Summary
Detta arbete beskriver enkla, anpassningsbara och billiga metoder för att tillverka mikrogeler med extruderingsfragmentering, bearbeta mikrogelerna till injicerbara granulära hydrogeler och applicera de granulära hydrogelerna som extruderingstryckfärger för biomedicinska applikationer.
Abstract
Granulära hydrogeler är fastnat sammansättningar av hydrogelmikropartiklar (dvs "mikrogeler"). Inom biomaterialområdet har granulära hydrogeler många fördelaktiga egenskaper, inklusive injicerbarhet, mikroskala porositet och tunabilitet genom att blanda flera mikrogelpopulationer. Metoder för att tillverka mikrogeler förlitar sig ofta på vatten-i-olja-emulsioner (t.ex. mikrofluidik, batchemulsioner, elektrosprutning) eller fotolitografi, vilket kan ställa höga krav när det gäller resurser och kostnader och kanske inte är kompatibelt med många hydrogeler. Detta arbete beskriver enkla men ändå mycket effektiva metoder för att tillverka mikrogeler med hjälp av extruderingsfragmentering och för att bearbeta dem till granulära hydrogeler som är användbara för biomedicinska applikationer (t.ex. 3D-utskriftsfärger). Först extruderas bulkhydrogeler (med fotocrosslinkbar hyaluronsyra (HA) som exempel) genom en serie nålar med sekventiellt mindre diametrar för att bilda fragmenterade mikrogeler. Denna mikrogeltillverkningsteknik är snabb, billig och mycket skalbar. Metoder för att fastna mikrogeler i granulära hydrogeler genom centrifugering och vakuumdriven filtrering beskrivs, med valfri efterkoppling för hydrogelstabilisering. Slutligen demonstreras granulära hydrogeler tillverkade av fragmenterade mikrogeler som extruderingstryckfärger. Medan exemplen som beskrivs här använder fotokrysslänkbar HA för 3D-utskrift, är metoderna lätt anpassningsbara för en mängd olika hydrogeltyper och biomedicinska applikationer.
Introduction
Granulära hydrogeler tillverkas genom packning av hydrogelpartiklar (dvs mikrogeler) och är en spännande klass av biomaterial med många fördelaktiga egenskaper för biomedicinska applikationer 1,2,3. På grund av sin partikelstruktur är granulära hydrogeler skjuvförtunnande och självläkande, vilket möjliggör användning som extruderingstryck (bio) bläck, granulära stöd för inbäddad utskrift och injicerbara terapier 4,5,6,7,8,9. Dessutom ger tomrummet mellan mikrogeler en porositet i mikroskala för cellrörelse och molekylär diffusion 8,10,11. Vidare kan flera mikrogelpopulationer kombineras till en enda formulering för att möjliggöra förbättrad tunbarhet och materialfunktionalitet 8,10,12,13. Dessa viktiga egenskaper har motiverat den snabba expansionen av granulär hydrogelutveckling de senaste åren.
Det finns en rad metoder tillgängliga för att bilda mikrogeler mot granulär hydrogeltillverkning, var och en med sina egna fördelar och nackdelar. Exempelvis bildas mikrogeler ofta från vatten-i-olja-emulsioner med användning av droppmikrofluidik 4,11,13,14,15,16,17, batchemulsioner 7,18,19,20,21,22 eller elektrosprutning 6,23, 24,25. Dessa metoder ger sfäriska mikrogeler med antingen likformiga (mikrofluidik) eller polydispers (batchemulsioner, elektrosprutning) diametrar. Det finns vissa begränsningar för dessa vatten-i-olja-emulsionstillverkningsmetoder, inklusive potentiellt lågkapacitetsproduktion, behovet av hydrogelprekursorlösningar med låg viskositet och de höga kostnaderna och resurserna för installation. Dessutom kan dessa protokoll kräva hårda oljor och ytaktiva ämnen som måste tvättas från mikrogelerna med hjälp av procedurer som lägger till bearbetningssteg och kan vara svåra att översätta till sterila förhållanden för biomedicinska applikationer i många laboratorier. Att ta bort behovet av vatten-i-olja-emulsioner, (foto)litografi kan också användas, där formar eller fotomasker används för att styra härdningen av mikrogeler från hydrogelprekursorlösningar 1,26,27. Liksom mikrofluidik kan dessa metoder vara begränsade i sin produktionsgenomströmning, vilket är en stor utmaning när stora volymer behövs.
Som ett alternativ till dessa metoder har mekanisk fragmentering av bulkhydrogeler använts för att tillverka mikrogeler med oregelbundna storlekar 19,28,29,30,31,32. Till exempel kan bulkhydrogeler förformas och därefter passera genom maskor eller siktar för att bilda fragmenterade mikrogeler, en process som till och med har gjorts i närvaro av celler i mikrogelsträngarna33,34. Bulkhydrogeler har också bearbetats till mikrogeler med mekanisk störning med hjälp av tekniker som slipning med murbruk och stöt eller genom användning av kommersiella blandare 35,36,37. Andra har också använt mekanisk omrörning under hydrogelbildning för att tillverka fragmenterade mikrogeler (dvs. vätskegeler)31.
Metoderna häri utökar dessa mekaniska fragmenteringstekniker och presenterar ett enkelt tillvägagångssätt för att tillverka mikrogeler med extruderingsfragmentering, med hjälp av fotocrosslinkbara hyaluronsyrahydrogeler (HA) som ett exempel. Extruderingsfragmentering använder endast sprutor och nålar för att tillverka fragmenterade mikrogeler i en billig, hög genomströmning och lätt skalbar metod som är lämplig för ett brett spektrum av hydrogeler19,32. Vidare beskrivs metoder för att montera dessa fragmenterade mikrogeler i granulära hydrogeler med användning av antingen centrifugering (låg packning) eller vakuumdriven filtrering (hög packning). Slutligen diskuteras tillämpningen av dessa fragmenterade granulära hydrogeler för användning som extruderingstryckfärg. Målet med detta protokoll är att introducera enkla metoder som är anpassningsbara till en mängd olika hydrogeler och kan implementeras i praktiskt taget alla laboratorier som är intresserade av granulära hydrogeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av bulkhydrogeler inuti en spruta med fotocrosslinking
OBS: En översikt över bulkhydrogeltillverkning inuti en spruta med fotokorslänkning visas i figur 1. Detta protokoll använder norbornenmodifierad hyaluronsyra (NorHA) för att tillverka bulkhydrogeler med hjälp av en fotomedierad tiol-enreaktion. Detaljerade förfaranden för syntes av NorHA beskrivs på annan plats38. Detta protokoll är dock mycket anpassningsbart till alla fotocrosslinkbara hydrogeler. Se Diskussion för mer information.
- Förutbestäm önskade koncentrationer av polymer, tvärbindare och initiatorer för bulkhydrogelformuleringen. I detta protokoll består hydrogelprekursorlösningen av NorHA (2 wt.%, ~ 25% grad av norbornenmodifiering), ditiotreitol (DTT, 6 mM) och Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 wt.%). Se till att komponenterna (1 ml) är helt upplösta i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett mikrocentrifugrör.
OBS: Vid beredning av hydrogelprekursorlösningen kan FITC-dextran med hög molekylvikt (2 MDa, 0,1 vikt%) tillsättas till lösningen för att visualisera mikrogeler tillverkade senare i protokollet med hjälp av fluorescerande mikroskopi. - Ladda en 3 ml spruta med hydrogelprekursorlösningen.
- Ta bort kolven från baksidan av en tom 3 ml spruta och tillsätt ett spetslock på toppen av sprutpipan.
- Använd en 1 000 μL pipett för att överföra hydrogelprekursorlösningen till sprutpipan med spetslocket.
- Håll sprutpipan med hydrogelprekursorlösning i ena handen, med spetslocket nedåt och pipans öppna ände uppåt. Med den andra handen, sätt tillbaka sprutkolven till öppningen på baksidan av sprutröret. Tryck försiktigt in sprutkolven i pipan, precis tillräckligt för att täta öppningen på baksidan av sprutpipan.
- Håll försiktigt ihop kolven och sprutpipan för att säkerställa att sprutrörets baksida är förseglad med kolven, vänd upp sprutan så att kolven är vänd nedåt och spetslocket nu är vänt uppåt. Ta bort spetslocket och tryck försiktigt in kolven i sprutröret tills all luft har tagits bort från sprutan (bara hydrogelprekursorlösning kvarstår).
- Sätt tillbaka spetslocket på sprutan. Se till att hydrogelprekursorlösningen är säkrad i 3 ml sprutan med ett spetslock.
- Forma en bulkhydrogel i 3 ml sprutan.
- Se till att korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) och skyddsåtgärder vidtas innan du slår på UV-lampan. Detta inkluderar att bära UV-skyddande glasögon och omsluta lampområdet för att skydda andra från UV-ljus.
- Kalibrera UV-punkthärdningslampan till en ljusintensitet på 10 mW/cm2 med hjälp av en radiometer.
OBS: Det kommer att finnas lätt dämpning genom sprutröret. Före tillverkning, bestäm procentandelen ljusdämpning närvarande med hjälp av en radiometer. Ljusintensitetsutgången från punkthärdningssystemet bör justeras i enlighet med detta för att ta hänsyn till sådan dämpning. - Placera 3 ml sprutan laddad med hydrogelprekursorlösningen under UV-punkthärdningslampan under önskad tid för att helt fotokorslänka. För det system som beskrivs häri utsätts NorHA hydrogelprekursorlösning för UV-ljus i 5 minuter med en intensitet av 10 mW / cm2, vilket, baserat på tidigare studier39, var tillräckligt med tid och ljusintensitet för att säkerställa fullständig tvärbindning som bestäms av fotocrosslänkande oscillerande skjuvreologi tidssvep.
OBS: För att säkerställa fullständig fotokrysslänkning i sprutan kan sprutan vändas halvvägs genom fotokryssningsperioden. - Stäng av UV-lampan och ta bort sprutan. Se till att hydrogelen nu är fotokorslänkad i sprutan. Detta kan göras genom att dra tillbaka kolven och observera hydrogelrörelsen som ett fast block snarare än en viskös vätska.
Figur 1: Översikt över tillverkning av bulkhydrogeler inuti en spruta med hjälp av fotokorslänkning. Figuren visar (A) avlägsnande av kolven från sprutan, (B) säkring av spetslocket till sprutröret, (C) tillsats av hydrogelprekursor till sprutpipan, (D) återföring av kolven till sprutan, (E) avlägsnande av överflödig luft och säkring av spetslocket och (F) foto tvärlänkande bulkhydrogel inuti sprutan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Tillverkning av mikrogeler med extruderingsfragmentering
OBS: En översikt över mikrogeltillverkning med extruderingsfragmentering visas i figur 2.
- Ta bort kolven från baksidan av en tom 3 ml spruta. Fäst ett spetslock på Luer-Lock.
- Ta bort spetslocket från sprutan som innehåller den fotokorslänkade bulkhydrogelen. Rikta upp toppen av hydrogelsprutan med pipans öppning på den tomma sprutan.
- Extrudera bulkhydrogelen genom sprutöppningen (ingen nål fäst) i den tomma sprutans pipa. Kassera sprutan som nu är tom (tidigare innehöll hydrogelen) ordentligt i rätt avfallsström.
- Håll sprutan som innehåller den extruderade hydrogelen så att spetslocket är vänd nedåt och pipöppningen är vänd uppåt. Använd en pipett på 1 000 μL och tillsätt 1,5 ml PBS till sprutpipan.
- Rikta in sprutkolven mot pipans öppning, tryck knappt in kolven tillräckligt för att skapa en tätning. Vänd upp sprutan så att kolven nu är vänd nedåt och spetslocket är vänt uppåt, se till att hålla ihop kolven och sprutpipan på plats så att ingen hydrogel eller PBS läcker ut. Invertera flera gånger för att blanda den fragmenterade hydrogelen med PBS tillsatt.
- Håll sprutan så att spetslocket är vänt uppåt och kolven är vänd nedåt. Ta bort spetslocket. Tryck försiktigt kolven uppåt för att ta bort eventuell luft från sprutans insida.
OBS: Det kommer sannolikt att finnas ett spår på baksidan av 3 ml sprutan som kräver extra kraft för att trycka in kolven. Tryck försiktigt kolven över spåret. Varje plötslig eller hård mängd kraft kommer att få kolven att röra sig för snabbt och eventuellt utvisa den fragmenterade hydrogelsuspensionen. - Extrudera den fragmenterade hydrogelsuspensionen genom en serie nålar för att skapa fragmenterade mikrogeler.
- Fäst en trubbig 18 G-nål på toppen av sprutan som innehåller den fragmenterade hydrogelen och PBS. Ta bort kolven från en ny 3 ml spruta och fäst ett spetslock i den tomma sprutpipan.
- Extrudera den fragmenterade hydrogelsuspensionen genom 18 G-nålen på baksidan av den tomma sprutpipan. Kasta den tomma sprutan och nålen i rätt avfallsström.
- Håll sprutan som innehåller den fragmenterade hydrogelsuspensionen så att spetslocket är vänd nedåt och pipöppningen är vänd uppåt. Rikta in sprutkolven mot pipans öppning, tryck knappt in kolven tillräckligt för att skapa en tätning.
- Vänd upp sprutan så att kolven nu är vänd nedåt och spetslocket är vänt uppåt, se till att hålla ihop kolven och sprutpipan så att ingen hydrogel eller PBS läcker ut.
- Håll sprutan så att spetslocket är vänt uppåt och kolven är vänd nedåt. Ta bort spetslocket. Tryck försiktigt kolven uppåt för att ta bort eventuell luft från sprutans insida. Se anmärkningen ovan angående att försiktigt trycka sprutkolven inåt för att förhindra oönskad utvisning av hydrogelmaterial.
- Upprepa steg 2.7.1-2.7.5 med en 23 G-, 27 G- och 30 G-nål. Vid det sista extruderingssteget (30 G nål), extrudera den fragmenterade hydrogelsuspensionen i mikrocentrifugrör. För de volymer som beskrivs häri kommer den slutliga fragmenterade hydrogelsuspensionsvolymen att vara ~ 2,5 ml, vilket kräver två 1,5 ml mikrocentrifugrör (volymen delas lika).
OBS: Ingen överdriven kraft bör krävas för att extrudera fragmenterad hydrogelsuspension genom nålarna. För bästa säkerhetspraxis rekommenderas att du utför alla extruderingsfragmenteringssteg inuti en kemisk huva för att ge skydd i händelse av övertryck av sprutan under extrudering. Dessutom kan denna process enkelt utföras i ett biosäkerhetsskåp / laminär flödeshuv för att bibehålla sterilitet under tillverkningen. Se Diskussion för ytterligare felsökningsförslag.
- Tvätta och isolera den fragmenterade hydrogelsuspensionen.
OBS: Tvätt av fragmenterade mikrogeler hjälper till att ta bort all oreagerad polymer och tvärbindare. Dessutom kommer centrifugering att bidra till att isolera mikrogelerna från suspensionen genom att bilda en pellet.- Använd en mikrocentrifug och snurra ner den fragmenterade mikrogelsuspensionen vid 5 000 x g i 5 minuter.
- Använd en pipett för att ta bort supernatanten. Tillsätt 1 ml PBS till varje mikrocentrifugrör som innehåller fragmenterade mikrogeler och virvel i 5-10 s.
- Upprepa centrifugering och tvättning med PBS 3x.
Figur 2: Översikt över mikrogeltillverkning med extruderingsfragmentering. Figuren visar (A) extrudering av bulkhydrogel i en tom sprutfat och tillsats av PBS, (B) säkring av en kolv i sprutan med fragmenterad hydrogel, (C) fästning av en 18 G nål och extrudering av fragmenterad hydrogelsuspension i en tom sprutfat och (D) upprepande extruderingsfragmenteringssteg med 23 G, 27 G och 30 G nålar, uppsamling av fragmenterad hydrogelsuspension i mikrocentrifugrör vid slutlig extrudering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Karakterisera fragmenterade mikrogeler med ImageJ
OBS: En översikt över att karakterisera de fragmenterade mikrogelerna med ImageJ visas i figur 3, liksom representativa resultat för att beskriva storleksfördelningar och former inom ett parti fragmenterade mikrogeler. Mikrogeler bör märkas fluorescerande före visualisering. Till exempel kan FITC-dextran med hög molekylvikt (2 MDa) kapslas in i bulkhydrogelen före fragmentering för att skapa fluoresceinmärkta mikrogeler.
- Kombinera 20 μL fragmenterad mikrogelsuspension med 180 μL PBS för att skapa en utspädd fragmenterad mikrogelsuspension. Virvel att blanda noggrant.
- Överför 50 μl utspädd fragmenterad mikrogelsuspension till ett glasmikroskopglas.
- Använd ett epifluorescerande mikroskop för att få bilder av fluorescerande märkta mikrogeler med 4x eller 10x zoom.
OBS: Mikrogelsuspensionen bör spädas tillräckligt så att närliggande mikrogeler inte är i kontakt med varandra, men ändå tillräckligt koncentrerade så att dussintals mikrogeler är synliga i fönstret. Utspädningen av mikrogelsuspensionen kan justeras i enlighet därmed för att uppnå detta. - Använda ImageJ för att analysera fragmenterade mikrogelpartiklar. Ytterligare information om hur du använder funktionen Analysera partiklar i ImageJ finns i länken i materialförteckningen.
- Öppna bilderna av mikrogeler i suspension i ImageJ.
- Välj Analysera > Ange mått, Kontrollera område, Formbeskrivningar och Ferets diameter. Klicka på OK.
- Välj Bild > Typ > 8-bitars.
- Välj Bild > Justera tröskelvärdet för >. Justera tröskeln så att mikrogeler täcks av en röd mask och bakgrunden förblir svart. Klicka på Apply.
Obs: Om några mikrogeler överlappar något, använd pennverktyget för att rita en tunn (<5 pixlar) svart linje mellan mikrogeler för att separera dem i den svartvita bilden. - Välj Analysera > Analysera partiklar. Ställ in Storlek (pixel2) från 50-Infinity för att minska bakgrundsbrus. Ställ in Cirkularitet på 0,00-1,00. Välj Visa konturer på rullgardinsmenyn. Kontrollera visningsresultat, Exkludera på kanter och Inkludera hål. Lämna de återstående rutorna avmarkerade. Klicka på OK.
- En resultatvisning öppnas, inklusive område, formbeskrivningar och Ferets diameterinformation för varje mikrogel som identifieras. Kopiera och klistra in resultaten i ett kalkylblad.
- Bestäm motsvarande cirkulär diameter för varje partikel.
- Hämta bildskalan i μm/pixel från skalstrecket eller instrumentinformationen. Skapa en kolumn i kalkylbladet som konverterar området för varje mikrogel från pixel2 till μm2.
- Använd området i μm2 för att bestämma mikrogelens ekvivalenta cirkulära diameter i μm (dvs ta kvadratroten av området dividerat med pi och fördubbla det sedan).
- Använd skalan μm/pixel för att konvertera Ferets diametrar (dvs. det längsta avståndet mellan två punkter på partikelgränsen) för varje mikrogel till en enhet på μm.
- Cirkularitet ("Circ."), bildförhållande ("AR"), rundhet ("Rund") och soliditetsvärden för varje mikrogel kan användas som direkt från ImageJ.
- Analysera mikrogelpopulationen efter önskemål, med tanke på fördelningen av diametrar (ekvivalent cirkulär och Ferets), cirkularitet, bildförhållande, rundhet och soliditet.
Figur 3: Översikt över karakterisering av fragmenterade mikrogelpartiklar med ImageJ. Figuren visar (A) att skapa en utspädd suspension av fragmenterade mikrogelpartiklar och använda ett epifluorescerande eller konfokalmikroskop för att avbilda mikrogeler i suspension (skalstång = 500 μm), (B) konvertera till en binär bild i ImageJ och analysera partiklar (antal, formbeskrivare etc.) och (C) representativa resultat. Felstaplar visar min och max med inre kvartilområden avgränsade. En populationsstorlek på n = 100 mikrogeler visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Montering av fragmenterade mikrogeler i granulära hydrogeler
OBS: Två metoder för formulering av granulära hydrogeler från fragmenterade mikrogeler presenteras med användning av centrifugering och filtrering. Metoden som används beror på önskad mikrogelförpackning (dvs. filtrering packar partiklar tätare) och om biologiska komponenter ingår (dvs. centrifugering kommer att behålla komponenter mellan partiklar, medan de vid filtrering kan gå förlorade). Tidigare arbete40 beskriver noggrant jämförande resultat (dvs. mekanik, porositet) för granulära hydrogeler bildade från antingen centrifug eller vakuumdriven filtrering.
- Alternativ 1: Fastna fragmenterade mikrogeler med centrifugering.
- Efter att ha tagit bort PBS-supernatanten från det sista tvättsteget, tillsätt 1 ml PBS till varje mikrocentrifugrör och återsuspendera mikrogelerna.
- Snurra ner den fragmenterade hydrogelsuspensionen vid 18 000 x g i 5 min.
OBS: Långsammare centrifughastigheter kan användas för att fastna mikrogeler i granulära hydrogeler med mindre tät förpackning om så önskas. - Ta bort PBS-supernatanten.
- Skaffa en ny 3 ml spruta och ta bort kolven. Använd en metallspatel för att skopa den fragmenterade granulära hydrogelen ur mikrocentrifugröret och överför den till baksidan av den tomma sprutpipan. En pipettspets kan användas för att hjälpa till att överföra den granulära hydrogelen till sprutan. Sätt tillbaka kolven i sprutan. Ladda nu den fragmenterade granulära hydrogelen i sprutan, och den är klar för användning.
- Alternativ 2: Fastna fragmenterade mikrogeler med vakuumdriven filtrering. En översikt över störning genom vakuumdriven filtrering visas i figur 4.
- Montera och testa den vakuumdrivna filtreringsapparaten.
- Säkra en Buchnertratt inuti en filterkolv och placera filteradaptern mellan tratten och kolvöppningen.
- Använd slangen för att ansluta filterkolven till en vakuumledning.
- Placera ett membranfilter (0,22 μm) i Buchnertrattkoppen.
- Slå på vakuumledningen genom att öppna rattventilen. Testa anslutningen genom att pipettera ~ 0,5 ml PBS på membranfiltret och observera att all PBS går genom filtret och samlas i botten av filterkolven.
- Slå på vakuumledningen och se till att den är helt tät. Vortex den fragmenterade hydrogelsuspensionen så att mikrogeler suspenderas i PBS.
- Överför den fragmenterade hydrogelsuspensionen till membranfiltret (0,22 μm) med en pipett på 1 000 μl. Efter överföring av hela mikrogelsuspensionen, vänta i ~ 30 s tills vakuumet drar PBS ur den fragmenterade hydrogelsuspensionen. Stäng av vakuumledningen.
OBS: Tiden som den fragmenterade hydrogelsuspensionen sitter på membranfiltret medan du drar vakuum kan varieras. Se Diskussion för mer information och felsökningsförslag. - Skaffa en ny 3 ml spruta och ta bort kolven. Använd en metallspatel för att skopa den fragmenterade granulära hydrogelen från filtret och överför den till baksidan av den tomma sprutpipan. En pipettspets kan användas för att hjälpa till att överföra den granulära hydrogelen till sprutan. Sätt tillbaka kolven i sprutan. Ladda den fragmenterade granulära hydrogelen i sprutan, och den är nu klar för användning.
- Montera och testa den vakuumdrivna filtreringsapparaten.
Figur 4: Översikt över störning av mikrogeler genom vakuumdriven filtrering för att tillverka tätt packade fragmenterade granulära hydrogeler. Figuren visar (A) placera ett membranfilter på vakuumfiltreringsapparaten, (B) använda en pipett för att överföra fragmenterad mikrogelsuspension till filtret, (C) dra vakuumet och vänta på att mikrogeler fastnar och bilda en granulär hydrogel, (D) stänga av vakuumet och ta bort fragmenterad granulär hydrogel med hjälp av en metallspatel och (E) använda en metallspatel för att överföra granulär hydrogel till sprutan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Extruderingstryck med granulära hydrogelfärger
OBS: En översikt över extruderingstryckprocessen visas i figur 5, inklusive ett representativt tryck av en stjärnformad konstruktion med fragmenterade granulära hydrogeler som fastnat med vakuumdriven filtrering. Utskriftsarbetsflödet består av att formulera en pennanteckning, planera utskriftsdesignen och sedan skriva ut tryckfärgen baserat på önskad design41. Om så önskas kan tryckta granulära hydrogelkonstruktioner stabiliseras med hjälp av fotokrysslänkning efter extrudering genom att tillsätta överskott av DTT (5 mM) och I2959 (0,05 vikt%) till den fragmenterade mikrogelsuspensionen före störning. Detta kommer att resultera i fotokorslänkade kovalenta bindningar bildade mellan mikrogelerna, vilket leder till permanent stabilisering av den granulära hydrogelkonstruktionen.
- Bläckformulering
- Tänk på egenskaperna hos bläcket som ska användas under planeringsprocessen. För att karakterisera bläcket, slutför den reologiska analysen av de fragmenterade hydrogelerna för att informera utskriftsdesignprocessen. Metoder som beskriver den reologiska karakteriseringen av granulära hydrogeler beskrivs på annat håll och kan anpassas för denna studie40.
- Från den reologiska analysen väljer du en utskriftsplattform och en serie initiala utskriftsparametrar.
OBS: På grund av de övergripande höga viskositets- och skjuvförtunnande egenskaperna hos granulära hydrogelfärger används vanligtvis skruvbaserade extruderingsskrivare.
- Tryck design
REPETIER Host-programvara (hädanefter kallad 3D-utskriftsprogramvara) används för 3D-utskriftsprogram (steg 5.2-5.3).- Skapa utskriftsdesignerna med CAD-programvara (Computer-Aided Design). Användare kan skapa nya mönster från grunden eller ändra befintliga mönster, till exempel från patientvävnadsskanningar eller från andra användare. Mer information om hur du skapar CAD-konstruktioner finns i följande referenser 41,42,43.
- För att bearbeta CAD-modeller till G-Code, se till att CAD-filen sparas i ".stl" -format (Tilläggsfil 1) och laddas upp till 3D-utskriftsprogrammet genom att välja inläsningsknappen i den övre panelen eller välja Arkiv > Ladda i menyraden. Denna G-kod definierar utskriftsvägen för deponering av bläcket. Ett exempel på en .stl-fil av en ihålig cylinder har inkluderats i tilläggsfilerna.
- När en STL-fil har laddats upp till 3D-utskriftsprogrammet navigerar du till panelen Utsnitt och väljer Slic3r som utsnittsalternativ. Här kan inställningar som munstycksdiameter, lagerhöjd, utskriftshastighet och extruderingshastighet justeras baserat på bläckkarakterisering och önskade utskriftsresultat. I detta protokoll används en 18 G nål (innerdiameter på 838 μm). Lagerhöjden är inställd på 1 mm, utskriftshastigheten är inställd på 8 mm/s och flödeshastigheten är inställd på 9 μL/s, baserat på tidigare optimering39. Numeriska värden för parametrar kan justeras med ± 20% för att ta hänsyn till variationer i egenskaperna hos granulära hydrogelfärger.
Det är viktigt att notera att dessa inställningar och utskriftsdesignen kan behöva justeras genom iterativa experimentella tester, beroende på justeringar av bläckformuleringen, önskad utskriftsupplösning eller utskriftsplattform som används. För mer information om dessa parametrar, samt om karakterisering av utskriftsinställningar med en ny bläckformulering, se andra referenser 40,44,45,46.
- Extruderingstryck med fragmenterade granulära hydrogeler
- För laddning av sprutor med fragmenterade granulära hydrogeler, se 4.2.4 samt figur 4 och figur 5.
- Ta bort spetslocket och sätt tillbaka det med en valfri nål.
- Ladda sprutan i den valda utskriftsplattformen. Här används en specialbyggd skruvbaserad extruderingsskrivare.
OBS: För information om att bygga anpassade bioprinters, se andra referenser 44,47. - Ladda den förberedda G-Code-filen från planeringsfasen till 3D-utskriftsprogramvaran. Navigera till panelen Förhandsgranska och tryck på Skriv ut.
- Så snart utskriftsavsättningen är klar, utsätt de fragmenterade granulära hydrogelkonstruktionerna för UV-ljus för fotokorslänkning och stabilisering.
- När tvärbindningen är klar, bearbeta provet genom att tvätta det i PBS tre gånger.
Figur 5: Översikt över extruderingsutskrift med fragmenterade granulära hydrogeler. Figuren visar (A) med hjälp av en spatel för att överföra fragmenterad granulär hydrogel till en sprutfat, (B) fästa en trubbig nål (18 G visas) och skjuta provet till toppen, (C) en grafik som representerar anslutningen till datorprogramvara för utskrift och (D) slutföra utskriften av en stjärnformad konstruktion med fragmenterad granulär hydrogel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat från dessa protokoll visas i figur 3 och figur 6. Extruderingsfragmentering ger mikrogeler med taggiga polygonformer med diametrar från 10-300 μm (figur 3). Vidare varierar cirkulariteten från 0,2 (inte cirkulär) till nästan 1 (perfekt cirkel), och bildförhållandet sträcker sig från 1-3 (figur 3). Dessa parametrar beskriver de oregelbundna och taggiga mikrogelformerna som bildas av fragmenteringsprocessen.
När den packas ihop med antingen centrifugering eller vakuumdriven filtrering är den monterade granulära hydrogelen skjuvförtunnande och självläkande, som beskrivits i föregående arbete39. Dessutom har den fragmenterade granulära hydrogelen hög form trohet och mekanisk integritet för en injicerbar hydrogel, vilket framgår av avsättningen av en ihålig cylinder med en höjd av 2 cm som extrudering trycks i figur 6. Fragmenterade granulära hydrogeler tillverkade med dessa enkla och kostnadseffektiva metoder är användbara för många biomedicinska applikationer, inklusive injicerbara terapier och 3D-utskriftsfärger.
Figur 6: Protokollöversikt och representativa resultat. Figuren visar (A) fragmentering, (B) mikrogeler i suspension, (C) störning genom vakuumdriven filtrering och (D) fastnat granulär hydrogel som extruderas genom en nål och skrivs ut i en ihålig cylinder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: Exempel .stl-fil Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs metoder för att tillverka granulära hydrogeler med hjälp av extruderingsfragmenterade mikrogeler och packning genom antingen centrifugering eller vakuumdriven filtrering. Jämfört med andra mikrogeltillverkningsmetoder (dvs. mikrofluidik, batchemulsioner, elektrosprayning, fotolitografi) är extruderingsfragmenteringsmikrogeltillverkning mycket snabb, billig, lätt skalbar och mottaglig för en mängd olika hydrogelsystem. Vidare är detta protokoll mycket repeterbart med minimal batch-till-batch-variabilitet, vilket kännetecknades i det tidigare arbetet39.
Detta protokoll använder norbornenmodifierad hyaluronsyra (NorHA) för att tillverka bulkhydrogeler med hjälp av en fotomedierad tiol-enreaktion. Detaljerade förfaranden för syntes av NorHA beskrivs på annan plats38. Många hydrogelkemier kan emellertid användas för att tillverka fragmenterade mikrogeler med hjälp av de metoder som beskrivs häri om en bulkhydrogel kan bildas i pipan på en spruta. Det är också användbart att förstå de mekaniska egenskaperna hos bulkhydrogel (t.ex. tryckmodul). Bulkhydrogelerna som används i detta protokoll har en bulktryckmodul på cirka 30 kPa39. En bulkhydrogel med en högre tryckmodul kommer att kräva mer kraft att extrudera under fragmenteringsstegen, vilket kan leda till ökad igensättning eller övertryck av sprutorna; Således rekommenderas att använda hydrogeler med tryckmodul mindre än 80 kPa. Vidare kan en bulkhydrogel med tryckmodul lägre än 10 kPa deformeras under fragmenteringsstegen, vilket gör det utmanande att fragmentera.
Detta protokoll är optimerat för en UV-punkthärdande lampa. Som ett alternativ till UV-ljuskällan och UV-responsiva fotoinitiatorer kan synliga ljuskällor också användas tillsammans med synliga ljusresponsiva fotoinitiatorer, såsom vattenlösliga litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfininat (LAP). Initiatorkoncentration, ljusintensitet och provvolym påverkar tvärbindningstiderna beroende på vilken polymer och tvärbindningssystem som används. Vidare kan många lampkällor användas som ett alternativ till spothärdningssystem.
Det mest kritiska steget i protokollet är den seriella extruderingen genom mindre och mindre nålmätare. I denna procedur föreslås att man använder nålmätare från 18 G (838 μm innerdiameter) ner till 30 G (159 μm innerdiameter). Att tillsätta PBS till den fragmenterade bulkhydrogelen före extrudering genom nålar är avgörande för att avsevärt minska kraften som behövs för att extrudera och fragmentera. Ingen överdriven kraft bör användas för att extrudera hydrogelen, eftersom överdriven kraft kan leda till trycksättning i sprutan och riskera att spränga hydrogelen ur sprutan tillbaka. Ytterligare strategier för att minska den kraft som krävs för att extrudera inkluderar att använda fler nålar i serien för att minska fragmentstorleken mer gradvis, samt att lägga till ytterligare PBS mellan fragmenteringsstegen.
Vid störning av de fragmenterade mikrogelerna med vakuumdriven filtrering kan det finnas variation i processen. Vissa materialsystem kan kräva mer (eller mindre) tid för att ta bort PBS och helt fastna mikrogelerna. Det föreslås att man registrerar den tid som krävs för enskilda materialsystem för att säkerställa repeterbarhet över experiment. Tiden att sylt kommer också att bero på tjockleken och storleken på provet som läggs till filtret. Att sprida provet jämnt över filtret kan hjälpa till med enhetlig störning.
Extruderingsfragmenteringsmikrogeltillverkningsmetoden kan anpassas för många biomedicinska applikationer. Till exempel kan terapier inkluderas i hydrogelprekursorlösningen och därefter inkapslas i fragmenterade mikrogeler för att tillverka en skjuvförtunnande, självläkande granulär hydrogel för lokaliserad terapeutisk leverans. Dessutom kan fragmenterade mikrogeler torkas för att möjliggöra långvarig lagring och enkla steriliseringsmetoder. En begränsning för extruderingsfragmenteringen är emellertid införlivandet av celler i mikrogeler. På grund av de höga skjuvhastigheterna under extruderingsfragmentering är metoden sannolikt inte mottaglig för cellinkapsling i mikrogeler, eftersom den höga skjuvningen kan leda till signifikant minskad cellviabilitet. Ändå kan celler och sfäroider enkelt införlivas mellan mikrogeler för in vitro-odling och in vivo-cellleverans .
Fragmenterade granulära hydrogeler är ett lovande biomaterial för biomedicinska tillämpningar. Under de senaste åren har granulära hydrogeler tillverkade av olika fragmenteringsmetoder (dvs. murbruk och stöt, blandare och nätgaller) använts som cellladdade 3D-utskriftsfärger48, terapeutiska leveransfordon29, injicerbara vävnadsreparationsställningar30 och sfäroidodlingsplattformar39. Av de fragmenteringsmetoder som tidigare rapporterats är extruderingsfragmenteringsmetoden som beskrivs här en av de enklaste och mest kostnadseffektiva metoderna med många fördelar. Att dela metoderna häri kommer att öka tillgängligheten till granulär hydrogeltillverkning och leda till betydande framsteg inom det växande området granulära hydrogelbiomaterial, vilket gör det möjligt för fler forskare att konstruera innovativa biomedicinska lösningar med fragmenterade granulära hydrogeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation genom UPenn MRSEC-programmet (DMR-1720530) och forskarstipendier (till V.G.M och M.E.P.) och National Institutes of Health (R01AR077362 till J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
