Summary
このプロトコルは、解剖されたマウス胚の顔面プロセスまたは培養マウス胚口蓋間葉系細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離し、その後のウェスタンブロッティングを実行してリン酸化タンパク質レベルを評価する方法を提示する。
Abstract
哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。これらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始され、維持される。ここでは、哺乳類の頭蓋顔面発達中のタンパク質のリン酸化を研究する生理学的に関連する文脈の2つの例が提供される:マウス顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉間膜細胞。タンパク質単離中の脱リン酸化の一般的な障壁を克服するために、リンタンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、全細胞タンパク質溶解物のウェスタンブロッティング後のリンタンパク質の適切な分析および定量化のためのベストプラクティスが提供される。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活性な様々なリンタンパク質の動態および役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。
Introduction
哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。マウスでは、このプロセスは胚期(E)9.5に始まり、前頭鼻突出部および上顎および下顎突起のペアの形成が起こり、それぞれに回遊後頭蓋神経堤細胞が含まれる。側方および内側の鼻プロセスは、鼻孔の出現を伴う前頭鼻突出部から生じ、最終的に融合して鼻孔を形成する。さらに、内側鼻プロセスと上顎プロセスが融合して上唇を生成する。同時に、口蓋形成は、E11.5で上顎突起の口腔側から明確な外生(二次口蓋棚)の形成によって開始される。時間が経つにつれて、口蓋棚は舌の両側で下方に成長し、舌の上の反対の位置に上昇し、最終的に正中線で融合して、E16.51によって鼻腔と口腔を隔てる連続的な口蓋を形成する。
頭蓋顔面発達全体にわたるこれらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始および維持される。例えば、骨形成タンパク質受容体(BMPR)を含む形質転換成長因子(TGF)β受容体のサブファミリー、および種々の受容体チロシンキナーゼ(RTK)ファミリーなどの細胞膜受容体は、頭蓋神経堤細胞におけるリガンド結合および活性化時に自己リン酸化される2,3,4。.さらに、平滑化されたGタンパク質共役型膜貫通型受容体は、Patched1受容体に結合するソニックヘッジホッグ(SHH)リガンドの下流の頭蓋神経堤細胞および頭蓋顔面外胚葉においてリン酸化され、毛様体膜およびSHH経路活性化5における平滑化蓄積をもたらす。このようなリガンド-受容体相互作用は、頭蓋顔面状況におけるオートクリン、パラクリン、および/またはジュクスタクリンシグナル伝達を介して起こり得る。例えば、BMP6は軟骨細胞分化6中にオートクリン様式でシグナル伝達することが知られており、一方、線維芽細胞増殖因子(FGF)8は咽頭弓外胚葉に発現し、咽頭弓間葉に発現するRTKのFGFファミリーのメンバーにパラクリン様式で結合して咽頭弓7のパターニングおよび外生を開始し、8,9,10。さらに、Notchシグナル伝達は、膜貫通デルタおよび/またはギザギザリガンドが隣接する細胞上の膜貫通Notch受容体に結合し、その後切断およびリン酸化されるときに、傍タクリンシグナル伝達を介して、頭蓋顔面骨格発達中に軟骨細胞および骨芽細胞の両方で活性化される11。しかし、頭蓋顔面発達にとって重要な他のリガンドおよび受容体対は、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達の両方において機能する柔軟性を有する。一例として、マウス歯の形態形成中に、血小板由来成長因子(PDGF)−AAリガンドがオートクリン様式でシグナル伝達し、エナメル器官上皮12中のRTK PDGFRαを活性化することが実証された。対照的に、妊娠中期のマウス顔面突起では、リガンドPDGF-AAおよびPDGF-CCをコードする転写産物が頭蓋顔面外胚葉で発現し、一方、PDGFRα受容体は下層の頭蓋神経堤由来間葉系で発現され、パラクリンシグナル伝達をもたらす13、14、15、16、17.シグナル伝達機構にかかわらず、これらの受容体リン酸化事象は、しばしばアダプタータンパク質および/またはシグナル伝達分子の動員をもたらし、それらはしばしばそれ自体がリン酸化されてマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路などの細胞内キナーゼカスケードを開始する18,19。
これらのカスケードの末端細胞内エフェクターは、転写因子、RNA結合、細胞骨格および細胞外マトリックスタンパク質などの基質の配列をリン酸化することができる。Runx220、Hand1 21、Dlx3/5 22、23、24、Gli1-3 25、およびSox9 26は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化された転写因子の1つである。この翻訳後修飾(PTM)は、他の活性の中でも特に、代替PTMに対する感受性、二量体化、安定性、切断、および/またはDNA結合親和性に直接影響し得る20、21、25、26。さらに、RNA結合タンパク質Srsf3は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化され、その核移行をもたらす27。一般に、RNA結合タンパク質のリン酸化は、その細胞内局在化、タンパク質間相互作用、RNA結合、および/または配列特異性に影響を及ぼすことが示されている28。さらに、アクトミオシンのリン酸化は、頭蓋顔面発生29、30全体にわたる細胞骨格再配列をもたらし得、小さなインテグリン結合リガンドN結合型糖タンパク質などの細胞外マトリックスタンパク質のリン酸化は、骨格発生中のバイオミネラリゼーションに寄与する31。上記および他の多くの例を通して、頭蓋顔面発達中のタンパク質リン酸化に幅広い意味合いがあることは明らかである。さらなるレベルの調節を加えると、タンパク質リン酸化はホスファターゼによってさらに調節され、ホスファターゼはリン酸基を除去することによってキナーゼを打ち消す。
受容体レベルとエフェクター分子レベルの両方でのこれらのリン酸化事象は、シグナル伝達経路の伝播にとって重要であり、最終的には核内の遺伝子発現の変化をもたらし、遊走、増殖、生存、分化などの特定の細胞活性を駆動し、哺乳動物の顔の適切な形成をもたらす。キナーゼおよびホスファターゼとのタンパク質相互作用の状況特異性、PTMの結果生じる変化、および細胞活性に対するそれらの影響を考慮すると、これらのパラメータを生理学的に関連する設定で研究することが重要であり、頭蓋顔面発達に対するリン酸化事象の寄与を完全に理解する。ここでは、タンパク質のリン酸化、したがって哺乳類の頭蓋顔面発達中のシグナル伝達経路の活性化を研究するための2つの文脈の例が提供される:マウスの顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉細胞 - 一次32および不死化33の両方.E11.5では、上顎突起は側鼻突起および内側鼻突起1と融合する過程にあり、それによってマウス頭蓋顔面発達中の臨界時点を表す。さらに、口蓋棚に由来する上顎プロセスおよび細胞がここで選択されたのは、後者の構造が前者の誘導体であり、それによって研究者に、関連する文脈においてインビボおよびインビトロでタンパク質リン酸化を調査する機会を提供するからである。しかし、このプロトコルは、代替の顔のプロセスや発達の時点にも適用できます。
リン酸化タンパク質を研究する上で重要な問題は、豊富な環境ホスファターゼによってタンパク質単離中に容易に脱リン酸化されることである。この障壁を克服するために、リン酸化タンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、リン酸化タンパク質の適切な分析と定量のためのベストプラクティスが提供されています。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活動する様々なシグナル伝達経路のダイナミクスおよび役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。
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Protocol
動物を含むすべての手順は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、施設のガイドラインおよび規制に準拠して実施されました。生後1.5~6ヶ月の雌129S4マウスを21~23°Cの亜熱中性温度で飼育し、胚採取に用いた。プロトコルの概略ワークフローを 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、試薬、および動物の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. E11.5マウス胚の採取
- 約50%の変位(3チャンバーで2.95L/分)および曝露期間に必要なIACUC承認のCO2流量を使用して、CO2チャンバーでの時限交配中の膣プラグの検出後11.5日後に妊娠中のメスマウスを安楽死させる(材料表を参照)。安楽死の二次的方法として子宮頸部脱臼を行う。すぐに解剖に進みます。
- マウス本体を腹側を上に向けて解剖ボードの上に置きます。マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。
- まっすぐなせんけ鉗子で前部の皮膚を膣口につまんで持ち上げ、持ち上げられた皮膚と下層の層をまっすぐな刃の手術用はさみで両側に45°の角度で切断して腹腔を開き、前肢と後肢のほぼ半分の各側面に広がる「V」形状を生成します。
- Semken鉗子を使用して、子宮角の1つをつかみ、外科用はさみで卵管の下と子宮頸部の上を切断します。子宮角を完全に除去できるようにメソメトリウムを切り取ります。
- 解剖した子宮角を10 mLの組織学リン酸緩衝生理食塩水(PBS)[0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 一塩基, 10.14 mMNa2HPO 4二塩基, pH7.4] に10 cmのシャーレに移す。
- 腹腔の反対側にある第2の子宮角は、ステップ1.4-1.5で説明したのと同じ手順を使用して除去する。
- 個々の胚の解剖に直ちに進まない場合(すなわち、2匹目の雌マウスが解剖される場合)に、両方の子宮角を含む10cmのシャーレを氷の上に置く。
- 解剖実体顕微鏡下で、デュモン#5の細かい鉗子で子宮角から各胚を慎重に解剖します。子宮筋層、デシドゥア、および絨毛膜をゆっくりと引き離す。胚を囲む比較的透明な羊膜を引き裂いて取り除き、胚と胎盤をつなぐ臍帯を切断する。
- 切断したプラスチック転写ピペットまたは胚スプーンを用いて、氷上の12ウェル細胞培養プレートの個々のウェル中の組織学PBSの2.5mLに各解剖胚を移す。
注:複数の遺伝子型の胚を含む可能性のあるごみを扱う場合は、氷上の独自のラベル付き0.5 mLマイクロ遠心チューブにそれぞれを入れて、ジェノタイピングのために各胚を囲む羊膜を保存します。
2. E11.5マウス胚からの上顎突起を解剖する
- 組織学PBS10mLを含む3つの10cmペトリ皿を準備し、胚間の回転に使用するためにそれらを氷上に保管する。
- 12ウェル細胞培養プレートの個々のウェルから、切断されたプラスチック転写ピペットまたは胚スプーンを用いて氷上の組織学PBSを有する10cmペトリ皿の1つに1つの胚を移す。
- 解剖顕微鏡下で、微細な鉗子を使用して顔から各上顎プロセスを分離する。まず、側鼻突起と上顎突起とを隔てる自然圧痕に沿って1つの上顎突起の前側を切断する(図2A)。
- 第2に、上顎突起と下顎突起とを隔てる自然のくぼみに沿って上顎突起の後側を切断する(図2A)。
- 第3に、上顎突起を完全に分離するために、上顎突起の前側から後側に向かって、上顎突起の眼側で、上顎突起の端部を基準とした垂直方向の切り込みを行う(図2A-C)。
- 顔の反対側の上顎プロセスに対してこれらの3つのカットを繰り返します。
- 2 mL の小型ラテックス電球を備えた 9 インチパスツールピペットを使用して、解剖した一対の上顎プロセスと約 30 μL の組織学 PBS の小さな液滴を、氷上の標識された 35 mm シャーレに移します (図 2D)。
- 各胚についてステップ2.3〜2.7に従い、組織学PBSを含む3つの10cmペトリ皿を胚間の氷上で回転させる。解剖された上顎突起の個々のペアを氷上の別々の35mmペトリ皿に入れる。
注:上顎プロセス外胚葉および間葉の分離(ステップ2.9〜2.17)は、同腹仔内のすべての胚の上顎プロセスを解剖した後に行うことができる。外胚葉と間葉の両方を含む無傷の上顎突起が必要な場合は、以下のステップ2.18に進みます。 - 組織培養PBSに新鮮な2%トリプシン250 μL、組織培養PBSに10%ウシ胎児血清(FBS)250 μLを調製し、氷上で保存する。
- 上顎プロセスを含む組織学PBSの最初の小さな液滴とは別の35mmシャーレに、約30μLの2%トリプシンの第2の小さな液滴を置く。パスツールピペットを使用して、一対の上顎プロセスを2%トリプシンの小さな液滴に移します(図2D)。
- 皿を氷の上で15分間インキュベートする。
- 氷から35mmのペトリ皿を取り出し、解剖顕微鏡の下に置きます。
- 微細な鉗子を用いて、各上顎突起から外胚葉の層をゆっくりと慎重に引き離す(図2E)。
注:外胚葉が無傷のシートで間葉から分離していない場合は、分離を続行する前に、室温(RT)で2%トリプシン中で最大5分間インキュベートしてください。組織が2%トリプシンで崩壊し始めたら、以下に説明するように上顎プロセスを10%FBSに移動してトリプシンを中和し、外胚葉と間葉の分離を終了します。 - 上顎突起外胚葉と間葉が分離されたら(図2F)、パスツールピペットを使用して、一対の上顎突起から、約30μLの10%FBSの3番目の小さな液滴に所望の組織を移します(図2D)。
- 35mmペトリ皿を氷の上に置き、トリプシン処理を停止します。
- 上顎突起組織を氷上で10%FBS中で1〜2分間インキュベートし、その後、パスツールピペットを使用して、両方の上顎突起から、氷上の約30μLの予冷組織学PBSの第4の小さな液滴に組織を移す(前の3つの小さな液滴とは分離する)(図2D)。
- 上顎プロセス組織を組織学PBS中で1分間インキュベートし、パスツールピペットの先端で上顎プロセス組織の周りに組織学PBSを穏やかに旋回させ、すべてのFBSが組織から洗い流されるようにする。
- パスツールピペットを使用して、一対の上顎プロセス組織を氷上の標識された1.5mL微量遠心チューブに移し、組織学PBSの移送を最小限に抑えた。パスツールピペットで1.5mL微量遠心チューブ内の過剰な組織像PBSを除去します。
- 上記の手順に従って、同腹仔の各胚から上顎プロセスを解剖する。
- サンプルを直ちに処理して、全細胞タンパク質溶解物(下記)を単離するか、-80°Cで長期間保存します。長期保存する前に、1.5 mL マイクロ遠心チューブをドライアイス上の 100% EtOH の浴中で 5 分間スナップフリーズします。
3. マウス上顎突起から全細胞タンパク質溶解物を単離する
- 上顎プロセスが以前に-80°Cで凍結していた場合は、氷上で解凍する。
- 0.1 mLの氷冷NP-40溶解緩衝液(20 mM Tris HCl pH 8、150 mM NaCl、10% グリセロール、1% ノニデット P-40、2 mM EDTA、4 °C 保存)をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 (1x 完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル [水に溶解; -20 °C 保存]、1 mM PMSF [イソプロパノールに溶解; 4°C 保存]) と共に加えます。 氷上で使用直前に10 mM NaF[-20°Cで保存;凍結/解凍を避け]、1 mMNa3VO4[-20°Cで保存]、25 mM β-グリセロリン酸[4°Cで保存])を加えた。
注:細胞分画は、細胞質、核、膜、またはミトコンドリアタンパク質画分を単離するために代替的に行うことができる。 - ピペットマンを200μLで10回上下させる。
- ボルテックスを10秒間、次いで200μLのピペットマンで上下に10回ピペットする。気泡の発生を避けてください。
- チューブリボルバー付きの1.5 mL/2 mLパドルを使用して端から端まで回転させながら、4 °C で 2 時間インキュベートします。
- サンプルを13,500 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
- 上清を200 mLピペットマンで氷上の新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに集めます。
- 実験サンプル用のタンパク質溶解液10 μL+NP-40溶解バッファー10 μL、およびNP-40溶解バッファー(画分V)のウシ血清アルブミン(画分V)(BSA)を3~5希釈液(BSA)をNP-40溶解バッファーでタンパク質標準として0.25~2.0 mg/mLの範囲で使用して、タンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を定量します。
- ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) (ステップ 5) を続行するか、残りの溶解物をドライアイス上で急速凍結し、-80 °C で長期間保存します。
4. 初代および/または不死化マウス胚性口蓋間葉(MEPM)細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離する
注:E13.5マウス胚および不死化MEPM細胞からの初代MEPM細胞の単離および培養は、以前に記載されている32、33、34。成長因子による細胞の刺激(ステップ4.1〜4.7)は、細胞溶解の前に行うことができる。非刺激細胞が必要な場合は、以下のステップ4.8に進みます。
- 真空システムに取り付けられた5.75インチパスツールピペットを使用して、6cm細胞培養皿中の約70%コンフルエントでMEPM細胞から増殖培地[ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、10%FBSで吸引する。
- 1mLの組織培養PBSで細胞を洗浄する。
- 37°Cの水浴中で予備加温した血清飢餓培地3mL[DMEMとペニシリン50U/mL、ストレプトマイシン50μg/mL、2mM L-グルタミン、0.1%FBS]を加える。
- 37°Cおよび5%CO2で23 時間インキュベートする。
- 血清飢餓培地を、3 mL の新鮮な、予め加温した血清飢餓培地と交換する。
- 37°Cおよび5%CO2 で1時間インキュベートする。
- 所望の時間の間、経験的に決定された濃度で選択した成長因子で細胞を刺激する。
- 真空システムに取り付けられた5.75インチパスツールピペットを使用して、MEPM細胞から80%〜100%コンフルエントで培地を吸引する。
- 氷冷組織培養PBS(6cm細胞培養皿の場合は1mL)で細胞を2回洗浄する。最後の洗浄中にプレートを横に傾けて、すべての組織培養PBSが吸引されるようにする。
- 使用直前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した氷冷NP-40溶解バッファー(6cm細胞培養皿の場合は0.1mL)を氷上に加えて細胞を溶解する。
- プレートを氷上で5分間インキュベートし、プレートを完全にカバーできるようにします。
- 予冷されたセルリフターを使用してプレートから細胞をこすり落とし、細胞懸濁液を氷上の予冷された1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。
- 細胞懸濁液を4°Cで30分間インキュベートし、チューブリボルバーを備えた1.5mL/2mLパドルを用いてエンドオーバーエンドを回転させた。
- 上記の手順 3.6 ~ 3.9 に進みます。
5. リンタンパク質に対するマウスフェイシャルプロセスおよび/またはMEPM細胞からの全細胞タンパク質溶解物のウェスタンブロッティング
- SDS-PAGE用の全細胞タンパク質溶解物サンプルを調製する。
- ロードするタンパク質の量を決定します, 組織/細胞内のタンパク質の存在量に応じて;12.5μgは、通常、全細胞タンパク質溶解物中の強固に発現されたタンパク質に十分である。
- 等量の2x Laemmli緩衝液[20%グリセロール、4%SDS、0.004%ブロモフェノールブルー、0.125MトリスHCl pH 6.8]を、使用直前に10%β-メルカプトエタノールを加えて加える。
警告: β-メルカプトエタノールは、皮膚または眼に腐食性があり、有毒で、飲み込むと危険であり、水生毒性があります。手袋、実験用コート、フェイスシールド、安全メガネを着用して、化学ヒュームフードで取り扱います。環境安全衛生ガイドラインに従って廃棄してください。 - ボルテックスでミックスします。
- サンプルをミニドライバス中で100°Cで5分間加熱する。
- ボルテックスで混合し、サンプルを氷の上に置きます。
- 9,400 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
- SDS-PAGEゲルにロードする前にサンプルを氷上に短時間置くか、-20°Cで長期間保存してください。
- 4%〜15%プレキャストタンパク質ゲルおよび電気泳動緩衝液35を有する電気泳動細胞を用いてSDS−PAGEを行う。
- 使用直前に0%〜20%メタノール(100kDaを超えるタンパク質の場合は0%〜10%、100kDa未満のタンパク質の場合は20%)を添加した転写緩衝液を使用して、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に電気転写する35。
- 目的のリンタンパク質の膜およびプローブを遮断する。
- 転写後、膜を1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)[20mM Tris、0.137M NaCl、pH 7.6]でウェスタンブロットボックスで5分間洗浄する。
- 膜を5 mLのブロッキングバッファー[1x TBS、0.1% Tween 20、5% w/v BSA;よく混合し、ルアーチップ付き10 mLシリンジを使用して0.2 μmの孔を有する25 mmシリンジフィルターでろ過]で1時間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで1時間インキュベートする。
注:牛乳にはリンタンパク質カゼインが含まれており、高い非特異的なバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性があるため、リンタンパク質を特徴付ける際にブロッキング剤として使用しないでください。 - TBS-T[1x TBS, 0.1% Tween 20]で膜を3回ずつ5分間洗浄し、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスに入れます。
- ブロッキングバッファーで希釈した5 mLの一次抗体のメンブレンを、チューブリボルバーを備えた50 mLパドルを用いて50 mL円錐形チューブ中で4°Cで一晩インキュベートする。
注: ウェスタンブロッティングの適切な濃度については、抗体データシートを参照してください。 - TBS-TでRTで3回、それぞれ5分間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで膜を洗浄します。
- 膜を、ブロッキングバッファーで希釈した適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体の5mL中で、オービタルシェーカー上で撹拌しながらウェスタンブロットボックス内で1時間インキュベートする。
- オービタルシェーカーで攪拌しながら、ウェスタンブロットボックス内のTBS-Tで膜を5分間3回洗浄する。
- 膜を増強化学発光(ECL)ウェスタンブロッティング基質[ボトル1および2から等容量を混合;大型(8.6cm×6.7cm)膜に対してそれぞれ0.5mL]で1分間インキュベートし、膜全体がECLウェスタンブロッティング基質に継続的に曝露されるようにする。
- 余分なECLウェスタンブロッティング基板の膜をドレインし、化学発光イメージャーを用いて直ちに現像する。
- メンブレンを剥ぎ取り、目的のタンパク質全体を再プローブします。
- PVDF膜を、使用直前に8 μL/mLのβ-メルカプトエタノールを加えた5 mLのストリッピングバッファー[2% SDS、62.5 mM Tris HCl pH 6.8]を含むポリエチレンライニング付きの透明パウチに入れます。
- ハイブリダイゼーションオーブン中で毎分11回転でロッキングしながら、50°Cで30分間インキュベートする。
- TBS-TでRTで3回、それぞれ5分間、オービタルシェーカーで攪拌しながらウェスタンブロットボックスで膜を洗浄します。
- 上記の手順 5.4.2-5.4.9 に進みます。
- ImageJソフトウェアを用いてウェスタンブロットバンド密度を定量し、目的のリン酸化タンパク質のレベルを目的の総タンパク質のレベル36に正規化する。
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Representative Results
マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉系細胞から単離されたタンパク質のリン酸化を特徴付けようとする場合、代表的な結果は、対応する総タンパク質バンドの高さまたはその近くで実行される抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロッティング後の、明確で再現性のあるバンドを理想的に明らかにするであろう(図3).しかしながら、タンパク質の広範なリン酸化が起こる場合、全タンパク質バンドのそれと比較してリンタンパク質バンドのわずかな上方シフトがあり得る。さらに、タンパク質の複数のアイソフォームが組織内に存在し、それぞれがリン酸化されている場合、またはタンパク質が可変的に追加のPTMを受ける場合、抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロットに複数のバンドが現れ得る。目的のリンタンパク質についてシグナルが観察されない場合、目的の全タンパク質が検出されているにもかかわらず、タンパク質が選択されたコンテキストでリン酸化されないか、またはプロトコルに技術的な問題が生じている可能性があります。後者の場合、全細胞溶解物のウェスタンブロッティングを抗ホスホセリン/スレオニンおよび/または抗ホスホチロシン抗体を用いて行い、プロトコールが期待どおりに機能したかどうかを示すことができる。タンパク質のリン酸化は頭蓋顔面組織に豊富に存在する25,37ので、複数のリンタンパク質バンドの存在は、プロトコールの正常な完了および初期スクリーニングからの正確な結果を示すであろう。
野生型および変異型胚組織間で、または培養細胞の処理に応答して、リンタンパク質レベルを比較することはしばしば有用である。前者の場合、遺伝子型間のリンタンパク質レベルの差は、目的の全タンパク質の類似のレベルを有する目的のリンタンパク質についてのバンド強度の差として現れるであろう27。後者の場合、代表的な転帰は、例えば成長因子(図3)による処理時に未処理の細胞と比較してリンタンパク質バンド強度の増加およびキナーゼ阻害剤による処理後のバンド強度の減少を明らかにするであろう27,37。これらの差の定量のために、目的のリンタンパク質のレベルは、目的のタンパク質全体のレベルに正規化されるであろう。目的のタンパク質全体のレベルはサンプル間で比較的等しいと予想され、この知見は、β-チューブリン、β-アクチン、および/またはGAPDHなどのローディングおよび発現制御タンパク質に対する1つ以上の抗体を用いた別個のウェスタンブロッティングによって確認されるべきである(図3)。培養細胞の成長因子処理の場合、肯定的な結果は、刺激後2〜15分の比較的短い時間枠でリンタンパク質レベルの増加を示す可能性が高い(図3)。タンパク質のリン酸化をもたらす他の因子が作用しない限り、成長因子処理の非存在下ではリン酸化がほとんどまたは全くないはずであり、その例には、細胞による成長因子の内因性発現、細胞によって発現される別のシグナル伝達分子によるタンパク質のリン酸化、および/または成長因子処理の非存在下でのタンパク質の構成的リン酸化をもたらす変異が含まれる。これらの要因は、結果の解釈において考慮されるべきである。否定的な結果は、成長因子治療の経時変化に応答したリン酸化の変化を含まず、その場合、プロトコールは、上記で詳述したようにリンタンパク質の維持について評価されるべきである。さらに、膜剥離のプロセスは、総タンパク質レベルに影響を与え、低下させることがある。この場合、目的のリンタンパク質の量と目的のタンパク質の合計とでは反対の傾向が観察されるであろう。総タンパク質レベルは、タンパク質のローディングと発現が等しいと仮定して、サンプル間で比較的等しいと予想され、変化はリンタンパク質レベルでのみ起こるため、これは最適ではありません。
図1:リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離するためのワークフロー。 上顎突起を氷上のE11.5マウス胚から解剖し、および/または培地を培養MEPM細胞から80%〜100%コンフルエントで吸引し、続いて氷冷PBSで2回洗浄する。全細胞タンパク質溶解物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む溶解緩衝液を用いて単離し、続いてSDS−PAGE、PVDF膜への電気転写、BSAによる膜の遮断、リンタンパク質のプロービング、膜の剥離、総タンパク質のリプロービング、およびバンド強度の定量を行う。略語: LNP = 側方鼻プロセス;MxP = 上顎突起;MdP = 下顎突起;PA2 = 第2咽頭弓;PBS = リン酸緩衝生理食塩水;FBS = ウシ胎児血清;PS = 口蓋棚;MEPM = マウス胚性口蓋間葉;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動;PVDF=ポリフッ化ビニリデン;p-P = リン酸化タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:上顎突起の解剖 (A)MxPを顔から分離するために必要な3つの切り込み(1-3とラベル付けされた)を有するE11.5マウス胚の側面図。(b)MxP除去後のE11.5マウス胚の側面図を黒破線で輪郭を描いている。(C) 解剖されたMxP. (D) MxP外胚葉と間葉を任意に分離するために、PBS、2%トリプシン、および10%FBSの小さな液滴を備えた35mmのペトリ皿セットアップ。(E) Mesから部分的に分離された電気ショック療法を有するMxP。(F) MxP Ect と Me を分離した。スケールバー:1ミリメートル(A-C、E、F)、10ミリメートル(D)。略語: LNP = 側方鼻プロセス;MxP = 上顎突起;MdP = 下顎突起;PA2 = 第2咽頭弓;PBS = リン酸緩衝生理食塩水;FBS = ウシ胎児血清;Mes = 間葉;電気ショック療法=外胚葉。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:不死化MEPM細胞のPDGF-BBリガンド処理に応答したPDGFRβおよびMAPKエフェクターErk1/2リン酸化。 抗リン酸化PDGFR、抗PDGFRβ、抗リン酸化Erk1/2、抗Erk1/2、および抗β尿細管(E7)抗体による10ng/mL PDGF-BB リガンド刺激のタイムコースを2分から15分間追跡した後の不死化MEPM細胞からの全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。抗PDGFRβブロット中の複数のバンドは、差次的にグリコシル化されたタンパク質を表す。略語:PDGF = 血小板由来成長因子;WCL = 全細胞溶解物;kD = キロダルトン;WB = ウェスタンブロット;p-PDGFR = リン酸化PDGFR;PDGFR = PDGF受容体;p-Erk = リン酸化エルク;Erk = 細胞外シグナル調節キナーゼ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルにより、研究者は頭蓋顔面発達中の重要なリン酸化依存性シグナル伝達事象を堅牢かつ再現可能な方法でプローブすることができます。このプロトコルには、データの適切な収集と結果の分析を保証するいくつかの重要なステップがあります。マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉細胞からリンタンパク質を単離するかどうかにかかわらず、指示されたときにすべての試薬および材料を氷上に保持しながら、迅速かつ効率的に移動することが不可欠です。氷の低温は細胞内の代謝活性を低下させ、それによってリン酸化タンパク質をホスファターゼ活性38から保護し、高いタンパク質収率を維持する。上顎プロセスの解剖中に3つの別々の10cmペトリ皿を使用することにより、すべての解剖が十分に予冷された組織学PBSで行われることを確実にする。関連して、このタンパク質単離プロトコルの追加的で必須の成分は、すべての溶解緩衝液におけるホスファターゼ阻害剤の使用である。これらの試薬はまた、目的のタンパク質39、40上のリン酸基を保護し、ウェスタンブロッティングによるさらなる分析のためにリン酸化タンパク質の完全性を維持する。
このプロトコルは、組織および培養細胞中のリンタンパク質のより具体的な分析を可能にする改変をさらに導入する。顔面プロセスを解剖する過程において、コンパートメント特異的タンパク質リン酸化の研究を可能にするために、外胚葉および間葉の上顎プロセスの分離のための任意のステップが追加されている27。これらの組織層の効率的な単離を試験するために、ユーザーは、Gabrp、Trim29、Esrp1、およびMpzl2などの外胚葉に富む遺伝子、および/またはAldh1a2およびAW551984 41などの間葉系に富む遺伝子の発現を評価することができる。培養口蓋間葉系細胞からのリンタンパク質の単離のために、成長因子刺激のための任意のステップが追加されている。この場合、細胞は0.0%〜0.1%血清を含む培地中で血清飢餓状態にすべきである。FBSなどの標準的な血清は、外因性成長因子刺激から結果を畳み込むことができる多数の成長因子42を含む。したがって、一時的な血清飢餓は、急性成長因子治療に応答するように細胞をプライミングする。
このプロトコルはまた、タンパク質リン酸化を正確に定量するための最適化された方法も提供する。ウェスタンブロッティングステップでは、多くの標準的なウェスタンブロッティング技術で使用されている牛乳ではなくBSAを使用してPVDF膜をブロックすることが重要です。牛乳にはリンタンパク質カゼイン43 が含まれており、他のリンタンパク質の分析において高いバックグラウンドシグナルをもたらすため、このスイッチは不可欠です。さらに、目的のリン酸化タンパク質のレベルが、標準的なローディング制御タンパク質のレベルではなく、目的のタンパク質全体のレベルに対して定量化されることが重要である。このようにして、目的の全タンパク質の発現における任意の変化は、リンタンパク質レベルの定量において説明され得る。タンパク質収量が一般に低すぎて正確なリンタンパク質検出ができない場合、同じ段階および遺伝子型からの組織サンプルをプールすることができ27、および/または将来の実験のためにここに記載されたものよりも大きな細胞培養容器で細胞を増殖させることができる。あるいは、ストリッピングが一貫して総タンパク質レベルを変化させるように見える場合、再現性のある結果を達成するために記載されたプロトコルを修正するために2つのアプローチをとることができる:1)異なる宿主種で生成された抗リンタンパク質および抗タンパク質抗体を2つの種特異的二次抗体と組み合わせて分離する抗体スキームの使用(HRP結合二次抗体を使用する場合)または同時(フルオロフォア結合二次抗体を使用する場合) ブロットの開発;2)2つの同一の膜の同時処理−第1を抗リンタンパク質抗体と共にインキュベートし、第2を抗タンパク質抗体と共にインキュベートする。両方の代替アプローチにおいて、目的のリン酸化タンパク質のレベルは、依然として、関心のある総タンパク質のレベルに対して定量されるべきである。最後に、リン酸化は動的プロセスであるため、リンタンパク質レベルは、条件ごとに少なくとも3回の生物学的反復で評価されるべきである。マウスの顔面プロセス組織または初代MEPM細胞は、同じ段階および遺伝子型からの個々の胚または個々の胚プールに由来する、単一の生物学的複製を構成するであろう。同様に、異なる継代の不死化MEPM細胞は、生物学的複製を構成するであろう。培養細胞を成長因子で処理する場合、生物学的複製物の処理は、成長因子の別々のアリコートを使用して異なる日に行われるべきである。
ここで示すアプローチには 2 つの制限があり、以下で説明するので、プロトコルを開始する前に考慮する必要があります。1つ目は、ECLのダイナミックレンジです。このプロトコルで推奨されているECLウェスタンブロッティング基板は、広いダイナミックレンジを持ち、ピコグラム感度が低い。しかしながら、経験的には、低存在量または低リン酸化状態のタンパク質は、これらの方法を用いて検出することが困難であり得る。ECL基質インキュベーションの20分後にリン酸化タンパク質が検出できない場合は、記載されているように膜をTBS-Tで洗浄し、代わりにフェムトグラム感度の低い高感度ECLウェスタンブロッティング基板でメンブレンをインキュベートすることをお勧めします。あるいは、ECL44などの酵素ベースのアプローチよりも広いダイナミックレンジを提供するフルオロフォア結合二次抗体を使用することもできます。2 番目の制限は、正規化手順から生じます。広範囲に記載されているように、目的のリンタンパク質からのシグナルは、目的のタンパク質全体からのシグナルに正規化することが推奨される。しかしながら、このプロセスは、目的の総タンパク質のレベルがサンプル間で変化しないという仮定に依存しており、これはしばしば、1つ以上のハウスキーピングタンパク質に対する抗体を用いた別個のウェスタンブロッティングによって確認される。しかし、重要な考慮事項は、不均一な負荷、膜への不完全な転写、および/またはタンパク質発現の違いのために、ハウスキーピングタンパク質のレベルがサンプル間で変化する可能性があることです。したがって、正規化中の精度を高めるために、研究者は、膜の各レーン内のすべてのタンパク質を検出し、これらの技術的限界を説明するPonceau S45などの真の総タンパク質染色を実装するための移動を検討することができます。
全体として、このプロトコルは、タンパク質単離中に一般的に起こるタンパク質脱リン酸化の問題を克服する。タンパク質リン酸化の正確な分析は、研究者が頭蓋顔面発達中のリン酸化タンパク質の役割をより正確に理解するのに役立ちます。さらに、このプロトコルは、生理学的に関連する状況でリン酸化タンパク質レベルを分析するための堅牢で効率的な方法を提供し、それぞれに独自の利点があります。胚組織からのタンパク質溶解物は、 インビボでのタンパク質リン酸化の静的スナップショットを提供するが、培養細胞の実施は、急性治療に対する動的リン酸化応答に関するデータを提供する。このプロトコルは、大規模なデータセット(質量分析37 やRNAシーケンシング27など)から生じる結果や仮説を直接確認および拡張し、シグナル伝達ネットワーク内の新しい相互作用を発見する能力を有する。重要なことに、このプロトコルは、リン酸化における摂動が、頭蓋顔面状況における細胞内シグナル伝達、遺伝子発現、および細胞活動に直接どのように影響するかを調査するために使用することができる。これらの多様な応用は、頭蓋顔面発達におけるタンパク質リン酸化の影響の理解を大幅に強化するであろう。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
129S4マウスは、シナイ山のアイカーン医科大学のフィリップ・ソリアーノ博士からの贈り物でした。この研究は、国立衛生研究所(NIH)/国立歯科頭蓋顔面研究所(NIDCR)R01 DE027689およびK02 DE028572からK.A.F.、F31 DE029976からM.A.R.、F31 DE029364からB.J.C.D.への資金で支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
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