Summary
Este trabalho descreve métodos simples, adaptáveis e de baixo custo para fabricar microgels com fragmentação de extrusão, processar os microgésis em hidrogéis granulares injetáveis e aplicar os hidrogéis granulares como tintas de impressão extrusão para aplicações biomédicas.
Abstract
Hidrogéis granulares são conjuntos emperrados de micropartículas de hidrogel (ou seja, "microgel"). No campo dos biomateriais, os hidrogéis granulares possuem muitas propriedades vantajosas, incluindo injeção, porosidade de microescala e tunability misturando várias populações de microgel. Os métodos para fabricar microgels muitas vezes dependem de emulsões de água em óleo (por exemplo, microfluidos, emulsões em lote, eletrolografia) ou fotolithografia, que podem apresentar altas demandas em termos de recursos e custos, e podem não ser compatíveis com muitos hidrogéis. Este trabalho detalha métodos simples, mas altamente eficazes, para fabricar microgels usando a fragmentação de extrusão e processá-los em hidrogéis granulares úteis para aplicações biomédicas (por exemplo, tintas de impressão 3D). Primeiro, hidrogéis a granel (usando ácido hialurônico fotocrosslinkable (HA) como exemplo) são extrudados através de uma série de agulhas com diâmetros sequencialmente menores para formar microgels fragmentados. Esta técnica de fabricação de microgel é rápida, de baixo custo e altamente escalável. Métodos para emperrar microgéis em hidrogéis granulares por centrifugação e filtração movida a vácuo são descritos, com pós-crosslinking opcional para estabilização de hidrogel. Por fim, hidrogéis granulares fabricados a partir de microgéis fragmentados são demonstrados como tintas de impressão de extrusão. Embora os exemplos descritos aqui usem HA fotocrosslinkable para impressão 3D, os métodos são facilmente adaptáveis para uma grande variedade de tipos de hidrogel e aplicações biomédicas.
Introduction
Hidrogéis granulares são fabricados através da embalagem de partículas de hidrogel (ou seja, microgels) e são uma classe emocionante de biomateriais com muitas propriedades vantajosas para aplicações biomédicas 1,2,3. Devido à sua estrutura de partículas, os hidrogéis granulares são de corte e auto-cura, permitindo seu uso como impressão de extrusão (bio)tintas, suportes granulares para impressão embarcada e terapêutica injetável 4,5,6,7,8,9. Além disso, o espaço vazio entre microgésis fornece uma porosidade de microescala para o movimento celular e difusão molecular 8,10,11. Além disso, várias populações de microgel podem ser combinadas em uma única formulação para permitir maior sintonia e funcionalidade de material 8,10,12,13. Essas importantes propriedades têm motivado a rápida expansão do desenvolvimento de hidrogel granular nos últimos anos.
Há uma gama de métodos disponíveis para formar microgéis para a fabricação de hidrogel granular, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Por exemplo, microgéis são frequentemente formados a partir de emulsões de água em óleo usando microfluidos de gotículas 4,11,13,14,15,16,17, emulsões em lote 7,18,19,20,21,22 ou eletros rezando 6,23, 24,25. Estes métodos produzem microgel esféricos com diâmetros uniformes (microfluidos) ou polidisperse (emulsões em lote, eletros rezando). Existem algumas limitações para esses métodos de fabricação de emulsão água-em-óleo, incluindo a produção potencialmente de baixo rendimento, a necessidade de soluções precursoras de hidrogel de baixa viscosidade e o alto custo e recursos para a instalação. Além disso, esses protocolos podem exigir óleos severos e surfactantes que devem ser lavados dos microgéis usando procedimentos que adicionam etapas de processamento, e podem ser difíceis de traduzir para condições estéreis para aplicações biomédicas em muitos laboratórios. A remoção da necessidade de emulsões de água em óleo, (foto)litografia também pode ser usada, onde moldes ou fotomasks são usados para controlar a cura de microgéis de soluções precursoras de hidrogel 1,26,27. Assim como os microfluidos, esses métodos podem ser limitados em sua produção, o que é um grande desafio quando grandes volumes são necessários.
Como alternativa a esses métodos, a fragmentação mecânica de hidrogéis a granel tem sido usada para fabricar microgéis com tamanhos irregulares 19,28,29,30,31,32. Por exemplo, hidrogéis a granel podem ser pré-formados e posteriormente passados através de malhas ou peneiras para formar microgéis fragmentados, um processo que tem sido feito até mesmo na presença de células dentro dos fios de microgel33,34. Hidrogéis a granel também foram transformados em microgéis com disrupção mecânica usando técnicas como moagem com argamassa e pilão ou através do uso de liquidificadores comerciais 35,36,37. Outros também usaram agitação mecânica durante a formação de hidrogel para fabricar microgéis fragmentados (ou seja, géis fluidos)31.
Os métodos aqui se expandem nessas técnicas de fragmentação mecânica e apresentam uma abordagem simples para fabricar microgels com fragmentação de extrusão, usando hidrogéis de ácido hialurônico fotocrosslinkable (HA) como exemplo. A fragmentação da extrusão usa apenas seringas e agulhas para fabricar microgéis fragmentados em um método de baixo custo, alto rendimento e facilmente escalável que é apropriado para uma ampla gama de hidrogéis19,32. Além disso, métodos para montar esses microgels fragmentados em hidrogéis granulares são descritos usando centrifugação (embalagem baixa) ou filtração movida a vácuo (embalagem alta). Por fim, a aplicação desses hidrogéis granulares fragmentados é discutida para uso como tinta de impressão de extrusão. O objetivo deste protocolo é introduzir métodos simples que sejam adaptáveis a uma grande variedade de hidrogéis e possam ser implementados em praticamente qualquer laboratório interessado em hidrogéis granulares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricação de hidrogéis a granel dentro de uma seringa usando fotocrosslinking
NOTA: Uma visão geral da fabricação de hidrogel a granel dentro de uma seringa usando fotocrosslinking é mostrada na Figura 1. Este protocolo usa ácido hialurônico modificado por norbornene (NorHA) para fabricar hidrogéis a granel usando uma reação de thiol-ene mediada por foto. Procedimentos detalhados para a síntese da NorHA são descritos em outros lugares38. No entanto, este protocolo é altamente adaptável a qualquer hidrogel fotocrosslinkável. Consulte Discussão para obter mais informações.
- As concentrações desejadas de pré-determina de polímeros, crosslinker e iniciadores para a formulação de hidrogel a granel. Neste protocolo, a solução precursora do hidrogel consiste em NorHA (2 wt.%, ~25% de grau de modificação norbornene), dithiothreitol (DTT, 6 mM) e Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 wt.%). Certifique-se de que os componentes (1 mL) estejam totalmente dissolvidos em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS) dentro de um tubo de microcentrifusagem.
NOTA: Ao preparar a solução precursora do hidrogel, o fitc-dextran de alto peso molecular (2 MDa, 0,1 wt.%) pode ser adicionado à solução para visualizar microgésis fabricados posteriormente no protocolo usando microscopia fluorescente. - Carregue uma seringa de 3 mL com a solução precursora do hidrogel.
- Retire o êmbolo da parte de trás de uma seringa vazia de 3 mL e adicione uma tampa de ponta na parte superior do barril de seringa.
- Use uma pipeta de 1.000 μL para transferir a solução precursora do hidrogel para o barril de seringa com a tampa da ponta.
- Segure o barril de seringa com solução precursora de hidrogel em uma mão, com a tampa de ponta voltada para baixo e a extremidade aberta do barril voltada para cima. Por outro lado, devolva o êmbolo da seringa para a abertura da parte de trás do barril de seringa. Empurre suavemente o êmbolo da seringa para dentro do barril, apenas o suficiente para selar a abertura na parte de trás do barril de seringa.
- Segurando cuidadosamente o êmbolo e o barril de seringa juntos para garantir que a parte de trás do barril de seringa esteja selada com o êmbolo, inverta a seringa de tal forma que o êmbolo esteja virado para baixo, e a tampa da ponta esteja agora virada para cima. Retire a tampa da ponta e empurre suavemente o êmbolo para dentro do barril de seringa até que todo o ar seja removido da seringa (apenas a solução precursora do hidrogel permanece).
- Recoloque a tampa da ponta na seringa. Certifique-se de que a solução precursora do hidrogel esteja presa dentro da seringa de 3 mL com uma tampa de ponta.
- Forme um hidrogel a granel dentro da seringa de 3 mL.
- Certifique-se de que os equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados e as proteções sejam tomadas antes de ligar a lâmpada UV. Isso inclui o uso de óculos protetores UV e o uso da área da lâmpada para proteger outros da luz UV.
- Calibrar a lâmpada de cura da mancha UV a uma intensidade leve de 10 mW/cm2 usando um radiômetro.
NOTA: Haverá atenuação leve através do barril de seringa. Antes da fabricação, determine a porcentagem de atenuação da luz presente usando um radiômetro. A saída de intensidade de luz do sistema de cura do local deve ser ajustada de acordo com essa atenuação. - Coloque a seringa de 3 mL carregada com a solução precursora do hidrogel sob a lâmpada de cura da mancha UV por um tempo desejado para fotocrosslink completo. Para o sistema aqui descrito, a solução precursora de hidrogel NorHA é exposta à luz UV por 5 minutos a uma intensidade de 10 mW/cm2, que, com base em estudos anteriores39, foi suficientemente tempo e intensidade de luz para garantir a completa ligação cruzada conforme determinado por varreduras de tempo de reologia oscilatória de fotocrosslinking.
NOTA: Para garantir a completa fotocrosslinking dentro da seringa, a seringa pode ser virada no meio do período de fotocrosslinking. - Desligue a lâmpada UV e remova a seringa. Certifique-se de que o hidrogel está agora fotocrossdado dentro da seringa. Isso pode ser feito puxando o êmbolo e observando o movimento do hidrogel como um bloco sólido em vez de um líquido viscoso.
Figura 1: Visão geral da fabricação de hidrogéis a granel dentro de uma seringa usando fotocrosslinking. A figura retrata (A) a remoção do êmbolo da seringa, (B) fixando a tampa da ponta ao barril de seringa, (C) adicionando precursor de hidrogel ao barril de seringa, (D) devolvendo o êmbolo para a seringa, (E) removendo o excesso de ar e protegendo a tampa da ponta, e (F) hidrogel a granel de fotocrossdão dentro da seringa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Fabricação de microgéis usando fragmentação de extrusão
NOTA: Uma visão geral da fabricação de microgel usando fragmentação de extrusão é mostrada na Figura 2.
- Remova o êmbolo da parte de trás de uma seringa vazia de 3 mL. Fixar uma tampa de ponta no Luer-Lock.
- Remova a tampa da ponta da seringa contendo o hidrogel a granel fotocrossdado. Alinque o topo da seringa hidrogel com a abertura do barril na seringa vazia.
- Extrude o hidrogel a granel através da abertura da seringa (sem agulha presa) no barril da seringa vazia. Descarte corretamente a seringa que agora está vazia (antes contida o hidrogel) no fluxo de resíduos adequado.
- Segure a seringa que contém o hidrogel extrudado de tal forma que a tampa da ponta esteja virada para baixo, e a abertura do barril está voltada para cima. Usando uma pipeta de 1.000 μL, adicione 1,5 mL de PBS ao barril de seringa.
- Alinhe o êmbolo da seringa com a abertura do barril, apenas mal empurrando o êmbolo para dentro o suficiente para criar uma vedação. Inverta a seringa de tal forma que o êmbolo esteja agora virado para baixo e a tampa da ponta esteja voltada para cima, certificando-se de segurar o êmbolo e o barril de seringa juntos no lugar para que nenhum hidrogel ou PBS vaze. Inverta várias vezes para misturar o hidrogel fragmentado com o PBS adicionado.
- Segure a seringa de tal forma que a tampa da ponta esteja voltada para cima e o êmbolo esteja virado para baixo. Retire a tampa da ponta. Empurre suavemente o êmbolo para cima para remover qualquer ar do interior da seringa.
NOTA: Provavelmente haverá uma ranhura na parte de trás da seringa de 3 mL que exigirá força extra para empurrar o êmbolo para dentro. Empurre com muito cuidado o êmbolo sobre a ranhura. Qualquer quantidade repentina ou dura de força fará com que o êmbolo se mova muito rápido e possivelmente expulse a suspensão fragmentada do hidrogel. - Extrude a suspensão fragmentada do hidrogel através de uma série de agulhas para criar microgéis fragmentados.
- Fixar uma agulha de ponta semálais de 18 G no topo da seringa contendo o hidrogel fragmentado e PBS. Remova o êmbolo de uma seringa fresca de 3 mL e fixe uma tampa de ponta no barril de seringa vazia.
- Extrude a suspensão fragmentada do hidrogel através da agulha de 18 G na parte de trás do barril de seringa vazio. Descarte a seringa vazia e a agulha no fluxo de resíduos afiados adequados.
- Segure a seringa que contém a suspensão fragmentada do hidrogel de modo que a tampa da ponta esteja virada para baixo e a abertura do barril esteja voltada para cima. Alinhe o êmbolo da seringa com a abertura do barril, apenas mal empurrando o êmbolo para dentro o suficiente para criar uma vedação.
- Inverta a seringa de tal forma que o êmbolo esteja agora virado para baixo, e a tampa da ponta está voltada para cima, certificando-se de segurar o êmbolo e o barril de seringa juntos para que nenhum hidrogel ou PBS vaze.
- Segure a seringa de tal forma que a tampa da ponta esteja voltada para cima e o êmbolo esteja virado para baixo. Retire a tampa da ponta. Empurre suavemente o êmbolo para cima para remover qualquer ar do interior da seringa. Consulte a NOTA acima sobre empurrar suavemente o êmbolo da seringa para dentro para evitar a expulsão indesejada do material hidrogel.
- Repita as etapas 2.7.1-2.7.5 com uma agulha de 23 G, 27 G e 30 G. Após a última etapa de extrusão (agulha de 30 G), extrude a suspensão fragmentada do hidrogel em tubos de microcentrifusagem. Para os volumes aqui descritos, o volume final de suspensão de hidrogel fragmentado será de ~2,5 mL, exigindo dois tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL (divisão de volume igualmente).
NOTA: Não deve ser necessária força excessiva para extrusão da suspensão fragmentada do hidrogel através das agulhas. Para as melhores práticas de segurança, recomenda-se realizar todos os passos de fragmentação de extrusão dentro de uma capa química para fornecer proteção em caso de sobrepressão da seringa durante a extrusão. Além disso, esse processo pode ser facilmente realizado em um armário de biossegurança/capô de fluxo laminar para manter a esterilidade durante a fabricação. Consulte Discussão para obter sugestões adicionais de solução de problemas.
- Lave e isole a suspensão fragmentada do hidrogel.
NOTA: Lavar microgéis fragmentados ajudará a remover qualquer polímero e crosslinker não redigidos. Além disso, a centrifugação ajudará a isolar os microgéis da suspensão, formando uma pelota.- Usando um microcentrifuge, gire a suspensão fragmentada do microgel a 5.000 x g por 5 min.
- Use uma pipeta para remover o supernatante. Adicione 1 mL de PBS a cada tubo de microcentrifuuge contendo microgel fragmentados e vórtice para 5-10 s.
- Repita a centrifugação e a lavagem com PBS 3x.
Figura 2: Visão geral da fabricação de microgel usando fragmentação de extrusão. A figura mostra (A) extrudamento de hidrogel a granel em um barril de seringa vazio e adicionando PBS, (B) fixando um êmbolo na seringa com hidrogel fragmentado, (C) anexando uma agulha de 18 G e extrudando a suspensão fragmentada de hidrogel em um barril de seringa vazio, e (D) repetindo passos de fragmentação de extrusão com 23 G, 27 G e 30 G. coleta de suspensão fragmentada de hidrogel em tubos de microcentrifuuge na extrusão final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Caracterizando microgéis fragmentados usando ImageJ
NOTA: Uma visão geral da caracterização dos microgéis fragmentados usando ImageJ é mostrada na Figura 3, bem como resultados representativos para descrever distribuições de tamanho e formas dentro de um lote de microgéis fragmentados. Os microgels devem ser rotulados fluorescentemente antes da visualização. Por exemplo, o peso da molécula de alta molécula FITC-dextran (2 MDa) pode ser encapsulado no hidrogel a granel antes da fragmentação para criar microgelados com fluoresceína.
- Combine 20 μL de suspensão fragmentada de microgel com 180 μL de PBS para criar uma suspensão de microgel fragmentada diluída. Vórtice para misturar bem.
- Transfira 50 μL de suspensão de microgel fragmentado diluído para um slide de microscópio de vidro.
- Use um microscópio epifluorescente para adquirir imagens de microgéis fluorescentes com marcação fluorescente a zoom de 4x ou 10x.
NOTA: A suspensão do microgel deve ser diluída o suficiente para que os microgéis vizinhos não estejam em contato uns com os outros, mas concentrados o suficiente para que dezenas de microgéis sejam visíveis na área de visão. A diluição da suspensão de microgel pode ser ajustada de acordo para conseguir isso. - Usando ImageJ para analisar partículas fragmentadas de microgel. Informações adicionais sobre o uso da funcionalidade Analisar partículas no ImageJ podem ser encontradas no link fornecido na Tabela de Materiais.
- Abra as imagens de microgésis em suspensão no ImageJ.
- Selecione Analisar > definir medidas, verificar área, descritores de forma e diâmetro de Feret. Clique ok.
- Selecione > > de imagem > 8 bits.
- Selecione > de imagem Ajustar > limiar. Ajuste o limiar de tal forma que os microgésis estejam cobertos por uma máscara vermelha, e o fundo permanece preto. Clique em Aplicar.
NOTA: Se algum microgel estiver ligeiramente sobreposto, use a Ferramenta lápis para desenhar uma linha preta fina (<5 pixels) entre microgésis para separá-los na imagem preto e branco. - Selecione Analisar > analisar partículas. Definir tamanho (pixel2) a partir de 50-Infinity para reduzir o ruído de fundo. Definir Circularidade para 0,00-1,00. Selecione Mostrar contornos no menu Suspenso. Verifique os resultados do visor, exclua em bordas e inclua furos. Deixe as caixas restantes desmarcadas. Clique em OK.
- Uma exibição de resultados será aberta, incluindo a área, descritores de forma e informações de diâmetro de Feret para cada microgel identificado. Copie e cole os resultados em uma planilha.
- Determine o diâmetro circular equivalente para cada partícula.
- Obtenha a escala de imagem em μm/pixel a partir da barra de escala ou das informações do instrumento. Crie uma coluna na planilha que converte a área de cada microgel do pixel2 para μm2.
- Use a área em μm2 para determinar o diâmetro circular equivalente do microgel em μm (ou seja, pegue a raiz quadrada da área dividida por pi, em seguida, dobre-a).
- Use a escala de μm/pixel para converter os diâmetros do Feret (ou seja, a maior distância entre dois pontos no limite de partículas) para cada microgel para uma unidade de μm.
- Circularidade ("Circ."), proporção ("AR"), arredondamento ("Round") e valores de solidez para cada microgel podem ser usados diretamente do ImageJ.
- Analisar a população de microgel conforme desejado, considerando a distribuição de diâmetros (circular equivalente e feret), circularidade, razão de aspecto, arredondamento e solidez.
Figura 3: Visão geral da caracterização de partículas fragmentadas de microgel usando ImageJ. A figura retrata (A) a criação de uma suspensão diluída de partículas de microgel fragmentadas e o uso de um microscópio epifluorescente ou confocal para microgésis de imagem em suspensão (barra de escala = 500 μm), (B) convertendo-se em uma imagem binária em ImageJ e analisando partículas (contagem, descritores de forma, etc.), e (C) resultados representativos. As barras de erro retratam min e max com faixas internas de quartil demarcadas. Um tamanho populacional de n = 100 microgéis é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Montagem de microgéis fragmentados em hidrogéis granulares
NOTA: São apresentados dois métodos para a formulação de hidrogéis granulares a partir de microgéis fragmentados, utilizando centrifugação e filtração. O método utilizado dependerá da embalagem de microgel desejada (ou seja, as partículas de filtragem são mais densas) e se os componentes biológicos estão incluídos (ou seja, a centrifugação reterá componentes entre partículas, enquanto na filtração estas podem ser perdidas). Trabalho anterior40 descreve minuciosamente os desfechos comparativos (ou seja, mecânica, porosidade) para hidrogéis granulares formados a partir de centrífugas ou filtragem movida a vácuo.
- Opção 1: Emperrar microgéis fragmentados usando centrifugação.
- Depois de remover o supernasal pbs da última etapa de lavagem, adicione 1 mL de PBS a cada tubo de microcentrifuus de microcentruuagem e resuspenja os microgel.
- Gire a suspensão fragmentada do hidrogel a 18.000 x g por 5 min.
NOTA: Velocidades de centrífugas mais lentas podem ser usadas para a interferência de microgéis em hidrogéis granulares com embalagem menos densa, se desejar. - Remova o supernatante PBS.
- Obtenha uma seringa fresca de 3 mL e remova o êmbolo. Use uma espátula metálica para colher o hidrogel granular fragmentado do tubo de microcentrifuuge e transferi-lo para a parte de trás do barril de seringa vazio. Uma ponta de pipeta pode ser usada para auxiliar na transferência do hidrogel granular para a seringa. Devolva o êmbolo para a seringa. Agora carregue o hidrogel granular fragmentado na seringa, e ele está pronto para uso.
- Opção 2: Emperrar microgéis fragmentados usando filtragem movida a vácuo. Uma visão geral da interferência por filtragem movida a vácuo é retratada na Figura 4.
- Monte e teste o aparelho de filtragem movido a vácuo.
- Fixar um funil Buchner dentro de um frasco de filtro, colocando o adaptador de filtro entre o funil e a abertura do frasco.
- Use tubos para conectar o frasco do filtro a uma linha de vácuo.
- Coloque um filtro de membrana (0,22 μm) no copo do funil Buchner.
- Ligue a linha de vácuo abrindo a válvula de discagem. Teste a conexão pipetando ~0,5 mL de PBS sobre o filtro de membrana e observe que todo o PBS passa pelo filtro e coleta na parte inferior do frasco do filtro.
- Ligue a linha de vácuo e garanta uma vedação completa. Vórtice a suspensão fragmentada de hidrogel para que os microgéis sejam suspensos na PBS.
- Utilizando uma pipeta de 1.000 μL, transfira a suspensão fragmentada do hidrogel para o filtro de membrana (0,22 μm). Depois de transferir toda a suspensão do microgel, espere por ~30 s para que o vácuo retire o PBS da suspensão fragmentada do hidrogel. Desligue a linha de vácuo.
NOTA: O tempo em que a suspensão fragmentada do hidrogel está no filtro de membrana enquanto puxa o vácuo pode ser variado. Consulte Discussão para obter mais informações e sugestões de solução de problemas. - Obtenha uma seringa fresca de 3 mL e remova o êmbolo. Use uma espátula metálica para colher o hidrogel granular fragmentado do filtro e transferi-lo para a parte de trás do barril de seringa vazio. Uma ponta de pipeta pode ser usada para auxiliar na transferência do hidrogel granular para a seringa. Devolva o êmbolo para a seringa. Coloque o hidrogel granular fragmentado na seringa, e agora está pronto para uso.
- Monte e teste o aparelho de filtragem movido a vácuo.
Figura 4: Visão geral dos microgéis de interferência por filtragem movida a vácuo para fabricar hidrogéis granulares fragmentados bem embalados. A figura retrata (A) colocar um filtro de membrana no aparelho de filtragem de vácuo, (B) usando uma pipeta para transferir suspensão fragmentada de microgel para o filtro, (C) puxando o vácuo e esperando que os microgéis emperrem e formem um hidrogel granular, (D) desligando o vácuo e removendo hidrogel granular fragmentado usando uma espátula metálica, e (E) usando uma espátula metálica para transferir hidrogel granular para o hidrogel granular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Impressão de extrusão com tintas de hidrogel granular
NOTA: Uma visão geral do processo de impressão de extrusão é mostrada na Figura 5, incluindo uma impressão representativa de uma construção em forma de estrela usando hidrogéis granulares fragmentados presos com filtração movida a vácuo. O fluxo de trabalho de impressão consiste em formular uma tinta, planejar o design de impressão e, em seguida, imprimir a tinta com base no designdesejado 41. Se desejar, as construções de hidrogel granular impresso podem ser estabilizadas usando fotocrosslinking pós-extrusão adicionando dtt em excesso (5 mM) e I2959 (0,05 wt.%) à suspensão fragmentada de microgel antes da interferência. Isso resultará em ligações covalentes fotocrossdadas formadas entre os microgésis, levando à estabilização permanente da construção de hidrogel granular.
- Formulação de tinta
- Durante o processo de planejamento, tenha em mente as propriedades da tinta a ser usada. Para caracterizar a tinta, complete a análise reológica dos hidrogéis fragmentados para ajudar a informar o processo de projeto de impressão. Métodos que descrevem a caracterização reológica de hidrogéis granulares são descritos em outros lugares e podem ser adaptados para este estudo40.
- A partir da análise reológica, selecione uma plataforma de impressão e uma série de parâmetros de impressão iniciais.
NOTA: Devido às propriedades gerais de alta viscosidade e desbaste de tintas de hidrogel granular, as impressoras de extrusão baseadas em parafusos são tipicamente usadas.
- Design de impressão
NOTA: O software Repetier Host (a partir de agora referido como software de impressão 3D) é usado para aplicações de impressão 3D (etapas 5.2-5.3).- Crie os projetos de impressão através do software CAD (Computer-Aided Design, design auxiliado por computador). Os usuários podem criar novos projetos a partir do zero ou modificar projetos pré-existentes, como a partir de tomografias de tecidos do paciente ou de outros usuários. Para obter mais informações sobre a criação de projetos CAD, consulte as seguintes referências 41,42,43.
- Para processar modelos CAD em G-Code, certifique-se de que o arquivo CAD seja salvo no formato ".stl" (Arquivo Suplementar 1) e carregado no software de impressão 3D selecionando o botão de carga no painel superior ou selecionando Arquivo > Carregar na barra de menu. Este código G define o caminho de impressão para a deposição da tinta. Um exemplo de arquivo .stl de um cilindro oco foi incluído nos arquivos suplementares.
- Uma vez que um arquivo STL tenha sido carregado para o software de impressão 3D, navegue até o painel Slicer e selecione Slic3r como opção de cortador. Aqui, configurações como diâmetro do bocal, altura da camada, velocidade de impressão e taxa de extrusão podem ser ajustadas com base na caracterização da tinta e nos resultados de impressão desejados. Neste protocolo, é utilizada uma agulha de 18 G (diâmetro interno de 838 μm). A altura da camada é definida como 1 mm, a velocidade de impressão é definida para 8 mm/s, e a taxa de fluxo é definida para 9 μL/s, com base na otimização anterior39. Os valores numéricos dos parâmetros podem ser ajustados em ± 20% para contabilizar variações nas propriedades das tintas de hidrogel granular.
NOTA: É importante notar que essas configurações e o design de impressão podem precisar ser ajustados por meio de testes experimentais iterativos, dependendo dos ajustes na formulação da tinta, resolução de impressão desejada ou plataforma de impressão utilizada. Para obter mais informações sobre esses parâmetros, bem como sobre a caracterização de configurações de impressão com uma nova formulação de tinta, consulte outras referências 40,44,45,46.
- Impressão de extrusão com hidrogéis granulares fragmentados
- Para carregar seringas com hidrogéis granulares fragmentados, consulte 4.2.4, bem como a Figura 4 e a Figura 5.
- Retire a tampa da ponta e substitua-a por uma agulha escolhida.
- Coloque a seringa na plataforma de impressão escolhida. Aqui, uma impressora de extrusão personalizada baseada em parafusos é usada.
NOTA: Para obter informações sobre a construção de bioimpores personalizados, consulte outras referências44,47. - Carregue o arquivo G-Code preparado da fase de planejamento para o software de impressão 3D. Navegue até o painel Visualização de impressão e pressione Imprimir.
- Assim que a deposição de impressão estiver completa, exponha as construções fragmentadas de hidrogel granular à luz UV para fotocrosslinking e estabilização.
- Uma vez que o crosslinking esteja concluído, processe a amostra lavando-a em PBS três vezes.
Figura 5: Visão geral da impressão de extrusão com hidrogéis granulares fragmentados. A figura retrata (A) usando uma espátula para transferir hidrogel granular fragmentado para um barril de seringa, (B) anexando uma agulha de ponta bruta (18 G mostrada) e empurrando a amostra para o topo, (C) um gráfico representando a conexão ao software do computador para impressão, e (D) completando a impressão de uma construção em forma de estrela com hidrogel granular fragmentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os resultados representativos desses protocolos são mostrados nas Figuras 3 e Figura 6. A fragmentação da extrusão produz microgel com formas irregulares de polígono com diâmetros que variam de 10 a 300 μm (Figura 3). Além disso, a circularidade varia de 0,2 (não circular) a quase 1 (círculo perfeito), e a proporção varia de 1 a 3 (Figura 3). Esses parâmetros descrevem as formas irregulares e irregulares de microgel formadas pelo processo de fragmentação.
Quando embalado usando centrifugação ou filtragem movida a vácuo, o hidrogel granular montado é de enraizamento e auto-cura, como descrito no trabalho anterior39. Além disso, o hidrogel granular fragmentado tem alta fidelidade e integridade mecânica para um hidrogel injetável, como mostra a deposição de um cilindro oco com uma altura de 2 cm sendo extrusão impressa na Figura 6. Hidrogéis granulares fragmentados fabricados com esses métodos simples e econômicos são úteis para muitas aplicações biomédicas, incluindo terapêuticas injetáveis e tintas de impressão 3D.
Figura 6: Visão geral do protocolo e resultados representativos. A figura retrata (A) fragmentação, (B) microgéis em suspensão, (C) emperrado por filtragem movida a vácuo, e (D) hidrogel granular preso sendo extrudado através de uma agulha e impresso em um cilindro oco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Exemplo .stl arquivo Por favor clique aqui para baixar este Arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, são descritos métodos para fabricar hidrogéis granulares usando microgéis fragmentados de extrusão e embalagem por centrifugação ou filtragem movida a vácuo. Em comparação com outros métodos de fabricação de microgel (ou seja, microfluidos, emulsões em lote, eletros rezando, fotolítica), a fabricação de microgel de fragmentação de extrusão é altamente rápida, de baixo custo, facilmente escalável e agradável a uma grande variedade de sistemas de hidrogel. Além disso, este protocolo é altamente repetível com variabilidade mínima em lote, que foi caracterizada no trabalho anterior39.
Este protocolo usa ácido hialurônico modificado por norbornene (NorHA) para fabricar hidrogéis a granel usando uma reação de thiol-ene mediada por foto. Procedimentos detalhados para a síntese da NorHA são descritos em outros lugares38. No entanto, muitas químicas de hidrogel podem ser usadas para fabricar microgéis fragmentados usando os métodos aqui descritos se um hidrogel a granel pode ser formado dentro do barril de uma seringa. Também é útil entender as propriedades mecânicas de hidrogel a granel (por exemplo, módulo compressivo). Os hidrogéis a granel usados neste protocolo têm um módulo compressivo a granel de cerca de 30 kPa39. Um hidrogel a granel com um módulo compressivo mais alto exigirá mais força para extrusão durante as etapas de fragmentação, o que pode levar ao aumento do entupimento ou sobrepressão das seringas; assim, recomenda-se o uso de hidrogéis com moduli compressivo inferior a 80 kPa. Além disso, um hidrogel a granel com moduli compressivo inferior a 10 kPa pode se deformar durante as etapas de fragmentação, tornando-o desafiador para fragmentar.
Este protocolo é otimizado para uma lâmpada de cura de ponto UV. Como alternativa à fonte de luz UV e aos fotoinitidores responsivos uv, fontes de luz visível também podem ser usadas juntamente com fotoinitidores sensíveis à luz visível, como fenil de lítio solúvel-2,4,4,6-trimetilbenzoyl-fosfinato (LAP). A concentração do iniciador, a intensidade da luz e o volume da amostra influenciarão os tempos de crosslinking, dependendo do sistema de polimer e crosslinking que está sendo usado. Além disso, muitas fontes de lâmpadas podem ser usadas como uma alternativa para detectar sistemas de cura.
O passo mais crítico no protocolo é a extrusão em série através de medidores de agulha menores e menores. Neste procedimento, sugere-se o uso de medidores de agulha de 18 G (838 μm de diâmetro interno) até 30 G (159 μm de diâmetro interno). Adicionar PBS ao hidrogel a granel fragmentado antes de extrudar através de agulhas é crucial para reduzir significativamente a força necessária para extrusão e fragmentação. Nenhuma força excessiva deve ser usada para extrusão do hidrogel, pois a força excessiva pode levar à pressurização das costas na seringa e correr o risco de estourar o hidrogel da seringa de volta. Estratégias adicionais para reduzir a força necessária para extrusão incluem o uso de mais agulhas na série para reduzir o tamanho do fragmento mais gradualmente, bem como adicionar PBS adicional entre etapas fragmentantes.
Ao bloquear os microgéis fragmentados usando filtragem movida a vácuo, pode haver variabilidade no processo. Alguns sistemas de materiais podem exigir mais (ou menos) tempo para remover o PBS e emperrar totalmente os microgel. Sugere-se registrar o tempo necessário para sistemas materiais individuais para garantir a repetibilidade entre experimentos. O tempo de emperrar também dependerá da espessura e tamanho da amostra adicionada ao filtro. Espalhar a amostra uniformemente pelo filtro pode ajudar com a interferência uniforme.
O método de fabricação de microgel de fragmentação de extrusão pode ser adaptado para muitas aplicações biomédicas. Por exemplo, a terapêutica pode ser incluída na solução precursora do hidrogel e, posteriormente, encapsulada dentro de microgéis fragmentados para fabricar um hidrogel granular de corte, auto-cura para entrega terapêutica localizada. Além disso, microgéis fragmentados podem ser secos para permitir o armazenamento a longo prazo e práticas simples de esterilização. No entanto, uma limitação à fragmentação da extrusão é a incorporação de células dentro de microgésis. Devido às altas taxas de corte durante a fragmentação da extrusão, o método provavelmente não é aceitável para o encapsulamento celular dentro de microgels, uma vez que a alta tesoura pode levar a uma diminuição significativa da viabilidade celular. Ainda assim, células e esferoides podem ser facilmente incorporados entre microgéis para cultura in vitro e entrega de células in vivo .
Hidrogéis granulares fragmentados são um bioma material promissor para aplicações biomédicas. Nos últimos anos, hidrogéis granulares feitos a partir de vários métodos de fragmentação (ou seja, argamassa e pilão, liquidificadores e raladores de malha) têm sido usados como tintas de impressão 3D carregadas de células48, veículos de entrega terapêutica29, andaimes de reparação de tecidos injetáveis30 e plataformas de cultura esfóide39. Dos métodos de fragmentação relatados anteriormente, o método de fragmentação de extrusão descrito aqui é um dos métodos mais simples e econômicos com inúmeras vantagens. O compartilhamento dos métodos aqui aumentará a acessibilidade à fabricação de hidrogel granular e levará a avanços significativos no campo crescente de biomateriais de hidrogel granular, permitindo que mais pesquisadores projegem soluções biomédicas inovadoras com hidrogéis granulares fragmentados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência através do programa UPenn MRSEC (DMR-1720530) e bolsas de pesquisa de pós-graduação (para V.G.M e M.E.P.) e os Institutos Nacionais de Saúde (R01AR077362 a J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
