Summary
Este trabajo describe métodos sencillos, adaptables y de bajo costo para fabricar microgeles con fragmentación por extrusión, procesar los microgeles en hidrogeles granulares inyectables y aplicar los hidrogeles granulares como tintas de impresión de extrusión para aplicaciones biomédicas.
Abstract
Los hidrogeles granulares son conjuntos atascados de micropartículas de hidrogel (es decir, "microgeles"). En el campo de los biomateriales, los hidrogeles granulares tienen muchas propiedades ventajosas, incluida la inyectabilidad, la porosidad a microescala y la capacidad de sintonización al mezclar múltiples poblaciones de microgeles. Los métodos para fabricar microgeles a menudo se basan en emulsiones de agua en aceite (por ejemplo, microfluídica, emulsiones por lotes, electropulverización) o fotolitografía, que pueden presentar altas demandas en términos de recursos y costos, y pueden no ser compatibles con muchos hidrogeles. Este trabajo detalla métodos simples pero altamente efectivos para fabricar microgeles utilizando la fragmentación por extrusión y procesarlos en hidrogeles granulares útiles para aplicaciones biomédicas (por ejemplo, tintas de impresión 3D). En primer lugar, los hidrogeles a granel (utilizando ácido hialurónico fotoreticulable (HA) como ejemplo) se extruyen a través de una serie de agujas con diámetros secuencialmente más pequeños para formar microgeles fragmentados. Esta técnica de fabricación de microgel es rápida, de bajo costo y altamente escalable. Se describen los métodos para atascar microgeles en hidrogeles granulares por centrifugación y filtración impulsada por vacío, con post-reticulación opcional para la estabilización del hidrogel. Por último, los hidrogeles granulares fabricados a partir de microgeles fragmentados se demuestran como tintas de impresión por extrusión. Si bien los ejemplos descritos en este documento utilizan HA fotoreticulable para la impresión 3D, los métodos son fácilmente adaptables para una amplia variedad de tipos de hidrogel y aplicaciones biomédicas.
Introduction
Los hidrogeles granulares se fabrican a través del empaquetamiento de partículas de hidrogel (es decir, microgeles) y son una clase emocionante de biomateriales con muchas propiedades ventajosas para aplicaciones biomédicas 1,2,3. Debido a su estructura de partículas, los hidrogeles granulares son de adelgazamiento por cizallamiento y autocuración, lo que permite su uso como tintas (bio)de impresión por extrusión, soportes granulares para impresión incrustada y terapias inyectables 4,5,6,7,8,9. Además, el espacio vacío entre microgeles proporciona una porosidad a microescala para el movimiento celular y la difusión molecular 8,10,11. Además, se pueden combinar múltiples poblaciones de microgeles en una sola formulación para permitir una mayor capacidad de ajuste y funcionalidad del material 8,10,12,13. Estas importantes propiedades han motivado la rápida expansión del desarrollo de hidrogel granular en los últimos años.
Existe una gama de métodos disponibles para formar microgeles hacia la fabricación de hidrogel granular, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Por ejemplo, los microgeles a menudo se forman a partir de emulsiones de agua en aceite que utilizan microfluídica de gotas 4,11,13,14,15,16,17, emulsiones por lotes 7,18,19,20,21,22 o electropulverización 6,23, 24,25. Estos métodos producen microgeles esféricos con diámetros uniformes (microfluídica) o polidispersos (emulsiones por lotes, electropulverización). Existen algunas limitaciones para estos métodos de fabricación de emulsión de agua en aceite, incluida la producción potencialmente de bajo rendimiento, la necesidad de soluciones precursoras de hidrogel de baja viscosidad y el alto costo y los recursos para la configuración. Además, estos protocolos pueden requerir aceites y surfactantes agresivos que deben lavarse de los microgeles utilizando procedimientos que agregan pasos de procesamiento, y pueden ser difíciles de traducir a condiciones estériles para aplicaciones biomédicas en muchos laboratorios. Eliminando la necesidad de emulsiones de agua en aceite, también se puede utilizar la (foto)litografía, donde se utilizan moldes o fotomáscaras para controlar el curado de microgeles de soluciones precursoras de hidrogel 1,26,27. Al igual que la microfluídica, estos métodos pueden estar limitados en su rendimiento de producción, lo cual es un gran desafío cuando se necesitan grandes volúmenes.
Como alternativa a estos métodos, se ha utilizado la fragmentación mecánica de hidrogeles a granel para fabricar microgeles con tamaños irregulares 19,28,29,30,31,32. Por ejemplo, los hidrogeles a granel pueden ser preformados y posteriormente pasados a través de mallas o tamices para formar microgeles fragmentados, un proceso que incluso se ha realizado en presencia de células dentro de hebras de microgel33,34. Los hidrogeles a granel también se han procesado en microgeles con interrupción mecánica utilizando técnicas como la molienda con mortero y mortero o mediante el uso de licuadoras comerciales 35,36,37. Otros también han utilizado la agitación mecánica durante la formación de hidrogel para fabricar microgeles fragmentados (es decir, geles fluidos)31.
Los métodos aquí presentes amplían estas técnicas de fragmentación mecánica y presentan un enfoque simple para fabricar microgeles con fragmentación por extrusión, utilizando hidrogeles de ácido hialurónico (HA) fotocruzables como ejemplo. La fragmentación por extrusión utiliza solo jeringas y agujas para fabricar microgeles fragmentados en un método de bajo costo, alto rendimiento y fácilmente escalable que es apropiado para una amplia gama de hidrogeles19,32. Además, los métodos para ensamblar estos microgeles fragmentados en hidrogeles granulares se describen utilizando centrifugación (bajo embalaje) o filtración impulsada por vacío (alto embalaje). Por último, se discute la aplicación de estos hidrogeles granulares fragmentados para su uso como tinta de impresión de extrusión. El objetivo de este protocolo es introducir métodos simples que se adapten a una amplia variedad de hidrogeles y se puedan implementar en prácticamente cualquier laboratorio interesado en hidrogeles granulares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricación de hidrogeles a granel dentro de una jeringa mediante fotoreticulación
NOTA: En la Figura 1 se muestra una descripción general de la fabricación de hidrogel a granel dentro de una jeringa mediante fotoreticulación. Este protocolo utiliza ácido hialurónico modificado con norborneno (NorHA) para fabricar hidrogeles a granel utilizando una reacción de tiol-ene fotomediada. Los procedimientos detallados para la síntesis de NorHA se describen en otra parte38. Sin embargo, este protocolo es altamente adaptable a cualquier hidrogel fotoreticulable. Consulte Discusión para obtener más información.
- Predetermine las concentraciones deseadas de polímero, reticulador e iniciadores para la formulación de hidrogel a granel. En este protocolo, la solución precursora de hidrogel consiste en NorHA (2 wt.%, ~25% grado de modificación de norborneno), ditiotreitol (TDT, 6 mM) e Irgacure D-2959 (I2959, 0.05 wt.%). Asegúrese de que los componentes (1 ml) estén completamente disueltos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) dentro de un tubo de microcentrífuga.
NOTA: Al preparar la solución precursora de hidrogel, se puede agregar FITC-dextrano de alto peso molecular (2 MDa, 0.1 wt.%) a la solución para visualizar microgeles fabricados más adelante en el protocolo utilizando microscopía fluorescente. - Cargue una jeringa de 3 ml con la solución precursora de hidrogel.
- Retire el émbolo de la parte posterior de una jeringa vacía de 3 ml y agregue una tapa de punta a la parte superior del barril de la jeringa.
- Utilice una pipeta de 1.000 μL para transferir la solución precursora de hidrogel al barril de la jeringa con la tapa de la punta.
- Sostenga el barril de la jeringa con solución precursora de hidrogel en una mano, con la tapa de la punta hacia abajo y el extremo abierto del barril hacia arriba. Con la otra mano, devuelva el émbolo de la jeringa a la abertura de la parte posterior del barril de la jeringa. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa en el barril, lo suficiente para sellar la abertura en la parte posterior del barril de la jeringa.
- Sostenga cuidadosamente el émbolo y el barril de la jeringa juntos para asegurarse de que la parte posterior del barril de la jeringa esté sellada con el émbolo, invierta la jeringa de tal manera que el émbolo esté hacia abajo y la tapa de la punta ahora esté hacia arriba. Retire la tapa de la punta y empuje suavemente el émbolo en el barril de la jeringa hasta que se elimine todo el aire de la jeringa (solo queda la solución precursora de hidrogel).
- Vuelva a colocar la tapa de la punta en la jeringa. Asegúrese de que la solución precursora de hidrogel esté asegurada dentro de la jeringa de 3 ml con una tapa de punta.
- Forme un hidrogel a granel dentro de la jeringa de 3 ml.
- Asegúrese de que se tomen el equipo de protección personal (EPP) adecuado y las protecciones antes de encender la lámpara UV. Esto incluye el uso de anteojos protectores contra los rayos UV y encerrar el área de la lámpara para proteger a los demás de la luz UV.
- Calibre la lámpara de curado de puntos UV a una intensidad de luz de 10 mW/cm2 utilizando un radiómetro.
NOTA: Habrá atenuación ligera a través del barril de la jeringa. Antes de la fabricación, determine el porcentaje de atenuación de la luz presente utilizando un radiómetro. La salida de intensidad de luz del sistema de curado por puntos debe ajustarse en consecuencia para tener en cuenta dicha atenuación. - Coloque la jeringa de 3 ml cargada con la solución precursora de hidrogel debajo de la lámpara de curado de puntos UV durante el tiempo deseado para realizar un enlace fotocruzado completo. Para el sistema descrito en este documento, la solución precursora de hidrogel NorHA se expone a la luz UV durante 5 minutos a una intensidad de 10 mW / cm2, que, según estudios previos39, fue suficiente tiempo e intensidad de luz para garantizar una reticulación completa según lo determinado por los barridos de tiempo de reología de cizallamiento oscilatorio de fotoreticulación.
NOTA: Para garantizar un fotocrosslinking completo dentro de la jeringa, la jeringa se puede voltear a la mitad del período de photocrosslinking. - Apague la lámpara UV y retire la jeringa. Asegúrese de que el hidrogel esté ahora fotocruzado dentro de la jeringa. Esto se puede hacer tirando hacia atrás del émbolo y observando el movimiento del hidrogel como un bloque sólido en lugar de un líquido viscoso.
Figura 1: Descripción general de la fabricación de hidrogeles a granel dentro de una jeringa utilizando fotoreticulación. La figura muestra (A) quitando el émbolo de la jeringa, (B) asegurando la tapa de la punta al barril de la jeringa, (C) agregando precursor de hidrogel al barril de la jeringa, (D) devolviendo el émbolo a la jeringa, (E) eliminando el exceso de aire y asegurando la tapa de la punta, y (F) fotocruzando hidrogel a granel dentro de la jeringa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Fabricación de microgeles mediante fragmentación por extrusión
NOTA: En la Figura 2 se muestra una descripción general de la fabricación de microgel mediante fragmentación por extrusión.
- Retire el émbolo de la parte posterior de una jeringa vacía de 3 ml. Asegure una tapa de punta al Luer-Lock.
- Retire la tapa de la punta de la jeringa que contiene el hidrogel a granel fotoreticulado. Alinee la parte superior de la jeringa de hidrogel con la abertura del barril en la jeringa vacía.
- Extruya el hidrogel a granel a través de la abertura de la jeringa (sin aguja) en el barril de la jeringa vacía. Deseche adecuadamente la jeringa que ahora está vacía (anteriormente contenía el hidrogel) en el flujo de desechos adecuado.
- Sostenga la jeringa que contiene el hidrogel extruido de tal manera que la tapa de la punta esté hacia abajo y la abertura del barril esté hacia arriba. Usando una pipeta de 1,000 μL, agregue 1.5 mL de PBS al barril de la jeringa.
- Alinee el émbolo de la jeringa con la abertura del barril, apenas empujando el émbolo lo suficiente como para crear un sello. Invierta la jeringa de tal manera que el émbolo ahora esté hacia abajo y la tapa de la punta esté hacia arriba, asegurándose de mantener el émbolo y el barril de la jeringa juntos en su lugar para que no se filtre hidrogel o PBS. Invierta varias veces para mezclar el hidrogel fragmentado con el PBS agregado.
- Sostenga la jeringa de tal manera que la tapa de la punta esté hacia arriba y el émbolo hacia abajo. Retire la tapa de la punta. Empuje muy suavemente el émbolo hacia arriba para eliminar el aire del interior de la jeringa.
NOTA: Es probable que haya una ranura en la parte posterior de la jeringa de 3 ml que requerirá fuerza adicional para empujar el émbolo. Empuje con mucho cuidado el émbolo sobre la ranura. Cualquier cantidad repentina o brusca de fuerza hará que el émbolo se mueva demasiado rápido y posiblemente expulse la suspensión de hidrogel fragmentada. - Extruir la suspensión de hidrogel fragmentado a través de una serie de agujas para crear microgeles fragmentados.
- Asegure una aguja de punta roma de 18 G en la parte superior de la jeringa que contiene el hidrogel fragmentado y el PBS. Retire el émbolo de una jeringa fresca de 3 ml y asegure una tapa de punta al barril de la jeringa vacío.
- Extruya la suspensión de hidrogel fragmentada a través de la aguja de 18 G en la parte posterior del barril de la jeringa vacío. Deseche la jeringa y la aguja vacías en el flujo de desechos de objetos punzantes adecuado.
- Sostenga la jeringa que contiene la suspensión de hidrogel fragmentada de modo que la tapa de la punta esté hacia abajo y la abertura del barril esté hacia arriba. Alinee el émbolo de la jeringa con la abertura del barril, apenas empujando el émbolo lo suficiente como para crear un sello.
- Invierta la jeringa de tal manera que el émbolo ahora esté hacia abajo, y la tapa de la punta esté hacia arriba, asegurándose de mantener el émbolo y el barril de la jeringa juntos para que no se filtre hidrogel o PBS.
- Sostenga la jeringa de tal manera que la tapa de la punta esté hacia arriba y el émbolo hacia abajo. Retire la tapa de la punta. Empuje muy suavemente el émbolo hacia arriba para eliminar el aire del interior de la jeringa. Vea la NOTA anterior con respecto a empujar suavemente el émbolo de la jeringa hacia adentro para evitar la expulsión no deseada del material de hidrogel.
- Repita los pasos 2.7.1-2.7.5 con una aguja de 23 G, 27 G y 30 G. En el último paso de extrusión (aguja de 30 G), extruya la suspensión de hidrogel fragmentada en tubos de microcentrífuga. Para los volúmenes descritos en este documento, el volumen final de suspensión de hidrogel fragmentado será de ~ 2.5 ml, lo que requerirá dos tubos de microcentrífuga de 1.5 ml (volumen dividido por igual).
NOTA: No se debe requerir fuerza excesiva para extruir la suspensión de hidrogel fragmentada a través de las agujas. Para las mejores prácticas de seguridad, se recomienda realizar todos los pasos de fragmentación de extrusión dentro de una campana química para proporcionar protección en caso de sobrepresurización de la jeringa durante la extrusión. Además, este proceso se puede realizar fácilmente en un gabinete de bioseguridad / campana de flujo laminar para mantener la esterilidad durante la fabricación. Consulte Discusión para obtener sugerencias adicionales de solución de problemas.
- Lave y aísle la suspensión de hidrogel fragmentada.
NOTA: El lavado de microgeles fragmentados ayudará a eliminar cualquier polímero no reaccionado y reticulante. Además, el centrifugado ayudará a aislar los microgeles de la suspensión formando un pellet.- Usando una microcentrífuga, gire hacia abajo la suspensión de microgel fragmentada a 5.000 x g durante 5 min.
- Use una pipeta para quitar el sobrenadante. Agregue 1 ml de PBS a cada tubo de microcentrífuga que contenga microgeles fragmentados y vórtice durante 5-10 s.
- Repetir centrifugado y lavado con PBS 3x.
Figura 2: Descripción general de la fabricación de microgel mediante fragmentación por extrusión. La figura representa (A) extruyendo hidrogel a granel en un barril de jeringa vacío y agregando PBS, (B) asegurando un émbolo en la jeringa con hidrogel fragmentado, (C) uniendo una aguja de 18 G y extruyendo suspensión de hidrogel fragmentado en un barril de jeringa vacío, y (D) repitiendo pasos de fragmentación de extrusión con agujas de 23 G, 27 G y 30 G, recolección de suspensión de hidrogel fragmentado en tubos de microcentrífuga en extrusión final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Caracterización de microgeles fragmentados usando ImageJ
NOTA: En la Figura 3 se muestra una descripción general de la caracterización de los microgeles fragmentados utilizando ImageJ, así como resultados representativos para describir distribuciones de tamaño y formas dentro de un lote de microgeles fragmentados. Los microgeles deben etiquetarse fluorescentemente antes de la visualización. Por ejemplo, el FITC-dextrano de alto peso molecular (2 MDa) se puede encapsular en el hidrogel a granel antes de la fragmentación para crear microgeles marcados con fluoresceína.
- Combine 20 μL de suspensión de microgel fragmentado con 180 μL de PBS para crear una suspensión de microgel fragmentada diluida. Vórtice para mezclar a fondo.
- Transfiera 50 μL de suspensión de microgel fragmentado diluido a un portaobjetos de microscopio de vidrio.
- Use un microscopio epifluorescente para adquirir imágenes de microgeles marcados fluorescentemente con un zoom de 4x o 10x.
NOTA: La suspensión de microgel debe diluirse lo suficiente como para que los microgeles vecinos no estén en contacto entre sí, pero lo suficientemente concentrados como para que docenas de microgeles sean visibles en la ventanilla. La dilución de la suspensión de microgel se puede ajustar en consecuencia para lograr esto. - Uso de ImageJ para analizar partículas de microgel fragmentadas. Puede encontrar información adicional sobre el uso de la funcionalidad Analizar partículas en ImageJ en el enlace proporcionado en la Tabla de materiales.
- Abra las imágenes de microgeles en suspensión en ImageJ.
- Seleccione Analizar > establecer medidas, comprobar área, descriptores de forma y diámetro de Feret. Haga clic en Aceptar.
- Seleccione Tipo de > de imagen > 8 bits.
- Seleccione Imagen > Ajustar > umbral. Ajuste el umbral de tal manera que los microgeles estén cubiertos por una máscara roja y el fondo permanezca negro. Haga clic en Aplicar.
NOTA: Si hay microgeles ligeramente superpuestos, utilice la herramienta Lápiz para dibujar una línea negra delgada (<5 píxeles) entre microgeles para separarlos en la imagen en blanco y negro. - Seleccione Analizar > Analizar partículas. Establezca el tamaño (píxel2) de 50-Infinity para reducir el ruido de fondo. Establezca circularidad en 0.00-1.00. Seleccione Mostrar contornos en el menú desplegable. Compruebe Mostrar resultados, Excluir en aristas e Incluir taladros. Deje las casillas restantes sin marcar. Haga clic en Aceptar.
- Se abrirá una pantalla de resultados, que incluye el área, los descriptores de forma y la información de diámetro de Feret para cada microgel identificado. Copie y pegue los resultados en una hoja de cálculo.
- Determine el diámetro circular equivalente para cada partícula.
- Obtenga la escala de la imagen en μm/píxel a partir de la barra de escala o de la información del instrumento. Cree una columna en la hoja de cálculo que convierta el área de cada microgel de píxel2 a μm2.
- Use el área en μm2 para determinar el diámetro circular equivalente del microgel en μm (es decir, tome la raíz cuadrada del área dividida por pi, luego duplique).
- Utilice la escala μm/píxel para convertir los diámetros del Feret (es decir, la distancia más larga entre dos puntos cualesquiera en el límite de partículas) para cada microgel a una unidad de μm.
- La circularidad ("Circ."), la relación de aspecto ("AR"), la redondez ("Round") y los valores de solidez para cada microgel se pueden usar directamente desde ImageJ.
- Analizar la población de microgeles según se desee, considerando la distribución de diámetros (circular equivalente y feret), circularidad, relación de aspecto, redondez y solidez.
Figura 3: Descripción general de la caracterización de partículas de microgel fragmentadas utilizando ImageJ. La figura representa (A) creando una suspensión diluida de partículas de microgel fragmentadas y utilizando un microscopio epifluorescente o confocal para obtener imágenes de microgeles en suspensión (barra de escala = 500 μm), (B) convirtiendo a una imagen binaria en ImageJ y analizando partículas (recuento, descriptores de forma, etc.), y (C) resultados representativos. Las barras de error representan min y max con rangos de cuartiles internos demarcados. Se muestra un tamaño de población de n = 100 microgeles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Ensamblaje de microgeles fragmentados en hidrogeles granulares
NOTA: Se presentan dos métodos para la formulación de hidrogeles granulares a partir de microgeles fragmentados, utilizando centrifugación y filtración. El método utilizado dependerá del empaquetamiento de microgel deseado (es decir, la filtración empaqueta las partículas más densamente) y si se incluyen componentes biológicos (es decir, la centrifugación retendrá los componentes entre las partículas, mientras que en la filtración estos pueden perderse). El trabajo previo40 describe a fondo los resultados comparativos (es decir, mecánica, porosidad) para hidrogeles granulares formados a partir de centrífugas o filtración impulsada por vacío.
- Opción 1: Microgeles fragmentados por mermelada mediante centrifugación.
- Después de retirar el sobrenadante de PBS del último paso de lavado, agregue 1 ml de PBS a cada tubo de microcentrífuga y vuelva a suspender los microgeles.
- Gire hacia abajo la suspensión de hidrogel fragmentada a 18.000 x g durante 5 min.
NOTA: Se pueden utilizar velocidades de centrífuga más lentas para la interferencia de microgeles en hidrogeles granulares con un empaquetamiento menos denso si se desea. - Retire el sobrenadante PBS.
- Obtenga una jeringa fresca de 3 ml y retire el émbolo. Use una espátula de metal para sacar el hidrogel granular fragmentado del tubo de la microcentrífuga y transfiéralo a la parte posterior del barril de la jeringa vacío. Se puede usar una punta de pipeta para ayudar a transferir el hidrogel granular a la jeringa. Devuelva el émbolo a la jeringa. Ahora cargue el hidrogel granular fragmentado en la jeringa y estará listo para su uso.
- Opción 2: Jam microgeles fragmentados mediante filtración impulsada por vacío. En la Figura 4 se muestra una visión general de la interferencia por filtración impulsada por vacío.
- Montar y probar el aparato de filtración accionado por vacío.
- Asegure un embudo Buchner dentro de un matraz de filtro, colocando el adaptador de filtro entre el embudo y la abertura del matraz.
- Utilice tubos para conectar el matraz del filtro a una línea de vacío.
- Coloque un filtro de membrana (0,22 μm) en la copa del embudo de Buchner.
- Encienda la línea de vacío abriendo la válvula del dial. Pruebe la conexión canalizando ~ 0.5 ml de PBS en el filtro de membrana y observe que todo el PBS pasa a través del filtro y se acumula en la parte inferior del matraz del filtro.
- Encienda la línea de vacío y asegúrese de un sellado completo. Vórtice la suspensión de hidrogel fragmentado para que los microgeles queden suspendidos en PBS.
- Utilizando una pipeta de 1.000 μL, transfiera la suspensión de hidrogel fragmentado al filtro de membrana (0,22 μm). Después de transferir toda la suspensión de microgel, espere ~ 30 s para que el vacío saque PBS de la suspensión de hidrogel fragmentada. Apague la línea de vacío.
NOTA: El tiempo que la suspensión de hidrogel fragmentado permanece en el filtro de membrana mientras tira del vacío puede variar. Consulte Discusión para obtener más información y sugerencias de solución de problemas. - Obtenga una jeringa fresca de 3 ml y retire el émbolo. Use una espátula de metal para extraer el hidrogel granular fragmentado del filtro y transfiéralo a la parte posterior del barril de la jeringa vacío. Se puede usar una punta de pipeta para ayudar a transferir el hidrogel granular a la jeringa. Devuelva el émbolo a la jeringa. Cargue el hidrogel granular fragmentado en la jeringa y ahora está listo para su uso.
- Montar y probar el aparato de filtración accionado por vacío.
Figura 4: Descripción general de la interferencia de microgeles por filtración impulsada por vacío para fabricar hidrogeles granulares fragmentados bien empaquetados. La figura representa (A) colocando un filtro de membrana en el aparato de filtración al vacío, (B) usando una pipeta para transferir la suspensión de microgel fragmentada al filtro, (C) tirando del vacío y esperando a que los microgeles se atascen y formen un hidrogel granular, (D) apagando el vacío y eliminando el hidrogel granular fragmentado usando una espátula de metal, y (E) usando una espátula de metal para transferir hidrogel granular a la jeringa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Impresión por extrusión con tintas de hidrogel granular
NOTA: En la Figura 5 se muestra una descripción general del proceso de impresión por extrusión, incluida una impresión representativa de una construcción en forma de estrella que utiliza hidrogeles granulares fragmentados atascados con filtración impulsada por vacío. El flujo de trabajo de impresión consiste en formular una tinta, planificar el diseño de impresión y, a continuación, imprimir la tinta en función del diseño deseado41. Si se desea, las construcciones de hidrogel granular impreso se pueden estabilizar mediante fotoreticulado posterior a la extrusión agregando un exceso de TDT (5 mM) e I2959 (0,05 en peso) a la suspensión de microgel fragmentada antes de la interferencia. Esto dará como resultado enlaces covalentes fotocruzados formados entre los microgeles, lo que conducirá a la estabilización permanente de la construcción de hidrogel granular.
- Formulación de tinta
- Durante el proceso de planificación, tenga en cuenta las propiedades de la tinta que se utilizará. Para caracterizar la tinta, complete el análisis reológico de los hidrogeles fragmentados para ayudar a informar el proceso de diseño de impresión. Los métodos que describen la caracterización reológica de hidrogeles granulares se describen en otra parte y pueden adaptarse para este estudio40.
- A partir del análisis reológico, seleccione una plataforma de impresión y una serie de parámetros de impresión iniciales.
NOTA: Debido a la alta viscosidad general y las propiedades de adelgazamiento por cizallamiento de las tintas de hidrogel granular, normalmente se utilizan impresoras de extrusión a base de tornillo.
- Diseño de impresión
NOTA: El software Repetier Host (en adelante, software de impresión 3D) se utiliza para aplicaciones de impresión 3D (pasos 5.2-5.3).- Cree los diseños de impresión a través de un software de diseño asistido por computadora (CAD). Los usuarios pueden crear diseños novedosos desde cero o modificar diseños preexistentes, como los escáneres de tejido del paciente o de otros usuarios. Para obtener más información sobre la creación de diseños CAD, consulte las siguientes referencias 41,42,43.
- Para procesar modelos CAD en G-Code, asegúrese de que el archivo CAD se guarde en formato ".stl" (Archivo suplementario 1) y se cargue en el software de impresión 3D seleccionando el botón de carga en el panel superior o seleccionando Archivo > Cargar en la barra de menús. Este código G define la ruta de impresión para la deposición de la tinta. Se ha incluido un archivo .stl de ejemplo de un cilindro hueco en los archivos suplementarios.
- Una vez que se haya cargado un archivo STL en el software de impresión 3D, navegue hasta el panel Slicer y seleccione Slic3r como la opción de segmentación de datos. Aquí, los ajustes como el diámetro de la boquilla, la altura de la capa, la velocidad de impresión y la velocidad de extrusión se pueden ajustar en función de la caracterización de la tinta y los resultados de impresión deseados. En este protocolo, se utiliza una aguja de 18 G (diámetro interior de 838 μm). La altura de la capa se establece en 1 mm, la velocidad de impresión se establece en 8 mm/s y el caudal se establece en 9 μL/s, según la optimización anterior39. Los valores numéricos de los parámetros pueden ajustarse en ± 20% para tener en cuenta las variaciones en las propiedades de las tintas de hidrogel granular.
NOTA: Es importante tener en cuenta que estos ajustes y el diseño de impresión pueden necesitar ser ajustados a través de pruebas experimentales iterativas, dependiendo de los ajustes a la formulación de tinta, la resolución de impresión deseada o la plataforma de impresión utilizada. Para obtener más información sobre estos parámetros, así como sobre la caracterización de los ajustes de impresión con una formulación de tinta novedosa, consulte otras referencias 40,44,45,46.
- Impresión por extrusión con hidrogeles granulares fragmentados
- Para la carga de jeringas con hidrogeles granulares fragmentados, véase 4.2.4, así como la figura 4 y la figura 5.
- Retire la tapa de la punta y reemplácela con una aguja de su elección.
- Cargue la jeringa en la plataforma de impresión de su elección. Aquí, se utiliza una impresora de extrusión a medida basada en tornillos.
NOTA: Para obtener información sobre la construcción de bioimpresoras personalizadas, consulte otras referencias44,47. - Cargue el archivo G-Code preparado desde la fase de planificación en el software de impresión 3D. Desplácese hasta el panel Vista previa de impresión y pulse Imprimir.
- Tan pronto como se complete la deposición de impresión, exponga las construcciones de hidrogel granular fragmentado a la luz UV para la fotoreticulación y estabilización.
- Una vez que se complete la reticulación, procese la muestra lavándola en PBS tres veces.
Figura 5: Descripción general de la impresión por extrusión con hidrogeles granulares fragmentados. La figura representa (A) usando una espátula para transferir hidrogel granular fragmentado a un barril de jeringa, (B) conectando una aguja de punta roma (se muestra 18 G) y empujando la muestra a la parte superior, (C) un gráfico que representa la conexión al software de computadora para imprimir, y (D) completando la impresión de una construcción en forma de estrella con hidrogel granular fragmentado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los resultados representativos de estos protocolos se muestran en la Figura 3 y la Figura 6. La fragmentación por extrusión produce microgeles con formas de polígonos irregulares con diámetros que oscilan entre 10-300 μm (Figura 3). Además, la circularidad varía de 0.2 (no circular) a casi 1 (círculo perfecto), y la relación de aspecto varía de 1 a 3 (Figura 3). Estos parámetros describen las formas irregulares y dentadas de microgel formadas por el proceso de fragmentación.
Cuando se empaqueta mediante centrifugación o filtración impulsada por vacío, el hidrogel granular ensamblado es de adelgazamiento por cizallamiento y autocuración, como se describe en el trabajo anterior39. Además, el hidrogel granular fragmentado tiene una alta fidelidad de forma e integridad mecánica para un hidrogel inyectable, como lo demuestra la deposición de un cilindro hueco con una altura de 2 cm que se está extrayendo por extrusión en la Figura 6. Los hidrogeles granulares fragmentados fabricados con estos métodos simples y rentables son útiles para muchas aplicaciones biomédicas, incluidas las terapias inyectables y las tintas de impresión 3D.
Figura 6: Resumen del protocolo y resultados representativos. La figura representa (A) fragmentación, (B) microgeles en suspensión, (C) interferencia por filtración impulsada por vacío y (D) hidrogel granular atascado que se extruye a través de una aguja y se imprime en un cilindro hueco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario 1: Ejemplo de archivo .stl Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí, se describen los métodos para fabricar hidrogeles granulares utilizando microgeles fragmentados por extrusión y empaque por centrifugación o filtración impulsada por vacío. En comparación con otros métodos de fabricación de microgel (es decir, microfluídica, emulsiones por lotes, electropulverización, fotolitografía), la fabricación de microgel de fragmentación por extrusión es altamente rápida, de bajo costo, fácilmente escalable y susceptible de una amplia variedad de sistemas de hidrogel. Además, este protocolo es altamente repetible con una variabilidad mínima de lote a lote, que se caracterizó en el trabajo anterior39.
Este protocolo utiliza ácido hialurónico modificado con norborneno (NorHA) para fabricar hidrogeles a granel utilizando una reacción de tiol-ene fotomediada. Los procedimientos detallados para la síntesis de NorHA se describen en otra parte38. Sin embargo, muchas químicas de hidrogel se pueden utilizar para fabricar microgeles fragmentados utilizando los métodos descritos en este documento si se puede formar un hidrogel a granel dentro del barril de una jeringa. También es útil comprender las propiedades mecánicas del hidrogel a granel (por ejemplo, módulo de compresión). Los hidrogeles a granel utilizados en este protocolo tienen un módulo de compresión a granel de aproximadamente 30 kPa39. Un hidrogel a granel con un módulo de compresión más alto requerirá más fuerza para extruir durante los pasos de fragmentación, lo que podría conducir a una mayor obstrucción o sobrepresurización de las jeringas; por lo tanto, se recomienda utilizar hidrogeles con módulos compresivos inferiores a 80 kPa. Además, un hidrogel a granel con módulos compresivos inferiores a 10 kPa puede deformarse durante los pasos de fragmentación, lo que dificulta su fragmentación.
Este protocolo está optimizado para una lámpara de curado de puntos UV. Como alternativa a la fuente de luz UV y a los fotoiniciadores con respuesta a los rayos UV, las fuentes de luz visible también se pueden utilizar junto con los fotoiniciadores sensibles a la luz visible, como el fenil-2,4,6-trimetilbenzoil-fosfinato (LAP) soluble en agua. La concentración del iniciador, la intensidad de la luz y el volumen de la muestra influirán en los tiempos de reticulación dependiendo del polímero y el sistema de reticulación que se utilice. Además, muchas fuentes de lámparas se pueden utilizar como una alternativa a los sistemas de curado por puntos.
El paso más crítico en el protocolo es la extrusión en serie a través de medidores de aguja cada vez más pequeños. En este procedimiento, se sugiere utilizar medidores de aguja desde 18 G (838 μm de diámetro interior) hasta 30 G (159 μm de diámetro interior). Agregar PBS al hidrogel a granel fragmentado antes de la extrusión a través de agujas es crucial para reducir significativamente la fuerza necesaria para extruir y fragmentar. No se debe usar fuerza excesiva para extruir el hidrogel, ya que la fuerza excesiva puede provocar una presurización posterior en la jeringa y correr el riesgo de que el hidrogel salga de la jeringa hacia atrás. Las estrategias adicionales para reducir la fuerza requerida para extruir incluyen el uso de más agujas en la serie para reducir el tamaño del fragmento de manera más gradual, así como la adición de PBS adicionales entre los pasos de fragmentación.
Al atascar los microgeles fragmentados utilizando filtración impulsada por vacío, puede haber variabilidad en el proceso. Algunos sistemas de materiales pueden requerir más (o menos) tiempo para eliminar el PBS y atascar completamente los microgeles. Se sugiere registrar el tiempo necesario para los sistemas de materiales individuales para garantizar la repetibilidad en todos los experimentos. El tiempo de atasco también dependerá del grosor y tamaño de la muestra añadida al filtro. Distribuir la muestra uniformemente a través del filtro puede ayudar con la interferencia uniforme.
El método de fabricación de microgel de fragmentación por extrusión se puede adaptar para muchas aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, la terapéutica puede incluirse en la solución precursora de hidrogel y posteriormente encapsularse dentro de microgeles fragmentados para fabricar un hidrogel granular de adelgazamiento por cizallamiento y autocuración para la administración terapéutica localizada. Además, los microgeles fragmentados se pueden secar para permitir el almacenamiento a largo plazo y las prácticas de esterilización directas. Sin embargo, una limitación a la fragmentación de la extrusión es la incorporación de células dentro de microgeles. Debido a las altas tasas de cizallamiento durante la fragmentación de la extrusión, es probable que el método no sea susceptible de encapsulación celular dentro de microgeles, ya que el alto cizallamiento puede conducir a una disminución significativa de la viabilidad celular. Aún así, las células y los esferoides se pueden incorporar fácilmente entre microgeles para el cultivo in vitro y la administración de células in vivo .
Los hidrogeles granulares fragmentados son un biomaterial prometedor para aplicaciones biomédicas. En los últimos años, los hidrogeles granulares hechos de diversos métodos de fragmentación (es decir, mortero y mortero, licuadoras y ralladores de malla) se han utilizado como tintas de impresión 3D cargadas de células48, vehículos de entrega terapéutica29, andamios inyectables de reparación de tejidos30 y plataformas de cultivo de esferoides39. De los métodos de fragmentación reportados anteriormente, el método de fragmentación de extrusión descrito aquí es uno de los métodos más simples y rentables con numerosas ventajas. Compartir los métodos aquí contenidos aumentará la accesibilidad a la fabricación de hidrogel granular y conducirá a avances significativos en el creciente campo de los biomateriales de hidrogel granular, lo que permitirá a más investigadores diseñar soluciones biomédicas innovadoras con hidrogeles granulares fragmentados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation a través del programa UPenn MRSEC (DMR-1720530) y becas de investigación de posgrado (a V.G.M y M.E.P.) y los Institutos Nacionales de Salud (R01AR077362 a J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
