Summary
この研究は、押出断片化を伴うミクロゲルを製造し、ミクロゲルを注射可能な顆粒状ヒドロゲルに加工し、顆粒状ヒドロゲルを生物医学的用途のための押出印刷インクとして適用するための、簡単で適応性のある低コストの方法を記述している。
Abstract
顆粒状ヒドロゲルは、ヒドロゲル微粒子(すなわち、「ミクロゲル」)の詰まった集合体である。生体材料の分野では、粒状ヒドロゲルは、複数のミクロゲル集団を混合することによる注射性、マイクロスケールの多孔性、および同調性を含む多くの有利な特性を有する。ミクロゲルを製造する方法は、油中水型エマルジョン(例えば、マイクロフルイディクス、バッチエマルジョン、エレクトロスプレー)またはフォトリソグラフィーに依存することが多く、これは資源およびコストの面で高い要求を提示する可能性があり、多くのヒドロゲルと適合しない可能性がある。この研究は、押出断片化を使用してミクロゲルを製造し、それらを生物医学的用途(例えば、3D印刷インク)に有用な粒状ヒドロゲルに加工するための単純でありながら非常に効果的な方法を詳述する。まず、バルクヒドロゲル(例として光架橋性ヒアルロン酸(HA)を使用)を、連続してより小さい直径を有する一連の針を通して押し出し、断片化されたミクロゲルを形成する。このミクロゲル製造技術は、迅速で低コストで、拡張性が高い。遠心分離および真空駆動濾過によってミクロゲルを粒状ヒドロゲルに詰まらせる方法が記載されており、ヒドロゲル安定化のための任意の後架橋を伴う。最後に、断片化されたミクロゲルから製造された顆粒状ヒドロゲルは、押出印刷インキとして実証される。本明細書に記載の実施例は3D印刷に光架橋性HAを使用するが、これらの方法は、多種多様なヒドロゲルタイプおよび生物医学的用途に容易に適応可能である。
Introduction
顆粒状ヒドロゲルは、ヒドロゲル粒子(すなわち、ミクロゲル)のパッキングを介して製造され、生物医学的用途のための多くの有利な特性を有する生体材料の刺激的なクラスである1、2、3。その粒子状構造のために、粒状ヒドロゲルは剪断減粘および自己修復性であり、押出印刷(バイオ)インク、埋め込み印刷のための粒状支持体、および注射可能な治療薬4、5、6、7、8、9としての使用を可能にする。さらに、ミクロゲル間の空隙空間は、細胞移動および分子拡散のためのマイクロスケールの多孔性を提供する8、10、11。さらに、複数のミクロゲル集団を単一の製剤に組み合わせて、強化された同調性および材料機能性8、10、12、13を可能にすることができる。これらの重要な特性は、近年の粒状ヒドロゲル開発の急速な拡大を動機付けている。
顆粒状ヒドロゲル製造に向けてミクロゲルを形成するために利用可能な方法の範囲があり、それぞれに独自の長所と短所がある。例えば、ミクロゲルは、しばしば、液滴マイクロフルイディクス4、11、13、14、15、16、17、バッチエマルジョン7、18、19、20、21、22、またはエレクトロスプレー6、23を用いて油中水型エマルジョンから形成され、24,25。これらの方法は、均一な(マイクロ流体)または多分散(バッチエマルジョン、エレクトロスプレー)直径のいずれかを有する球状ミクロゲルを得る。これらの油中水型エマルジョン製造方法には、潜在的に低スループットの生産、低粘度ヒドロゲル前駆体溶液の必要性、およびセットアップのための高いコストとリソースなど、いくつかの制限があります。さらに、これらのプロトコルは、処理ステップを追加する手順を使用してミクロゲルから洗浄しなければならない過酷な油および界面活性剤を必要とする可能性があり、多くのラボでの生物医学的用途のための滅菌条件に変換することは困難であり得る。油中水型エマルジョンの必要性を排除するために、(フォト)リソグラフィーも使用することができ、そこでは、ヒドロゲル前駆体溶液1,26,27からのミクロゲルの硬化を制御するためにモールドまたはフォトマスクが使用される。マイクロ流体学と同様に、これらの方法は生産スループットが制限される可能性があり、これは大量が必要な場合に大きな課題です。
これらの方法の代替として、バルクヒドロゲルの機械的断片化が、不規則なサイズ19、28、29、30、31、32を有するミクロゲルを製造するために用いられてきた。例えば、バルクヒドロゲルを予め形成し、続いてメッシュまたはふるいに通して断片化されたミクロゲルを形成することができ、このプロセスは、ミクロゲル鎖33、34内の細胞の存在下でも行われてきた。バルクヒドロゲルはまた、乳鉢および乳棒による粉砕などの技術を用いて、または市販のブレンダー35、36、37の使用を介して機械的破壊を伴うミクロゲルに加工されている。また、ヒドロゲル形成中の機械的攪拌を用いて、断片化されたミクロゲル(すなわち、流体ゲル)を製造する者もいる31。
本明細書の方法は、これらの機械的断片化技術を拡張し、光架橋性ヒアルロン酸(HA)ヒドロゲルを例として使用して、押出断片化を有するミクロゲルを作製するための単純なアプローチを提示する。押出フラグメンテーションは、シリンジおよび針のみを使用して、広範囲のヒドロゲル19,32に適した低コスト、高スループット、および容易にスケーラブルな方法で断片化されたミクロゲルを作製する。さらに、これらの断片化されたミクロゲルを粒状ヒドロゲルに組み立てる方法は、遠心分離(低パッキング)または真空駆動濾過(高パッキング)のいずれかを用いて記載されている。最後に、これらの断片化された粒状ヒドロゲルの適用が、押出印刷インキとして使用するために議論される。このプロトコルの目標は、多種多様なヒドロゲルに適応可能であり、粒状ヒドロゲルに関心のある事実上あらゆる実験室で実施することができる簡単な方法を導入することである。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 光架橋を用いたシリンジ内部のバルクヒドロゲル作製
注:光架橋を使用したシリンジ内のバルクヒドロゲル製造の概要を 図1に示します。このプロトコルは、ノルボルネン修飾ヒアルロン酸(NorHA)を使用して、光媒介チオールエン反応を使用してバルクヒドロゲルを製造する。NorHAの合成のための詳細な手順は、他の場所38に記載されている。しかしながら、このプロトコールは、任意の光架橋性ヒドロゲルに対して高度に適応可能である。詳細については、「ディスカッション」を参照してください。
- バルクヒドロゲル製剤のポリマー、架橋剤、および開始剤の所望の濃度を予め決定する。このプロトコールにおいて、ヒドロゲル前駆体溶液は、NorHA(2重量%、〜25%のノルボルネン修飾度)、ジチオスレイトール(DTT、6mM)、およびイルガキュアD−2959(I2959、0.05重量%)からなる。成分(1 mL)が微量遠心管内のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に完全に溶解していることを確認してください。
注:ヒドロゲル前駆体溶液を調製する際に、高分子量FITC−デキストラン(2MDa、0.1重量%)を溶液に添加して、蛍光顕微鏡法を用いてプロトコルの後半で作製されたミクロゲルを視覚化することができる。 - 3mLシリンジにヒドロゲル前駆体溶液をロードする。
- 空の3 mLシリンジの背面からプランジャーを取り外し、シリンジバレルの上部にチップキャップを追加します。
- 1,000 μL のピペットを使用して、ヒドロゲル前駆体溶液をチップキャップ付きのシリンジバレルに移します。
- ヒドロゲル前駆体溶液を入れたシリンジバレルを片手で持ち、先端キャップを下向きにし、バレルの開放端を上に向けてください。一方、シリンジプランジャーをシリンジバレルの背面の開口部に戻す。シリンジプランジャーをバレルに静かに押し込み、シリンジバレルの後ろの開口部を密閉するのに十分です。
- プランジャーとシリンジバレルを慎重に保持して、シリンジバレルの背面がプランジャーで密閉されていることを確認し、プランジャーが下を向くようにシリンジを反転させ、チップキャップが上を向くようにします。先端キャップを取り外し、シリンジからすべての空気が除去されるまで、プランジャーをシリンジバレルに静かに押し込みます(ヒドロゲル前駆体溶液だけが残ります)。
- 先端キャップをシリンジに取り付け直します。ヒドロゲル前駆体溶液がチップキャップ付きの3mLシリンジ内に固定されていることを確認する。
- 3mLシリンジ内にバルクヒドロゲルを形成する。
- UVランプを点灯する前に、適切な個人用保護具(PPE)と安全対策が講じられていることを確認してください。これには、UV保護メガネを着用し、UV光から他の人を保護するためにランプ領域を囲むことが含まれます。
- 放射計を使用して、UVスポットキュアランプを10mW/cm2 の光強度に較正します。
注:シリンジバレルを通して光減衰があります。作製に先立って、放射計を用いて存在する光減衰の割合を決定する。スポット硬化システムから出力される光強度は、そのような減衰を考慮してそれに応じて調整されるべきである。 - ヒドロゲル前駆体溶液を装填した3mLシリンジをUVスポットキュアランプの下に置き、完全に光架橋するまで所望の時間置く。本明細書に記載の系について、NorHAヒドロゲル前駆体溶液は、10mW/cm2の強度でUV光に5分間曝露され、これは、先行研究39に基づいて、光架橋振動剪断レオロジー時間スイープによって決定される完全な架橋を確実にするのに十分な時間および光強度であった。
注:シリンジ内で完全な光架橋を確実にするために、シリンジは光架橋期間の途中で反転させることができる。 - UVランプを消灯し、シリンジを取り外します。ヒドロゲルがシリンジ内で光架橋されていることを確認します。これは、プランジャーを後ろに引っ張り、ヒドロゲルが粘性のある液体ではなく固体ブロックとして動くのを観察することによって行うことができる。
図1:光架橋を用いてシリンジ内でバルクヒドロゲルを製造することの概要。 図は、(A)シリンジからプランジャーを取り外す、(B)先端キャップをシリンジバレルに固定する、(C)ヒドロゲル前駆体をシリンジバレルに加える、(D)プランジャーをシリンジに戻す、(E)余分な空気を除去してチップキャップを固定する、(F)シリンジ内部のバルクヒドロゲルを光架橋する様子を描いている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. 押出フラグメンテーションを用いたミクロゲルの作製
注:押出フラグメンテーションを使用したミクロゲル製造の概要を 図2に示します。
- 空の3 mLシリンジの背面からプランジャーを取り外します。先端キャップをルアーロックに固定します。
- 光架橋バルクヒドロゲルを含むシリンジから先端キャップを取り外す。ヒドロゲルシリンジの上部を空のシリンジのバレルの開口部に揃える。
- バルクヒドロゲルをシリンジ開口部(針が取り付けられていない)を通して空のシリンジのバレルに押し出す。空になったシリンジ(以前はヒドロゲルが含まれていました)を適切な廃棄物の流れに適切に廃棄します。
- 押し出されたハイドロゲルを含むシリンジを、先端キャップが下を向き、バレル開口部が上を向くように保持します。1,000 μLのピペットを使用して、1.5 mLのPBSをシリンジバレルに加えます。
- シリンジプランジャーをバレルの開口部に合わせ、シールを作成するのに十分なだけプランジャーをかろうじて押し込みます。プランジャーが下を向き、チップキャップが上を向くようにシリンジを反転させ、プランジャーとシリンジバレルを所定の位置に保持して、ハイドロゲルやPBSが漏れないようにします。断片化したヒドロゲルをPBS添加と混合するために複数回反転させる。
- 先端キャップが上を向き、プランジャーが下を向くようにシリンジを持ちます。先端キャップを取り外します。プランジャーを非常に静かに上に押し上げて、シリンジの内側から空気を取り除きます。
注: 3 mL シリンジの背面に溝があり、プランジャーを押し込むために余分な力が必要になる可能性があります。非常に慎重に溝の上にプランジャーを押します。突然または過酷な量の力は、プランジャーの動きを速すぎ、断片化されたヒドロゲル懸濁液を排出する可能性があります。 - 断片化されたヒドロゲル懸濁液を一連の針を通して押し出し、断片化されたミクロゲルを作成する。
- 断片化されたヒドロゲルおよびPBSを含むシリンジの上部に鈍い先端18G針を固定する。新しい3 mLシリンジからプランジャーを取り外し、チップキャップを空のシリンジバレルに固定します。
- 断片化したヒドロゲル懸濁液を18G針を通して空のシリンジバレルの背面に押し出す。空のシリンジと針を適切な鋭利な廃棄物の流れに捨てます。
- 断片化されたヒドロゲル懸濁液を含むシリンジを、先端キャップが下を向き、バレル開口部が上を向くように保持する。シリンジプランジャーをバレルの開口部に合わせ、シールを作成するのに十分なだけプランジャーをかろうじて押し込みます。
- プランジャーが下を向き、先端キャップが上を向くようにシリンジを反転させ、プランジャーとシリンジバレルを一緒に保持して、ハイドロゲルやPBSが漏れないようにします。
- 先端キャップが上を向き、プランジャーが下を向くようにシリンジを持ちます。先端キャップを取り外します。プランジャーを非常に静かに上に押し上げて、シリンジの内側から空気を取り除きます。ヒドロゲル材料の望ましくない排出を防ぐために、シリンジプランジャーを静かに内側に押し込むことについては、上記の注を参照してください。
- 手順 2.7.1 ~ 2.7.5 を 23 G、27 G、および 30 G の針で繰り返します。最後の押出工程(30G針)に際し、断片化されたヒドロゲル懸濁液を微量遠心チューブに押し出す。本明細書に記載の容量の場合、最終的な断片化ヒドロゲル懸濁液容量は〜2.5mLとなり、2本の1.5mL微量遠心チューブを必要とする(体積は均等に分割される)。
注:断片化されたヒドロゲル懸濁液を針を通して押し出すために過度の力は必要ありません。最良の安全対策として、押出中にシリンジが過加圧された場合に保護を提供するために、化学フード内のすべての押出フラグメンテーションステップを実行することをお勧めします。さらに、このプロセスは、バイオセーフティキャビネット/層流フードで簡単に実行して、製造中の無菌性を維持することができます。その他のトラブルシューティングの提案については、「ディスカッション」を参照してください。
- 断片化されたヒドロゲル懸濁液を洗浄し、単離する。
注:断片化されたミクロゲルを洗浄すると、未反応のポリマーおよび架橋剤を除去するのに役立ちます。さらに、遠心分離は、ペレットを形成することによって懸濁液からミクロゲルを単離するのに役立つであろう。- 微量遠心分離機を用いて、断片化したミクロゲル懸濁液を5,000 x g で5分間スピンダウンする。
- ピペットを使用して上清を除去します。断片化したミクロゲルおよび渦を含む各微量遠心管に1mLのPBSを5〜10秒間加える。
- PBS 3xによる遠心分離と洗浄を繰り返す。
図2:押出フラグメンテーションを用いたミクロゲル作製の概要。 図は、(A)バルクヒドロゲルを空のシリンジバレルに押し出し、PBSを添加すること、(B)断片化されたヒドロゲルでシリンジ内のプランジャーを固定すること、(C)18G針を取り付け、断片化されたヒドロゲル懸濁液を空のシリンジバレルに押し出すこと、および(D)23G、27G、および30G針で押出フラグメンテーションステップを繰り返すこと、 断片化されたヒドロゲル懸濁液を最終押出し時に微量遠心管に集める。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. ImageJを用いた断片化ミクロゲルの特性評価
注:ImageJを使用して断片化されたミクロゲルを特徴付ける概要、および断片化されたミクロゲルのバッチ内のサイズ分布および形状を記述するための代表的な結果を 図3に示す。ミクロゲルは、可視化の前に蛍光標識する必要があります。例えば、高分子重量FITC−デキストラン(2MDa)を断片化前にバルクヒドロゲルに封入して、フルオレセイン標識ミクロゲルを作成することができる。
- 20 μLの断片化ミクロゲル懸濁液と180 μLのPBSを組み合わせて、希薄な断片化ミクロゲル懸濁液を作成した。徹底的に混ぜる渦。
- 50 μLの希薄断片化ミクロゲル懸濁液をガラス顕微鏡スライドに移す。
- エピ蛍光顕微鏡を使用して、蛍光標識されたミクロゲルの画像を4倍または10倍ズームで取得します。
注:ミクロゲル懸濁液は、隣接するミクロゲルが互いに接触しないように十分に希釈し、しかも数十個のミクロゲルがビューポートに見えるように十分に濃縮されるべきである。ミクロゲル懸濁液の希釈は、これを達成するためにそれに応じて調整することができる。 - ImageJを使用して断片化されたミクロゲル粒子を分析した。ImageJ の パーティクル解析 機能の使用に関する追加情報は、 材料表のリンクを参照してください。
- 懸濁液中のミクロゲルの画像をImageJで開く。
- 「解析」>「測定値の設定」、「領域の確認」、「形状記述子」、および「フェレの直径」を選択します。「OK」をクリックします。
- [ 画像>タイプ] > 8 ビットを選択します。
- [ 画像] > [しきい値>調整] を選択します。ミクロゲルが赤いマスクで覆われ、背景が黒のままになるようにしきい値を調整します。「 適用」をクリックします。
メモ: ミクロゲルがわずかに重なっている場合は、 鉛筆 ツールを使用してミクロゲル間に細い(<5ピクセル)黒い線を描き、白黒画像でミクロゲルを分離します。 - [解析]>[パーティクルの解析]を選択します。[サイズ (ピクセル2)] を 50-Infinity から設定して、バックグラウンド ノイズを減らします。円形度を 0.00 ~ 1.00 に設定します。ドロップダウンメニューから「アウトラインを表示」を選択します。表示結果を確認し、エッジで除外し、穴を含めます。残りのボックスはオフのままにします。[OK]をクリックします。
- 領域、形状記述子、および識別された各ミクロゲルのフェレーの直径情報を含む結果表示が開きます。結果をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。
- 各粒子の等価円形直径を決定します。
- スケールバーまたは計測器情報からμm/ピクセル単位の画像スケールを取得します。スプレッドシートに、各ミクロゲルの面積をピクセル2 から μm2 に変換する列を作成します。
- μm 2 の面積を使用して、ミクロゲルの等価円径を μm 単位で求めます (つまり、面積の平方根を pi で割ってから2 倍にします)。
- μm/ピクセルスケールを使用して、各ミクロゲルのフェレーの直径(すなわち、粒子境界上の任意の2点間の最長距離)をμmの単位に変換します。
- 各ミクロゲルの円形度(「円形」)、アスペクト比(「AR」)、真円度(「円形」)、および固体度の値は、ImageJから直接そのまま使用できます。
- 直径(フェレーと同等の円形)、円形度、アスペクト比、真円度、および固体性の分布を考慮して、必要に応じてミクロゲル集団を分析します。
図3:ImageJを用いた断片化ミクロゲル粒子の特性評価の概要。 図は、(A)断片化されたミクロゲル粒子の希薄懸濁液を作成し、エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して懸濁液中のミクロゲルを画像化し(スケールバー=500μm)、(B)ImageJで二値画像に変換して粒子を分析する(カウント、形状記述子など)、および(C)代表的な結果を示しています。誤差範囲は、内四分位範囲が区切られた最小値と最大値を表します。n = 100ミクロゲルの集団サイズが示されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. 断片化したミクロゲルを粒状ハイドロゲルに組み立てる
注:断片化されたミクロゲルからの顆粒状ヒドロゲルの製剤化のための2つの方法が、遠心分離および濾過を用いて提示される。使用される方法は、所望のミクロゲル充填物(すなわち、粒子をより密に濾過パックする)および生物学的成分が含まれるかどうかに依存する(すなわち、遠心分離は粒子間の成分を保持するが、濾過においてこれらは失われ得る)。先行研究40 は、遠心分離機または真空駆動濾過のいずれかから形成された粒状ヒドロゲルについての比較結果(すなわち、力学、気孔率)を徹底的に記述している。
- オプション1:遠心分離を用いて断片化されたミクロゲルをジャムする。
- 最後の洗浄工程からPBS上清を除去した後、各微量遠心チューブに1mLのPBSを加え、ミクロゲルを再懸濁する。
- 断片化したヒドロゲル懸濁液を18,000 x g で5分間スピンダウンする。
注:より遅い遠心分離速度は、必要に応じて密度の低いパッキングでミクロゲルを粒状ヒドロゲルに詰まらせるために使用できます。 - PBS上清を除去します。
- 新鮮な3mLシリンジを入手し、プランジャーを取り外します。金属ヘラを使用して、断片化された顆粒状ヒドロゲルを微量遠心管からすくい取り、空のシリンジバレルの背面に移す。ピペットチップを使用して、粒状ヒドロゲルをシリンジに移すのを補助することができる。プランジャーをシリンジに戻します。断片化した粒状ヒドロゲルをシリンジに装填すると、使用準備が整います。
- オプション2:真空駆動ろ過を使用して断片化されたミクロゲルをジャムする。真空駆動ろ過によるジャミングの概要を 図4に示します。
- 真空駆動ろ過装置を組み立ててテストします。
- フィルターフラスコの内側にブフナー漏斗を固定し、フィルターアダプターを漏斗とフラスコ開口部の間に配置します。
- チューブを使用して、フィルターフラスコを真空ラインに接続します。
- メンブレンフィルター(0.22 μm)をブフナー漏斗カップに入れます。
- ダイヤルバルブを開いて真空ラインをオンにします。約0.5mLのPBSをメンブレンフィルターにピペッティングして接続をテストし、すべてのPBSがフィルターを通過してフィルターフラスコの底に集まることを確認します。
- 真空ラインをオンにし、完全なシールを確認します。断片化されたヒドロゲル懸濁液を、ミクロゲルがPBSに懸濁されるように渦巻きにする。
- 1,000 μLのピペットを用いて、断片化したヒドロゲル懸濁液をメンブレンフィルター(0.22 μm)上に移す。ミクロゲル懸濁液全体を移した後、断片化されたヒドロゲル懸濁液からPBSを引き出すために真空まで〜30秒間待つ。真空ラインをオフにします。
注:断片化されたヒドロゲル懸濁液が真空を引っ張りながらメンブレンフィルター上に座る時間は変化させることができる。詳細とトラブルシューティングの提案については、「ディスカッション」を参照してください。 - 新鮮な3mLシリンジを入手し、プランジャーを取り外します。金属ヘラを使用して、断片化された顆粒状ヒドロゲルをフィルターからすくい取り、空のシリンジバレルの背面に移す。ピペットチップを使用して、粒状ヒドロゲルをシリンジに移すのを補助することができる。プランジャーをシリンジに戻します。断片化された粒状ヒドロゲルをシリンジに装填すると、使用準備が整いました。
- 真空駆動ろ過装置を組み立ててテストします。
図4:密閉された断片状の顆粒状ヒドロゲルを製造するための真空駆動濾過による妨害ミクロゲルの概要。 図は、(A)真空濾過装置上にメンブレンフィルターを載置すること、(B)ピペットを用いて断片化したミクロゲル懸濁液をフィルター上に転写すること、(C)真空を引っ張ってミクロゲルが詰まって粒状ヒドロゲルを形成するのを待つこと、(D)真空をオフにして金属ヘラを用いて断片化した粒状ヒドロゲルを除去すること、(E)金属ヘラを用いて粒状ヒドロゲルをシリンジに移すこと、を描いている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5. 粒状ハイドロゲルインクによる押出印刷
注:押出印刷プロセスの概要を 図5に示し、真空駆動ろ過で詰まった断片化された粒状ヒドロゲルを使用した星形構造物の代表的な印刷を含む。印刷ワークフローは、インクを定式化し、印刷設計を計画し、次いで、所望の設計41に基づいてインクを印刷することからなる。所望により、印刷された粒状ヒドロゲル構築物は、ジャミングの前に断片化されたミクロゲル懸濁液に過剰のDTT(5mM)およびI2959(0.05重量%)を添加することによって、光架橋後押出しを用いて安定化させることができる。これは、ミクロゲル間に形成される光架橋共有結合をもたらし、粒状ヒドロゲル構築物の永久的な安定化をもたらす。
- インク配合
- 計画プロセス中は、使用するインクの特性に注意してください。インクを特徴付けるには、断片化されたヒドロゲルのレオロジー分析を完了して、印刷設計プロセスに役立ててください。顆粒状ヒドロゲルのレオロジー特性評価を記述する方法は、他の箇所にも記載されており、この研究40に適合させることができる。
- レオロジー分析から、印刷プラットフォームと一連の初期印刷パラメータを選択します。
メモ:粒状ハイドロゲルインクの全体的な高粘度とせん断減粘特性のために、スクリューベースの押出プリンタが通常使用されます。
- 印刷デザイン
メモ: リペティエホストソフトウェア(以下、3D印刷ソフトウェア)は、3D印刷アプリケーションに使用されます(手順5.2~5.3)。- コンピュータ支援デザイン(CAD)ソフトウェアを使用して印刷デザインを作成します。ユーザーは、新しいデザインをゼロから作成したり、患者の組織スキャンや他のユーザーなどから既存のデザインを変更したりできます。CAD設計の作成の詳細については、以下の参考文献41,42,43を参照してください。
- CAD モデルを G-Code に処理するには、トップパネルのロードボタンを選択するか、メニューバーの「ロード」を選択して、CAD ファイルが「.stl」フォーマット(補足ファイル1)で保存され、3Dプリントソフトウェアにアップロードされているこ > 確認します。このGコードは、インクの堆積のための印刷経路を定義する。中空円柱の .stl ファイルの例が補足ファイルに含まれています。
- STL ファイルが 3D 印刷ソフトウェアにアップロードされたら、[ スライサー ] パネルに移動し、スライサー オプションとして [ Slic3r ] を選択します。ここでは、ノズル径、層の高さ、印刷速度、押出速度などの設定は、インクの特性評価と所望の印刷結果に基づいて調整できます。このプロトコルでは、18G針(内径838μm)が使用される。層の高さは1mmに設定され、印刷速度は8mm/sに設定され、流速は9μL/sに設定され、以前の最適化39に基づいている。パラメータの数値は、粒状ヒドロゲルインクの特性の変動を説明するために±20%によって調整され得る。
メモ: これらの設定と印刷デザインは、インクの配合、必要な印刷解像度、または使用する印刷プラットフォームの調整に応じて、反復的な実験テストによって調整する必要があることに注意することが重要です。これらのパラメータ、ならびに新規インク配合による印刷設定の特性評価の詳細については、他の参考文献40、44、45、46を参照されたい。
- 断片化された粒状ヒドロゲルによる押出印刷
- 断片化された粒状ヒドロゲルでシリンジを装填するには、4.2.4、ならびに図 4 および 図5を参照されたい。
- 先端キャップを外し、お好みの針と交換してください。
- シリンジを選択した印刷プラットフォームにロードします。ここでは、カスタムメイドのスクリューベースの押出プリンタが使用されています。
注:カスタムバイオプリンタの構築に関する情報については、他の参考文献44,47を参照してください。 - 準備したG-Codeファイルを計画段階から3D印刷ソフトウェアにロードします。 印刷プレビュー パネルに移動し、 印刷を押します。
- 印刷堆積が完了したらすぐに、断片化された粒状ヒドロゲル構築物をUV光にさらして、光架橋および安定化させる。
- 架橋が完了したら、PBSで3回洗浄してサンプルを処理します。
図5:断片化された粒状ヒドロゲルによる押出印刷の概要。 この図は、(A)ヘラを使用して断片化された顆粒状ヒドロゲルをシリンジバレルに移すこと、(B)鈍い先端針(図18G)を取り付けてサンプルを上部に押し込むこと、(C)印刷用のコンピュータソフトウェアへの接続を表すグラフィック、および(D)断片化された顆粒状ヒドロゲルによる星形構造の印刷の完了を描いている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
これらのプロトコルからの代表的な結果を図 3 および 図6に示す。押出フラグメンテーションにより、直径10~300μmのギザギザの多角形形状のミクロゲルが得られます(図3)。さらに、円形度は0.2(円形ではない)からほぼ1(真円)までの範囲であり、アスペクト比は1〜3の範囲である(図3)。これらのパラメータは、フラグメンテーションプロセスによって形成される不規則でギザギザのミクロゲル形状を記述する。
遠心分離または真空駆動濾過のいずれかを用いて一緒に充填すると、組み立てられた粒状ヒドロゲルは、前の作業39で説明したように、剪断減粘および自己修復である。さらに、断片化された顆粒状ヒドロゲルは、 図6に押出印刷される高さ2cmの中空シリンダーの堆積によって示されるように、注射用ヒドロゲルに対して高い形状忠実度および機械的完全性を有する。これらのシンプルで費用対効果の高い方法で製造された断片化された粒状ヒドロゲルは、注射可能な治療薬や3D印刷インクを含む多くの生物医学的用途に有用である。
図6:プロトコルの概要と代表的な結果 この図は、(A)断片化、(B)懸濁液中のミクロゲル、(C)真空駆動濾過によるジャミング、および(D)詰まった粒状ヒドロゲルが針を通して押し出され、中空シリンダーに印刷される様子を描いている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: .stl ファイルの例 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本明細書には、押出断片化ミクロゲルおよび遠心分離または真空駆動濾過のいずれかによるパッキングを用いて顆粒状ヒドロゲルを製造する方法が記載されている。他のミクロゲル作製方法(すなわち、マイクロフルイディクス、バッチエマルジョン、エレクトロスプレー、フォトリソグラフィー)と比較して、押出フラグメンテーションミクロゲル作製は非常に迅速で、低コストで、容易にスケーラブルであり、多種多様なヒドロゲル系に順応可能である。さらに、このプロトコルは、バッチ間の変動性を最小限に抑えて高い再現性であり、これは前の作業39で特徴付けられた。
このプロトコルは、ノルボルネン修飾ヒアルロン酸(NorHA)を使用して、光媒介チオールエン反応を使用してバルクヒドロゲルを製造する。NorHAの合成のための詳細な手順は、他の場所38に記載されている。しかしながら、バルクヒドロゲルをシリンジのバレル内に形成することができる場合、多くのヒドロゲル化学は、本明細書に記載の方法を用いて断片化されたミクロゲルを作製するために使用することができる。バルクヒドロゲルの機械的特性(例えば、圧縮弾性率)を理解することも有用である。このプロトコールで使用されるバルクヒドロゲルは、約30kPa39のバルク圧縮弾性率を有する。より高い圧縮弾性率を有するバルクヒドロゲルは、断片化ステップ中に押し出すためにより多くの力を必要とし、シリンジの目詰まりまたは過加圧の増加につながる可能性がある。したがって、圧縮弾性率が80kPa未満のヒドロゲルを使用することが推奨される。さらに、圧縮弾性率が10kPaより低いバルクヒドロゲルは、断片化ステップ中に変形する可能性があり、断片化が困難になる。
このプロトコルは、UVスポットキュアランプ用に最適化されています。UV光源およびUV応答性光開始剤の代替として、可視光光源は、水溶性フェニル−2,4,6−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)などの可視光応答性光開始剤と共に使用することもできる。開始剤濃度、光強度、およびサンプル量は、使用されるポリマーおよび架橋系に応じて架橋時間に影響します。さらに、多くのランプ光源をスポット硬化システムの代替として使用することができる。
プロトコルの最も重要なステップは、より小型のニードルゲージによるシリアル押出成形です。この手順では、18 G(内径838 μm)から30 G(内径159 μm)までのニードルゲージを使用することをお勧めします。針を通して押し出す前に断片化されたバルクヒドロゲルにPBSを添加することは、押し出しおよび断片化に必要な力を大幅に減少させるために重要である。過度の力はシリンジ内の背中の加圧につながり、シリンジの背中からヒドロゲルを破裂させる危険性があるため、ヒドロゲルを押し出すために過度の力を使用すべきではありません。押し出すために必要な力を減らすための追加の戦略には、シリーズ内でより多くの針を使用してフラグメントサイズをより徐々に縮小すること、およびフラグメント化ステップ間に追加のPBSを追加することが含まれます。
真空駆動ろ過を使用して断片化されたミクロゲルを詰まらせる場合、プロセスにばらつきがある可能性があります。いくつかの材料系は、PBSを除去し、ミクロゲルを完全に詰まらせるために、より多くの(またはより少ない)時間を必要とするかもしれない。実験全体の再現性を確保するために、個々の材料システムに必要な時間を記録することをお勧めします。ジャムまでの時間は、フィルターに添加されるサンプルの厚さとサイズにも依存します。フィルター全体にサンプルを均等に広げると、均一なジャミングに役立ちます。
押出フラグメンテーションミクロゲル作製法は、多くの生物医学的用途に適合させることができる。例えば、治療薬をヒドロゲル前駆体溶液に含ませ、続いて断片化されたミクロゲル内に封入して、局所的な治療送達のための剪断間伐、自己治癒顆粒状ヒドロゲルを作製することができる。さらに、断片化されたミクロゲルを乾燥させて、長期保存および簡単な滅菌慣行を可能にすることができる。しかしながら、押出断片化に対する1つの制限は、ミクロゲル内の細胞の取り込みである。押出フラグメンテーション中の高い剪断速度のために、この方法は、高剪断が細胞生存率を著しく低下させる可能性があるため、ミクロゲル内の細胞封入に順応しない可能性が高い。それでも、細胞およびスフェロイドは、 インビトロ 培養および インビボ 細胞送達のためにミクロゲル間に容易に組み込むことができる。
断片化された顆粒状ヒドロゲルは、生物医学的用途のための有望な生体材料である。近年、様々な断片化法(すなわち、乳鉢および乳棒、ブレンダー、およびメッシュおろし金)から作製された顆粒状ヒドロゲルが、細胞を含む3D印刷インキ48、治療送達ビヒクル29、注射可能な組織修復足場30、および回転楕円体培養プラットフォーム39として使用されている。以前に報告されたフラグメンテーション法のうち、本明細書に記載の押出フラグメンテーション法は、多数の利点を有する最も単純で費用対効果の高い方法の1つである。本明細書の方法を共有することは、粒状ヒドロゲル製造へのアクセス性を高め、粒状ヒドロゲル生体材料の成長分野における著しい進歩をもたらし、より多くの研究者が断片化された粒状ヒドロゲルを用いて革新的な生物医学的ソリューションを設計することを可能にする。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは競合する金銭的利益を持っていない。
Acknowledgments
この研究は、UPenn MRSECプログラム(DMR-1720530)および大学院研究フェローシップ(V.G.M.およびM.E.P.へ)および国立衛生研究所(R01AR077362からJ.A.B.)を通じて国立科学財団によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
