीय शेकर पर आंदोलन के साथ एक पश्चिमी धब्बा बॉक्स में टीबीएस-टी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए आरटी पर झिल्ली को तीन बार धोलें।
    6. एक कक्षीय शेकर पर आंदोलन के साथ एक पश्चिमी धब्बा बॉक्स में 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध करने में पतला उपयुक्त हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेस (एचआरपी) -संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 5 एमएल में झिल्ली को सेते हैं।
    7. एक कक्षीय शेकर पर आंदोलन के साथ एक पश्चिमी धब्बा बॉक्स में टीबीएस-टी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोलें।
    8. 1 मिनट के लिए बढ़ी हुई केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) पश्चिमी सोख्ता सब्सट्रेट [बोतलों 1 और 2 से बराबर मात्रा में मिश्रण; बड़े (8.6 सेमी एक्स 6.7 सेमी) झिल्ली के लिए प्रत्येक के 0.5 एमएल] में झिल्ली को सेते हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि पूरी झिल्ली लगातार ईसीएल पश्चिमी सोख्ता सब्सट्रेट के संपर्क में है।
    9. अतिरिक्त ईसीएल पश्चिमी सोख्ता सब्सट्रेट की झिल्ली नाली और तुरंत एक chemiluminescence इमेजर का उपयोग कर विकसित.
  5. झिल्ली पट्टी और ब्याज की कुल प्रोटीन के लिए reprobe.
    1. पॉलीथीन अस्तर के साथ एक पारदर्शी थैली में पीवीडीएफ झिल्ली रखें जिसमें स्ट्रिपिंग बफर [2% एसडीएस, 62.5 एमएम ट्रिस एचसीएल पीएच 6.8] के 5 एमएल होते हैं, जिसमें उपयोग से तुरंत पहले जोड़े गए β-मर्केप्टोइथेनॉल के 8 μ एल /
    2. प्रति मिनट 11 क्रांतियों पर एक संकरण ओवन में कमाल के साथ 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. एक कक्षीय शेकर पर आंदोलन के साथ एक पश्चिमी धब्बा बॉक्स में टीबीएस-टी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए आरटी पर झिल्ली को तीन बार धोलें।
    4. ऊपर वर्णित चरण 5.4.2-5.4.9 के साथ आगे बढ़ें।
  6. इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा बैंड घनत्व की मात्रा निर्धारित करें, ब्याज के फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन के स्तर को ब्याज के कुल प्रोटीन के स्तरतक सामान्य करना 36.

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Representative Results

या सुसंस्कृत तालु मेसेंकाइम कोशिकाओं से अलग प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन को चिह्नित करने का प्रयास करते समय, प्रतिनिधि परिणाम आदर्श रूप से एक एंटी-फॉस्फोप्रोटीन एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता के बाद एक अलग, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बैंड प्रकट करेंगे जो ऊंचाई पर या उसके पास चलता है इसी कुल प्रोटीन बैंड (चित्रा 3) ). हालांकि, यदि प्रोटीन का व्यापक फॉस्फोराइलेशन होता है, तो कुल प्रोटीन बैंड की तुलना में फॉस्फोप्रोटीन बैंड की थोड़ी ऊपर की ओर बदलाव हो सकता है। इसके अलावा, यदि एक प्रोटीन के कई आइसोफॉर्म एक ऊतक में मौजूद हैं, जिनमें से प्रत्येक फॉस्फोरिलेटेड है, या प्रोटीन को अतिरिक्त पीटीएम के अधीन किया जाता है, तो कई बैंड पश्चिमी धब्बे में एंटी-फॉस्फोप्रोटीन एंटीबॉडी के साथ दिखाई दे सकते हैं। यदि ब्याज के फॉस्फोप्रोटीन के लिए कोई संकेत नहीं देखा जाता है, तो ब्याज के कुल प्रोटीन का पता लगाने के बावजूद, प्रोटीन को चुने हुए संदर्भ में फॉस्फोराइलेट नहीं किया जा सकता है, या प्रोटोकॉल के साथ एक तकनीकी मुद्दा उत्पन्न हो सकता है। उत्तरार्द्ध मामले में, पूरे सेल लाइसेट्स के पश्चिमी सोख्ता को एंटी-फॉस्फोसेरिन / थ्रेओनिन और / या एंटी-फॉस्फोटायरोसिन एंटीबॉडी के साथ किया जा सकता है ताकि यह इंगित किया जा सके कि प्रोटोकॉल ने उम्मीद के अनुसार काम किया है या नहीं। चूंकि प्रोटीन का फॉस्फोराइलेशन क्रैनियोफेशियलऊतकों 25,37 में प्रचुर मात्रा में है, इसलिए कई फॉस्फोप्रोटीन बैंड की उपस्थिति प्रोटोकॉल के सफल समापन और प्रारंभिक स्क्रीनिंग से सटीक परिणामों का संकेत देगी।

जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती भ्रूण ऊतकों के बीच या सुसंस्कृत कोशिकाओं के उपचार के जवाब में फॉस्फोप्रोटीन के स्तर की तुलना करना अक्सर उपयोगी होता है। पूर्व मामले में, जीनोटाइप के बीच फॉस्फोप्रोटीन के स्तर में अंतर ब्याज27 के कुल प्रोटीन के समान स्तर के साथ ब्याज के फॉस्फोप्रोटीन के लिए बैंड तीव्रता में अंतर के रूप में दिखाई देगा। उत्तरार्द्ध मामले में, प्रतिनिधि परिणाम उपचार पर अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में बढ़ी हुई फॉस्फोप्रोटीन बैंड तीव्रता को प्रकट करेंगे, उदाहरण के लिए, एक विकास कारक (चित्रा 3) और किनेज अवरोधक27,37 के साथ उपचार के बाद बैंड तीव्रता में कमी आई है। इन मतभेदों की मात्रा के लिए, ब्याज के फॉस्फोप्रोटीन के स्तर को ब्याज के कुल प्रोटीन के स्तर पर सामान्यीकृत किया जाएगा। ब्याज के कुल प्रोटीन के स्तर नमूनों के बीच अपेक्षाकृत बराबर होने की उम्मीद कर रहे हैं, एक खोज जो लोड हो रही है और अभिव्यक्ति नियंत्रण प्रोटीन के खिलाफ एक या एक से अधिक एंटीबॉडी का उपयोग करके अलग पश्चिमी सोख्ता द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए जैसे कि β-ट्यूबिलिन, β-एक्टिन, और / सुसंस्कृत कोशिकाओं के विकास कारक उपचार के लिए, सकारात्मक परिणाम संभवतः उत्तेजना (चित्रा 3) के बाद 2-15 मिनट के अपेक्षाकृत कम समय सीमा में फॉस्फोप्रोटीन के स्तर में वृद्धि दिखाएंगे। विकास कारक उपचार की अनुपस्थिति में बहुत कम या कोई फॉस्फोराइलेशन नहीं होना चाहिए, जब तक कि प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन के परिणामस्वरूप खेलने में अन्य कारक न हों, जिनमें से उदाहरणों में कोशिकाओं द्वारा विकास कारकों की अंतर्जात अभिव्यक्ति, कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एक अन्य सिग्नलिंग अणु द्वारा प्रोटीन का फॉस्फोराइलेशन, और / या एक उत्परिवर्तन जो विकास कारक उपचार की अनुपस्थिति में प्रोटीन के संवैधानिक फॉस्फोराइलेशन की ओर जाता है। परिणामों की व्याख्या में इन कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। नकारात्मक परिणामों में विकास कारक उपचार के टाइमकोर्स के जवाब में फॉस्फोराइलेशन में कोई बदलाव नहीं होता है, इस मामले में प्रोटोकॉल का मूल्यांकन फॉस्फोप्रोटीन के रखरखाव के लिए किया जाना चाहिए जैसा कि ऊपर विस्तृत है। इसके अतिरिक्त, झिल्ली स्ट्रिपिंग की प्रक्रिया कभी-कभी कुल प्रोटीन के स्तर को प्रभावित कर सकती है, और कम कर सकती है। इस मामले में, ब्याज के कुल प्रोटीन बनाम ब्याज के फॉस्फोप्रोटीन की मात्रा के लिए विपरीत रुझान देखे जाएंगे। यह सबऑप्टिमल है, क्योंकि कुल प्रोटीन का स्तर नमूनों में अपेक्षाकृत बराबर होने की उम्मीद है, प्रोटीन के बराबर लोडिंग और अभिव्यक्ति मानते हुए, केवल फॉस्फोप्रोटीन स्तरों में होने वाले परिवर्तनों के साथ।

Figure 1
चित्रा 1: फॉस्फोप्रोटीन विश्लेषण के लिए माउस चेहरे की प्रक्रियाओं और सुसंस्कृत तालु मेसेंकाइमल कोशिकाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स के अलगाव के लिए वर्कफ़्लो। मैक्सिलरी प्रक्रियाओं को बर्फ पर ई 11.5 माउस भ्रूण से विच्छेदित किया जाता है, और / या माध्यम को 80% -100% संगम पर सुसंस्कृत एमईपीएम कोशिकाओं से एस्पिरेटेड किया जाता है, जिन्हें बाद में बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोया जाता है। पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स को प्रोटीज और फॉस्फेट इनहिबिटर के साथ लाइसिस बफर का उपयोग करके अलग किया जाता है, इसके बाद एसडीएस-पेज, पीवीडीएफ झिल्ली के लिए इलेक्ट्रोट्रांसफर, बीएसए के साथ झिल्ली को अवरुद्ध करना, फॉस्फोप्रोटीन के लिए जांच करना, झिल्ली को अलग करना, कुल प्रोटीन के लिए पुन: जांच करना, और बैंड तीव्रता की मात्रा। संक्षेप: एलएनपी = पार्श्व नाक प्रक्रिया; एमएक्सपी = मैक्सिलरी प्रक्रिया; एमडीपी = मैंडिबुलर प्रक्रिया; पीए 2 = दूसरा ग्रसनी मेहराब; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम; पीएस = तालु शेल्फ; एमईपीएम = माउस भ्रूण तालु मेसेंकाइम; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; पीवीडीएफ = पॉलीविनाइलिडेन फ्लोराइड; पी-पी = फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: दाढ़ की हड्डी की प्रक्रियाओं का विच्छेदन। (ए) रंगीन लाइनों द्वारा इंगित चेहरे से एमएक्सपी को अलग करने के लिए आवश्यक तीन कटौती (लेबल 1-3) के साथ एक ई 11.5 माउस भ्रूण का पार्श्व दृश्य। (बी) एक धराशायी काली रेखा के साथ उल्लिखित एमएक्सपी को हटाने के बाद एक ई 11.5 माउस भ्रूण का पार्श्व दृश्य। (डी) पीबीएस की छोटी बूंदों के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश सेट-अप, 2% ट्रिप्सिन, और एमएक्सपी एक्टोडर्म और मेसेंकाइमल के वैकल्पिक पृथक्करण के लिए 10% एफबीएस। (ई) ईसीटी के साथ एमएक्सपी आंशिक रूप से एमईएस से अलग हो गया। (एफ) अलग एमएक्सपी एक्ट और मेस। स्केल बार: 1 मिमी (ए-सी, ई, एफ), 10 मिमी (डी)। संक्षेप: एलएनपी = पार्श्व नाक प्रक्रिया; एमएक्सपी = मैक्सिलरी प्रक्रिया; एमडीपी = मैंडिबुलर प्रक्रिया; पीए 2 = दूसरा ग्रसनी मेहराब; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम; मेस = मेसेंकाइम; एक्ट = एक्टोडर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: अमर एमईपीएम कोशिकाओं के पीडीजीएफ-बीबी लिगैंड उपचार के जवाब में पीडीजीएफआर और एमएपीके प्रभावक एर्क 1/2 फॉस्फोराइलेशन। एमएल पीडीजीएफ-बीबी लिगैंड उत्तेजना के टाइमकोर्स के बाद 2 मिनट से 15 मिनट तक एंटी-फॉस्फो-पीडीजीएफआर, एंटी-पीडीजीएफआर, एंटी-फॉस्फो-एर्क 1/2, एंटी-एर्क 1/2, और एंटी-β-ट्यूबिलिन (ई 7) एंटीबॉडी के साथ पूरे सेल लाइसेट्स का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। एंटी-पीडीजीएफआरब्लॉट में एकाधिक बैंड विभेदक ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: पीडीजीएफ = प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक; डब्ल्यूसीएल = पूरे सेल लाइसेट; केडी = किलोडाल्टन; डब्ल्यूबी = पश्चिमी धब्बा; पी-पीडीजीएफआर = फॉस्फोरिलेटेड पीडीजीएफआर; पीडीजीएफआर = पीडीजीएफ रिसेप्टर; पी-एर्क = फॉस्फोरिलेटेड एर्क; एर्क = बाह्य संकेत-विनियमित किनेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान महत्वपूर्ण फॉस्फोराइलेशन-निर्भर सिग्नलिंग घटनाओं की जांच करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो डेटा के उचित संग्रह और परिणामों के विश्लेषण को सुनिश्चित करते हैं। चाहे माउस चेहरे की प्रक्रियाओं और / या सुसंस्कृत तालु मेसेंकाइम कोशिकाओं से फॉस्फोप्रोटीन को अलग करना हो, संकेत दिए जाने पर बर्फ पर सभी अभिकर्मकों और सामग्रियों को रखते हुए जल्दी और कुशलता से आगे बढ़ना अनिवार्य है। बर्फ का कम तापमान कोशिकाओं में चयापचय गतिविधि को धीमा कर देता है, जिससे फॉस्फेट गतिविधि38 से फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन की रक्षा होती है और उच्च प्रोटीन उपज बनाए रहती है। दाढ़ की हड्डी प्रक्रियाओं के विच्छेदन के दौरान तीन अलग-अलग 10 सेमी पेट्री डिश का उपयोग यह सुनिश्चित करता है कि सभी विच्छेदन पर्याप्त रूप से पूर्ववर्ती ऊतक विज्ञान पीबीएस में होते हैं। संबंधित रूप से, इस प्रोटीन अलगाव प्रोटोकॉल का एक अतिरिक्त, आवश्यक घटक सभी लाइसिस बफर में फॉस्फेट अवरोधकों का उपयोग है। ये अभिकर्मक ब्याज39,40 के प्रोटीन पर फॉस्फेट समूहों की भी रक्षा करते हैं और पश्चिमी सोख्ता द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन की अखंडता को बनाए रखते हैं।

यह प्रोटोकॉल अतिरिक्त रूप से संशोधनों का परिचय देता है जो ऊतक और सुसंस्कृत कोशिकाओं में फॉस्फोप्रोटीन के अधिक विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति देते हैं। चेहरे की प्रक्रियाओं को विच्छेदित करने की प्रक्रिया में, डिब्बे-विशिष्ट प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन27 के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए मैक्सिलरी प्रक्रिया एक्टोडर्म और मेसेंकाइम के पृथक्करण के लिए वैकल्पिक कदम जोड़े गए हैं। इन ऊतक परतों के कुशल अलगाव के लिए परीक्षण करने के लिए, उपयोगकर्ता एक्टोडर्म में समृद्ध जीन की अभिव्यक्ति का आकलन कर सकते हैं, जैसे कि गैब्र्प, ट्रिम 2 9, एसआरपी 1, और एमपीजेडएल 2, और / या मेसेंकाइमल में समृद्ध जीन, जैसे कि एलडीएच 1 ए 2 और एडब्ल्यू 551 9 8441। सुसंस्कृत तालु मेसेंकाइम कोशिकाओं से फॉस्फोप्रोटीन के अलगाव के लिए, विकास कारक उत्तेजना के लिए वैकल्पिक कदम जोड़े गए हैं। इस मामले में, कोशिकाओं को 0.0% -0.1% सीरम युक्त माध्यम में सीरम भूखा होना चाहिए। एफबीएस जैसे मानक सीरम में कई विकास कारक42 होते हैं जो बहिर्जात विकास कारक उत्तेजना से परिणामों को जोड़ सकते हैं। इस प्रकार, अस्थायी सीरम भुखमरी तीव्र विकास कारक उपचार का जवाब देने के लिए कोशिकाओं को प्राइम करती है।

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन को सटीक रूप से मापने के लिए अनुकूलित तरीके भी प्रदान करता है। पश्चिमी सोख्ता चरणों में, दूध के बजाय बीएसए का उपयोग करके पीवीडीएफ झिल्ली को अवरुद्ध करना महत्वपूर्ण है, जिसका उपयोग कई मानक पश्चिमी सोख्ता तकनीकों में किया जाता है। यह स्विच अनिवार्य है, क्योंकि दूध में फॉस्फोप्रोटीन कैसिइन43 होता है और अन्य फॉस्फोप्रोटीन के विश्लेषण में उच्च पृष्ठभूमि संकेत की ओर जाता है। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि ब्याज के फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के स्तर को मानक लोडिंग नियंत्रण प्रोटीन के स्तर के बजाय ब्याज के कुल प्रोटीन के स्तर के खिलाफ मात्रा निर्धारित किया जाता है। इस तरह, ब्याज के कुल प्रोटीन की अभिव्यक्ति में किसी भी बदलाव को फॉस्फोप्रोटीन स्तरों की मात्रा का ठहराव में जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। यदि सटीक फॉस्फोप्रोटीन का पता लगाने के लिए सामान्य रूप से प्रोटीन उपज बहुत कम है, तो एक ही चरण और जीनोटाइप से ऊतक के नमूनों को27 पूल किया जा सकता है, और / या कोशिकाओं को भविष्य के प्रयोगों के लिए यहां वर्णित लोगों की तुलना में बड़े सेल संस्कृति वाहिकाओं में उगाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि अलग करना लगातार कुल प्रोटीन के स्तर को बदलने के लिए प्रकट होता है, तो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए दो दृष्टिकोण ों को लिया जा सकता है: 1) एक एंटीबॉडी योजना का उपयोग जो विभिन्न मेजबान प्रजातियों में उत्पन्न एंटी-फॉस्फोप्रोटीन और एंटी-प्रोटीन एंटीबॉडी को नियोजित करता है दो प्रजातियों-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी और अलग (यदि एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके) या एक साथ (यदि फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए) या एक साथ (यदि फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए) धब्बों का विकास; या 2) दो समान झिल्ली का एक साथ प्रसंस्करण - पहला एक विरोधी फॉस्फोप्रोटीन एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया, दूसरा एंटी-प्रोटीन एंटीबॉडी के साथ। दोनों वैकल्पिक दृष्टिकोणों में, ब्याज के फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के स्तर को अभी भी ब्याज के कुल प्रोटीन के स्तर के खिलाफ मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए। अंत में, जैसा कि फॉस्फोराइलेशन एक गतिशील प्रक्रिया है, फॉस्फोप्रोटीन के स्तर का मूल्यांकन प्रति स्थिति कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियों में किया जाना चाहिए। माउस चेहरे की प्रक्रिया ऊतक या प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाएं एक व्यक्तिगत भ्रूण या एक ही चरण और जीनोटाइप से भ्रूण के एक व्यक्तिगत पूल से व्युत्पन्न एक एकल जैविक प्रतिकृति का गठन करेंगी। इसी तरह, विभिन्न मार्गों के अमर एमईपीएम कोशिकाएं जैविक प्रतिकृति का गठन करेंगी। यदि सुसंस्कृत कोशिकाओं को विकास कारक के साथ इलाज किया जाता है, तो जैविक प्रतिकृतियों का उपचार विकास कारक के अलग-अलग एलिकोट का उपयोग करके अलग-अलग दिनों में होना चाहिए।

यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की दो सीमाएं मौजूद हैं, जिन पर नीचे चर्चा की गई है और प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले विचार किया जाना चाहिए। पहले में ईसीएल की गतिशील सीमा शामिल है। इस प्रोटोकॉल में अनुशंसित ईसीएल पश्चिमी सोख्ता सब्सट्रेट में कम पिकोग्राम संवेदनशीलता के साथ एक विस्तृत गतिशील सीमा है। हालांकि, अनुभवजन्य रूप से, कम बहुतायत या कम फॉस्फोराइलेशन स्थिति के प्रोटीन को इन तरीकों का उपयोग करके पता लगाना मुश्किल हो सकता है। यदि फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन ईसीएल सब्सट्रेट इनक्यूबेशन के 20 मिनट के बाद अनिर्धारित हैं, तो टीबीएस-टी में झिल्ली को धोने की सिफारिश की जाती है जैसा कि वर्णित है और इसके बजाय झिल्ली को कम फेम्टोग्राम संवेदनशीलता के साथ उच्च संवेदनशीलता ईसीएल पश्चिमी सोख्ता सब्सट्रेट में सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है, जो ईसीएल 44 जैसे एंजाइम-आधारितदृष्टिकोणों की तुलना में एक व्यापक गतिशील सीमा प्रदान करते हैं। सामान्यीकरण प्रक्रिया से एक दूसरी सीमा उत्पन्न होती है। जैसा कि बड़े पैमाने पर वर्णित है, यह अनुशंसा की जाती है कि ब्याज के फॉस्फोप्रोटीन से संकेत को ब्याज के कुल प्रोटीन से संकेत के लिए सामान्यीकृत किया जाए। हालांकि, यह प्रक्रिया इस धारणा पर निर्भर करती है कि ब्याज के कुल प्रोटीन के स्तर नमूनों के बीच नहीं बदलते हैं, जो अक्सर एक या एक से अधिक हाउसकीपिंग प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके अलग-अलग पश्चिमी सोख्ता द्वारा पुष्टि की जाती है। हालांकि एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि असमान लोडिंग, झिल्ली में अपूर्ण हस्तांतरण, और / या प्रोटीन अभिव्यक्ति में अंतर के कारण नमूनों के बीच हाउसकीपिंग प्रोटीन का स्तर बदल सकता है। इस प्रकार, सामान्यीकरण के दौरान सटीकता को बढ़ाने के लिए, शोधकर्ता एक सच्चे कुल प्रोटीन दाग को लागू करने के लिए आगे बढ़ने पर विचार कर सकते हैं, जैसे कि पोन्सेउ एस45, जो झिल्ली के प्रत्येक लेन में सभी प्रोटीन का पता लगाता है और इन तकनीकी सीमाओं के लिए जिम्मेदार है।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल प्रोटीन डिफॉस्फोराइलेशन की समस्या को दूर करता है जो आमतौर पर प्रोटीन अलगाव के दौरान होता है। प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन का सटीक विश्लेषण शोधकर्ताओं को क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन की भूमिका की अधिक सटीक समझ हासिल करने में मदद करेगा। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भों में फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण करने के लिए मजबूत और कुशल तरीके प्रदान करता है, प्रत्येक अपने स्वयं के लाभों के साथ। जबकि भ्रूण के ऊतकों से प्रोटीन लाइसेट्स विवो में प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन का एक स्थिर स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, सुसंस्कृत कोशिकाओं का कार्यान्वयन तीव्र उपचार के लिए गतिशील फॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रियाओं पर डेटा की आपूर्ति करता है। इस प्रोटोकॉल में सिग्नलिंग नेटवर्क के भीतर नई बातचीत की खोज करने के लिए बड़े डेटासेट से उपजी परिणामों और परिकल्पनाओं पर सीधे पुष्टि और विस्तार करने की क्षमता है, उदाहरण के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री37 और आरएनए-अनुक्रमण27। महत्वपूर्ण रूप से, इस प्रोटोकॉल का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि फॉस्फोराइलेशन में गड़बड़ी सीधे क्रैनियोफेशियल संदर्भों में इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग, जीन अभिव्यक्ति और सेलुलर गतिविधि को कैसे प्रभावित करती है। ये विविध अनुप्रयोग क्रैनियोफेशियल विकास में प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन के प्रभावों की समझ को बहुत बढ़ाएंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

फिलिप सोरियानो, माउंट सिनाई में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन से एक उपहार थे। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच)/नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च (एनआईडीसीआर) आर01 डीई027689 और के02 डीई028572 से केएएफ, एफ31 डीई029976 से एमएआर और एफ31 डीई029364 से बीजेसीडी तक के फंड से धन के साथ समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

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फॉस्फोप्रोटीन विश्लेषण के लिए माउस चेहरे की प्रक्रियाओं और सुसंस्कृत पैलेटल मेसेंकाइम कोशिकाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स का अलगाव
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