Summary
Dit werk beschrijft eenvoudige, aanpasbare en goedkope methoden om microgels met extrusiefragmentatie te fabriceren, de microgels te verwerken tot injecteerbare granulaire hydrogels en de granulaire hydrogels toe te passen als extrusiedrukinkten voor biomedische toepassingen.
Abstract
Granulaire hydrogels zijn vastgelopen samenstellingen van hydrogelmicrodeeltjes (d.w.z. "microgels"). Op het gebied van biomaterialen hebben granulaire hydrogels veel voordelige eigenschappen, waaronder injecteerbaarheid, porositeit op microschaal en tonijnbaarheid door meerdere microgelpopulaties te mengen. Methoden om microgels te fabriceren zijn vaak afhankelijk van water-in-olie-emulsies (bijv. Microfluïdica, batch-emulsies, elektrospraying) of fotolithografie, die hoge eisen kunnen stellen aan middelen en kosten, en mogelijk niet compatibel zijn met veel hydrogels. Dit werk beschrijft eenvoudige maar zeer effectieve methoden om microgels te fabriceren met behulp van extrusiefragmentatie en om ze te verwerken tot granulaire hydrogels die nuttig zijn voor biomedische toepassingen (bijv. 3D-printinkten). Ten eerste worden bulkhydrogels (met fotocrosslinkbaar hyaluronzuur (HA) als voorbeeld) geëxtrudeerd door een reeks naalden met sequentieel kleinere diameters om gefragmenteerde microgels te vormen. Deze microgelfabricagetechniek is snel, goedkoop en zeer schaalbaar. Methoden om microgels in granulaire hydrogels te jammen door centrifugatie en vacuümgestuurde filtratie worden beschreven, met optionele post-crosslinking voor hydrogelstabilisatie. Ten slotte worden granulaire hydrogels vervaardigd uit gefragmenteerde microgels gedemonstreerd als extrusiedrukinkten. Hoewel de hierin beschreven voorbeelden fotocrosslinkbare HA gebruiken voor 3D-printen, zijn de methoden gemakkelijk aan te passen voor een breed scala aan hydrogeltypen en biomedische toepassingen.
Introduction
Granulaire hydrogels worden vervaardigd door het verpakken van hydrogeldeeltjes (d.w.z. microgels) en zijn een opwindende klasse van biomaterialen met veel voordelige eigenschappen voor biomedische toepassingen 1,2,3. Vanwege hun deeltjesstructuur zijn granulaire hydrogels afschuifverdunnend en zelfherstellend, waardoor ze kunnen worden gebruikt als extrusiedruk (bio)inkten, granulaire ondersteuningen voor ingebed printen en injecteerbare therapieën 4,5,6,7,8,9. Bovendien biedt de lege ruimte tussen microgels een porositeit op microschaal voor celbeweging en moleculaire diffusie 8,10,11. Verder kunnen meerdere microgelpopulaties worden gecombineerd tot één formulering om een verbeterde tonijnbaarheid en materiaalfunctionaliteit mogelijk te maken 8,10,12,13. Deze belangrijke eigenschappen hebben de snelle uitbreiding van de ontwikkeling van granulaire hydrogel in de afgelopen jaren gemotiveerd.
Er is een scala aan methoden beschikbaar om microgels te vormen voor granulaire hydrogelfabricage, elk met zijn eigen voor- en nadelen. Microgels worden bijvoorbeeld vaak gevormd uit water-in-olie-emulsies met behulp van druppelmicrofluïdica 4,11,13,14,15,16,17, batch-emulsies 7,18,19,20,21,22, of elektrospraying 6,23, 24,25. Deze methoden leveren bolvormige microgels op met uniforme (microfluïdica) of polydisperse (batch-emulsies, elektrospraying) diameters. Er zijn enkele beperkingen aan deze water-in-olie emulsie fabricagemethoden, waaronder potentieel lage doorvoerproductie, de behoefte aan hydrogel-precursoroplossingen met een lage viscositeit en de hoge kosten en middelen voor installatie. Bovendien kunnen deze protocollen agressieve oliën en oppervlakteactieve stoffen vereisen die uit de microgels moeten worden gewassen met behulp van procedures die verwerkingsstappen toevoegen, en kunnen ze moeilijk te vertalen zijn naar steriele omstandigheden voor biomedische toepassingen in veel laboratoria. Om de noodzaak van water-in-olie-emulsies weg te nemen, kan ook (foto)lithografie worden gebruikt, waarbij mallen of fotomaskers worden gebruikt om het uitharden van microgels uit hydrogel precursoroplossingen te beheersen 1,26,27. Net als microfluïdica kunnen deze methoden beperkt zijn in hun productiedoorvoer, wat een grote uitdaging is wanneer grote volumes nodig zijn.
Als alternatief voor deze methoden is mechanische fragmentatie van bulkhydrogels gebruikt om microgels te fabriceren met onregelmatige maten 19,28,29,30,31,32. Bulkhydrogels kunnen bijvoorbeeld worden voorgevormd en vervolgens door mazen of zeven worden geleid om gefragmenteerde microgels te vormen, een proces dat zelfs is uitgevoerd in aanwezigheid van cellen in microgelstrengen33,34. Bulkhydrogels zijn ook verwerkt tot microgels met mechanische verstoring met behulp van technieken zoals malen met vijzel en stamper of door het gebruik van commerciële blenders 35,36,37. Anderen hebben ook mechanische agitatie tijdens hydrogelvorming gebruikt om gefragmenteerde microgels (d.w.z. vloeistofgels) te fabriceren31.
De methoden hierin breiden deze mechanische fragmentatietechnieken uit en presenteren een eenvoudige benadering om microgels met extrusiefragmentatie te fabriceren, met behulp van fotocrosslinkable hyaluronzuur (HA) hydrogels als voorbeeld. Extrusiefragmentatie gebruikt alleen spuiten en naalden om gefragmenteerde microgels te fabriceren in een goedkope, hoge doorvoer en gemakkelijk schaalbare methode die geschikt is voor een breed scala aan hydrogels19,32. Verder worden methoden om deze gefragmenteerde microgels in korrelige hydrogels te assembleren beschreven met behulp van centrifugatie (lage verpakking) of vacuümgestuurde filtratie (hoge verpakking). Ten slotte wordt de toepassing van deze gefragmenteerde granulaire hydrogels besproken voor gebruik als extrusiedrukinkt. Het doel van dit protocol is om eenvoudige methoden te introduceren die kunnen worden aangepast aan een breed scala aan hydrogels en kunnen worden geïmplementeerd in vrijwel elk laboratorium dat geïnteresseerd is in granulaire hydrogels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bulkhydrogels in een spuit fabriceren met behulp van photocrosslinking
OPMERKING: Een overzicht van bulk hydrogel fabricage in een spuit met behulp van photocrosslinking is weergegeven in figuur 1. Dit protocol maakt gebruik van norborneen-gemodificeerd hyaluronzuur (NorHA) om bulkhydrogels te fabriceren met behulp van een foto-gemedieerde thiol-ene-reactie. Gedetailleerde procedures voor de synthese van NorHA worden elders beschreven38. Dit protocol is echter zeer aanpasbaar aan elke fotocrosslinkbare hydrogel. Zie Discussie voor meer informatie.
- Bepaal vooraf de gewenste concentraties polymeer, crosslinker en initiators voor de bulkhydrogelformulering. In dit protocol bestaat de hydrogel precursoroplossing uit NorHA (2 wt.%, ~25% mate van norborneenmodificatie), dithiothreitol (DTT, 6 mM) en Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 wt.%). Zorg ervoor dat de componenten (1 ml) volledig zijn opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een microcentrifugebuis.
OPMERKING: Bij het bereiden van de hydrogel-precursoroplossing kan FITC-dextran met een hoog molecuulgewicht (2 MDa, 0,1 wt.%) aan de oplossing worden toegevoegd om microgels te visualiseren die later in het protocol zijn vervaardigd met behulp van fluorescerende microscopie. - Laad een spuit van 3 ml met de hydrogel-precursoroplossing.
- Verwijder de zuiger van de achterkant van een lege spuit van 3 ml en voeg een tipdop toe aan de bovenkant van de spuitcilinder.
- Gebruik een pipet van 1.000 μL om de hydrogelprecursoroplossing met de dop van de tip in het spuitvat over te brengen.
- Houd het spuitvat met hydrogelprecursoroplossing in één hand, met de tipdop naar beneden gericht en het open uiteinde van de loop naar boven gericht. Breng met de andere hand de zuiger van de spuit terug naar de opening van de achterkant van de spuitcilinder. Duw de zuiger van de spuit voorzichtig in de loop, net genoeg om de opening aan de achterkant van het spuitvat af te sluiten.
- Houd de zuiger en het spuitvat voorzichtig bij elkaar om ervoor te zorgen dat de achterkant van het spuitvat is afgesloten met de zuiger, keer de spuit zodanig om dat de zuiger naar beneden is gericht en de dop nu naar boven is gericht. Verwijder de dop van de tip en duw de zuiger voorzichtig in het vat van de spuit totdat alle lucht uit de spuit is verwijderd (alleen hydrogel precursor oplossing blijft over).
- Bevestig de dop opnieuw aan de spuit. Zorg ervoor dat de hydrogelprecursoroplossing is bevestigd in de spuit van 3 ml met een tipdop.
- Vorm een bulk hydrogel in de spuit van 3 ml.
- Zorg ervoor dat de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) en voorzorgsmaatregelen worden genomen voordat de UV-lamp wordt ingeschakeld. Dit omvat het dragen van een UV-beschermende bril en het omsluiten van het lampgebied om anderen te beschermen tegen UV-licht.
- Kalibreer de UV-spothardingslamp met een lichtintensiteit van 10 mW/cm2 met behulp van een radiometer.
OPMERKING: Er zal lichte demping door de spuitloop zijn. Bepaal voorafgaand aan de fabricage het aanwezige percentage lichtdemping met behulp van een radiometer. De lichtintensiteit van het spothardingssysteem moet dienovereenkomstig worden aangepast om rekening te houden met een dergelijke demping. - Plaats de spuit van 3 ml geladen met de hydrogel-precursoroplossing onder de UV-spothardingslamp gedurende een gewenste tijd om volledig photocrosslink te maken. Voor het hierin beschreven systeem wordt norha hydrogel precursor oplossing blootgesteld aan UV-licht gedurende 5 minuten met een intensiteit van 10 mW/cm2, wat, op basis van eerdere studies39, voldoende tijd en lichtintensiteit was om volledige crosslinking te garanderen zoals bepaald door fotocrosslinking oscillerende shear reologie tijd sweeps.
OPMERKING: Om volledige photocrosslinking in de spuit te garanderen, kan de spuit halverwege de fotocrosslinkingperiode worden omgedraaid. - Doe de UV-lamp uit en verwijder de spuit. Zorg ervoor dat de hydrogel nu fotocrosslinked is in de spuit. Dit kan worden gedaan door de zuiger terug te trekken en de hydrogelbeweging te observeren als een vast blok in plaats van een stroperige vloeistof.
Figuur 1: Overzicht van het vervaardigen van bulkhydrogels in een spuit met behulp van photocrosslinking. De figuur toont (A) het verwijderen van de zuiger uit de spuit, (B) het vastzetten van de dop aan het spuitvat, (C) het toevoegen van hydrogelprecursoren aan het spuitvat, (D) het terugbrengen van de zuiger naar de spuit, (E) het verwijderen van overtollige lucht en het vastzetten van de tipdop, en (F) het fotocrosslinken van bulkhydrogel in de spuit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Microgels fabriceren met behulp van extrusiefragmentatie
OPMERKING: Een overzicht van microgelfabricage met behulp van extrusiefragmentatie is weergegeven in figuur 2.
- Verwijder de zuiger van de achterkant van een lege spuit van 3 ml. Bevestig een tipdop aan de Luer-Lock.
- Verwijder de dop van de spuit met de fotocrosslinked bulkhydrogel. Lijn de bovenkant van de hydrogelspuit uit met de opening van het vat op de lege spuit.
- Extrudeer de bulkhydrogel door de opening van de spuit (geen naald bevestigd) in de loop van de lege spuit. Gooi de spuit die nu leeg is (waar voorheen de hydrogel in zat) op de juiste manier weg in de juiste afvalstroom.
- Houd de spuit met de geëxtrudeerde hydrogel zo vast dat de dop naar beneden is gericht en de opening van de loop naar boven is gericht. Gebruik een pipet van 1.000 μL en voeg 1,5 ml PBS toe aan het spuitvat.
- Lijn de zuiger van de spuit uit met de opening van de loop en duw de zuiger nauwelijks genoeg naar binnen om een afdichting te creëren. Keer de spuit zodanig om dat de zuiger nu naar beneden is gericht en de tipdop naar boven is gericht, zorg ervoor dat de zuiger en de spuitcilinder bij elkaar op hun plaats worden gehouden, zodat er geen hydrogel of PBS uitlekt. Keer meerdere keren om om de gefragmenteerde hydrogel te mengen met de PBS toegevoegd.
- Houd de spuit zo vast dat de dop naar boven is gericht en de zuiger naar beneden. Verwijder de tipdop. Duw de zuiger heel voorzichtig omhoog om eventuele lucht uit de binnenkant van de spuit te verwijderen.
OPMERKING: Er zal waarschijnlijk een groef in de achterkant van de 3 ml spuit zitten die extra kracht nodig heeft om de zuiger naar binnen te duwen. Duw de zuiger heel voorzichtig over de groef. Elke plotselinge of harde hoeveelheid kracht zal ervoor zorgen dat de zuiger te snel beweegt en mogelijk de gefragmenteerde hydrogelsuspensie verdrijft. - Extrudeer de gefragmenteerde hydrogelsuspensie door een reeks naalden om gefragmenteerde microgels te creëren.
- Bevestig een naald van 18 G met stompe punt aan de bovenkant van de spuit met de gefragmenteerde hydrogel en PBS. Haal de zuiger uit een verse spuit van 3 ml en bevestig een dop aan de lege spuitcilinder.
- Extrudeer de gefragmenteerde hydrogelsuspensie door de naald van 18 G in de achterkant van de lege spuitloop. Gooi de lege spuit en naald weg in de juiste afvalstroom van scherpe punten.
- Houd de spuit met de gefragmenteerde hydrogelsuspensie zo vast dat de tipdop naar beneden is gericht en de opening van de loop naar boven is gericht. Lijn de zuiger van de spuit uit met de opening van de loop en duw de zuiger nauwelijks genoeg naar binnen om een afdichting te creëren.
- Keer de spuit zodanig om dat de zuiger nu naar beneden is gericht en de dop naar boven is gericht, zorg ervoor dat de zuiger en de spuitloop bij elkaar worden gehouden, zodat er geen hydrogel of PBS uitlekt.
- Houd de spuit zo vast dat de dop naar boven is gericht en de zuiger naar beneden. Verwijder de tipdop. Duw de zuiger heel voorzichtig omhoog om eventuele lucht uit de binnenkant van de spuit te verwijderen. Zie de OPMERKING hierboven met betrekking tot het voorzichtig naar binnen duwen van de zuiger van de spuit om ongewenste uitdrijving van hydrogelmateriaal te voorkomen.
- Herhaal stap 2.7.1-2.7.5 met een naald van 23 G, 27 G en 30 G. Extrudeer bij de laatste extrusiestap (naald van 30 G) de gefragmenteerde hydrogelsuspensie in microcentrifugebuizen. Voor de hierin beschreven volumes zal het uiteindelijke gefragmenteerde hydrogel-suspensievolume ~ 2,5 ml zijn, waarvoor twee microcentrifugebuizen van 1,5 ml nodig zijn (volume gelijk verdeeld).
OPMERKING: Er mag geen overmatige kracht nodig zijn om gefragmenteerde hydrogelsuspensie door de naalden te extruderen. Voor de beste veiligheidspraktijken wordt aanbevolen om alle extrusiefragmentatiestappen in een chemische kap uit te voeren om bescherming te bieden in het geval van overdruk van de spuit tijdens extrusie. Bovendien kan dit proces eenvoudig worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast / laminaire stromingskap om de steriliteit tijdens de fabricage te behouden. Zie Discussie voor aanvullende suggesties voor probleemoplossing.
- Was en isoleer de gefragmenteerde hydrogel suspensie.
OPMERKING: Het wassen van gefragmenteerde microgels zal helpen om niet-gereageerd polymeer en crosslinker te verwijderen. Bovendien zal centrifuging helpen om de microgels van de suspensie te isoleren door een pellet te vormen.- Draai met behulp van een microcentrifuge de gefragmenteerde microgelsuspensie op 5.000 x g gedurende 5 minuten.
- Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen. Voeg 1 ml PBS toe aan elke microcentrifugebuis met gefragmenteerde microgels en vortex gedurende 5-10 s.
- Herhaal centrifugeren en wassen met PBS 3x.
Figuur 2: Overzicht van microgelfabricage met behulp van extrusiefragmentatie. De figuur toont (A) het extruderen van bulkhydrogel in een lege spuitvat en het toevoegen van PBS, (B) het vastzetten van een zuiger in de spuit met gefragmenteerde hydrogel, (C) het bevestigen van een naald van 18 G en het extruderen van gefragmenteerde hydrogelsuspensie in een lege spuitvat, en (D) het herhalen van extrusiefragmentatiestappen met naalden van 23 G, 27 G en 30 G, het verzamelen van gefragmenteerde hydrogelsuspensie in microcentrifugebuizen bij de uiteindelijke extrusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Gefragmenteerde microgels karakteriseren met ImageJ
OPMERKING: Een overzicht van het karakteriseren van de gefragmenteerde microgels met behulp van ImageJ wordt weergegeven in Figuur 3, evenals representatieve resultaten voor het beschrijven van grootteverdelingen en vormen binnen een partij gefragmenteerde microgels. Microgels moeten fluorescerend worden geëtiketteerd voorafgaand aan visualisatie. Fitc-dextran (2 MDa) met een hoog molecuulgewicht kan bijvoorbeeld worden ingekapseld in de bulkhydrogel voorafgaand aan fragmentatie om microgels met fluoresceïne-label te maken.
- Combineer 20 μL gefragmenteerde microgelsuspensie met 180 μL PBS om een verdunde gefragmenteerde microgelsuspensie te creëren. Vortex om grondig te mengen.
- Breng 50 μL verdunde gefragmenteerde microgelsuspensie over naar een glazen microscoopglaasje.
- Gebruik een epifluorescente microscoop om beelden te maken van fluorescerend gelabelde microgels met 4x of 10x zoom.
OPMERKING: De microgelsuspensie moet voldoende verdund zijn zodat naburige microgels niet met elkaar in contact komen, maar toch voldoende geconcentreerd zijn zodat tientallen microgels zichtbaar zijn in de viewport. De verdunning van microgelsuspensie kan dienovereenkomstig worden aangepast om dit te bereiken. - ImageJ gebruiken om gefragmenteerde microgeldeeltjes te analyseren. Aanvullende informatie over het gebruik van de Analyze Particles-functionaliteit in ImageJ is te vinden in de link in de tabel met materialen.
- Open de afbeeldingen van microgels in suspensie in ImageJ.
- Selecteer Analyseren > Metingen instellen, Gebied controleren, Vormbeschrijvingen en Feret's Diameter. Klik op OK.
- Selecteer Afbeelding > Typ > 8-bits.
- Selecteer Afbeelding > > drempel aanpassen. Pas de drempel zo aan dat microgels worden bedekt door een rood masker en de achtergrond zwart blijft. Klik op Toepassen.
OPMERKING: Als microgels enigszins overlappen, gebruikt u het potloodgereedschap om een dunne (<5 pixels) zwarte lijn tussen microgels te tekenen om ze in de zwart-witafbeelding te scheiden. - Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren. Stel Grootte (pixel2) in op 50-Oneindig om achtergrondgeluid te verminderen. Stel Circulariteit in op 0,00-1,00. Selecteer Contouren weergeven in het vervolgkeuzemenu. Controleer weergaveresultaten, Uitsluiten op randen en Gaten opnemen. Laat de overige vakjes uitgeschakeld. Klik op OK.
- Er wordt een resultatenweergave geopend, inclusief het gebied, de vormbeschrijvingen en de diameterinformatie van Feret voor elke geïdentificeerde microgel. Kopieer en plak de resultaten in een spreadsheet.
- Bepaal de equivalente cirkeldiameter voor elk deeltje.
- Verkrijg de beeldschaal in μm/pixel uit de schaalbalk of de instrumentinformatie. Maak een kolom in de spreadsheet die het gebied van elke microgel converteert van pixel2 naar μm2.
- Gebruik het gebied in μm2 om de equivalente cirkelvormige diameter van de microgel in μm te bepalen (d.w.z. neem de vierkantswortel van het gebied gedeeld door pi en verdubbel het vervolgens).
- Gebruik de μm/pixelschaal om de diameters van de Feret (d.w.z. de langste afstand tussen twee punten op de deeltjesgrens) voor elke microgel om te zetten in een eenheid van μm.
- Circulariteit ("Circ."), beeldverhouding ("AR"), rondheid ("Rond") en soliditeitswaarden voor elke microgel kunnen worden gebruikt zoals rechtstreeks van ImageJ.
- Analyseer de microgelpopulatie naar wens, rekening houdend met de verdeling van diameters (equivalent circulair en Feret's), circulariteit, beeldverhouding, rondheid en stevigheid.
Figuur 3: Overzicht van het karakteriseren van gefragmenteerde microgeldeeltjes met behulp van ImageJ. De figuur toont (A) het creëren van een verdunde suspensie van gefragmenteerde microgeldeeltjes en het gebruik van een epifluorescente of confocale microscoop om microgels in suspensie in beeld te brengen (schaalbalk = 500 μm), (B) converteren naar een binair beeld in ImageJ en deeltjes analyseren (aantal, vormbeschrijvingen, enz.), En (C) representatieve resultaten. Foutbalken geven min en max weer met afgebakende binnenkwartielbereiken. Een populatiegrootte van n = 100 microgels wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Gefragmenteerde microgels assembleren tot granulaire hydrogels
OPMERKING: Twee methoden voor de formulering van granulaire hydrogels uit gefragmenteerde microgels worden gepresenteerd, met behulp van centrifugatie en filtratie. De gebruikte methode is afhankelijk van de gewenste microgelverpakking (d.w.z. filtratie verpakt deeltjes dichter) en of biologische componenten zijn opgenomen (d.w.z. centrifugatie behoudt componenten tussen deeltjes, terwijl deze bij filtratie verloren kunnen gaan). Eerder werk40 beschrijft grondig vergelijkende uitkomsten (d.w.z. mechanica, porositeit) voor granulaire hydrogels gevormd uit centrifuge of vacuümaangedreven filtratie.
- Optie 1: Jam gefragmenteerde microgels met behulp van centrifugatie.
- Nadat u pbs-supernatant uit de laatste wasstap hebt verwijderd, voegt u 1 ml PBS toe aan elke microcentrifugebuis en resuspendeert u de microgels.
- Draai de gefragmenteerde hydrogelsuspensie op 18.000 x g gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Lagere centrifugesnelheden kunnen worden gebruikt voor het vastlopen van microgels in korrelige hydrogels met een minder dichte verpakking indien gewenst. - Verwijder het PBS-supernatant.
- Verkrijg een verse spuit van 3 ml en verwijder de zuiger. Gebruik een metalen spatel om de gefragmenteerde korrelige hydrogel uit de microcentrifugebuis te scheppen en breng deze over in de achterkant van de lege spuitloop. Een pipetpunt kan worden gebruikt om te helpen bij het overbrengen van de korrelige hydrogel in de spuit. Breng de zuiger terug naar de spuit. Laad nu de gefragmenteerde korrelige hydrogel in de spuit en deze is klaar voor gebruik.
- Optie 2: Jam gefragmenteerde microgels met behulp van vacuümgestuurde filtratie. Een overzicht van jamming door vacuümaangedreven filtratie is weergegeven in figuur 4.
- Monteer en test het vacuümaangedreven filtratieapparaat.
- Bevestig een Buchner-trechter in een filterkolf en plaats de filteradapter tussen de trechter en de kolfopening.
- Gebruik slangen om de filterkolf aan te sluiten op een vacuümleiding.
- Plaats een membraanfilter (0,22 μm) in de Buchner trechterbeker.
- Schakel de vacuümleiding in door de kiezerklep te openen. Test de verbinding door ~ 0,5 ml PBS op het membraanfilter te pipetteren en merk op dat alle PBS door het filter gaat en zich verzamelt in de bodem van de filterkolf.
- Zet de vacuümleiding aan en zorg voor een volledige afdichting. Vortex de gefragmenteerde hydrogel suspensie zodat microgels worden gesuspendeerd in PBS.
- Breng met een pipet van 1.000 μL de gefragmenteerde hydrogelsuspensie over op het membraanfilter (0,22 μm). Nadat u de volledige microgel-suspensie hebt overgebracht, wacht u ~ 30 s totdat het vacuüm PBS uit de gefragmenteerde hydrogelsuspensie trekt. Schakel de vacuümleiding uit.
OPMERKING: De tijd dat de gefragmenteerde hydrogelsuspensie op het membraanfilter zit tijdens het trekken van vacuüm kan worden gevarieerd. Zie Discussie voor meer informatie en suggesties voor probleemoplossing. - Verkrijg een verse spuit van 3 ml en verwijder de zuiger. Gebruik een metalen spatel om de gefragmenteerde korrelige hydrogel uit het filter te scheppen en breng deze over in de achterkant van de lege spuitloop. Een pipetpunt kan worden gebruikt om te helpen bij het overbrengen van de korrelige hydrogel in de spuit. Breng de zuiger terug naar de spuit. Laad de gefragmenteerde korrelige hydrogel in de spuit en deze is nu klaar voor gebruik.
- Monteer en test het vacuümaangedreven filtratieapparaat.
Figuur 4: Overzicht van jamming microgels door vacuüm aangedreven filtratie om dicht opeengepakte gefragmenteerde granulaire hydrogels te fabriceren. De figuur toont (A) het plaatsen van een membraanfilter op het vacuümfiltratieapparaat, (B) het gebruik van een pipet om gefragmenteerde microgelsuspensie op het filter over te brengen, (C) het trekken van het vacuüm en wachten tot microgels vastlopen en een korrelige hydrogel vormen, (D) het uitschakelen van het vacuüm en het verwijderen van gefragmenteerde korrelige hydrogel met behulp van een metalen spatel, en (E) het gebruik van een metalen spatel om granulaire hydrogel naar de spuit over te brengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Extrusiedruk met korrelige hydrogelinkten
OPMERKING: Een overzicht van het extrusiedrukproces wordt weergegeven in figuur 5, inclusief een representatieve afdruk van een stervormig construct met behulp van gefragmenteerde granulaire hydrogels die vastzitten met vacuümaangedreven filtratie. De afdrukworkflow bestaat uit het formuleren van een inkt, het plannen van het afdrukontwerp en vervolgens het afdrukken van de inkt op basis van het gewenste ontwerp41. Indien gewenst kunnen geprinte korrelige hydrogelconstructies worden gestabiliseerd met behulp van fotocrosslinking na extrusie door overtollige DTT (5 mM) en I2959 (0,05 wt.%) toe te voegen aan de gefragmenteerde microgel-suspensie voorafgaand aan het vastlopen. Dit zal resulteren in fotocrosslinked covalente bindingen gevormd tussen de microgels, wat leidt tot permanente stabilisatie van het granulaire hydrogelconstruct.
- Inktformulering
- Houd tijdens het planningsproces rekening met de eigenschappen van de te gebruiken inkt. Om de inkt te karakteriseren, voltooit u de reologische analyse van de gefragmenteerde hydrogels om het printontwerpproces te helpen informeren. Methoden die de reologische karakterisering van granulaire hydrogels beschrijven, worden elders beschreven en kunnen voor dit onderzoek worden aangepast40.
- Selecteer uit de reologische analyse een afdrukplatform en een reeks initiële afdrukparameters.
OPMERKING: Vanwege de algehele hoge viscositeit en afschuifverdunnende eigenschappen van granulaire hydrogelinkten, worden meestal op schroef gebaseerde extrusieprinters gebruikt.
- Printontwerp
OPMERKING: Repetier Host-software (voortaan 3D-afdruksoftware genoemd) wordt gebruikt voor 3D-afdruktoepassingen (stappen 5.2-5.3).- Maak de afdrukontwerpen via CAD-software (Computer-Aided Design). Gebruikers kunnen nieuwe ontwerpen helemaal opnieuw maken of reeds bestaande ontwerpen wijzigen, zoals van weefselscans van patiënten of van andere gebruikers. Voor meer informatie over het maken van CAD-ontwerpen verwijzen wij u naar de volgende referenties 41,42,43.
- Als u CAD-modellen in G-Code wilt verwerken, moet u ervoor zorgen dat het CAD-bestand wordt opgeslagen in de ".stl"-indeling (Aanvullend bestand 1) en wordt geüpload naar de 3D-afdruksoftware door de knop Laden in het bovenpaneel te selecteren of Bestand > laden in de menubalk te selecteren. Deze G-code definieert het afdrukpad voor de afzetting van de inkt. Een voorbeeld van een .stl-bestand van een holle cilinder is opgenomen in de aanvullende bestanden.
- Zodra een STL-bestand is geüpload naar de 3D-afdruksoftware, navigeert u naar het deelvenster Slicer en selecteert u Slic3r als sliceroptie. Hier kunnen instellingen zoals nozzlediameter, laaghoogte, afdruksnelheid en extrusiesnelheid worden aangepast op basis van inktkarakterisering en gewenste afdrukresultaten. In dit protocol wordt een naald van 18 G (binnendiameter van 838 μm) gebruikt. De laaghoogte is ingesteld op 1 mm, de afdruksnelheid is ingesteld op 8 mm/s en het debiet is ingesteld op 9 μL/s, op basis van eerdere optimalisatie39. Numerieke waarden van parameters kunnen met ± 20% worden aangepast om rekening te houden met variaties in de eigenschappen van granulaire hydrogelinkten.
OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat deze instellingen en het afdrukontwerp mogelijk moeten worden aangepast door middel van iteratieve experimentele tests, afhankelijk van aanpassingen aan de inktformulering, de gewenste afdrukresolutie of het gebruikte afdrukplatform. Voor meer informatie over deze parameters, evenals over de karakterisering van afdrukinstellingen met een nieuwe inktformulering, verwijzen wij u naar andere referenties 40,44,45,46.
- Extrusiedruk met gefragmenteerde granulaire hydrogels
- Voor het laden van spuiten met gefragmenteerde korrelige hydrogels, zie 4.2.4, alsmede figuur 4 en figuur 5.
- Verwijder de dop en vervang deze door een naald naar keuze.
- Plaats de spuit in het afdrukplatform van uw keuze. Hier wordt een op maat gemaakte extrusieprinter op basis van schroef gebruikt.
OPMERKING: Voor informatie over het bouwen van bioprinters op maat, zie andere referenties44,47. - Laad het voorbereide G-Code-bestand uit de planningsfase in de 3D-afdruksoftware. Navigeer naar het deelvenster Afdrukvoorbeeld en druk op Afdrukken.
- Zodra de afdrukafzetting is voltooid, stelt u de gefragmenteerde korrelige hydrogelconstructies bloot aan UV-licht voor fotocrosslinking en stabilisatie.
- Zodra het crosslinken is voltooid, verwerkt u het monster door het drie keer in PBS te wassen.
Figuur 5: Overzicht van extrusiedruk met gefragmenteerde granulaire hydrogels. De figuur toont (A) het gebruik van een spatel om gefragmenteerde korrelige hydrogel over te brengen naar een spuitvat, (B) het bevestigen van een stompe naald (18 G weergegeven) en het naar boven duwen van het monster, (C) een afbeelding die de verbinding met computersoftware voor afdrukken weergeeft, en (D) het voltooien van het afdrukken van een stervormige constructie met gefragmenteerde korrelige hydrogel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten van deze protocollen zijn weergegeven in figuur 3 en figuur 6. Extrusiefragmentatie levert microgels op met gekartelde, veelhoekige vormen met diameters variërend van 10-300 μm (figuur 3). Verder varieert circulariteit van 0,2 (niet cirkelvormig) tot bijna 1 (perfecte cirkel) en de beeldverhouding varieert van 1-3 (figuur 3). Deze parameters beschrijven de onregelmatige en gekartelde microgelvormen gevormd door het fragmentatieproces.
Wanneer de geassembleerde korrelige hydrogel samengepakt is met behulp van centrifugatie of vacuümaangedreven filtratie, is het afschuifverdunnend en zelfherstellend, zoals beschreven in het vorige werk39. Bovendien heeft de gefragmenteerde korrelige hydrogel een hoge vormgetrouwheid en mechanische integriteit voor een injecteerbare hydrogel, zoals blijkt uit de afzetting van een holle cilinder met een hoogte van 2 cm die in figuur 6 wordt afgedrukt. Gefragmenteerde granulaire hydrogels vervaardigd met deze eenvoudige en kosteneffectieve methoden zijn nuttig voor vele biomedische toepassingen, waaronder injecteerbare therapieën en 3D-printinkten.
Figuur 6: Protocoloverzicht en representatieve resultaten. De figuur toont (A) fragmentatie, (B) microgels in suspensie, (C) jamming door vacuümaangedreven filtratie en (D) vastgelopen korrelige hydrogel die door een naald wordt geëxtrudeerd en in een holle cilinder wordt afgedrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Voorbeeld .stl-bestand Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin worden methoden beschreven om granulaire hydrogels te fabriceren met behulp van extrusie gefragmenteerde microgels en verpakking door centrifugatie of vacuümgestuurde filtratie. In vergelijking met andere microgelfabricagemethoden (d.w.z. microfluïdica, batch-emulsies, elektrospraying, fotolithografie), is de fabricage van extrusiefragmentatiemicrogel zeer snel, goedkoop, gemakkelijk schaalbaar en vatbaar voor een breed scala aan hydrogelsystemen. Verder is dit protocol zeer herhaalbaar met minimale batch-to-batch variabiliteit, wat werd gekenmerkt in het vorige werk39.
Dit protocol maakt gebruik van norborneen-gemodificeerd hyaluronzuur (NorHA) om bulkhydrogels te fabriceren met behulp van een foto-gemedieerde thiol-ene-reactie. Gedetailleerde procedures voor de synthese van NorHA worden elders beschreven38. Veel hydrogelchemie kan echter worden gebruikt om gefragmenteerde microgels te fabriceren met behulp van de hierin beschreven methoden als een bulkhydrogel kan worden gevormd in het vat van een spuit. Het is ook nuttig om de mechanische eigenschappen van bulkhydrogel (bijv. Compressive modulus) te begrijpen. De bulkhydrogels die in dit protocol worden gebruikt, hebben een bulkcompressiemodulus van ongeveer 30 kPa39. Een bulkhydrogel met een hogere drukmodulus vereist meer kracht om te extruderen tijdens de fragmentatiestappen, wat kan leiden tot verhoogde verstopping of overdruk van de spuiten; daarom wordt aanbevolen om hydrogels te gebruiken met drukmodulatie van minder dan 80 kPa. Verder kan een bulkhydrogel met drukmodulus lager dan 10 kPa vervormen tijdens de fragmentatiestappen, waardoor het een uitdaging wordt om te fragmenteren.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor een UV spot cure lamp. Als alternatief voor de UV-lichtbron en UV-responsieve foto-initiators kunnen zichtbare lichtbronnen ook worden gebruikt samen met zichtbaar licht-responsieve foto-initiators, zoals in water oplosbare lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoyl-fosfinaat (LAP). Initiatorconcentratie, lichtintensiteit en monstervolume beïnvloeden de crosslinkingtijden, afhankelijk van het polymeer en het crosslinkingsysteem dat wordt gebruikt. Verder kunnen veel lampbronnen worden gebruikt als alternatief voor spothardingssystemen.
De meest kritische stap in het protocol is de seriële extrusie door steeds kleinere naaldmeters. In deze procedure wordt voorgesteld om naaldmeters te gebruiken van 18 G (838 μm binnendiameter) tot 30 G (159 μm binnendiameter). Het toevoegen van PBS aan de gefragmenteerde bulkhydrogel voorafgaand aan het extruderen door naalden is cruciaal om de kracht die nodig is om te extruderen en te fragmenteren aanzienlijk te verminderen. Er mag geen overmatige kracht worden gebruikt om de hydrogel te extruderen, omdat overmatige kracht kan leiden tot rugdruk in de spuit en het risico loopt dat de hydrogel uit de achterkant van de spuit barst. Aanvullende strategieën om de kracht die nodig is om te extruderen te verminderen, omvatten het gebruik van meer naalden in de serie om de fragmentgrootte geleidelijker te verminderen, evenals het toevoegen van extra PBS tussen fragmenterende stappen.
Bij het vastzetten van de gefragmenteerde microgels met behulp van vacuümgestuurde filtratie, kan er variabiliteit in het proces zijn. Sommige materiaalsystemen kunnen meer (of minder) tijd nodig hebben om PBS te verwijderen en de microgels volledig te blokkeren. Er wordt voorgesteld om de tijd vast te leggen die nodig is voor individuele materiaalsystemen om herhaalbaarheid in experimenten te garanderen. De tijd om te jammen is ook afhankelijk van de dikte en grootte van het monster dat aan het filter wordt toegevoegd. Het gelijkmatig verspreiden van het monster over het filter kan helpen bij uniforme jamming.
De extrusiefragmentatie microgel fabricagemethode kan worden aangepast voor vele biomedische toepassingen. Therapeutica kunnen bijvoorbeeld worden opgenomen in de hydrogel-precursoroplossing en vervolgens worden ingekapseld in gefragmenteerde microgels om een afschuifverdunnende, zelfherstellende granulaire hydrogel te fabriceren voor gelokaliseerde therapeutische toediening. Bovendien kunnen gefragmenteerde microgels worden gedroogd om langdurige opslag en eenvoudige sterilisatiepraktijken mogelijk te maken. Een beperking van de extrusiefragmentatie is echter de opname van cellen in microgels. Vanwege de hoge afschuifsnelheden tijdens extrusiefragmentatie, is de methode waarschijnlijk niet vatbaar voor celinkapseling in microgels, omdat de hoge afschuif kan leiden tot een aanzienlijk verminderde levensvatbaarheid van de cel. Toch kunnen cellen en sferoïden gemakkelijk worden opgenomen tussen microgels voor in vitro kweek en in vivo celafgifte.
Gefragmenteerde granulaire hydrogels zijn een veelbelovend biomateriaal voor biomedische toepassingen. In de afgelopen jaren zijn granulaire hydrogels gemaakt van verschillende fragmentatiemethoden (d.w.z. mortel en stamper, blenders en gaasraspen) gebruikt als celbeladen 3D-printinkten48, therapeutische leveringsvoertuigen29, injecteerbare weefselreparatiesteigers30 en sferoïde-kweekplatforms39. Van de eerder gerapporteerde fragmentatiemethoden is de hierin beschreven extrusiefragmentatiemethode een van de meest eenvoudige en kosteneffectieve methoden met tal van voordelen. Het delen van de methoden hierin zal de toegankelijkheid tot granulaire hydrogelfabricage vergroten en leiden tot aanzienlijke vooruitgang op het groeiende gebied van granulaire hydrogel-biomaterialen, waardoor meer onderzoekers innovatieve biomedische oplossingen kunnen ontwikkelen met gefragmenteerde granulaire hydrogels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation via het UPenn MRSEC-programma (DMR-1720530) en graduate research fellowships (aan V.G.M en M.E.P.) en de National Institutes of Health (R01AR077362 aan J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
