Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering av hele celleprotein lysater fra mus ansiktsprosesser og kultivert palatal mesenchyme celler for fosfoprotein analyse

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63834
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen presenterer en metode for å isolere hele celleprotein lysater fra dissekerte museembryo ansiktsprosesser eller dyrket mus embryonale palatal mesenchyme celler og utføre påfølgende vestlig blotting for å vurdere fosforylatert protein nivåer.

Abstract

Pattedyr kraniofacial utvikling er en kompleks morfologisk prosess der flere cellepopulasjoner koordinerer for å generere frontonasal skjelettet. Disse morfologiske endringene initieres og opprettholdes gjennom ulike signalinteraksjoner, som ofte inkluderer proteinfosforylering av kinaser. Her gis to eksempler på fysiologisk relevante sammenhenger for å studere fosforylering av proteiner under pattedyr kraniofacial utvikling: muse ansiktsbehandlingsprosesser, spesielt E11,5 maksillære prosesser, og kultivert mus embryonale palatalmesenchyme celler avledet fra E13,5 sekundære palatalhyller. For å overvinne den vanlige barrieren for defosforylering under proteinisolasjon, diskuteres tilpasninger og modifikasjoner til standard laboratoriemetoder som muliggjør isolering av fosfoproteiner. I tillegg er beste praksis gitt for riktig analyse og kvantifisering av fosfoproteiner etter vestlig blotting av hele celleproteinlysater. Disse teknikkene, spesielt i kombinasjon med farmakologiske hemmere og/eller muringenetiske modeller, kan brukes til å få større innsikt i dynamikken og rollene til ulike fosfoproteiner som er aktive under kraniofacial utvikling.

Introduction

Pattedyr kraniofacial utvikling er en kompleks morfologisk prosess der flere cellepopulasjoner koordinerer for å generere frontonasal skjelettet. I musen begynner denne prosessen på embryonal dag (E) 9,5 med dannelsen av frontonasal prominens og par av maksillære og mandibulære prosesser, som hver inneholder postmigrerende kraniale nevrale kamceller. De laterale og mediale neseprosessene oppstår fra frontonasal prominens med utseendet på nesegravene og til slutt smelter sammen for å danne neseborene. Videre smelter mediale neseprosesser og maksillære prosesser sammen for å generere overleppen. Samtidig initieres palatogenesis med dannelsen av forskjellige utvekster - de sekundære palatalhyllene - fra den muntlige siden av maksillære prosesser på E11,5. Over tid vokser palasshyllene nedover på hver side av tungen, løfter seg til en motsatt posisjon over tungen, og til slutt smelter de sammen ved midtlinjen for å danne en kontinuerlig gane som skiller nese- og munnhulene med E16,51.

Disse morfologiske endringene gjennom kraniofacial utvikling er initiert og opprettholdt gjennom ulike signalinteraksjoner, som ofte inkluderer proteinfosforylering av kinases. For eksempel er cellemembranreseptorer, som underfamilier av transformerende vekstfaktor (TGF)-β reseptorer, inkludert benmorfogenetiske proteinreseptorer (BMPRs) og ulike reseptor tyrosinkinasefamilier (RTK), autofosforylert ved ligandbinding og aktivering i kranial nevrale kamceller 2,3,4 . I tillegg blir G protein-koblet transmembranreseptor Smoothened fosforylert i kranial nevrale kamceller og kraniofacial ektoderm nedstrøms for Sonic pinnsvin (SHH) ligandbinding til Patched1-reseptoren, noe som resulterer i glattet akkumulering ved ciliary membranen og SHH-baneaktivering5. Slike ligandreseptorinteraksjoner kan forekomme gjennom autokriminelle, parakrine- og/eller jukstakrinsignalering i kraniofaciale sammenhenger. For eksempel er BMP6 kjent for å signalisere på en autocrine måte under kondrocyttdifferensiering6, mens fibroblast vekstfaktor (FGF) 8 uttrykkes i pharyngeal arch ectoderm og binder seg til medlemmer av FGF-familien av RTK uttrykt i pharyngeal arch mesenchyme på en paracrine måte for å initiere mønster og utvekst av pharyngeal buer7, 8,9,10. Videre aktiveres Notch-signalering i både kondrocytter og osteoblaster under kraniofacial skjelettutvikling gjennom jukstakrinsignalering når transmembrane Delta og/eller Taggete ligander binder seg til transmembrane Notch-reseptorer på nærliggende celler, som senere spaltes og fosforyllatert11. Imidlertid er det andre ligand- og reseptorpar som er viktige for kraniofacial utvikling som har fleksibilitet til å fungere i både autocrine og paracrine signalering. Som et eksempel, under murin tannmorfogenese, har blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF)-AA ligand vist seg å signalisere på en autocrine måte å aktivere RTK PDGFRα i emaljeorganet epitel12. I murine ansiktsbehandlingsprosesser under midten av svangerskapet uttrykkes transkripsjoner som koder ligandene PDGF-AA og PDGF-CC i kraniofacial etoderm, mens PDGFRα-reseptoren uttrykkes i den underliggende kranial nevrale kam-avledede mesenchymen, noe som resulterer iparakrinesignalering 13,14,15,16,17 . Uavhengig av signalmekanismen resulterer disse reseptorfosforyleringshendelsene ofte i rekruttering av adapterproteiner og / eller signalmolekyler, som ofte blir fosforylert selv for å initiere intracellulære kinasekaskader som mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) sti18,19.

Terminalens intracellulære effektorer av disse kaskadene kan deretter fosforylere en rekke substrater, for eksempel transkripsjonsfaktorer, RNA-bindende, cytoskeletale og ekstracellulære matriseproteiner. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 og Sox926 er blant transkripsjonsfaktorene fosforylert i sammenheng med kraniofacial utvikling. Denne postoversettelsesendringen (PTM) kan direkte påvirke følsomheten for alternative PTMer, dimerisering, stabilitet, spalting og/eller DNA-bindende affinitet, blant annetaktiviteter på 20,21,25,26. I tillegg er det RNA-bindende proteinet Srsf3 fosforylert i sammenheng med kraniofacial utvikling, noe som fører til kjernefysisk translokasjon27. Generelt har fosforylering av RNA-bindende proteiner vist seg å påvirke deres subcellulære lokalisering, proteinproteininteraksjoner, RNA-binding og / eller sekvensspesifikkitet28. Videre kan fosforylering av actomyosin føre til cytoskeletale omorganiseringer gjennom kraniofacial utvikling29,30, og fosforylering av ekstracellulære matriseproteiner, som små integrinbindende ligand N-koblede glykoproteiner, bidrar til biomineralisering under skjelettutvikling31. Gjennom ovennevnte og mange andre eksempler er det tydelig at det er store implikasjoner for proteinfosforylering under kraniofacial utvikling. Ved å legge til et ekstra reguleringsnivå, moduleres proteinfosforylering ytterligere av fosfater, som motvirker kinaser ved å fjerne fosfatgrupper.

Disse fosforyleringshendelsene på både reseptor- og effektormolekylnivåene er avgjørende for forplantning av signalveier og resulterer til slutt i endringer i genuttrykk i kjernen, som driver spesifikke celleaktiviteter, for eksempel migrasjon, spredning, overlevelse og differensiering, noe som resulterer i riktig dannelse av pattedyrets ansikt. Gitt kontekstspesifisiteten av proteininteraksjoner med kinaser og fosfater, de resulterende endringene i PTMer, og deres effekter på celleaktivitet, er det avgjørende at disse parametrene studeres i en fysiologisk relevant setting for å få full forståelse av bidraget av fosforyleringshendelser til kraniofacial utvikling. Her gis eksempler på to sammenhenger for å studere fosforylering av proteiner og dermed aktivering av signalveier under pattedyr kraniofacial utvikling: muse ansiktsbehandlingsprosesser, spesielt E11.5 maksillære prosesser, og kultivert mus embryonale palatalmesenchymeceller avledet fra E13.5 sekundære palatalhyller - både primær32 og udødeliggjort33. . På E11.5 er de maksillære prosessene i ferd med å fusjonere med laterale og mediale neseprosesser1, og representerer dermed et kritisk tidspunkt under musekraniofacial utvikling. Videre ble maksillære prosesser og celler avledet fra palatalhyllene valgt her fordi de sistnevnte strukturene er derivater av førstnevnte, og dermed gir forskerne muligheten til å forhøre proteinfosforylering in vivo og in vitro i relaterte sammenhenger. Denne protokollen gjelder imidlertid også for alternative ansiktsprosesser og utviklingstidspunkter.

Et kritisk problem med å studere fosforylaterte proteiner er at de lett defosforeres under proteinisolasjon ved rikelig miljøfosfatase. For å overvinne denne barrieren diskuteres tilpasninger og modifikasjoner til standard laboratoriemetoder som muliggjør isolering av fosforylaterte proteiner. I tillegg er beste praksis gitt for riktig analyse og kvantifisering av fosforylaterte proteiner. Disse teknikkene, spesielt i kombinasjon med farmakologiske hemmere og/eller murine genetiske modeller, kan brukes til å få større innsikt i dynamikken og rollene til ulike signalveier som er aktive under kraniofacial utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrene som involverte dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Colorado Anschutz Medical Campus og utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og forskrifter. Kvinnelige 129S4 mus ved 1,5-6 måneders alder og plassert ved en subterminutral temperatur på 21-23 °C ble brukt til embryohøsting. En skjematisk arbeidsflyt for protokollen er representert i figur 1. Se materialtabellen for detaljer om alt materiale, utstyr, programvare, reagenser og dyr som brukes i denne protokollen.

1. Høsting av E11.5 museembryoer

  1. Euthanize gravid kvinnelig mus 11,5 dager etter påvisning av vaginal plugg under tidsinnstilt parring i et CO2-kammer ved hjelp av IACUC-godkjent CO2-strømningshastighet som kreves for omtrent 50% forskyvning (2,95 l / min i et 360 i3 kammer) og varighet av eksponering (se Materialfortegnelse). Utfør cervical dislokasjon som en sekundær metode for eutanasi. Fortsett umiddelbart til disseksjon.
  2. Legg musekroppen på et dissekeringsbrett med ventralsiden vendt opp. Spray musens underliv med 70% etanol.
  3. Åpne bukhulen ved å klemme og løfte huden fremre til vaginalåpningen med rette Semken tang og kutte løftet hud og underliggende lag med rett blad kirurgisk saks i en 45 ° vinkel på hver side for å generere en "V" form som strekker seg til hver lateral overflate omtrent halvveis mellom forbenene og bakbenene.
  4. Bruk Semken tang, grip en av livmor horn og kutt under ovidukten og over livmorhalsen med kirurgisk saks. Klipp bort mesometrium for å tillate fullstendig fjerning av livmorhornet.
  5. Overfør det dissekerte livmorhornet til 10 ml histologifosfatbufret saltvann (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasic, 10,14 mM Na2HPO4 dibasic, pH 7,4] i en 10 cm Petri-tallerken.
  6. Fjern det andre livmorhornet på motsatt side av bukhulen ved hjelp av samme prosedyre som er beskrevet i trinn 1.4-1.5.
  7. Legg 10 cm Petri-retten som inneholder begge livmorhornene på isen hvis du ikke fortsetter umiddelbart til disseksjon av individuelle embryoer (dvs. hvis en annen kvinnelig mus vil bli dissekert).
  8. Under et dissekerende stereomikroskop dissekerer du forsiktig ut hvert embryo fra livmorhornene med Dumont # 5 fine tang. Trekk sakte bort myometrium, decidua og chorion. Riv og fjern den relativt gjennomsiktige amnionen rundt embryoet, og kutt navlestrengen som forbinder embryoet til morkaken.
  9. Overfør hvert dissekerte embryo til 2,5 ml histologi PBS i en individuell brønn av en 12-brønns cellekulturplate på is ved hjelp av en kuttet plastoverføringspipet eller en embryoskje.
    MERK: Hvis du arbeider med et kull som kan inneholde embryoer av mer enn én genotype, må du lagre fosteret rundt hvert embryo for genotyping ved å plassere hvert av dem i sitt eget forhåndsmerkede mikrosenterrør på isen på 0,5 ml.

2. Dissekere maksillære prosesser fra E11.5 museembryoer

  1. Forbered tre 10 cm Petri-retter som inneholder 10 ml histologi PBS og hold dem på is som skal brukes i rotasjon mellom embryoer.
  2. Overfør ett embryo fra en individuell brønn av 12-brønns cellekulturplaten til en av de 10 cm Petri-rettene med histologi PBS på is ved hjelp av en kuttet plastoverføringspipet eller en embryoskje.
  3. Under dissekeringsmikroskopet skiller du hver maksillærprosess fra ansiktet ved hjelp av de fine tangene. Klipp først den fremre siden av en maksillær prosess langs den naturlige innrykket som skiller den laterale neseprosessen og den maksillære prosessen (figur 2A).
  4. Deretter kutter du den bakre siden av maksillærprosessen langs den naturlige innrykket som skiller maksillærprosessen og mandibulærprosessen (figur 2A).
  5. For det tredje, for å skille maksillærprosessen helt, gjør du et vertikalt kutt fra fremre til bakre sider av maksillærprosessen på øyesiden av maksillærprosessen der de naturlige innrykkene nevnt ovenfor enden (figur 2A-C).
  6. Gjenta disse tre kuttene for maksillærprosessen på motsatt side av ansiktet.
  7. Bruk en 9" Pasteur pipet med en 2 ml liten latekspære, overfør det dissekerte paret med maksillære prosesser og en liten dråpe på ca. 30 μL histologi PBS til en merket 35 mm Petri-tallerken på is (figur 2D).
  8. Følg trinn 2.3-2.7 for hvert embryo, rotere de tre 10 cm Petri-rettene som inneholder histologi PBS på is mellom embryoer. Legg individuelle par dissekerte maksillære prosesser i separate 35 mm Petri-retter på is.
    MERK: Separasjon av den maksillære prosessen ectoderm og mesenchyme (trinn 2.9-2.17) kan utføres etter dissekering av de maksillære prosessene til alle embryoer i søppelet. Hvis intakte maksillære prosesser som inneholder både ectoderm og mesenchyme er ønsket, fortsett til trinn 2.18 nedenfor.
  9. Forbered 250 μL fersk 2% trypsin i vevskultur PBS og 250 μL 10% foster bovint serum (FBS) i vevskultur PBS og lagre på is.
  10. Legg en annen, liten dråpe på ca. 30 μL 2% trypsin i 35 mm Petri-parabolen atskilt fra den første, lille dråpen av histologi PBS som inneholder de maksillære prosessene. Overfør paret med maksillære prosesser til den lille dråpen på 2% trypsin ved hjelp av Pasteur-pipeten (figur 2D).
  11. Inkuber retten på is i 15 min.
  12. Fjern petriskålen på 35 mm fra isen og plasser den under dissekeringsmikroskopet.
  13. Bruk de fine tangene, trekk sakte og forsiktig av laget av ektoderm fra hver maksillærprosess (figur 2E).
    MERK: Hvis ektodermet ikke skiller seg fra mesenchymet i et intakt ark, inkuberer du i 2% trypsin ved romtemperatur (RT) i opptil 5 ekstra minutter før du fortsetter med separasjon. Hvis vevet begynner å gå i oppløsning i 2% trypsin, flytt de maksillære prosessene til 10% FBS som beskrevet nedenfor for å nøytralisere trypsin og fullføre separasjonen av ektodermet og mesenchyme.
  14. Når maksillærprosessens ektoderm og mesenchyme er separert (figur 2F), overfør ønsket vev fra paret med maksillære prosesser til en tredje, liten dråpe på ca. 30 μL 10% FBS - separat fra de to tidligere små dråpene - ved hjelp av Pasteur pipet (figur 2D).
  15. Legg 35 mm Petri-retten på isen for å stoppe trypsiniseringen.
  16. Inkuber de maksillære prosessvevene på is i 10% FBS i 1-2 min, og overfør deretter vevet fra begge maksillære prosesser til en fjerde, liten dråpe på ca. 30 μL prechilled histologi PBS på is - skilt fra de tre tidligere små dråpene - ved hjelp av Pasteur-pipetten (figur 2D).
  17. Inkuber det maksillære prosessvevet i histologi PBS i 1 min mens du forsiktig virvler histologien PBS rundt det maksillære prosessvevet med spissen av Pasteur-pipetten for å sikre at alle FBS skylles av vevet.
  18. Overfør paret med maksillære prosessvev til et merket 1,5 ml mikrosenterrør på is ved hjelp av Pasteur-pipetten, og minimer overføringen av histologi PBS. Fjern overflødig histologi PBS i 1,5 ml mikrosenterrør med Pasteur-pipetten.
  19. Følg trinnene ovenfor for å dissekere maksillære prosesser fra hvert embryo i søppelet.
  20. Behandle prøvene umiddelbart for å isolere hele celleproteinlysater (nedenfor) eller lagre ved -80 °C på lang sikt. Før langtidslagring må du fryse det 1,5 ml mikrosenterrøret i et bad på 100 % EtOH på tørris i 5 minutter.

3. Isolerer hele celleprotein lysater fra mus maksillære prosesser

  1. Hvis maksillære prosesser tidligere var frosset ved -80 °C, tiner du dem på is.
  2. Tilsett 0,1 ml iskald NP-40 lysisbuffer (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glyserol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; lagret ved 4 °C) med protease- og fosfatasehemmere (1x komplett mini proteasehemmercocktail [oppløst i vann; lagret ved -20 °C], 1 mM PMSF [oppløst i isopropanol; lagret ved 4 °C], 10 mM NaF [lagret ved -20 °C; unngå frysing/opptining], 1 mM Na3VO4 [lagret ved -20 °C], 25 mM β-glyserofosfat [lagret ved 4 °C]) tilsettes umiddelbart før bruk på is.
    MERK: Cellefraksjonering kan alternativt utføres for å isolere cytoplasmatiske, kjernefysiske, membran- eller mitokondrieproteinfraksjoner.
  3. Pipet opp og ned 10 ganger med en 200 μL pipetman.
  4. Virvel i 10 s, og deretter pipet opp og ned 10 ganger med en 200 μL pipetman. Unngå å generere bobler.
  5. Inkuber ved 4 °C i 2 timer mens du roterer enden over enden ved hjelp av en 1,5 ml/2 ml padle med en rørrevolver.
  6. Sentrifuger prøvene ved 13.500 × g i 20 min ved 4 °C.
  7. Samle supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosenterrør på is med en 200 ml pipetman.
  8. Kvantifisere proteinkonsentrasjonen med proteinanalysesettet, ved hjelp av 10 μL proteinlyse + 10 μL NP-40 lysisbuffer for eksperimentelle prøver og 3-5 fortynninger av bovint serumalbumin (brøkdel V) (BSA) i NP-40 lysisbuffer i et område på 0,25-2,0 mg/ml som proteinstandarder.
  9. Fortsett med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) (trinn 5) eller frys raskt de resterende lysatene på tørris og oppbevar ved -80 °C på lang sikt.

4. Isolere helcelleprotein lyser fra primære og / eller udødelige mus embryonale palatal mesenchyme (MEPM) celler

MERK: Isolasjon og kultur av primære MEPM-celler fra E13.5 museembryoer og udødelige MEPM-celler har tidligere blitt beskrevet 32,33,34. Stimulering av celler med vekstfaktor (trinn 4.1-4.7) kan utføres før cellelys. Hvis ikke-stimulerte celler ønskes, fortsett til trinn 4.8 nedenfor.

  1. Aspirer vekstmediet [Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 10 % FBS] fra MEPM-cellene ved ~70 % samløp i en 6 cm cellekulturfat ved hjelp av en 5,75" Pasteur-pipet festet til et vakuumsystem.
  2. Vask cellene med 1 ml vevskultur PBS.
  3. Tilsett 3 ml serum sultmedium [DMEM med 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 0,1% FBS] forvarsel i et 37 °C vannbad.
  4. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 23 timer.
  5. Bytt ut serum sultmediet med 3 ml friskt, forhåndsvarslet serum sultmedium.
  6. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time.
  7. Stimulere cellene med vekstfaktoren for valg ved en empirisk bestemt konsentrasjon i ønsket tidsperiode.
  8. Aspirer mediet fra MEPM-cellene ved 80%-100% samløp ved hjelp av en 5,75" Pasteur pipet festet til et vakuumsystem.
  9. Vask cellene to ganger med iskald vevskultur PBS (1 ml for en 6 cm cellekulturrett); vippe platen til siden under siste vask for å sikre at all vevskulturen PBS aspireres.
  10. Lyse cellene ved å tilsette iskald NP-40 lysisbuffer med protease- og fosfathemmere tilsatt umiddelbart før bruk (0,1 ml for en 6 cm cellekulturrett) på is.
  11. Inkuber platen på is i 5 minutter med rotasjon omtrent hvert minutt for å sikre fullstendig dekning av platen.
  12. Skrap cellene av platen ved hjelp av en forhåndskjølt celleløfter og overfør celleopphenget til et forhåndskjølt 1,5 ml mikrosenterrør på is.
  13. Inkuber cellefjæringen ved 4 °C i 30 minutter mens du roterer enden over enden ved hjelp av en 1,5 ml/ 2 ml padle med en rørrevolver.
  14. Fortsett med trinn 3.6-3.9 beskrevet ovenfor.

5. Vestlig blotting av hele celleprotein lysater fra musen ansiktsprosesser og / eller MEPM celler for fosfoproteiner

  1. Forbered hele celleprotein lysatprøver for SDS-PAGE.
    1. Bestem mengden protein som skal lastes, avhengig av proteinoverflod i vevet / cellen; 12,5 μg er vanligvis tilstrekkelig for robust uttrykte proteiner i hele celleproteinlysater.
    2. Tilsett et likt volum av 2x Laemmli buffer [20% glyserol, 4% SDS, 0,004% bromophenol blå, 0,125 M Tris HCl pH 6.8] med 10% β-mercaptoethanol lagt til umiddelbart før bruk.
      FORSIKTIG: β-mercaptoetanol er hud- eller øyekorrosiv, giftig, farlig ved svelging og har akvatisk toksisitet. Håndter bruk av hansker, en laboratoriefrakk, ansiktsskjerm og vernebriller i en kjemisk avtrekkshette. Avhendes i henhold til miljøhelse- og sikkerhetsretningslinjer.
    3. Bland ved virveling.
    4. Varm opp prøvene ved 100 °C i 5 minutter i et tørt minibad.
    5. Bland ved virveling og legg prøvene på is.
    6. Sentrifuge ved 9400 × g i 5 min ved 4 °C.
    7. Legg prøvene kort på is før du laster dem inn i SDS-PAGE gel, eller oppbevar dem ved -20 °C på lang sikt.
  2. Utfør SDS-PAGE ved hjelp av en elektroforesecelle med en 4%-15% prefabrikert proteingel og elektroforesebuffer35.
  3. Elektrotransfer proteinene til en polyvinyllidfluoridmembran (PVDF) ved hjelp av overføringsbuffer med 0% -20% metanol (0% -10% for proteiner større enn 100 kDa; 20% for proteiner mindre enn 100 kDa) tilsatt umiddelbart før bruk35.
  4. Blokker membranen og sonden for fosfoprotein av interesse.
    1. Etter overføring, vask membranen i 1x tris-bufret saltvann (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] i 5 min i en vestlig flekkboks.
    2. Inkuber membranen i 5 ml blokkeringsbuffer [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% m/v BSA; blandet godt og filtrert gjennom et 25 mm sprøytefilter med 0,2 μm porer ved hjelp av en 10 ml sprøyte med luerspiss] i 1 time i en vestlig flekkboks med agitasjon på en orbital shaker.
      MERK: Ikke bruk melk som blokkerende middel når du karakteriserer fosfoproteiner, da det inneholder fosfoproteinet kasein, noe som kan forårsake et høyt, ikke-spesifikt bakgrunnssignal.
    3. Vask membranen tre ganger i 5 minutter hver i TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] i en vestlig flekkboks med agitasjon på en orbital shaker.
    4. Inkuber membranen i 5 ml primært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer ved 4 °C over natten i et konisk rør på 50 ml ved hjelp av en 50 ml padle med en rørrevolver.
      MERK: Se antistoffdatabladet for riktig konsentrasjon for vestlig blotting.
    5. Vask membranen tre ganger på RT i 5 minutter hver i TBS-T i en vestlig flekkboks med agitasjon på en orbital shaker.
    6. Inkuber membranen i 5 ml passende pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer i 1 time i en vestlig flekkboks med agitasjon på en orbital shaker.
    7. Vask membranen tre ganger i 5 minutter hver i TBS-T i en vestlig flekkboks med agitasjon på en orbital shaker.
    8. Inkuber membranen i forbedret chemiluminescence (ECL) vestlig blotting substrat [blande like volumer fra flasker 1 og 2; 0,5 ml av hver for store (8,6 cm x 6,7 cm) membraner] i 1 min, og sørg for at hele membranen kontinuerlig blir utsatt for ECL western blotting substrat.
    9. Tøm membranen til overflødig ECL vestlig blotting substrat og utvikle umiddelbart ved hjelp av en chemiluminescence imager.
  5. Strip membranen og bebreid for total protein av interesse.
    1. Plasser PVDF membranen i en gjennomsiktig pose med polyetylenfôr som inneholder 5 ml stripping buffer [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6.8] med 8 μL / ml β-mercaptoethanol tilsatt umiddelbart før bruk.
    2. Inkuber ved 50 °C i 30 minutter med gynging i en hybridiseringsovn ved 11 omdreininger per minutt.
    3. Vask membranen tre ganger på RT i 5 minutter hver i TBS-T i en vestlig flekkboks med agitasjon på en orbital shaker.
    4. Fortsett med trinn 5.4.2-5.4.9 som er beskrevet ovenfor.
  6. Kvantitet vestlige blot band tettheter ved hjelp av ImageJ programvare, normalisere nivåene av fosforrylatert protein av interesse til nivåene av det totale proteinet av interesse36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når du prøver å karakterisere fosforylering av proteiner isolert fra muse ansiktsbehandlingsprosesser og / eller kultivert palatal mesenchyme celler, vil de representative resultatene ideelt sett avsløre et tydelig, reproduserbart bånd etter vestlig blotting med et anti-fosfoprotein antistoff som går på eller nær høyden på det tilsvarende totale proteinbåndet (figur 3 ). Men hvis omfattende fosforylering av proteinet oppstår, kan det være et lite oppadgående skifte av fosfoproteinbåndet sammenlignet med det totale proteinbåndet. Videre, hvis flere isoformer av et protein eksisterer i et vev, som hver er fosforylatert, eller proteinet er variably utsatt for ekstra PTMer, kan flere bånd vises i den vestlige blotteren med et anti-fosfoprotein antistoff. Hvis det ikke observeres noe signal for fosfoproteinet av interesse, til tross for påvisning av det totale proteinet av interesse, kan proteinet ikke fosforiseres i den valgte konteksten, eller et teknisk problem kan ha oppstått med protokollen. I sistnevnte tilfelle kan vestlig blotting av hele cellelysater utføres med antifosfoserin/troonin og/eller antifosfotyrosinantistoffer for å indikere om protokollen fungerte som forventet. Ettersom fosforylering av proteiner er rikelig i kraniofaciale vev25,37, vil tilstedeværelsen av flere fosfoproteinbånd indikere vellykket gjennomføring av protokollen og nøyaktige resultater fra den første screeningen.

Det er ofte nyttig å sammenligne fosfoproteinnivåer mellom villtype og mutant embryovev eller som svar på behandling av dyrkede celler. I det tidligere tilfellet vil en forskjell i fosfoproteinnivåer mellom genotyper fremstå som en forskjell i båndintensiteter for fosfoproteinet av interesse med lignende nivåer av det totale proteinet av interesse27. I sistnevnte tilfelle ville representative resultater avsløre økte fosfoproteinbåndintensiteter sammenlignet med de av ubehandlede celler ved behandling med for eksempel en vekstfaktor (figur 3) og reduserte båndintensiteter etter behandling med en kinasehemmer27,37. For kvantitet av disse forskjellene vil nivåene av fosfoproteinet av interesse normaliseres til nivåer av det totale proteinet av interesse. Nivåene av det totale proteinet av interesse forventes å være relativt like mellom prøver, et funn som bør bekreftes ved separat vestlig blotting ved hjelp av ett eller flere antistoffer mot lasting og uttrykkskontrollproteiner som β-tubulin, β-aktin og / eller GAPDH (figur 3). For vekstfaktorbehandling av dyrkede celler vil positive resultater sannsynligvis vise en økning i fosfoproteinnivåer i en relativt kort tidsramme på 2-15 min etter stimulering (figur 3). Det bør være liten eller ingen fosforylering i fravær av vekstfaktorbehandling, med mindre det er andre faktorer i spill som resulterer i fosforylering av proteinet, eksempler som inkluderer endogene uttrykk for vekstfaktorer av cellene, fosforylering av proteinet ved et annet signalmolekyl uttrykt av cellene, og / eller en mutasjon som fører til konstituerende fosforylering av proteinet i fravær av vekstfaktorbehandling. Disse faktorene bør vurderes i tolkningen av resultatene. Negative resultater inkluderer ingen endring i fosforylering som svar på en tidsforløp for vekstfaktorbehandling, i så fall bør protokollen evalueres for vedlikehold av fosfoproteiner som beskrevet ovenfor. I tillegg kan prosessen med membranstriping av og til påvirke, og redusere, totale proteinnivåer. I dette tilfellet vil motsatte trender for mengden av fosfoproteinet av interesse kontra det totale proteinet av interesse bli observert. Dette er suboptimalt, da totale proteinnivåer forventes å være relativt like på tvers av prøver, forutsatt lik lasting og uttrykk for proteinet, med endringer som bare forekommer i fosfoproteinnivåer.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for isolering av helcelleprotein lyser fra muse ansiktsprosesser og dyrkede palatalmesenchyme celler for fosfoprotein analyse. Maksillære prosesser dissekeres fra E11,5 museembryoer på is, og/eller mediet aspireres fra dyrkede MEPM-celler ved 80%-100% samløp, som deretter vaskes to ganger med iskald PBS. Hele celleproteinlysater isoleres ved hjelp av lysisbuffer med protease- og fosfatasehemmere, etterfulgt av SDS-PAGE, elektrotransfer til en PVDF-membran, blokkering av membranen med BSA, probing for fosfoprotein, stripping av membranen, bebreiding for total protein og kvantitet av båndintensiteter. Forkortelser: LNP = lateral neseprosess; MxP = maksillær prosess; MdP = mandibulær prosess; PA2 = andre faryngelbue; PBS = fosfatbufret saltvann; FBS = foster bovint serum; PS = palatal hylle; MEPM = mus embryonal palatal mesenchyme; SDS-PAGE = natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel elektroforese; PVDF = polyvinyllidfluorid; p-P = fosforylatert protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Disseksjon av maksillære prosesser. (A) Lateral visning av et E11.5 museembryo med de tre kuttene (merket 1-3) som kreves for å skille MxP fra ansiktet indikert av fargede linjer. (B) Sidevisning av et E11.5 museembryo etter fjerning av MxP skissert med en stiplet svart linje. (C) Dissekert MxP. (D) Et 35 mm Petri-paraboloppsett med små dråper PBS, 2% trypsin og 10% FBS for valgfri separasjon av MxP-ektoderm og mesenchyme. (E) MxP med Ect delvis skilt fra Mes. (F) Separert MxP Ect og Mes. Skalastenger: 1 mm (A-C, E, F), 10 mm (D). Forkortelser: LNP = lateral neseprosess; MxP = maksillær prosess; MdP = mandibulær prosess; PA2 = andre faryngelbue; PBS = fosfatbufret saltvann; FBS = foster bovint serum; Mes = mesenchyme; Ect = ectoderm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: PDGFRβ og MAPK-effektor Erk1/2 fosforylering som svar på PDGF-BB-ligandbehandling av udødelige MEPM-celler. Vestlig flekkanalyse av hele cellelys fra udødeliggjorte MEPM-celler etter en tidsforløp på 10 ng/ml PDGF-BB-ligandstimulering fra 2 min til 15 min med anti-fosfo-PDGFR, anti-PDGFRβ, anti-fosfo-Erk1/2, anti-Erk1/2 og anti-β-tubulin (E7) anti-Erk1/2 og anti-β-tubulin (E7) anti-Erk1/2 og anti-β-tubulin (E7) anti-erk1/2. Flere bånd i anti-PDGFRβ blot representerer differensialt glykosylerte proteiner. Forkortelser: PDGF = blodplate-avledet vekstfaktor; WCL = hele celle lysate; kD = kilodalton; WB = vestlig blott; p-PDGFR = fosforylatert PDGFR; PDGFR = PDGF-reseptor; p-Erk = fosforylatert Erk; Erk = ekstracellulær signalregulert kinase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her gjør det mulig for forskere å granske kritiske fosforyleringsavhengige signalhendelser under kraniofacial utvikling på en robust og reproduserbar måte. Det er flere kritiske trinn i denne protokollen som sikrer riktig innsamling av data og analyse av resultater. Enten du isolerer fosfoproteiner fra muse ansiktsprosesser og / eller dyrket palatal mesenchyme celler, er det viktig å bevege seg raskt og effektivt mens du holder alle reagenser og materialer på is når det er angitt. Den lave temperaturen på isen bremser metabolsk aktivitet i cellene, og beskytter dermed fosforilater proteiner fra fosfataseaktivitet38 og opprettholder et høyt proteinutbytte. Bruken av tre separate 10 cm Petri-retter under disseksjonen av maksillære prosesser sikrer at alle disseksjoner foregår i tilstrekkelig prekhilled histologi PBS. Relatert er en ekstra, viktig komponent i denne proteinisolasjonsprotokollen bruk av fosfatasehemmere i alle lysisbuffere. Disse reagensene beskytter også fosfatgrupper på proteinet av interesse 39,40 og opprettholder integriteten til fosforillatert protein for videre analyse av vestlig blotting.

Denne protokollen introduserer i tillegg modifikasjoner som muliggjør mer spesifikke analyser av fosfoproteiner i vev og dyrkede celler. I prosessen med å dissekere ansiktsprosesser er det lagt til valgfrie trinn for separasjon av maksillærprosessen ectoderm og mesenchyme for å tillate studiet av romspesifikk proteinfosforylering27. For å teste for effektiv isolasjon av disse vevslagene, kan brukerne vurdere uttrykket av gener beriket i ektodermet, for eksempel Gabrp, Trim29, Esrp1 og Mpzl2, og / eller gener beriket i mesenchyme, som Aldh1a2 og AW55198441. For isolering av fosfoproteiner fra dyrkede palatalmesenchymeceller er det lagt til valgfrie trinn for vekstfaktorstimulering. I dette tilfellet bør celler sultes i medium som inneholder 0,0% -0,1% serum. Standard serum som FBS inneholder mange vekstfaktorer42 som kan konvolutere resultater fra eksogen vekstfaktorstimulering. Dermed er midlertidig serum sult primer celler for å reagere på akutt vekstfaktorbehandling.

Denne protokollen gir også optimaliserte metoder for å nøyaktig kvantifisere proteinfosforylering. I de vestlige blottingstrinnene er det viktig å blokkere PVDF-membranen ved hjelp av BSA i stedet for melk, som brukes i mange standard vestlige blottingsteknikker. Denne bryteren er viktig, da melk inneholder fosfoproteinet kasein43 og fører til høyt bakgrunnssignal i analysen av andre fosfoproteiner. Videre er det viktig at nivåene av fosforrylatert protein av interesse kvantifiseres mot nivåer av det totale proteinet av interesse i stedet for nivåer av et standard lastekontrollprotein. På denne måten kan eventuelle endringer i uttrykket av det totale proteinet av interesse gjøres rede for i kvantifiseringen av fosfoproteinnivåer. Hvis proteinutbyttet generelt er for lavt for nøyaktig fosfoproteindeteksjon, kan vevsprøver fra samme stadium og genotype samles27, og/eller celler kan dyrkes i større cellekulturbeholdere enn de som er beskrevet her for fremtidige eksperimenter. Alternativt, hvis stripping konsekvent ser ut til å endre de totale proteinnivåene, kan to tilnærminger tas for å endre den beskrevne protokollen for å oppnå reproduserbare resultater: 1) bruk av et antistoffskjema som bruker anti-fosfoprotein og antiproteinantistoffer generert i forskjellige vertsarter kombinert med to artsspesifikke sekundære antistoffer og separate (hvis du bruker HRP-konjugede sekundære antistoffer) eller samtidig (hvis du bruker fluorofor-konjugede sekundære antistoffer) eller samtidig (hvis du bruker fluorofor-konjugiserte sekundære antistoffer) utvikling av blottene; eller 2) samtidig behandling av to identiske membraner - den første inkubert med et anti-fosfoprotein antistoff, det andre med et antiprotein antistoff. I begge alternative tilnærminger bør nivåene av fosforrylatert protein av interesse fortsatt kvantifiseres mot nivåene av det totale proteinet av interesse. Til slutt, da fosforylering er en dynamisk prosess, bør fosfoproteinnivåer vurderes i minst tre biologiske repliker per tilstand. Ansiktsbehandlingsprosessvev for mus eller primære MEPM-celler avledet fra et individuelt embryo eller et individuelt basseng av embryoer fra samme stadium og genotype ville utgjøre en enkelt biologisk replikering. På samme måte vil udødeliggjorte MEPM-celler i forskjellige passasjer utgjøre biologiske replikeringer. Hvis dyrkede celler behandles med vekstfaktor, bør behandling av biologiske replikeringer skje på forskjellige dager ved hjelp av separate aliquots av vekstfaktor.

To begrensninger i tilnærmingen som presenteres her eksisterer, som diskuteres nedenfor og bør vurderes før du starter protokollen. Den første involverer det dynamiske spekteret av ECL. Det vestlige blottingssubstratet ECL som anbefales i denne protokollen, har et bredt dynamisk område, med lav picogramfølsomhet. Men empirisk kan proteiner med lav overflod eller lav fosforyleringsstatus være vanskelig å oppdage ved hjelp av disse metodene. Hvis fosforylaterte proteiner ikke kan oppdages etter 20 min ECL-substratinkubasjon, anbefales det å vaske membranen i TBS-T som beskrevet og i stedet inkubere membranen i et høysensitivt ECL vestlig blottingssubstrat med lav femtogramfølsomhet. Alternativt kan fluoroforkonjugede sekundære antistoffer brukes, som tilbyr et bredere dynamisk område enn enzymbaserte tilnærminger som ECL44. En annen begrensning oppstår fra normaliseringsprosedyren. Som beskrevet i stor grad anbefales det at signal fra fosfoproteinet av interesse normaliseres til signalet fra det totale proteinet av interesse. Denne prosessen er imidlertid avhengig av antagelsen om at nivåene av det totale proteinet av interesse ikke endres mellom prøver, som ofte bekreftes ved separat vestlig blotting ved hjelp av antistoffer mot ett eller flere rengjøringsproteiner. En viktig vurdering er imidlertid at nivåene av rengjøringsproteiner kan endres mellom prøver på grunn av ujevn lasting, ufullstendig overføring til membranen og/ eller forskjeller i proteinuttrykk. For å øke nøyaktigheten under normalisering kan forskerne derfor vurdere å flytte for å implementere en ekte total proteinflekk, for eksempel Ponceau S45, som oppdager alle proteiner i hver kjørefelt i membranen og står for disse tekniske begrensningene.

Totalt sett overvinner denne protokollen problemet med proteindefosforylering som vanligvis oppstår under proteinisolasjon. Nøyaktig analyse av proteinfosforylering vil hjelpe forskere med å få en mer presis forståelse av fosforylerte proteiners rolle under kraniofacial utvikling. Videre tilbyr denne protokollen robuste og effektive metoder for å analysere fosforylaterte proteinnivåer i fysiologisk relevante sammenhenger, hver med sine egne fordeler. Mens protein lysater fra embryovev gir et statisk øyeblikksbilde av protein fosforylering in vivo, leverer implementeringen av dyrkede celler data om dynamisk fosforyleringsrespons på akutte behandlinger. Denne protokollen har kapasitet til å direkte bekrefte og utvide resultater og hypoteser som stammer fra store datasett, for eksempel massespektrometri37 og RNA-sekvensering27, for å oppdage nye interaksjoner innen signalnettverk. Det er viktig at denne protokollen brukes til å undersøke hvordan perturbasjoner i fosforylering direkte påvirker intracellulær signalering, genuttrykk og cellulær aktivitet i kraniofaciale sammenhenger. Disse forskjellige applikasjonene vil i stor grad forbedre forståelsen av effekten av proteinfosforylering i kraniofacial utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

129S4 mus var en gave fra Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine ved Mount Sinai. Dette arbeidet ble støttet med midler fra National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 og K02 DE028572 til K.A.F., F31 DE029976 til M.A.R. og F31 DE029364 til B.J.C.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca - 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 182 Kraniofacial utvikling fosforylering fosfoproteiner mus maksillære prosesser mus embryonale palatalmesenchyme celler
Isolering av hele celleprotein lysater fra mus ansiktsprosesser og kultivert palatal mesenchyme celler for fosfoprotein analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C.,… More

Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter