Summary
Dette arbejde beskriver enkle, tilpasningsdygtige og billige metoder til fremstilling af mikrogeler med ekstruderingsfragmentering, behandle mikrogelerne til injicerbare granulære hydrogeler og anvende de granulære hydrogeler som ekstruderingstrykfarver til biomedicinske applikationer.
Abstract
Granulære hydrogeler er fastklemte samlinger af hydrogelmikropartikler (dvs. "mikrogeler"). Inden for biomaterialer har granulære hydrogeler mange fordelagtige egenskaber, herunder injicerbarhed, mikroskala porøsitet og tunabilitet ved at blande flere mikrogelpopulationer. Metoder til fremstilling af mikrogeler er ofte afhængige af vand-i-olie-emulsioner (f.eks. Mikrofluidik, batchemulsioner, elektrospray) eller fotolitografi, som kan stille høje krav med hensyn til ressourcer og omkostninger og muligvis ikke er kompatible med mange hydrogeler. Dette arbejde beskriver enkle, men yderst effektive metoder til fremstilling af mikrogeler ved hjælp af ekstruderingsfragmentering og til at behandle dem til granulære hydrogeler, der er nyttige til biomedicinske applikationer (f.eks. 3D-printfarver). For det første ekstruderes bulkhydrogeler (ved hjælp af fotocrosslinkbar hyaluronsyre (HA) som et eksempel) gennem en række nåle med sekventielt mindre diametre til dannelse af fragmenterede mikrogeler. Denne mikrogelfremstillingsteknik er hurtig, billig og meget skalerbar. Metoder til at jamme mikrogeler i granulære hydrogeler ved centrifugering og vakuumdrevet filtrering er beskrevet med valgfri post-tværbinding til hydrogelstabilisering. Endelig demonstreres granulære hydrogeler fremstillet af fragmenterede mikrogeler som ekstruderingstrykfarver. Mens eksemplerne beskrevet heri bruger fotocrosslinkbar HA til 3D-udskrivning, kan metoderne let tilpasses til en lang række hydrogeltyper og biomedicinske applikationer.
Introduction
Granulære hydrogeler fremstilles gennem pakning af hydrogelpartikler (dvs. mikrogeler) og er en spændende klasse af biomaterialer med mange fordelagtige egenskaber til biomedicinske anvendelser 1,2,3. På grund af deres partikelstruktur er granulære hydrogeler forskydningsfortyndende og selvhelbredende, hvilket gør det muligt at anvende dem som ekstruderingstryk (bio)blæk, granulære understøtninger til indlejret udskrivning og injicerbare terapier 4,5,6,7,8,9. Derudover giver tomrummet mellem mikrogeler en mikroskala porøsitet til cellebevægelse og molekylær diffusion 8,10,11. Endvidere kan flere mikrogelpopulationer kombineres til en enkelt formulering for at muliggøre forbedret tunabilitet og materialefunktionalitet 8,10,12,13. Disse vigtige egenskaber har motiveret den hurtige udvidelse af granulær hydrogeludvikling i de senere år.
Der er en række metoder til rådighed til at danne mikrogeler mod granulær hydrogelfremstilling, hver med sine egne fordele og ulemper. For eksempel dannes mikrogeler ofte af vand-i-olie-emulsioner ved anvendelse af dråbemikrofluidik 4,11,13,14,15,16,17, batchemulsioner 7,18,19,20,21,22 eller elektrospray 6,23, 24,25. Disse metoder giver sfæriske mikrogeler med enten ensartede (mikrofluidik) eller polydisperse (batchemulsioner, elektrospray) diametre. Der er nogle begrænsninger for disse vand-i-olie emulsion fremstillingsmetoder, herunder potentielt lav-gennemstrømning produktion, behovet for lavviskositet hydrogel forløber løsninger, og de høje omkostninger og ressourcer til opsætning. Derudover kan disse protokoller kræve hårde olier og overfladeaktive stoffer, der skal vaskes fra mikrogelerne ved hjælp af procedurer, der tilføjer behandlingstrin, og kan være vanskelige at oversætte til sterile forhold til biomedicinske applikationer i mange laboratorier. Fjernelse af behovet for vand-i-olie-emulsioner kan (foto) litografi også anvendes, hvor forme eller fotomasker bruges til at kontrollere hærdning af mikrogeler fra hydrogelprecursoropløsninger 1,26,27. Ligesom mikrofluidik kan disse metoder være begrænsede i deres produktionsgennemstrømning, hvilket er en stor udfordring, når der er behov for store mængder.
Som et alternativ til disse metoder er mekanisk fragmentering af bulkhydrogeler blevet brugt til fremstilling af mikrogeler med uregelmæssige størrelser 19,28,29,30,31,32. For eksempel kan bulkhydrogeler forformes og efterfølgende føres gennem masker eller sigter for at danne fragmenterede mikrogeler, en proces, der endda er udført i nærværelse af celler i mikrogelstrenge33,34. Bulkhydrogeler er også blevet forarbejdet til mikrogeler med mekanisk forstyrrelse ved hjælp af teknikker som slibning med mørtel og pistil eller ved brug af kommercielle blendere 35,36,37. Andre har også brugt mekanisk omrøring under hydrogeldannelse til fremstilling af fragmenterede mikrogeler (dvs. væskegeler)31.
Metoderne heri udvider disse mekaniske fragmenteringsteknikker og præsenterer en enkel tilgang til fremstilling af mikrogeler med ekstruderingsfragmentering ved hjælp af fotocrosslinkable hyaluronsyre (HA) hydrogeler som et eksempel. Ekstruderingsfragmentering bruger kun sprøjter og nåle til at fremstille fragmenterede mikrogeler i en billig, høj gennemstrømning og let skalerbar metode, der er passende til en lang række hydrogeler19,32. Endvidere beskrives metoder til at samle disse fragmenterede mikrogeler i granulære hydrogeler ved hjælp af enten centrifugering (lav pakning) eller vakuumdrevet filtrering (høj pakning). Endelig diskuteres anvendelsen af disse fragmenterede granulære hydrogeler til brug som ekstruderingstrykblæk. Målet med denne protokol er at introducere enkle metoder, der kan tilpasses en lang række hydrogeler og kan implementeres i stort set ethvert laboratorium, der er interesseret i granulære hydrogeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af bulkhydrogeler inde i en sprøjte ved hjælp af photocrosslinking
BEMÆRK: En oversigt over bulkhydrogelfremstilling inde i en sprøjte ved hjælp af photocrosslinking er vist i figur 1. Denne protokol bruger norbornen-modificeret hyaluronsyre (NorHA) til fremstilling af bulkhydrogeler ved hjælp af en fotomedieret thiol-ene-reaktion. Detaljerede procedurer for syntesen af NorHA er beskrevet andetsteds38. Denne protokol er dog meget tilpasningsdygtig til enhver fotocrosslinkbar hydrogel. Se Diskussion for at få flere oplysninger.
- Forudbestemme ønskede koncentrationer af polymer, tværbinding og initiatorer til bulkhydrogelformuleringen. I denne protokol består hydrogelprecursoropløsningen af NorHA (2 vægt%, ~ 25% grad af norbornenmodifikation), dithiothreitol (DTT, 6 mM) og Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 vægt%). Det sikres, at komponenterne (1 ml) er helt opløst i fosfatbufferet saltvand (PBS) i et mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Ved fremstilling af hydrogelprecursoropløsningen kan FITC-dextran med høj molekylvægt (2 MDa, 0,1 vægt%) tilsættes til opløsningen for at visualisere mikrogeler fremstillet senere i protokollen ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. - Ilæg en 3 ml sprøjte med hydrogelprecursoropløsningen.
- Fjern stemplet fra bagsiden af en tom 3 ml sprøjte, og tilsæt en tiphætte til toppen af sprøjtetønden.
- Brug en 1.000 μL pipette til at overføre hydrogelprecursoropløsningen til sprøjtetønden med spidshætten.
- Hold sprøjtetønden med hydrogelprecursoropløsning i den ene hånd med spidsen nedad og den åbne ende af tønden opad. Med den anden hånd skal du returnere sprøjtestemplet til åbningen af bagsiden af sprøjtetønden. Skub forsigtigt sprøjtestemplet ind i tønden, lige nok til at forsegle åbningen bag på sprøjtetønden.
- Hold forsigtigt stemplet og sprøjtetønden sammen for at sikre, at bagsiden af sprøjtetønden er forseglet med stemplet, vend sprøjten, så stemplet vender nedad, og hætten nu vender opad. Fjern tiphætten, og skub forsigtigt stemplet ind i sprøjtetønden, indtil al luft er fjernet fra sprøjten (kun hydrogelprecursoropløsning er tilbage).
- Sæt hætten på spidsen på sprøjten igen. Sørg for, at hydrogelprecursoropløsningen er fastgjort i 3 ml sprøjten med en tiphætte.
- Form en bulkhydrogel i 3 ml sprøjten.
- Sørg for, at der tages korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) og sikkerhedsforanstaltninger, inden UV-lampen tændes. Dette inkluderer brug af UV-beskyttende briller og omslutning af lampeområdet for at beskytte andre mod UV-lys.
- UV-spothærdningslampen kalibreres til en lysintensitet på 10 mW/cm2 ved hjælp af et radiometer.
BEMÆRK: Der vil være let dæmpning gennem sprøjtetønden. Før fremstilling bestemmes procentdelen af lysdæmpning, der er til stede ved hjælp af et radiometer. Lysintensitetsudgangen fra spothærdningssystemet bør justeres i overensstemmelse hermed for at tage højde for en sådan dæmpning. - Anbring 3 ml sprøjten fyldt med hydrogelprecursoropløsningen under UV-spothærdningslampen i den ønskede tid for fuldt ud at fotocrosslinke. For det system, der er beskrevet heri, udsættes NorHA hydrogelprecursoropløsning for UV-lys i 5 minutter ved en intensitet på 10 mW/cm2, hvilket baseret på tidligere undersøgelser39 var tilstrækkelig tids- og lysintensitet til at sikre fuldstændig tværbinding som bestemt ved fotocrosslinking oscillerende oscillerende forskydningstidsfejninger.
BEMÆRK: For at sikre fuldstændig fotocrosslinking i sprøjten kan sprøjten vendes halvvejs gennem fotocrosslinkingperioden. - Sluk UV-lampen, og fjern sprøjten. Sørg for, at hydrogelen nu er fotokrydset i sprøjten. Dette kan gøres ved at trække stemplet tilbage og observere hydrogelbevægelsen som en fast blok snarere end en viskøs væske.
Figur 1: Oversigt over fremstilling af bulkhydrogeler inde i en sprøjte ved hjælp af photocrosslinking. Figuren viser (A) fjernelse af stemplet fra sprøjten, (B) fastgørelse af spidshætten til sprøjtetønden, (C) tilsætning af hydrogelprecursor til sprøjtetønden, (D) returnering af stemplet til sprøjten, (E) fjernelse af overskydende luft og fastgørelse af spidshætten og (F) fotocrosslinking af bulkhydrogel inde i sprøjten. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Fremstilling af mikrogeler ved hjælp af ekstruderingsfragmentering
BEMÆRK: En oversigt over mikrogelfremstilling ved hjælp af ekstruderingsfragmentering er vist i figur 2.
- Fjern stemplet fra bagsiden af en tom 3 ml sprøjte. Fastgør en tiphætte til Luer-Lock.
- Fjern tiphætten fra sprøjten, der indeholder den fotokrydslinkede bulkhydrogel. Stil toppen af hydrogelsprøjten op med åbningen af tønden på den tomme sprøjte.
- Ekstruder bulkhydrogelen gennem sprøjteåbningen (ingen kanyle fastgjort) i tønden på den tomme sprøjte. Kassér sprøjten, der nu er tom (tidligere indeholdt hydrogelen), korrekt i den korrekte affaldsstrøm.
- Hold sprøjten, der indeholder den ekstruderede hydrogel, således at hætten vender nedad, og tøndeåbningen vender opad. Ved hjælp af en 1.000 μL pipette tilsættes 1,5 ml PBS til sprøjtetønden.
- Juster sprøjtestemplet med åbningen af tønden, og skub lige knap stemplet nok ind til at skabe en tætning. Vend sprøjten, så stemplet nu vender nedad, og spidshætten vender opad, og sørg for at holde stemplet og sprøjtetønden sammen på plads, så der ikke siver hydrogel eller PBS ud. Inverter flere gange for at blande den fragmenterede hydrogel med pbs tilsat.
- Hold sprøjten, så vippehætten vender opad, og stemplet vender nedad. Fjern spidshætten. Skub stemplet meget forsigtigt opad for at fjerne luft fra sprøjtens inderside.
BEMÆRK: Der vil sandsynligvis være en rille bag på 3 ml sprøjten, der kræver ekstra kraft for at skubbe stemplet ind. Skub stemplet meget forsigtigt over rillen. Enhver pludselig eller hård kraft vil få stemplet til at bevæge sig for hurtigt og muligvis udvise den fragmenterede hydrogelophæng. - Ekstruder den fragmenterede hydrogelsuspension gennem en række nåle for at skabe fragmenterede mikrogeler.
- Der fastgøres en stump spids 18 G nål øverst på sprøjten, der indeholder den fragmenterede hydrogel og PBS. Fjern stemplet fra en frisk 3 ml sprøjte, og fastgør en tiphætte til den tomme sprøjtetønde.
- Ekstruder den fragmenterede hydrogelsuspension gennem 18 G-nålen ind på bagsiden af den tomme sprøjtetønde. Kassér den tomme sprøjte og kanylen i den rigtige affaldsstrøm.
- Hold sprøjten, der indeholder den fragmenterede hydrogelophæng, således at hætten vender nedad, og tøndeåbningen vender opad. Juster sprøjtestemplet med åbningen af tønden, og skub lige knap stemplet nok ind til at skabe en tætning.
- Vend sprøjten, så stemplet nu vender nedad, og spidshætten vender opad, og sørg for at holde stemplet og sprøjtetønden sammen, så der ikke siver hydrogel eller PBS ud.
- Hold sprøjten, så vippehætten vender opad, og stemplet vender nedad. Fjern spidshætten. Skub stemplet meget forsigtigt opad for at fjerne luft fra sprøjtens inderside. Se BEMÆRKNINGen ovenfor vedrørende forsigtigt at skubbe sprøjtestemplet indad for at forhindre uønsket udstødning af hydrogelmateriale.
- Trin 2.7.1-2.7.5 gentages med en nål på 23 G, 27 G og 30 G. Ved det sidste ekstruderingstrin (30 G nål) ekstruderes den fragmenterede hydrogelsuspension til mikrocentrifugerør. For de volumener, der er beskrevet heri, vil det endelige fragmenterede hydrogelophængsvolumen være ~ 2,5 ml, hvilket kræver to 1,5 ml mikrocentrifugerør (volumen delt ligeligt).
BEMÆRK: Der bør ikke kræves overdreven kraft for at ekstrudere fragmenteret hydrogelsuspension gennem nålene. For bedste sikkerhedspraksis anbefales det at udføre alle ekstruderingsfragmenteringstrin inde i en kemisk hætte for at give beskyttelse i tilfælde af sprøjteovertryk under ekstrudering. Derudover kan denne proces let udføres i et biosikkerhedsskab / laminær flowhætte for at opretholde sterilitet under fremstillingen. Se Diskussion for at få yderligere forslag til fejlfinding.
- Den fragmenterede hydrogelsuspension vaskes og isoleres.
BEMÆRK: Vask af fragmenterede mikrogeler hjælper med at fjerne enhver ikke-reageret polymer og tværbinding. Derudover vil centrifugering bidrage til at isolere mikrogelerne fra suspensionen ved at danne en pellet.- Brug en mikrocentrifuge til at dreje den fragmenterede mikrogelsuspension ned ved 5.000 x g i 5 min.
- Brug en pipette til at fjerne supernatanten. Der tilsættes 1 ml PBS til hvert mikrocentrifugerør indeholdende fragmenterede mikrogeler og hvirvel i 5-10 s.
- Centrifugering og vask gentages med PBS 3x.
Figur 2: Oversigt over mikrogelfremstilling ved hjælp af ekstruderingsfragmentering. Figuren viser (A) ekstrudering af bulkhydrogel i en tom sprøjtetønde og tilsætning af PBS, (B) sikring af et stempel i sprøjten med fragmenteret hydrogel, (C) fastgørelse af en 18 G nål og ekstrudering af fragmenteret hydrogelsuspension i en tom sprøjtetønde og (D) gentagne ekstruderingsfragmenteringstrin med 23 G, 27 G og 30 G nåle, opsamling af fragmenteret hydrogelsuspension i mikrocentrifugerør ved endelig ekstrudering. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Karakterisering af fragmenterede mikrogeler ved hjælp af ImageJ
BEMÆRK: En oversigt over karakterisering af de fragmenterede mikrogeler ved hjælp af ImageJ er vist i figur 3 samt repræsentative resultater til beskrivelse af størrelsesfordelinger og former inden for et parti fragmenterede mikrogeler. Microgels skal være fluorescerende mærket før visualisering. For eksempel kan FITC-dextran med høj molekylevægt (2 MDa) indkapsles i bulkhydrogelen inden fragmentering for at skabe fluoresceinmærkede mikrogeler.
- Kombiner 20 μL fragmenteret mikrogelsuspension med 180 μL PBS for at skabe en fortyndet fragmenteret mikrogelsuspension. Vortex at blande grundigt.
- Overfør 50 μL fortyndet fragmenteret mikrogelsuspension til et glasmikroskopglas.
- Brug et epifluorescerende mikroskop til at erhverve billeder af fluorescerende mærkede mikrogeler ved 4x eller 10x zoom.
BEMÆRK: Mikrogelsuspensionen skal være fortyndet nok til, at nabomikrogeler ikke er i kontakt med hinanden, men alligevel koncentreret nok til, at snesevis af mikrogeler er synlige i udsigtsporten. Fortyndingen af mikrogelsuspension kan justeres i overensstemmelse hermed for at opnå dette. - Brug af ImageJ til at analysere fragmenterede mikrogelpartikler. Yderligere oplysninger om brug af funktionen Analysér partikler i ImageJ findes i linket i materialetabellen.
- Åbn billederne af mikrogeler i suspension i ImageJ.
- Vælg Analysér > Indstil mål, Kontrolområde, Figurbeskrivelser og Ferets diameter. Klik på OK.
- Vælg Billede > Type > 8-bit.
- Vælg Billede > Juster > tærskel. Juster tærsklen, så mikrogeler er dækket af en rød maske, og baggrunden forbliver sort. Klik på Anvend.
BEMÆRK: Hvis nogen mikrogeler overlapper lidt, skal du bruge blyantværktøjet til at tegne en tynd (<5 pixels) sort linje mellem mikrogeler for at adskille dem i det sort / hvide billede. - Vælg Analysér > Analysér partikler. Indstil Størrelse (pixel2) fra 50-Infinity for at reducere baggrundsstøj. Indstil cirkularitet til 0,00-1,00. Vælg Vis konturer i rullemenuen. Kontroller Vis resultater, Udelad på kanter og Inkluder huller. Lad de resterende felter være umarkeret. Klik på OK.
- Et resultatdisplay åbnes, herunder området, formbeskrivelserne og Ferets diameteroplysninger for hver identificeret mikrogel. Kopier og indsæt resultaterne i et regneark.
- Bestem den ækvivalente cirkulære diameter for hver partikel.
- Hent billedskalaen i μm/pixel fra skalabjælken eller instrumentoplysningerne. Opret en kolonne i regnearket, der konverterer arealet af hver mikrogel fra pixel2 til μm2.
- Brug arealet i μm2 til at bestemme den ækvivalente cirkulære diameter af mikrogelen i μm (dvs. tag kvadratroden af området divideret med pi, og dobbelt det derefter).
- Brug μm/pixelskalaen til at konvertere Ferets diametre (dvs. den længste afstand mellem to punkter på partikelgrænsen) for hver mikrogel til en enhed på μm.
- Cirkularitet ("Circ."), billedformat ("AR"), rundhed ("Rund") og soliditetsværdier for hver mikrogel kan bruges som direkte fra ImageJ.
- Analyser mikrogelpopulationen som ønsket under hensyntagen til fordelingen af diametre (ækvivalent cirkulær og feret), cirkularitet, billedformat, rundhed og soliditet.
Figur 3: Oversigt over karakterisering af fragmenterede mikrogelpartikler ved hjælp af ImageJ. Figuren viser (A) at skabe en fortyndet suspension af fragmenterede mikrogelpartikler og bruge et epifluorescerende eller konfokalt mikroskop til at afbilde mikrogeler i suspension (skalabjælke = 500 μm), (B) konvertere til et binært billede i ImageJ og analysere partikler (antal, formbeskrivelser osv.) og (C) repræsentative resultater. Fejlbjælker viser min og max med indre kvartilområder afgrænset. En populationsstørrelse på n = 100 mikrogeler vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Samling af fragmenterede mikrogeler i granulære hydrogeler
BEMÆRK: To metoder til formulering af granulære hydrogeler fra fragmenterede mikrogeler præsenteres ved anvendelse af centrifugering og filtrering. Den anvendte metode afhænger af den ønskede mikrogelpakning (dvs. filtreringspakker partikler tættere) og om biologiske komponenter er inkluderet (dvs. centrifugering vil bevare komponenter mellem partikler, mens disse i filtrering kan gå tabt). Forudgående arbejde40 beskriver grundigt komparative resultater (dvs. mekanik, porøsitet) for granulære hydrogeler dannet af enten centrifuge eller vakuumdrevet filtrering.
- Mulighed 1: Jam fragmenterede mikrogeler ved hjælp af centrifugering.
- Når PBS-supernatanten er fjernet fra det sidste vasketrin, tilsættes 1 ml PBS til hvert mikrocentrifugerør, og mikrogelerne sættes igen.
- Centrifuger den fragmenterede hydrogelsuspension ned ved 18.000 x g i 5 min.
BEMÆRK: Langsommere centrifugehastigheder kan bruges til fastklemning af mikrogeler i granulære hydrogeler med mindre tæt pakning, hvis det ønskes. - Fjern PBS-supernatanten.
- Få en frisk 3 ml sprøjte og fjern stemplet. Brug en metalspatula til at øse den fragmenterede granulære hydrogel ud af mikrocentrifugerøret og overfør den til bagsiden af den tomme sprøjtetønde. En pipettespids kan bruges til at hjælpe med at overføre den granulære hydrogel til sprøjten. Sæt stemplet tilbage til sprøjten. Læg nu den fragmenterede granulære hydrogel i sprøjten, og den er klar til brug.
- Mulighed 2: Jam fragmenterede mikrogeler ved hjælp af vakuumdrevet filtrering. En oversigt over fastklemning ved vakuumdrevet filtrering er vist i figur 4.
- Saml og test det vakuumdrevne filtreringsapparat.
- En Buchner-tragt fastgøres inde i en filterkolbe, og filteradapteren anbringes mellem tragten og kolbeåbningen.
- Brug slange til at forbinde filterkolben til en vakuumledning.
- Anbring et membranfilter (0,22 μm) i Buchner-tragtkoppen.
- Tænd vakuumledningen ved at åbne drejeventilen. Forbindelsen testes ved at pipettere ~0,5 ml PBS på membranfilteret, og det skal observeres, at al PBS går gennem filteret og samler sig i bunden af filterkolben.
- Tænd vakuumledningen og sørg for en komplet tætning. Vortex den fragmenterede hydrogel suspension, således at mikrogeler suspenderes i PBS.
- Ved hjælp af en 1.000 μL pipette overføres den fragmenterede hydrogelsuspension til membranfilteret (0,22 μm). Når hele mikrogelophænget er overført, skal du vente i ~30 s på, at vakuumet trækker PBS ud af den fragmenterede hydrogelsuspension. Sluk for vakuumledningen.
BEMÆRK: Den tid, hvor den fragmenterede hydrogelophæng sidder på membranfilteret, mens der trækkes vakuum, kan varieres. Se Diskussion for at få flere oplysninger og forslag til fejlfinding. - Få en frisk 3 ml sprøjte og fjern stemplet. Brug en metalspatula til at øse den fragmenterede granulære hydrogel fra filteret og overfør den til bagsiden af den tomme sprøjtetønde. En pipettespids kan bruges til at hjælpe med at overføre den granulære hydrogel til sprøjten. Sæt stemplet tilbage til sprøjten. Læg den fragmenterede granulære hydrogel i sprøjten, og den er nu klar til brug.
- Saml og test det vakuumdrevne filtreringsapparat.
Figur 4: Oversigt over fastklemning af mikrogeler ved vakuumdrevet filtrering til fremstilling af tætpakkede fragmenterede granulære hydrogeler. Figuren viser (A) placering af et membranfilter på vakuumfiltreringsapparatet, (B) ved hjælp af en pipette til at overføre fragmenteret mikrogelophæng på filteret, (C) trække vakuumet og vente på, at mikrogeler sidder fast og danner en granulær hydrogel, (D) slukker for vakuumet og fjerner fragmenteret granulær hydrogel ved hjælp af en metalspatula og (E) ved hjælp af en metalspatel til at overføre granulær hydrogel til sprøjten. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Ekstruderingstryk med granulær hydrogelblæk
BEMÆRK: En oversigt over ekstruderingsprocessen er vist i figur 5, herunder et repræsentativt tryk af en stjerneformet konstruktion ved hjælp af fragmenterede granulære hydrogeler fastklemt med vakuumdrevet filtrering. Udskrivningsarbejdsgangen består i at formulere en trykfarve, planlægge udskriftsdesignet og derefter udskrive blækket baseret på det ønskede design41. Hvis det ønskes, kan trykte granulære hydrogelkonstruktioner stabiliseres ved hjælp af fotocrosslinking efter ekstrudering ved at tilføje overskydende DTT (5 mM) og I2959 (0,05 vægt%) til den fragmenterede mikrogelophæng inden fastklemning. Dette vil resultere i fotocrosslinkede kovalente bindinger dannet mellem mikrogelerne, hvilket fører til permanent stabilisering af den granulære hydrogelkonstruktion.
- Formulering af blæk
- Under planlægningsprocessen skal du huske egenskaberne for det blæk, der skal bruges. For at karakterisere blækket skal du gennemføre den reologiske analyse af de fragmenterede hydrogeler for at hjælpe med at informere printdesignprocessen. Metoder, der beskriver den reologiske karakterisering af granulære hydrogeler, er beskrevet andetsteds og kan tilpasses til denne undersøgelse40.
- Fra den reologiske analyse skal du vælge en udskrivningsplatform og en række indledende udskrivningsparametre.
BEMÆRK: På grund af de overordnede høje viskositets- og forskydningsfortyndingsegenskaber af granulært hydrogelblæk anvendes typisk skruebaserede ekstruderingsprintere.
- Trykt design
BEMÆRK: Repetier Host-software (fremover benævnt 3D-printsoftware) bruges til 3D-printapplikationer (trin 5.2-5.3).- Opret udskriftsdesignene via CAD-software (Computer Aided Design). Brugere kan oprette nye designs fra bunden eller ændre allerede eksisterende designs, såsom fra patientvævsscanninger eller fra andre brugere. For mere information om oprettelse af CAD-design henvises til følgende referencer 41,42,43.
- For at behandle CAD-modeller til G-kode skal du sikre dig, at CAD-filen gemmes i ".stl"-format (supplerende fil 1) og uploades til 3D-udskrivningssoftwaren ved at vælge indlæsningsknappen i toppanelet eller vælge Filer > Indlæse i menulinjen. Denne G-kode definerer udskrivningsstien til aflejring af blækket. Et eksempel på .stl-fil af en hul cylinder er inkluderet i de supplerende filer.
- Når en STL-fil er blevet uploadet til 3D-udskrivningssoftwaren, skal du navigere til Slicer-panelet og vælge Slic3r som udsnitsindstilling. Her kan indstillinger som dysediameter, laghøjde, udskrivningshastighed og ekstruderingshastighed justeres baseret på blækkarakterisering og ønskede udskrivningsresultater. I denne protokol anvendes en 18 G nål (indvendig diameter på 838 μm). Laghøjden er indstillet til 1 mm, udskrivningshastigheden er indstillet til 8 mm/s, og strømningshastigheden er indstillet til 9 μL/s, baseret på tidligere optimering39. Numeriske værdier af parametre kan justeres med ± 20% for at tage højde for variationer i egenskaberne af granulært hydrogelblæk.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke, at disse indstillinger og udskriftsdesignet muligvis skal justeres gennem iterative eksperimentelle tests afhængigt af justeringer af blækformuleringen, den ønskede udskriftsopløsning eller den anvendte udskrivningsplatform. For mere information om disse parametre samt om karakterisering af udskriftsindstillinger med en ny blækformulering henvises til andre referencer 40,44,45,46.
- Ekstruderingsudskrivning med fragmenterede granulære hydrogeler
- For påfyldning af sprøjter med fragmenterede granulære hydrogeler, se 4.2.4 samt figur 4 og figur 5.
- Fjern tiphætten, og udskift den med en valgfri nål.
- Læg sprøjten i den valgte udskrivningsplatform. Her bruges en specialbygget skruebaseret ekstruderingsprinter.
BEMÆRK: For information om bygning af brugerdefinerede bioprintere, se venligst andre referencer44,47. - Indlæs den forberedte G-Kode-fil fra planlægningsfasen i 3D-printsoftwaren. Naviger til panelet Vis udskrift, og tryk på Udskriv.
- Så snart udskrivningsaflejringen er afsluttet, skal du udsætte de fragmenterede granulære hydrogelkonstruktioner for UV-lys til fotocrosslinking og stabilisering.
- Når krydsbindingen er afsluttet, behandles prøven ved at vaske den i PBS tre gange.
Figur 5: Oversigt over ekstruderingstryk med fragmenterede granulære hydrogeler. Figuren viser (A) ved hjælp af en spatel til at overføre fragmenteret granulær hydrogel til en sprøjtetønde, (B) fastgørelse af en stump spidsnål (18 G vist) og skubbe prøven til toppen, (C) en grafik, der repræsenterer forbindelsen til computersoftware til udskrivning, og (D) færdiggørelse af udskrivningen af en stjerneformet konstruktion med fragmenteret granulær hydrogel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater fra disse protokoller er vist i figur 3 og figur 6. Ekstruderingsfragmentering giver mikrogeler med takkede polygonformer med diametre fra 10-300 μm (figur 3). Endvidere varierer cirkulariteten fra 0,2 (ikke cirkulær) til næsten 1 (perfekt cirkel), og billedformatet varierer fra 1-3 (figur 3). Disse parametre beskriver de uregelmæssige og takkede mikrogelformer dannet af fragmenteringsprocessen.
Når den pakkes sammen ved hjælp af enten centrifugering eller vakuumdrevet filtrering, er den samlede granulære hydrogel forskydningsfortynding og selvhelbredende, som beskrevet i det foregående arbejde39. Derudover har den fragmenterede granulære hydrogel høj formfidelitet og mekanisk integritet for en injicerbar hydrogel, som det fremgår af aflejringen af en hul cylinder med en højde på 2 cm ekstrudering trykt i figur 6. Fragmenterede granulære hydrogeler fremstillet med disse enkle og omkostningseffektive metoder er nyttige til mange biomedicinske applikationer, herunder injicerbare terapier og 3D-printfarver.
Figur 6: Protokoloversigt og repræsentative resultater. Figuren viser (A) fragmentering, (B) mikrogeler i suspension, (C) fastklemning ved vakuumdrevet filtrering og (D) fastklemt granulær hydrogel, der ekstruderes gennem en nål og udskrives i en hul cylinder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Eksempel på .stl-fil Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri beskrives metoder til fremstilling af granulære hydrogeler ved hjælp af ekstruderingsfragmenterede mikrogeler og pakning ved enten centrifugering eller vakuumdrevet filtrering. Sammenlignet med andre mikrogelfremstillingsmetoder (dvs. mikrofluidik, batchemulsioner, elektrospray, fotolitografi) er ekstruderingsfragmenteringsmikrogelfremstilling meget hurtig, billig, let skalerbar og modtagelig for en lang række hydrogelsystemer. Endvidere er denne protokol meget repeterbar med minimal batch-til-batch-variabilitet, som blev karakteriseret i det foregående arbejde39.
Denne protokol bruger norbornen-modificeret hyaluronsyre (NorHA) til fremstilling af bulkhydrogeler ved hjælp af en fotomedieret thiol-ene-reaktion. Detaljerede procedurer for syntesen af NorHA er beskrevet andetsteds38. Imidlertid kan mange hydrogelkemikalier bruges til at fremstille fragmenterede mikrogeler ved hjælp af de metoder, der er beskrevet heri, hvis der kan dannes en bulkhydrogel i en sprøjtes tønde. Det er også nyttigt at forstå bulkhydrogel mekaniske egenskaber (fx kompressionsmodul). Bulkhydrogelerne, der anvendes i denne protokol, har et bulkkompressivmodul på ca. 30 kPa39. En bulkhydrogel med et højere trykmodul vil kræve mere kraft til at ekstrudere under fragmenteringstrinnene, hvilket kan føre til øget tilstopning eller overtryk af sprøjterne; Det anbefales således at anvende hydrogeler med trykmoduli mindre end 80 kPa. Endvidere kan en bulkhydrogel med trykmoduli lavere end 10 kPa deformeres under fragmenteringstrinnene, hvilket gør det udfordrende at fragmentere.
Denne protokol er optimeret til en UV-spothærdningslampe. Som et alternativ til UV-lyskilden og UV-responsive fotoinitiatorer kan synlige lyskilder også bruges sammen med synlige lysresponsive fotoinitiatorer, såsom vandopløselig lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoyl-phosphinat (LAP). Initiatorkoncentration, lysintensitet og prøvevolumen vil påvirke tværbindingstider afhængigt af det anvendte polymer- og tværbindingssystem. Desuden kan mange lampekilder bruges som et alternativ til spothærdningssystemer.
Det mest kritiske trin i protokollen er den serielle ekstrudering gennem mindre og mindre nålemålere. I denne procedure foreslås det at anvende nålemålere fra 18 G (838 μm indvendig diameter) ned til 30 G (159 μm indvendig diameter). Tilsætning af PBS til den fragmenterede bulkhydrogel inden ekstrudering gennem nåle er afgørende for signifikant at reducere den kraft, der er nødvendig for at ekstrudere og fragmentere. Der bør ikke anvendes overdreven kraft til at ekstrudere hydrogelen, da overdreven kraft kan føre til tilbagetryk i sprøjten og risikere at sprænge hydrogelen ud af sprøjten tilbage. Yderligere strategier til at reducere den kraft, der kræves for at ekstrudere, inkluderer brug af flere nåle i serien for at reducere fragmentstørrelsen mere gradvist samt tilføjelse af yderligere PBS mellem fragmenteringstrin.
Ved fastklemning af de fragmenterede mikrogeler ved hjælp af vakuumdrevet filtrering kan der være variation i processen. Nogle materialesystemer kan kræve mere (eller mindre) tid at fjerne PBS og sætte mikrogelerne helt fast. Det foreslås at registrere den tid, der er nødvendig for individuelle materialesystemer for at sikre repeterbarhed på tværs af eksperimenter. Tiden til jam vil også afhænge af tykkelsen og størrelsen af prøven, der tilsættes filteret. At sprede prøven jævnt ud over filteret kan hjælpe med ensartet fastklemning.
Ekstruderingsfragmenteringsmikrogelfremstillingsmetoden kan tilpasses til mange biomedicinske applikationer. For eksempel kan terapi inkluderes i hydrogelprecursoropløsningen og efterfølgende indkapsles i fragmenterede mikrogeler for at fremstille en forskydningsfortynding, selvhelbredende granulær hydrogel til lokaliseret terapeutisk levering. Derudover kan fragmenterede mikrogeler tørres for at muliggøre langtidsopbevaring og ligetil steriliseringspraksis. En begrænsning for ekstruderingsfragmenteringen er imidlertid inkorporeringen af celler i mikrogeler. På grund af de høje forskydningshastigheder under ekstruderingsfragmentering er metoden sandsynligvis ikke egnet til celleindkapsling i mikrogeler, da den høje forskydning kan føre til signifikant nedsat cellelevedygtighed. Alligevel kan celler og sfæroider let inkorporeres mellem mikrogeler til in vitro-kultur og in vivo-cellelevering .
Fragmenterede granulære hydrogeler er et lovende biomateriale til biomedicinske anvendelser. I de senere år er granulære hydrogeler fremstillet af forskellige fragmenteringsmetoder (dvs. mørtel og pistil, blendere og netriste) blevet brugt som cellebelastede 3D-printfarver48, terapeutiske leveringskøretøjer29, injicerbare vævsreparationsstilladser30 og sfæroidkulturplatforme39. Af de tidligere rapporterede fragmenteringsmetoder er den heri beskrevne ekstruderingsfragmenteringsmetode en af de mest enkle og omkostningseffektive metoder med mange fordele. Deling af metoderne heri vil øge tilgængeligheden til granulær hydrogelfremstilling og føre til betydelige fremskridt inden for det voksende felt af granulære hydrogelbiomaterialer, hvilket giver flere forskere mulighed for at konstruere innovative biomedicinske løsninger med fragmenterede granulære hydrogeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation gennem UPenn MRSEC-programmet (DMR-1720530) og kandidatforskningsstipendier (til V.G.M og M.E.P.) og National Institutes of Health (R01AR077362 til J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
