Summary
Ce travail décrit des méthodes simples, adaptables et peu coûteuses pour fabriquer des microgels avec fragmentation par extrusion, transformer les microgels en hydrogels granulaires injectables et appliquer les hydrogels granulaires comme encres d’impression par extrusion pour des applications biomédicales.
Abstract
Les hydrogels granulaires sont des assemblages coincés de microparticules d’hydrogel (c.-à-d. des « microgels »). Dans le domaine des biomatériaux, les hydrogels granulaires ont de nombreuses propriétés avantageuses, notamment l’injectabilité, la porosité à l’échelle microscopique et l’accordabilité en mélangeant plusieurs populations de microgels. Les méthodes de fabrication de microgels reposent souvent sur des émulsions eau-dans-huile (par exemple, microfluidique, émulsions par lots, électrodéfection) ou la photolithographie, qui peuvent présenter des exigences élevées en termes de ressources et de coûts, et peuvent ne pas être compatibles avec de nombreux hydrogels. Ce travail détaille des méthodes simples mais très efficaces pour fabriquer des microgels en utilisant la fragmentation par extrusion et pour les transformer en hydrogels granulaires utiles pour des applications biomédicales (par exemple, les encres d’impression 3D). Tout d’abord, les hydrogels en vrac (en utilisant l’acide hyaluronique photoréticable (HA) comme exemple) sont extrudés à travers une série d’aiguilles avec des diamètres séquentiellement plus petits pour former des microgels fragmentés. Cette technique de fabrication de microgel est rapide, peu coûteuse et hautement évolutive. Les méthodes de bourrage des microgels en hydrogels granulaires par centrifugation et filtration sous vide sont décrites, avec une post-réticulation facultative pour la stabilisation de l’hydrogel. Enfin, les hydrogels granulaires fabriqués à partir de microgels fragmentés sont présentés comme des encres d’impression par extrusion. Bien que les exemples décrits ici utilisent l’HA photoréticable pour l’impression 3D, les méthodes sont facilement adaptables à une grande variété de types d’hydrogel et d’applications biomédicales.
Introduction
Les hydrogels granulaires sont fabriqués par l’emballage de particules d’hydrogel (c.-à-d. des microgels) et constituent une classe passionnante de biomatériaux possédant de nombreuses propriétés avantageuses pour les applications biomédicales 1,2,3. En raison de leur structure particulaire, les hydrogels granulaires sont amincissants par cisaillement et auto-cicatrisants, ce qui permet leur utilisation comme (bio)encres d’impression par extrusion, supports granulaires pour l’impression intégrée et thérapeutiques injectables 4,5,6,7,8,9. De plus, l’espace vide entre les microgels fournit une porosité à l’échelle microscopique pour le mouvement cellulaire et la diffusion moléculaire 8,10,11. De plus, plusieurs populations de microgels peuvent être combinées en une seule formulation pour permettre une accordabilité et une fonctionnalité matérielleaméliorées 8,10,12,13. Ces propriétés importantes ont motivé l’expansion rapide du développement de l’hydrogel granulaire au cours des dernières années.
Il existe une gamme de méthodes disponibles pour former des microgels vers la fabrication d’hydrogel granulaire, chacune avec ses propres avantages et inconvénients. Par exemple, les microgels sont souvent formés à partir d’émulsions eau-dans-huile utilisant des microfluidiques gouttelettes 4,11,13,14,15,16,17, des émulsions par lots 7,18,19,20,21,22 ou de l’électropulvérisation 6,23, 24,25. Ces méthodes donnent des microgels sphériques de diamètres uniformes (microfluidiques) ou polydispersés (émulsions discontinues, électropulvérisation). Il existe certaines limites à ces méthodes de fabrication d’émulsions eau-dans-huile, notamment la production potentiellement à faible débit, la nécessité de solutions de précurseurs d’hydrogel à faible viscosité et le coût et les ressources élevés pour la mise en place. De plus, ces protocoles peuvent nécessiter des huiles et des tensioactifs agressifs qui doivent être lavés des microgels à l’aide de procédures qui ajoutent des étapes de traitement, et peuvent être difficiles à traduire en conditions stériles pour des applications biomédicales dans de nombreux laboratoires. Éliminant le besoin d’émulsions eau-dans-huile, la (photo)lithographie peut également être utilisée, où des moules ou des photomasques sont utilisés pour contrôler le durcissement de microgels à partir de solutions de précurseurs d’hydrogel 1,26,27. Comme la microfluidique, ces méthodes peuvent être limitées dans leur débit de production, ce qui est un défi majeur lorsque de grands volumes sont nécessaires.
Comme alternative à ces méthodes, la fragmentation mécanique des hydrogels en vrac a été utilisée pour fabriquer des microgels de tailles irrégulières 19,28,29,30,31,32. Par exemple, les hydrogels en vrac peuvent être préformés et ensuite passés à travers des mailles ou des tamis pour former des microgels fragmentés, un processus qui a même été effectué en présence de cellules dans des brins de microgel33,34. Les hydrogels en vrac ont également été transformés en microgels avec perturbation mécanique en utilisant des techniques telles que le broyage avec du mortier et du pilon ou par l’utilisation de mélangeurs commerciaux 35,36,37. D’autres ont également eu recours à l’agitation mécanique lors de la formation d’hydrogels pour fabriquer des microgels fragmentés (c.-à-d. des gels fluides)31.
Les méthodes décrites ici développent ces techniques de fragmentation mécanique et présentent une approche simple pour fabriquer des microgels avec fragmentation par extrusion, en utilisant des hydrogels d’acide hyaluronique (HA) photoréticables comme exemple. La fragmentation par extrusion utilise uniquement des seringues et des aiguilles pour fabriquer des microgels fragmentés dans une méthode peu coûteuse, à haut débit et facilement évolutive qui convient à une large gamme d’hydrogels19,32. De plus, les méthodes d’assemblage de ces microgels fragmentés en hydrogels granulaires sont décrites en utilisant soit la centrifugation (faible emballage), soit la filtration sous vide (emballage élevé). Enfin, l’application de ces hydrogels granulaires fragmentés est discutée pour une utilisation comme encre d’impression par extrusion. L’objectif de ce protocole est d’introduire des méthodes simples qui s’adaptent à une grande variété d’hydrogels et peuvent être mises en œuvre dans pratiquement tous les laboratoires intéressés par les hydrogels granulaires.
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Protocol
1. Fabrication d’hydrogels en vrac à l’intérieur d’une seringue à l’aide de la photocroisillonnage
REMARQUE : La figure 1 présente un aperçu de la fabrication d’hydrogel en vrac à l’intérieur d’une seringue à l’aide de la photoréticulation. Ce protocole utilise de l’acide hyaluronique modifié par norbornène (NorHA) pour fabriquer des hydrogels en vrac à l’aide d’une réaction thiol-ène photo-médiée. Les procédures détaillées pour la synthèse de NorHA sont décrites ailleurs38. Cependant, ce protocole est hautement adaptable à tout hydrogel photoréticable. Voir Discussion pour plus d’informations.
- Prédéterminer les concentrations souhaitées de polymère, de réticulant et d’initiateurs pour la formulation d’hydrogel en vrac. Dans ce protocole, la solution précurseur d’hydrogel se compose de NorHA (2 % en poids, degré ~ 25 % de modification du norbornène), de dithiothréitol (TNT, 6 mM) et d’Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 % en poids). S’assurer que les composants (1 mL) sont complètement dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube de microcentrifugation.
REMARQUE: Lors de la préparation de la solution de précurseur d’hydrogel, fitc-dextran de haut poids moléculaire (2 MDa, 0,1 % en poids) peut être ajouté à la solution pour visualiser les microgels fabriqués plus tard dans le protocole à l’aide de la microscopie fluorescente. - Charger une seringue de 3 mL avec la solution de précurseur d’hydrogel.
- Retirez le piston à l’arrière d’une seringue vide de 3 mL et ajoutez un capuchon de pointe au sommet du barillet de la seringue.
- Utilisez une pipette de 1 000 μL pour transférer la solution de précurseur d’hydrogel dans le barillet de la seringue avec le capuchon de la pointe.
- Tenez le barillet de la seringue avec la solution de précurseur d’hydrogel dans une main, avec le capuchon de pointe vers le bas et l’extrémité ouverte du canon vers le haut. Avec l’autre main, retournez le piston de la seringue à l’ouverture de l’arrière du barillet de la seringue. Poussez doucement le piston de la seringue dans le barillet, juste assez pour sceller l’ouverture à l’arrière du barillet de la seringue.
- Tenez soigneusement le piston et le barillet de la seringue ensemble pour vous assurer que l’arrière du barillet de la seringue est scellé avec le piston, inversez la seringue de sorte que le piston soit tourné vers le bas et que le capuchon de la pointe soit maintenant tourné vers le haut. Retirez le capuchon de la pointe et poussez doucement le piston dans le barillet de la seringue jusqu’à ce que tout l’air soit retiré de la seringue (il ne reste que la solution de précurseur d’hydrogel).
- Reconnectez le capuchon de la pointe à la seringue. Assurez-vous que la solution de précurseur d’hydrogel est fixée dans la seringue de 3 mL avec un embout.
- Formez un hydrogel en vrac dans la seringue de 3 mL.
- Assurez-vous que l’équipement de protection individuelle (EPI) et les mesures de protection appropriés sont pris avant d’allumer la lampe UV. Cela comprend le port de lunettes protectrices des UV et l’enfermement de la zone de la lampe pour protéger les autres de la lumière UV.
- Calibrer la lampe uv spot cure à une intensité lumineuse de 10 mW/cm2 à l’aide d’un radiomètre.
REMARQUE: Il y aura une légère atténuation à travers le barillet de la seringue. Avant la fabrication, déterminez le pourcentage d’atténuation lumineuse présent à l’aide d’un radiomètre. L’intensité lumineuse produite par le système de durcissement par points doit être ajustée en conséquence pour tenir compte de cette atténuation. - Placez la seringue de 3 mL chargée de la solution de précurseur d’hydrogel sous la lampe de durcissement par points UV pendant la durée souhaitée pour la photocroisillonner complètement. Pour le système décrit ici, la solution de précurseur d’hydrogel NorHA est exposée à la lumière UV pendant 5 min à une intensité de 10 mW/cm2, ce qui, sur la base d’études antérieures39, était suffisamment de temps et d’intensité lumineuse pour assurer une réticulation complète déterminée par des balayages de temps de rhéologie de cisaillement oscillatoire de photocroisillonnage.
REMARQUE: Pour assurer une photoréticulation complète dans la seringue, la seringue peut être retournée à mi-chemin de la période de photocroisillonnage. - Éteignez la lampe UV et retirez la seringue. Assurez-vous que l’hydrogel est maintenant photoréticulé à l’intérieur de la seringue. Cela peut être fait en tirant le piston et en observant l’hydrogel se déplacer comme un bloc solide plutôt que comme un liquide visqueux.
Figure 1 : Vue d’ensemble de la fabrication d’hydrogels en vrac à l’intérieur d’une seringue à l’aide de la photoréticulation. La figure représente (A) le retrait du piston de la seringue, (B) la fixation du capuchon de la pointe au barillet de la seringue, (C) l’ajout d’un précurseur d’hydrogel au barillet de la seringue, (D) le retour du piston à la seringue, (E) l’élimination de l’excès d’air et la fixation du capuchon de la pointe, et (F) la photoréticulation de l’hydrogel en vrac à l’intérieur de la seringue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Fabrication de microgels par fragmentation par extrusion
REMARQUE: Une vue d’ensemble de la fabrication de microgels à l’aide de la fragmentation par extrusion est illustrée à la figure 2.
- Retirez le piston à l’arrière d’une seringue vide de 3 mL. Fixez un embout au Luer-Lock.
- Retirez le capuchon de la seringue contenant l’hydrogel en vrac photoréticulé. Aligner le haut de la seringue d’hydrogel avec l’ouverture du barillet sur la seringue vide.
- Extruder l’hydrogel en vrac à travers l’ouverture de la seringue (sans aiguille attachée) dans le barillet de la seringue vide. Jetez correctement la seringue qui est maintenant vide (qui contenait auparavant l’hydrogel) dans le flux de déchets approprié.
- Tenez la seringue qui contient l’hydrogel extrudé de manière à ce que le capuchon de pointe soit tourné vers le bas et que l’ouverture du barillet soit tournée vers le haut. À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, ajouter 1,5 mL de PBS au barillet de la seringue.
- Alignez le piston de la seringue avec l’ouverture du canon, en poussant à peine le piston suffisamment pour créer un joint. Inverser la seringue de telle sorte que le piston soit maintenant tourné vers le bas et que le capuchon de pointe soit tourné vers le haut, en veillant à maintenir le piston et le barillet de la seringue ensemble en place afin qu’aucun hydrogel ou PBS ne s’échappe. Inverser plusieurs fois pour mélanger l’hydrogel fragmenté avec le PBS ajouté.
- Tenez la seringue de telle sorte que le capuchon de pointe soit tourné vers le haut et que le piston soit tourné vers le bas. Retirez le capuchon de la pointe. Poussez très doucement le piston vers le haut pour éliminer tout air de l’intérieur de la seringue.
REMARQUE: Il y aura probablement une rainure à l’arrière de la seringue de 3 mL qui nécessitera une force supplémentaire pour pousser le piston. Poussez très soigneusement le piston sur la rainure. Toute force soudaine ou sévère entraînera le piston à se déplacer trop vite et peut-être expulser la suspension d’hydrogel fragmentée. - Extruder la suspension d’hydrogel fragmentée à travers une série d’aiguilles pour créer des microgels fragmentés.
- Fixez une aiguille émoussée de 18 G au sommet de la seringue contenant l’hydrogel fragmenté et le PBS. Retirez le piston d’une seringue fraîche de 3 mL et fixez un embout au barillet vide de la seringue.
- Extruder la suspension d’hydrogel fragmentée à travers l’aiguille de 18 G à l’arrière du barillet de seringue vide. Jetez la seringue et l’aiguille vides dans le flux de déchets tranchants approprié.
- Tenez la seringue qui contient la suspension d’hydrogel fragmentée de telle sorte que le capuchon de la pointe soit tourné vers le bas et que l’ouverture du barillet soit tournée vers le haut. Alignez le piston de la seringue avec l’ouverture du canon, en poussant à peine le piston suffisamment pour créer un joint.
- Inversez la seringue de telle sorte que le piston soit maintenant tourné vers le bas et que le capuchon de pointe soit tourné vers le haut, en veillant à maintenir le piston et le barillet de la seringue ensemble afin qu’aucun hydrogel ou PBS ne s’échappe.
- Tenez la seringue de telle sorte que le capuchon de pointe soit tourné vers le haut et que le piston soit tourné vers le bas. Retirez le capuchon de la pointe. Poussez très doucement le piston vers le haut pour éliminer tout air de l’intérieur de la seringue. Voir la NOTE ci-dessus concernant le fait de pousser doucement le piston de la seringue vers l’intérieur pour éviter l’expulsion indésirable du matériau hydrogel.
- Répétez les étapes 2.7.1 à 2.7.5 avec une aiguille de 23 G, 27 G et 30 G. Lors de la dernière étape d’extrusion (aiguille de 30 G), extruder la suspension d’hydrogel fragmentée en tubes de microcentrifugation. Pour les volumes décrits ici, le volume final de suspension d’hydrogel fragmenté sera d’environ 2,5 mL, nécessitant deux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (volume divisé également).
REMARQUE: Aucune force excessive ne devrait être nécessaire pour extruder une suspension d’hydrogel fragmentée à travers les aiguilles. Pour les meilleures pratiques de sécurité, il est recommandé d’effectuer toutes les étapes de fragmentation de l’extrusion à l’intérieur d’une hotte chimique pour assurer une protection en cas de surpression de la seringue pendant l’extrusion. De plus, ce processus peut être facilement effectué dans une armoire de biosécurité / hotte à flux laminaire pour maintenir la stérilité pendant la fabrication. Voir Discussion pour d’autres suggestions de dépannage.
- Lavez et isolez la suspension d’hydrogel fragmentée.
REMARQUE: Le lavage de microgels fragmentés aidera à éliminer tout polymère et réticulant non réagi. De plus, la centrifugation aidera à isoler les microgels de la suspension en formant une pastille.- À l’aide d’une microcentrifugeuse, faire tourner la suspension de microgel fragmentée à 5 000 x g pendant 5 min.
- Utilisez une pipette pour retirer le surnageant. Ajouter 1 mL de PBS à chaque tube de microcentrifugation contenant des microgels fragmentés et un vortex pendant 5 à 10 s.
- Répétez la centrifugation et le lavage avec PBS 3x.
Figure 2 : Vue d’ensemble de la fabrication de microgels par fragmentation par extrusion. La figure représente (A) l’extrusion d’hydrogel en vrac dans un baril de seringue vide et l’ajout de PBS, (B) la fixation d’un piston dans la seringue avec de l’hydrogel fragmenté, (C) la fixation d’une aiguille de 18 G et l’extrusion d’une suspension d’hydrogel fragmentée dans un baril de seringue vide, et (D) la répétition des étapes de fragmentation par extrusion avec des aiguilles de 23 G, 27 G et 30 G, collecte de suspensions d’hydrogel fragmentées dans des tubes de microcentrifugation lors de l’extrusion finale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Caractérisation de microgels fragmentés à l’aide d’ImageJ
REMARQUE: Un aperçu de la caractérisation des microgels fragmentés à l’aide d’ImageJ est illustré à la figure 3, ainsi que des résultats représentatifs pour décrire les distributions de taille et les formes dans un lot de microgels fragmentés. Les microgels doivent être marqués par fluorescence avant la visualisation. Par exemple, le FITC-dextran (2 MDa) de poids moléculaire élevé peut être encapsulé dans l’hydrogel en vrac avant la fragmentation pour créer des microgels marqués à la fluorescéine.
- Combiner 20 μL de suspension de microgel fragmentée avec 180 μL de PBS pour créer une suspension de microgel fragmentée diluée. Vortex à bien mélanger.
- Transférer 50 μL de suspension de microgel fragmenté dilué sur une lame de microscope en verre.
- Utilisez un microscope épifluorescent pour acquérir des images de microgels marqués par fluorescence à un zoom de 4x ou 10x.
REMARQUE: La suspension de microgel doit être suffisamment diluée pour que les microgels voisins ne soient pas en contact les uns avec les autres, mais suffisamment concentrées pour que des dizaines de microgels soient visibles dans la fenêtre d’affichage. La dilution de la suspension de microgel peut être ajustée en conséquence pour y parvenir. - Utilisation d’ImageJ pour analyser des particules de microgel fragmentées. Des informations supplémentaires sur l’utilisation de la fonctionnalité Analyser les particules dans ImageJ peuvent être trouvées dans le lien fourni dans la table des matériaux.
- Ouvrez les images de microgels en suspension dans ImageJ.
- Sélectionnez Analyser > Définir les mesures, Vérifier la zone, les descripteurs de forme et le diamètre de Feret. Cliquez sur OK.
- Sélectionnez Image > Type > 8 bits.
- Sélectionnez Image > Ajuster > seuil. Ajustez le seuil de manière à ce que les microgels soient recouverts d’un masque rouge et que le fond reste noir. Cliquez sur Appliquer.
REMARQUE: Si des microgels se chevauchent légèrement, utilisez l’outil Crayon pour dessiner une fine ligne noire (<5 pixels) entre les microgels afin de les séparer dans l’image en noir et blanc. - Sélectionnez Analyser > Analyser les particules. Réglez la taille (pixel2) de 50-Infinity pour réduire le bruit de fond. Définissez Circularity sur 0,00-1,00. Sélectionnez Afficher les contours dans le menu déroulant. Cochez Afficher les résultats, Exclure sur les bords et Inclure les trous. Laissez les cases restantes décochées. Cliquez sur OK.
- Un affichage des résultats s’ouvrira, y compris la zone, les descripteurs de forme et les informations de diamètre de Feret pour chaque microgel identifié. Copiez et collez les résultats dans une feuille de calcul.
- Déterminez le diamètre circulaire équivalent pour chaque particule.
- Obtenez l’échelle de l’image en μm/pixel à partir de la barre d’échelle ou des informations de l’instrument. Créez une colonne dans la feuille de calcul qui convertit la surface de chaque microgel du pixel2 au μm2.
- Utilisez la surface en μm2 pour déterminer le diamètre circulaire équivalent du microgel en μm (c.-à-d. prenez la racine carrée de la zone divisée par pi, puis doublez-la).
- Utilisez l’échelle μm/pixel pour convertir les diamètres du feret (c’est-à-dire la plus longue distance entre deux points quelconques de la limite des particules) pour chaque microgel en une unité de μm.
- La circularité (« Circ. »), le rapport d’aspect (« AR »), la rondeur (« Round ») et les valeurs de solidité pour chaque microgel peuvent être utilisés directement à partir d’ImageJ.
- Analysez la population de microgels comme vous le souhaitez, en tenant compte de la distribution des diamètres (circulaire équivalente et de Feret), de la circularité, du rapport d’aspect, de la rondeur et de la solidité.
Figure 3 : Vue d’ensemble de la caractérisation des particules de microgel fragmentées à l’aide d’ImageJ. La figure représente (A) la création d’une suspension diluée de particules de microgel fragmentées et l’utilisation d’un microscope épifluorescent ou confocal pour imager des microgels en suspension (barre d’échelle = 500 μm), (B) la conversion en image binaire dans ImageJ et l’analyse des particules (nombre, descripteurs de forme, etc.) et (C) des résultats représentatifs. Les barres d’erreur représentent min et max avec des plages de quartiles internes délimitées. Une taille de population de n = 100 microgels est indiquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Assemblage de microgels fragmentés en hydrogels granulaires
REMARQUE: Deux méthodes de formulation d’hydrogels granulaires à partir de microgels fragmentés sont présentées, en utilisant la centrifugation et la filtration. La méthode utilisée dépendra de l’emballage de microgel souhaité (c.-à-d. des particules de filtration plus denses) et de l’inclusion de composants biologiques (c.-à-d. que la centrifugation retiendra les composants entre les particules, alors que dans la filtration, ceux-ci peuvent être perdus). Les travaux antérieurs40 décrivent en détail les résultats comparatifs (c.-à-d. mécanique, porosité) pour les hydrogels granulaires formés à partir d’une centrifugeuse ou d’une filtration sous vide.
- Option 1 : Confiture de microgels fragmentés par centrifugation.
- Après avoir retiré le surnageant PBS de la dernière étape de lavage, ajoutez 1 mL de PBS à chaque tube de microcentrifugation et remettez en suspension les microgels.
- Faire tourner la suspension d’hydrogel fragmentée à 18 000 x g pendant 5 min.
REMARQUE: Des vitesses de centrifugeuse plus lentes peuvent être utilisées pour le brouillage de microgels en hydrogels granulaires avec un emballage moins dense si vous le souhaitez. - Retirez le surnageant PBS.
- Procurez-vous une seringue fraîche de 3 mL et retirez le piston. Utilisez une spatule métallique pour extraire l’hydrogel granulaire fragmenté du tube de microcentrifugation et le transférer à l’arrière du barillet de seringue vide. Une pointe de pipette peut être utilisée pour aider à transférer l’hydrogel granulaire dans la seringue. Remettez le piston dans la seringue. Maintenant, chargez l’hydrogel granulaire fragmenté dans la seringue et il est prêt à l’emploi.
- Option 2 : Confiture de microgels fragmentés à l’aide d’une filtration sous vide. Une vue d’ensemble du brouillage par filtration sous vide est illustrée à la figure 4.
- Assemblez et testez l’appareil de filtration sous vide.
- Fixez un entonnoir Buchner à l’intérieur d’une fiole filtrante, en plaçant l’adaptateur de filtre entre l’entonnoir et l’ouverture de la fiole.
- Utilisez un tube pour connecter le ballon filtrant à une conduite de vide.
- Placez un filtre à membrane (0,22 μm) dans la tasse en entonnoir Buchner.
- Allumez la ligne de vide en ouvrant la vanne à cadran. Testez le raccord en pipetant environ 0,5 mL de PBS sur le filtre à membrane et observez que tout le PBS passe à travers le filtre et s’accumule dans le fond de la fiole filtrante.
- Allumez la conduite de vide et assurez-vous d’une étanchéité complète. Vortex la suspension d’hydrogel fragmentée de sorte que les microgels sont suspendus dans PBS.
- À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, transférer la suspension d’hydrogel fragmentée sur le filtre à membrane (0,22 μm). Après avoir transféré toute la suspension de microgel, attendez environ 30 s pour que le vide tire PBS de la suspension d’hydrogel fragmentée. Éteignez la ligne de vide.
REMARQUE: Le temps pendant lequel la suspension d’hydrogel fragmentée repose sur le filtre à membrane tout en tirant le vide peut varier. Voir Discussion pour plus d’informations et des suggestions de dépannage. - Procurez-vous une seringue fraîche de 3 mL et retirez le piston. Utilisez une spatule métallique pour extraire l’hydrogel granulaire fragmenté du filtre et transférez-le à l’arrière du barillet de seringue vide. Une pointe de pipette peut être utilisée pour aider à transférer l’hydrogel granulaire dans la seringue. Remettez le piston dans la seringue. Chargez l’hydrogel granulaire fragmenté dans la seringue et il est maintenant prêt à l’emploi.
- Assemblez et testez l’appareil de filtration sous vide.
Figure 4 : Vue d’ensemble du brouillage des microgels par filtration sous vide pour fabriquer des hydrogels granulaires fragmentés bien emballés. La figure représente (A) le placement d’un filtre à membrane sur l’appareil de filtration sous vide, (B) l’utilisation d’une pipette pour transférer une suspension de microgel fragmentée sur le filtre, (C) le fait de tirer le vide et d’attendre que les microgels se bloquent et forment un hydrogel granulaire, (D) l’arrêt du vide et l’élimination de l’hydrogel granulaire fragmenté à l’aide d’une spatule métallique, et (E) l’utilisation d’une spatule métallique pour transférer l’hydrogel granulaire à la seringue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
5. Impression par extrusion avec des encres hydrogel granulaires
REMARQUE: Une vue d’ensemble du processus d’impression par extrusion est illustrée à la figure 5, y compris une impression représentative d’une construction en forme d’étoile à l’aide d’hydrogels granulaires fragmentés coincés par filtration sous vide. Le flux de travail d’impression consiste à formuler une encre, à planifier la conception d’impression, puis à imprimer l’encre en fonction de la conception souhaitée41. Si vous le souhaitez, les constructions d’hydrogel granulaires imprimées peuvent être stabilisées à l’aide de la photoréticulation post-extrusion en ajoutant un excès de TNT (5 mM) et d’I2959 (0,05 % en poids) à la suspension de microgel fragmentée avant le brouillage. Il en résultera des liaisons covalentes photocroisées formées entre les microgels, conduisant à une stabilisation permanente de la construction granulaire de l’hydrogel.
- Formulation de l’encre
- Pendant le processus de planification, gardez à l’esprit les propriétés de l’encre à utiliser. Pour caractériser l’encre, complétez l’analyse rhéologique des hydrogels fragmentés pour aider à éclairer le processus de conception de l’impression. Les méthodes décrivant la caractérisation rhéologique des hydrogels granulaires sont décrites ailleurs et peuvent être adaptées pour cette étude40.
- Dans l’analyse rhéologique, sélectionnez une plate-forme d’impression et une série de paramètres d’impression initiaux.
REMARQUE: En raison de la viscosité globale élevée et des propriétés d’amincissement par cisaillement des encres hydrogel granulaires, les imprimantes d’extrusion à vis sont généralement utilisées.
- Conception d’impression
REMARQUE: Le logiciel Repetier Host (ci-après appelé logiciel d’impression 3D) est utilisé pour les applications d’impression 3D (étapes 5.2-5.3).- Créez les conceptions d’impression à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Les utilisateurs peuvent créer de nouvelles conceptions à partir de zéro ou modifier des conceptions préexistantes, telles que des scans de tissus de patients ou d’autres utilisateurs. Pour plus d’informations sur la création de conceptions CAO, reportez-vous aux références suivantes 41,42,43.
- Pour traiter les modèles CAO en G-Code, assurez-vous que le fichier CAO est enregistré au format « .stl » (fichier supplémentaire 1) et téléchargé dans le logiciel d’impression 3D en sélectionnant le bouton de chargement dans le panneau supérieur ou en sélectionnant Fichier > Charger dans la barre de menus. Ce G-code définit le chemin d’impression pour le dépôt de l’encre. Un exemple de fichier .stl d’un cylindre creux a été inclus dans les fichiers supplémentaires.
- Une fois qu’un fichier STL a été téléchargé sur le logiciel d’impression 3D, accédez au panneau Slicer et sélectionnez Slic3r comme option de slicer. Ici, les paramètres tels que le diamètre de la buse, la hauteur de la couche, la vitesse d’impression et le taux d’extrusion peuvent être ajustés en fonction de la caractérisation de l’encre et des résultats d’impression souhaités. Dans ce protocole, une aiguille de 18 G (diamètre intérieur de 838 μm) est utilisée. La hauteur de la couche est réglée sur 1 mm, la vitesse d’impression est réglée sur 8 mm/s et le débit est réglé sur 9 μL/s, sur la base de l’optimisation précédente39. Les valeurs numériques des paramètres peuvent être ajustées à ± 20 % pour tenir compte des variations des propriétés des encres d’hydrogel granulaires.
REMARQUE: Il est important de noter que ces paramètres et la conception d’impression peuvent devoir être ajustés par des tests expérimentaux itératifs, en fonction des ajustements apportés à la formulation de l’encre, à la résolution d’impression souhaitée ou à la plate-forme d’impression utilisée. Pour plus d’informations sur ces paramètres, ainsi que sur la caractérisation des paramètres d’impression avec une nouvelle formulation d’encre, veuillez vous référer à d’autres références 40,44,45,46.
- Impression par extrusion avec des hydrogels granulaires fragmentés
- Pour le chargement de seringues avec des hydrogels granulaires fragmentés, voir 4.2.4, ainsi que figure 4 et figure 5.
- Retirez le capuchon de la pointe et remplacez-le par une aiguille de votre choix.
- Chargez la seringue dans la plate-forme d’impression de votre choix. Ici, une imprimante d’extrusion à vis sur mesure est utilisée.
REMARQUE: Pour plus d’informations sur la construction de bioimprimantes personnalisées, veuillez consulter d’autres références 44,47. - Chargez le fichier G-Code préparé de la phase de planification dans le logiciel d’impression 3D. Accédez au panneau Aperçu avant impression et appuyez sur Imprimer.
- Dès que le dépôt d’impression est terminé, exposez les constructions d’hydrogel granulaire fragmentées à la lumière UV pour la photoréticulation et la stabilisation.
- Une fois la réticulation terminée, traitez l’échantillon en le lavant trois fois dans PBS.
Figure 5 : Vue d’ensemble de l’impression par extrusion avec des hydrogels granulaires fragmentés. La figure représente (A) l’utilisation d’une spatule pour transférer l’hydrogel granulaire fragmenté dans un baril de seringue, (B) attachant une aiguille à pointe émoussée (18 G montrés) et poussant l’échantillon vers le haut, (C) un graphique représentant la connexion à un logiciel informatique pour l’impression, et (D) complétant l’impression d’une construction en forme d’étoile avec un hydrogel granulaire fragmenté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Les résultats représentatifs de ces protocoles sont présentés à la figure 3 et à la figure 6. La fragmentation par extrusion donne des microgels avec des formes polygonales déchiquetées avec des diamètres allant de 10 à 300 μm (Figure 3). De plus, la circularité varie de 0,2 (non circulaire) à près de 1 (cercle parfait), et le rapport d’aspect varie de 1 à 3 (Figure 3). Ces paramètres décrivent les formes irrégulières et déchiquetées des microgels formées par le processus de fragmentation.
Lorsqu’il est emballé ensemble à l’aide de la centrifugation ou de la filtration sous vide, l’hydrogel granulaire assemblé est amincissant par cisaillement et auto-cicatrisant, comme décrit dans les travauxprécédents 39. De plus, l’hydrogel granulaire fragmenté présente une fidélité de forme et une intégrité mécanique élevées pour un hydrogel injectable, comme le montre le dépôt d’un cylindre creux d’une hauteur de 2 cm par extrusion imprimé à la figure 6. Les hydrogels granulaires fragmentés fabriqués avec ces méthodes simples et rentables sont utiles pour de nombreuses applications biomédicales, y compris les thérapies injectables et les encres d’impression 3D.
Figure 6 : Aperçu du protocole et résultats représentatifs. La figure représente (A) la fragmentation, (B) les microgels en suspension, (C) le brouillage par filtration sous vide et (D) l’hydrogel granulaire coincé extrudé à travers une aiguille et imprimé dans un cylindre creux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Exemple de fichier .stl Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ici, les méthodes de fabrication d’hydrogels granulaires à l’aide de microgels fragmentés par extrusion et d’emballage par centrifugation ou filtration sous vide sont décrites. Comparée à d’autres méthodes de fabrication de microgels (c.-à-d. microfluidique, émulsions par lots, électropulvérisation, photolithographie), la fabrication de microgels à fragmentation par extrusion est très rapide, peu coûteuse, facilement évolutive et se prête à une grande variété de systèmes d’hydrogel. De plus, ce protocole est hautement reproductible avec une variabilité minimale d’un lot à l’autre, ce qui a été caractérisé dans les travauxprécédents 39.
Ce protocole utilise de l’acide hyaluronique modifié par norbornène (NorHA) pour fabriquer des hydrogels en vrac à l’aide d’une réaction thiol-ène photo-médiée. Les procédures détaillées pour la synthèse de NorHA sont décrites ailleurs38. Cependant, de nombreuses chimies d’hydrogel peuvent être utilisées pour fabriquer des microgels fragmentés en utilisant les méthodes décrites ici si un hydrogel en vrac peut être formé dans le baril d’une seringue. Il est également utile de comprendre les propriétés mécaniques de l’hydrogel en vrac (par exemple, le module de compression). Les hydrogels en vrac utilisés dans ce protocole ont un module de compression en vrac d’environ 30 kPa39. Un hydrogel en vrac avec un module de compression plus élevé nécessitera plus de force pour extruder pendant les étapes de fragmentation, ce qui pourrait entraîner une augmentation du colmatage ou une surpression des seringues; ainsi, il est recommandé d’utiliser des hydrogels avec des modules compressifs inférieurs à 80 kPa. De plus, un hydrogel en vrac avec des modules compressifs inférieurs à 10 kPa peut se déformer pendant les étapes de fragmentation, ce qui le rend difficile à fragmenter.
Ce protocole est optimisé pour une lampe uv spot cure. Comme alternative à la source de lumière UV et aux photoinitiateurs sensibles aux UV, les sources de lumière visible peuvent également être utilisées avec des photoinitiateurs sensibles à la lumière visible, tels que le phényl-2,4,6-triméthylbenzoyl-phosphinate (LAP) soluble dans l’eau. La concentration de l’initiateur, l’intensité lumineuse et le volume de l’échantillon influenceront les temps de réticulation en fonction du polymère et du système de réticulation utilisés. En outre, de nombreuses sources de lampes peuvent être utilisées comme alternative aux systèmes de durcissement ponctuel.
L’étape la plus critique du protocole est l’extrusion en série à travers des jauges d’aiguilles de plus en plus petites. Dans cette procédure, il est suggéré d’utiliser des jauges à aiguilles de 18 G (diamètre intérieur de 838 μm) à 30 G (diamètre intérieur de 159 μm). L’ajout de PBS à l’hydrogel en vrac fragmenté avant l’extrusion à travers des aiguilles est crucial pour réduire considérablement la force nécessaire à l’extrusion et à la fragmentation. Aucune force excessive ne doit être utilisée pour extruder l’hydrogel, car une force excessive peut entraîner une pression arrière dans la seringue et risquer de faire éclater l’hydrogel hors de la seringue. D’autres stratégies pour réduire la force requise pour extruder comprennent l’utilisation de plus d’aiguilles dans la série pour réduire la taille des fragments plus progressivement, ainsi que l’ajout de PBS supplémentaire entre les étapes de fragmentation.
Lors du brouillage des microgels fragmentés à l’aide d’une filtration sous vide, il peut y avoir une variabilité dans le processus. Certains systèmes de matériaux peuvent nécessiter plus (ou moins) de temps pour éliminer le PBS et bloquer complètement les microgels. Il est suggéré d’enregistrer le temps nécessaire aux systèmes de matériaux individuels afin d’assurer la répétabilité entre les expériences. Le temps de bourrage dépendra également de l’épaisseur et de la taille de l’échantillon ajouté au filtre. Répartir l’échantillon uniformément à travers le filtre peut aider à un brouillage uniforme.
La méthode de fabrication de microgels par extrusion-fragmentation peut être adaptée à de nombreuses applications biomédicales. Par exemple, les produits thérapeutiques peuvent être inclus dans la solution de précurseur d’hydrogel et ensuite encapsulés dans des microgels fragmentés pour fabriquer un hydrogel granulaire auto-cicatrisant et amincissant pour une administration thérapeutique localisée. De plus, des microgels fragmentés peuvent être séchés pour permettre un stockage à long terme et des pratiques de stérilisation simples. Cependant, une limitation à la fragmentation par extrusion est l’incorporation de cellules dans des microgels. En raison des taux de cisaillement élevés lors de la fragmentation par extrusion, la méthode ne se prête probablement pas à l’encapsulation cellulaire dans des microgels, car le cisaillement élevé peut entraîner une diminution significative de la viabilité cellulaire. Pourtant, les cellules et les sphéroïdes peuvent facilement être incorporés entre les microgels pour la culture in vitro et l’administration de cellules in vivo .
Les hydrogels granulaires fragmentés sont un biomatériau prometteur pour les applications biomédicales. Au cours des dernières années, des hydrogels granulaires fabriqués à partir de diverses méthodes de fragmentation (c.-à-d. mortier et pilon, mélangeurs et râpes à mailles) ont été utilisés comme encres d’impression 3D chargées de cellules48, véhicules d’administration thérapeutique29, échafaudages de réparation de tissus injectables30 et plates-formes de culture sphéroïde39. Parmi les méthodes de fragmentation précédemment décrites, la méthode de fragmentation par extrusion décrite ici est l’une des méthodes les plus simples et les plus rentables avec de nombreux avantages. Le partage des méthodes présentées ici augmentera l’accessibilité à la fabrication d’hydrogel granulaire et conduira à des avancées significatives dans le domaine en pleine croissance des biomatériaux d’hydrogel granulaire, permettant à davantage de chercheurs de concevoir des solutions biomédicales innovantes avec des hydrogels granulaires fragmentés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation par le biais du programme UPenn MRSEC (DMR-1720530) et des bourses de recherche d’études supérieures (à V.G.M et M.E.P.) et les National Institutes of Health (R01AR077362 à J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
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