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Bioengineering

जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए दानेदार हाइड्रोगेल में खंडित थोक हाइड्रोगेल और प्रसंस्करण

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63867
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute, University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science, University of Colorado Boulder

Summary

यह काम एक्सट्रूज़न विखंडन के साथ माइक्रोगेल बनाने के लिए सरल, अनुकूलनीय और कम लागत वाले तरीकों का वर्णन करता है, माइक्रोगेल को इंजेक्शन दानेदार हाइड्रोगेल में संसाधित करता है, और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक्सट्रूज़न प्रिंटिंग स्याही के रूप में दानेदार हाइड्रोगेल लागू करता है।

Abstract

दानेदार हाइड्रोगेल हाइड्रोगेल माइक्रोपार्टिकल्स (यानी, "माइक्रोगेल") की जाम असेंबली हैं। बायोमैटेरियल्स के क्षेत्र में, दानेदार हाइड्रोगेल में कई फायदेमंद गुण होते हैं, जिनमें कई माइक्रोगेल आबादी को मिलाकर इंजेक्शन, माइक्रोस्केल पोरसिटी और ट्यूनेबिलिटी शामिल हैं। माइक्रोगेल बनाने के तरीके अक्सर पानी में तेल पायस (जैसे, माइक्रोफ्लुइडिक्स, बैच इमल्शन, इलेक्ट्रोस्प्रेइंग) या फोटोलिथोग्राफी पर भरोसा करते हैं, जो संसाधनों और लागतों के मामले में उच्च मांग पेश कर सकते हैं, और कई हाइड्रोगेल के साथ संगत नहीं हो सकते हैं। यह काम एक्सट्रूज़न विखंडन का उपयोग करके माइक्रोगेल बनाने और उन्हें बायोमेडिकल अनुप्रयोगों (जैसे, 3 डी प्रिंटिंग स्याही) के लिए उपयोगी दानेदार हाइड्रोगेल में संसाधित करने के लिए सरल लेकिन अत्यधिक प्रभावी तरीकों का विवरण देता है। सबसे पहले, थोक हाइड्रोगेल (एक उदाहरण के रूप में फोटोक्रॉसलिंक करने योग्य हाइलूरोनिक एसिड (एचए) का उपयोग करके) को खंडित माइक्रोगेल बनाने के लिए क्रमिक रूप से छोटे व्यास के साथ सुइयों की एक श्रृंखला के माध्यम से बाहर निकाला जाता है। यह माइक्रोगेल निर्माण तकनीक तेजी से, कम लागत वाली और अत्यधिक स्केलेबल है। हाइड्रोगेल स्थिरीकरण के लिए वैकल्पिक पोस्ट-क्रॉसलिंकिंग के साथ सेंट्रीफ्यूजेशन और वैक्यूम-संचालित निस्पंदन द्वारा दानेदार हाइड्रोगेल में माइक्रोगेल को जाम करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। अंत में, खंडित माइक्रोगेल से निर्मित दानेदार हाइड्रोगेल को एक्सट्रूज़न प्रिंटिंग स्याही के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। जबकि यहां वर्णित उदाहरण 3 डी प्रिंटिंग के लिए फोटोक्रॉसलिंक करने योग्य एचए का उपयोग करते हैं, विधियां विभिन्न प्रकार के हाइड्रोगेल प्रकारों और बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैं।

Introduction

दानेदार हाइड्रोगेल हाइड्रोगेल कणों (यानी, माइक्रोगेल) की पैकिंग के माध्यम से गढ़े जाते हैं और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों 1,2,3 के लिए कई फायदेमंद गुणों के साथ बायोमैटेरियल्स का एक रोमांचक वर्ग हैं। उनकी कण संरचना के कारण, दानेदार हाइड्रोगेल कतरनी-पतला और आत्म-उपचार हैं, जो एक्सट्रूज़न प्रिंटिंग (जैव) स्याही के रूप में उनके उपयोग की अनुमति देते हैं, एम्बेडेड प्रिंटिंग के लिए दानेदार समर्थन करता है, और इंजेक्शन चिकित्सीय 4,5,6,7,8,9। इसके अतिरिक्त, माइक्रोगेल के बीच शून्य स्थान सेल आंदोलन और आणविक प्रसार 8,10,11 के लिए एक माइक्रोस्केल छिद्र प्रदान करता है। इसके अलावा, बढ़ी हुई ट्यूनेबिलिटी और सामग्री कार्यक्षमता 8,10,12,13 की अनुमति देने के लिए कई माइक्रोगेल आबादी को एक ही फॉर्मूलेशन में जोड़ा जा सकता है। इन महत्वपूर्ण गुणों ने हाल के वर्षों में दानेदार हाइड्रोगेल विकास के तेजी से विस्तार को प्रेरित किया है।

दानेदार हाइड्रोगेल निर्माण की दिशा में माइक्रोगेल बनाने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, जिनमें से प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोगेल अक्सर छोटी बूंद माइक्रोफ्लुइडिक्स 4,11,13,14,15,16,17, बैच इमल्शन 7,18,19,20,21,22, या इलेक्ट्रोस्प्रेइंग 6,23, का उपयोग करके पानी में तेल पायस से बनते हैं, 24,25. इन विधियों में या तो समान (माइक्रोफ्लुइडिक्स) या पॉलीडिस्पर्स (बैच इमल्शन, इलेक्ट्रोस्प्रेइंग) व्यास के साथ गोलाकार माइक्रोगेल उत्पन्न होते हैं। इन वाटर-इन-ऑयल इमल्शन फैब्रिकेशन विधियों की कुछ सीमाएं हैं, जिनमें संभावित रूप से कम-थ्रूपुट उत्पादन, कम चिपचिपाहट हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान की आवश्यकता और सेटअप के लिए उच्च लागत और संसाधन शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, इन प्रोटोकॉल को कठोर तेलों और सर्फैक्टेंट्स की आवश्यकता हो सकती है जिन्हें प्रसंस्करण चरणों को जोड़ने वाली प्रक्रियाओं का उपयोग करके माइक्रोगेल से धोया जाना चाहिए, और कई प्रयोगशालाओं में बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए बाँझ स्थितियों में अनुवाद करना मुश्किल हो सकता है। पानी में तेल पायस की आवश्यकता को दूर करते हुए, (फोटो) लिथोग्राफी का भी उपयोग किया जा सकता है, जहां हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान 1,26,27 से माइक्रोगेल के इलाज को नियंत्रित करने के लिए मोल्ड या फोटोमास्क का उपयोग किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स की तरह, इन विधियों को उनके उत्पादन थ्रूपुट में सीमित किया जा सकता है, जो बड़ी मात्रा में आवश्यक होने पर एक बड़ी चुनौती है।

इन विधियों के विकल्प के रूप में, थोक हाइड्रोगेल के यांत्रिक विखंडन का उपयोग अनियमित आकार 19,28,29,30,31,32 के साथ माइक्रोगेल बनाने के लिए किया गया है। उदाहरण के लिए, थोक हाइड्रोगेल को पूर्व-गठित किया जा सकता है और बाद में खंडित माइक्रोगेल बनाने के लिए जाल या छलनी के माध्यम से पारित किया जा सकता है, एक प्रक्रिया जो माइक्रोगेल किस्में33,34 के भीतर कोशिकाओं की उपस्थिति में भी की गई है। थोक हाइड्रोगेल को मोर्टार और मूसल के साथ पीसने या वाणिज्यिक ब्लेंडर35,36,37 के उपयोग के माध्यम से यांत्रिक व्यवधान के साथ माइक्रोगेल में भी संसाधित किया गया है। दूसरों ने खंडित माइक्रोगेल (यानी, द्रव जैल) 31 बनाने के लिए हाइड्रोगेल गठन के दौरान यांत्रिक आंदोलन का भी उपयोग किया है।

यहां विधियां इन यांत्रिक विखंडन तकनीकों पर विस्तार करती हैं और एक उदाहरण के रूप में फोटोक्रॉसलिंकेबल हाइलूरोनिक एसिड (एचए) हाइड्रोगेल का उपयोग करके, एक्सट्रूज़न विखंडन के साथ माइक्रोगेल बनाने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रस्तुत करती हैं। एक्सट्रूज़न विखंडन कम लागत, उच्च थ्रूपुट और आसानी से स्केलेबल विधि में खंडित माइक्रोगेल बनाने के लिए केवल सिरिंज और सुइयों का उपयोग करता है जो हाइड्रोगेल19,32 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, इन खंडित माइक्रोगेल को दानेदार हाइड्रोगेल में इकट्ठा करने के तरीकों को या तो सेंट्रीफ्यूजेशन (कम पैकिंग) या वैक्यूम-चालित निस्पंदन (उच्च पैकिंग) का उपयोग करके वर्णित किया गया है। अंत में, इन खंडित दानेदार हाइड्रोगेल के आवेदन को एक्सट्रूज़न प्रिंटिंग स्याही के रूप में उपयोग के लिए चर्चा की जाती है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सरल तरीकों को पेश करना है जो विभिन्न प्रकार के हाइड्रोगेल के अनुकूल हैं और दानेदार हाइड्रोगेल में रुचि रखने वाली लगभग किसी भी प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. फोटोक्रॉसलिंकिंग का उपयोग करके सिरिंज के अंदर थोक हाइड्रोगेल बनाना

नोट: फोटोक्रॉसलिंकिंग का उपयोग करके एक सिरिंज के अंदर थोक हाइड्रोगेल निर्माण का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। यह प्रोटोकॉल फोटो-मध्यस्थता थियोल-एन प्रतिक्रिया का उपयोग करके थोक हाइड्रोगेल बनाने के लिए नॉरबोर्न-संशोधित हाइलूरोनिक एसिड (नॉरएचए) का उपयोग करता है। नोरहा के संश्लेषण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को कहीं और वर्णित किया गया है38. हालांकि, यह प्रोटोकॉल किसी भी फोटोक्रॉसलिंक करने योग्य हाइड्रोगेल के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है। अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें.

  1. थोक हाइड्रोगेल सूत्रीकरण के लिए बहुलक, क्रॉसलिंकर और सर्जक की वांछित सांद्रता को पूर्वनिर्धारित करें। इस प्रोटोकॉल में, हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान में नॉरहा (2 डब्ल्यूटी%, ~ 25% डिग्री नॉरबोर्न संशोधन), डाइथियोथ्रिटोल (डीटीटी, 6 एमएम), और इरगैक्योर डी -2959 (आई 2959, 0.05 डब्ल्यूटी। सुनिश्चित करें कि घटक (1 एमएल) पूरी तरह से एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के भीतर फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में भंग हो जाते हैं।
    नोट: हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान तैयार करते समय, उच्च आणविक भार एफआईटीसी-डेक्सट्रान (2 एमडीए, 0.1 डब्ल्यूटी.%) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटोकॉल में बाद में गढ़े गए माइक्रोगेल की कल्पना करने के लिए समाधान में जोड़ा जा सकता है।
  2. हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज लोड करें।
    1. एक खाली 3 मिलीलीटर सिरिंज के पीछे से सवार निकालें और सिरिंज बैरल के शीर्ष पर एक टिप टोपी जोड़ें।
    2. टिप कैप के साथ सिरिंज बैरल में हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान को स्थानांतरित करने के लिए 1,000 μL विंदुक का उपयोग करें।
    3. एक हाथ में हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान के साथ सिरिंज बैरल पकड़ो, टिप कैप नीचे की ओर और बैरल के खुले छोर का सामना करना पड़ रहा है। दूसरी ओर, सिरिंज प्लंजर को सिरिंज बैरल के पीछे के उद्घाटन पर वापस करें। धीरे-धीरे सिरिंज सवार को बैरल में धक्का दें, बस सिरिंज बैरल के पीछे उद्घाटन को सील करने के लिए पर्याप्त है।
    4. ध्यान से सवार और सिरिंज बैरल को एक साथ पकड़ना यह सुनिश्चित करने के लिए कि सिरिंज बैरल के पीछे सवार के साथ सील कर दिया गया है, सिरिंज को उल्टा करें जैसे कि सवार नीचे का सामना कर रहा है, और टिप कैप अब सामना कर रहा है। टिप कैप निकालें और धीरे-धीरे सवार को सिरिंज बैरल में धक्का दें जब तक कि सभी हवा सिरिंज से हटा न जाए (बस हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान रहता है)।
    5. सिरिंज के लिए टिप टोपी फिर से संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान एक टिप टोपी के साथ 3 एमएल सिरिंज के भीतर सुरक्षित है।
  3. 3 एमएल सिरिंज के भीतर एक थोक हाइड्रोगेल बनाएं।
    1. यूवी लैंप को चालू करने से पहले उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) और सुरक्षा उपाय सुनिश्चित करें। इसमें यूवी-रक्षक चश्मा पहनना और यूवी प्रकाश से दूसरों की रक्षा के लिए दीपक क्षेत्र को घेरना शामिल है।
    2. एक रेडियोमीटर का उपयोग करके यूवी स्पॉट इलाज दीपक को 10 मेगावाट / सेमी2 की हल्की तीव्रता के लिए कैलिब्रेट करें।
      नोट: सिरिंज बैरल के माध्यम से प्रकाश क्षीणन होगा। निर्माण से पहले, रेडियोमीटर का उपयोग करके मौजूद प्रकाश क्षीणन का प्रतिशत निर्धारित करें। स्पॉट इलाज प्रणाली से प्रकाश तीव्रता आउटपुट को इस तरह के क्षीणन के लिए तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
    3. पूरी तरह से फोटोक्रॉसलिंक करने के लिए वांछित समय के लिए यूवी स्पॉट इलाज दीपक के तहत हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान के साथ लोड 3 एमएल सिरिंज रखें। यहां वर्णित प्रणाली के लिए, नॉरहा हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान 10 मेगावाट / सेमी2 की तीव्रता पर 5 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क में है, जो पूर्व अध्ययन39 के आधार पर, फोटोक्रॉसलिंकिंग ऑसिलेटरी कतरनी रियोलॉजी टाइम स्वीप द्वारा निर्धारित पूर्ण क्रॉसलिंकिंग सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से पर्याप्त समय और प्रकाश तीव्रता थी।
      नोट: सिरिंज के भीतर पूर्ण फोटोक्रॉसलिंकिंग सुनिश्चित करने के लिए, सिरिंज को फोटोक्रॉसलिंकिंग अवधि के माध्यम से आधे रास्ते में फ़्लिप किया जा सकता है।
    4. यूवी लैंप बंद करें और सिरिंज को हटा दें। सुनिश्चित करें कि हाइड्रोगेल अब सिरिंज के भीतर फोटोक्रॉस जुड़ा हुआ है। यह प्लंजर को वापस खींचकर और हाइड्रोगेल चाल को चिपचिपा तरल के बजाय एक ठोस ब्लॉक के रूप में देखकर किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: फोटोक्रॉसलिंकिंग का उपयोग करके एक सिरिंज के अंदर थोक हाइड्रोगेल बनाने का अवलोकन। आंकड़ा दर्शाता है (ए) सिरिंज से सवार को हटाना, (बी) सिरिंज बैरल के लिए टिप कैप को सुरक्षित करना, (सी) सिरिंज बैरल में हाइड्रोगेल अग्रदूत जोड़ना, (डी) सवार को सिरिंज में लौटाना, (ई) अतिरिक्त हवा को हटाना और टिप कैप को सुरक्षित करना, और (एफ) सिरिंज के अंदर फोटोक्रॉसलिंकिंग बल्क हाइड्रोगेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. एक्सट्रूज़न विखंडन का उपयोग करके माइक्रोगेल बनाना

नोट: बाहर निकालना विखंडन का उपयोग माइक्रोगेल निर्माण का अवलोकन चित्रा 2 में दिखाया गया है।

  1. एक खाली 3 मिलीलीटर सिरिंज के पीछे से सवार निकालें। ल्यूयर-लॉक के लिए एक टिप कैप सुरक्षित करें।
  2. फोटोक्रॉसलिंक किए गए थोक हाइड्रोगेल युक्त सिरिंज से टिप कैप निकालें। खाली सिरिंज पर बैरल के उद्घाटन के साथ हाइड्रोगेल सिरिंज के शीर्ष को लाइन करें।
  3. खाली सिरिंज के बैरल में सिरिंज खोलने (कोई सुई संलग्न नहीं) के माध्यम से थोक हाइड्रोगेल बाहर निकालना। सिरिंज को ठीक से त्याग दें जो अब खाली है (पहले हाइड्रोगेल निहित) उचित अपशिष्ट धारा में।
  4. सिरिंज को पकड़ो जिसमें एक्सट्रूडेड हाइड्रोगेल होता है जैसे कि टिप कैप नीचे की ओर है, और बैरल खोलने का सामना करना पड़ रहा है। एक 1,000 μL विंदुक का उपयोग कर, सिरिंज बैरल के लिए पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. बैरल के उद्घाटन के साथ सिरिंज सवार को संरेखित करें, बस एक सील बनाने के लिए पर्याप्त रूप से सवार को मुश्किल से धक्का दें। सिरिंज को इस तरह से उल्टा करें कि सवार अब नीचे का सामना कर रहा है और टिप कैप ऊपर का सामना कर रहा है, जिससे सवार और सिरिंज बैरल को एक साथ पकड़ना सुनिश्चित हो जाता है ताकि कोई हाइड्रोगेल या पीबीएस लीक न हो। पीबीएस के साथ खंडित हाइड्रोगेल को मिश्रण करने के लिए कई बार पलटें।
  6. सिरिंज को इस तरह से पकड़ें कि टिप कैप ऊपर की ओर है और प्लंजर नीचे की ओर है। टिप कैप निकालें। सिरिंज के अंदर से किसी भी हवा को हटाने के लिए बहुत धीरे से सवार को ऊपर की ओर धकेलें।
    नोट: संभवतः 3 एमएल सिरिंज के पीछे एक नाली होगी जिसे सवार को धक्का देने के लिए अतिरिक्त बल की आवश्यकता होगी। नाली पर प्लंजर को बहुत सावधानी से धक्का दें। बल की किसी भी अचानक या कठोर मात्रा में सवार बहुत तेजी से आगे बढ़ेगा और संभवतः खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को निष्कासित कर देगा।
  7. खंडित माइक्रोगेल बनाने के लिए सुइयों की एक श्रृंखला के माध्यम से खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को बाहर निकालें।
    1. खंडित हाइड्रोगेल और पीबीएस युक्त सिरिंज के शीर्ष पर एक कुंद टिप 18 जी सुई सुरक्षित करें। एक ताजा 3 मिलीलीटर सिरिंज से सवार निकालें और खाली सिरिंज बैरल के लिए एक टिप टोपी सुरक्षित।
    2. खाली सिरिंज बैरल के पीछे 18 जी सुई के माध्यम से खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को बाहर निकालें। खाली सिरिंज और सुई को उचित शार्प अपशिष्ट धारा में त्यागें।
    3. सिरिंज को पकड़ो जिसमें खंडित हाइड्रोगेल निलंबन होता है जैसे कि टिप कैप नीचे की ओर है और बैरल खोलने का सामना करना पड़ रहा है। बैरल के उद्घाटन के साथ सिरिंज सवार को संरेखित करें, बस एक सील बनाने के लिए पर्याप्त रूप से सवार को मुश्किल से धक्का दें।
    4. सिरिंज को उल्टा करें जैसे कि सवार अब नीचे का सामना कर रहा है, और टिप कैप का सामना करना पड़ रहा है, जिससे सवार और सिरिंज बैरल को एक साथ पकड़ना सुनिश्चित हो जाता है ताकि कोई हाइड्रोगेल या पीबीएस लीक न हो।
    5. सिरिंज को इस तरह से पकड़ें कि टिप कैप ऊपर की ओर है और प्लंजर नीचे की ओर है। टिप कैप निकालें। सिरिंज के अंदर से किसी भी हवा को हटाने के लिए बहुत धीरे से सवार को ऊपर की ओर धकेलें। हाइड्रोगेल सामग्री के अवांछित निष्कासन को रोकने के लिए सिरिंज सवार को धीरे-धीरे अंदर की ओर धकेलने के बारे में ऊपर दिए गए नोट को देखें।
    6. 23 जी, 27 जी और 30 जी सुई के साथ चरण 2.7.1-2.7.5 दोहराएं। अंतिम एक्सट्रूज़न चरण (30 ग्राम सुई) पर, खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में बाहर निकालें। यहां वर्णित वॉल्यूम के लिए, अंतिम खंडित हाइड्रोगेल निलंबन मात्रा ~ 2.5 एमएल होगी, जिसमें दो 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब (वॉल्यूम स्प्लिट समान रूप से) की आवश्यकता होती है।
      नोट: सुइयों के माध्यम से खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को बाहर निकालने के लिए कोई अत्यधिक बल की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए। सर्वोत्तम सुरक्षा प्रथाओं के लिए, एक्सट्रूज़न के दौरान सिरिंज ओवर-प्रेशराइजेशन की स्थिति में सुरक्षा प्रदान करने के लिए रासायनिक हुड के अंदर सभी एक्सट्रूज़न विखंडन चरणों को करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, इस प्रक्रिया को निर्माण के दौरान बाँझपन बनाए रखने के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट / लामिना प्रवाह हुड में आसानी से किया जा सकता है। अतिरिक्त समस्या निवारण सुझावों के लिए चर्चा देखें.
  8. खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को धोएं और अलग करें।
    नोट: खंडित माइक्रोगेल धोने से किसी भी अनियंत्रित बहुलक और क्रॉसलिंकर को हटाने में मदद मिलेगी। इसके अलावा, सेंट्रीफ्यूजिंग एक गोली बनाकर निलंबन से माइक्रोगेल को अलग करने में मदद करेगा।
    1. एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज का उपयोग करके, 5 मिनट के लिए 5,000 एक्स जी पर खंडित माइक्रोगेल निलंबन को स्पिन करें।
    2. सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। 5-10 एस के लिए खंडित माइक्रोगेल और भंवर युक्त प्रत्येक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
    3. पीबीएस 3x के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग और धोने को दोहराएं।

Figure 2
चित्रा 2: एक्सट्रूज़न विखंडन का उपयोग करके माइक्रोगेल निर्माण का अवलोकन। आंकड़ा (ए) एक खाली सिरिंज बैरल में थोक हाइड्रोगेल को बाहर निकालना और पीबीएस जोड़ना, (बी) खंडित हाइड्रोगेल के साथ सिरिंज में एक सवार को सुरक्षित करना, (सी) एक 18 जी सुई संलग्न करना और एक खाली सिरिंज बैरल में खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को बाहर निकालना, और (डी) 23 जी, 27 जी और 30 जी सुइयों के साथ एक्सट्रूज़न विखंडन चरणों को दोहराना, अंतिम एक्सट्रूज़न पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में खंडित हाइड्रोगेल निलंबन एकत्र करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. इमेजजे का उपयोग करके खंडित माइक्रोगेल की विशेषता

नोट: इमेजजे का उपयोग करके खंडित माइक्रोगेल की विशेषता का अवलोकन चित्रा 3 में दिखाया गया है, साथ ही खंडित माइक्रोगेल के बैच के भीतर आकार वितरण और आकार का वर्णन करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम भी दिखाए गए हैं। विज़ुअलाइज़ेशन से पहले माइक्रोगेल को फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, उच्च अणु वजन एफआईटीसी-डेक्सट्रान (2 एमडीए) को फ्लोरोसिन-लेबल वाले माइक्रोगेल बनाने के लिए विखंडन से पहले थोक हाइड्रोगेल में समझाया जा सकता है।

  1. एक पतला खंडित माइक्रोगेल निलंबन बनाने के लिए पीबीएस के 180 μL के साथ खंडित माइक्रोगेल निलंबन के 20 μL गठबंधन। भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
  2. एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए पतला खंडित माइक्रोगेल निलंबन के 50 μL स्थानांतरण।
  3. 4x या 10x ज़ूम पर फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले माइक्रोगेल की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: माइक्रोगेल निलंबन को पर्याप्त पतला होना चाहिए जैसे कि पड़ोसी माइक्रोगेल एक दूसरे के संपर्क में नहीं हैं, फिर भी पर्याप्त केंद्रित हैं जैसे कि दर्जनों माइक्रोगेल व्यूपोर्ट में दिखाई देते हैं। माइक्रोगेल निलंबन के कमजोर पड़ने को इसे प्राप्त करने के लिए तदनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  4. खंडित माइक्रोगेल कणों का विश्लेषण करने के लिए इमेजजे का उपयोग करना। इमेजजे में विश्लेषण कण कार्यक्षमता का उपयोग करने के बारे में अतिरिक्त जानकारी सामग्री की तालिका में प्रदान किए गए लिंक में पाई जा सकती है।
    1. इमेजजे में निलंबन में माइक्रोगेल की छवियों को खोलें।
    2. विश्लेषण > सेट माप, क्षेत्र की जाँच करें, आकृति वर्णनकर्ता और फेरेट का व्यास का चयन करें। क्लिक करें,OK.
    3. छवि > टाइप > 8-बिट का चयन करें।
    4. छवि का चयन करें > थ्रेशोल्ड समायोजित > करें। थ्रेसहोल्ड को समायोजित करें जैसे कि माइक्रोगेल को लाल मुखौटा द्वारा कवर किया जाता है, और पृष्ठभूमि काली रहती है। अप्लाई पर क्लिक करें।
      नोट: यदि कोई माइक्रोगेल थोड़ा ओवरलैपिंग कर रहे हैं, तो काले और सफेद छवि में उन्हें अलग करने के लिए माइक्रोगेल के बीच एक पतली (<5 पिक्सेल) काली रेखा खींचने के लिए पेंसिल टूल का उपयोग करें।
    5. कणों का विश्लेषण > विश्लेषण करें का चयन करें। पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए 50-इन्फिनिटी से आकार (पिक्सेल2) सेट करें। परिपत्रता को 0.00-1.00 पर सेट करें। ड्रॉपडाउन मेनू से बाह्यरेखाएँ दिखाएँ का चयन करें. प्रदर्शन परिणामों की जाँच करें, किनारों पर बाहर करें, और छेद शामिल करें। शेष बक्से को अनियंत्रित छोड़ दें। ओके पर क्लिक करें।
    6. एक परिणाम प्रदर्शन खुलेगा, जिसमें पहचाने गए प्रत्येक माइक्रोगेल के लिए क्षेत्र, आकार वर्णनकर्ता और फेरेट के व्यास की जानकारी शामिल है। परिणामों को स्प्रेडशीट में कॉपी और पेस्ट करें।
    7. प्रत्येक कण के लिए समतुल्य परिपत्र व्यास निर्धारित करें।
      1. स्केल बार या साधन जानकारी से μm/पिक्सेल में छवि पैमाने प्राप्त करें। स्प्रेडशीट में एक कॉलम बनाएं जो प्रत्येक माइक्रोगेल के क्षेत्र को पिक्सेल2 से μm2 में परिवर्तित करता है।
      2. μm में माइक्रोगेल के समतुल्य वृत्ताकार व्यास को निर्धारित करने के लिए μm2 में क्षेत्र का उपयोग करें (यानी, पाई द्वारा विभाजित क्षेत्र के वर्गमूल को लें, फिर इसे दोगुना करें)।
    8. पिक्सेल पैमाने का उपयोग प्रत्येक माइक्रोगेल के लिए फेरेट के व्यास (यानी, कण सीमा पर किसी भी दो बिंदुओं के बीच सबसे लंबी दूरी) को μm की एक इकाई में परिवर्तित करने के लिए करें।
    9. परिपत्रता ("सर्क"), पहलू अनुपात ("एआर"), गोलाई ("राउंड"), और प्रत्येक माइक्रोगेल के लिए ठोसता मूल्यों का उपयोग इमेजजे से प्रत्यक्ष रूप से किया जा सकता है।
    10. वांछित के रूप में माइक्रोगेल आबादी का विश्लेषण करें, व्यास (समतुल्य परिपत्र और फेरेट), परिपत्रता, पहलू अनुपात, गोलाई और दृढ़ता के वितरण पर विचार करें।

Figure 3
चित्रा 3: इमेजजे का उपयोग करके खंडित माइक्रोगेल कणों की विशेषता का अवलोकन। आंकड़ा दर्शाता है (ए) खंडित माइक्रोगेल कणों का एक पतला निलंबन बनाना और निलंबन (स्केल बार = 500 μm) में माइक्रोगेल की छवि के लिए एक एपिफ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, (बी) इमेजजे में एक बाइनरी छवि में परिवर्तित करना और कणों (गिनती, आकार वर्णनकर्ता, आदि) का विश्लेषण करना, और (सी) प्रतिनिधि परिणाम। त्रुटि सलाखों आंतरिक चतुर्थक पर्वतमाला सीमांकित के साथ न्यूनतम और अधिकतम चित्रित करते हैं। एन = 100 माइक्रोगेल की आबादी का आकार दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. दानेदार हाइड्रोगेल में खंडित माइक्रोगेल को इकट्ठा करना

नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन का उपयोग करके खंडित माइक्रोगेल से दानेदार हाइड्रोगेल के निर्माण के लिए दो तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। उपयोग की जाने वाली विधि वांछित माइक्रोगेल पैकिंग (यानी, निस्पंदन पैक कणों को अधिक घनीभूत) पर निर्भर करेगी और क्या जैविक घटक शामिल हैं (यानी, सेंट्रीफ्यूजेशन कणों के बीच घटकों को बनाए रखेगा, जबकि निस्पंदन में ये खो सकते हैं)। पूर्व कार्य40 पूरी तरह से अपकेंद्रित्र या वैक्यूम संचालित निस्पंदन से गठित दानेदार हाइड्रोगेल के लिए तुलनात्मक परिणामों (यानी, यांत्रिकी, छिद्र) का वर्णन करता है।

  1. विकल्प 1: सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके जाम खंडित माइक्रोगेल।
    1. अंतिम धोने के चरण से पीबीएस सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद, प्रत्येक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और माइक्रोगेल को फिर से निलंबित करें।
    2. 5 मिनट के लिए 18,000 एक्स जी पर खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को स्पिन करें।
      नोट: धीमी अपकेंद्रित्र गति का उपयोग वांछित होने पर कम घने पैकिंग के साथ दानेदार हाइड्रोगेल में माइक्रोगेल के जामिंग के लिए किया जा सकता है।
    3. पीबीएस सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    4. एक ताजा 3 मिलीलीटर सिरिंज प्राप्त करें और सवार को हटा दें। माइक्रोसेंट्रिफुज ट्यूब से खंडित दानेदार हाइड्रोगेल को स्कूप करने और इसे खाली सिरिंज बैरल के पीछे स्थानांतरित करने के लिए एक धातु स्पैटुला का उपयोग करें। सिरिंज में दानेदार हाइड्रोगेल को स्थानांतरित करने में सहायता के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग किया जा सकता है। सवार सिरिंज के लिए वापस करो. अब खंडित दानेदार हाइड्रोगेल को सिरिंज में लोड करें, और यह उपयोग के लिए तैयार है।
  2. विकल्प 2: वैक्यूम संचालित निस्पंदन का उपयोग करके जाम खंडित माइक्रोगेल। वैक्यूम संचालित निस्पंदन द्वारा जाम का अवलोकन चित्रा 4 में दर्शाया गया है।
    1. वैक्यूम संचालित निस्पंदन उपकरण को इकट्ठा करें और परीक्षण करें।
      1. फिल्टर फ्लास्क के अंदर एक बुचनर फ़नल सुरक्षित करें, फ़िल्टर एडाप्टर को फ़नल और फ्लास्क खोलने के बीच में रखें।
      2. फिल्टर फ्लास्क को वैक्यूम लाइन से कनेक्ट करने के लिए ट्यूबिंग का उपयोग करें।
      3. बुचनर फ़नल कप में एक झिल्ली फ़िल्टर (0.22 μm) रखें।
      4. डायल वाल्व खोलकर वैक्यूम लाइन चालू करें। झिल्ली फिल्टर पर पीबीएस के ~ 0.5 एमएल पाइपिंग द्वारा कनेक्शन का परीक्षण करें और निरीक्षण करें कि सभी पीबीएस फिल्टर के माध्यम से जाते हैं और फिल्टर फ्लास्क के नीचे इकट्ठा होते हैं।
    2. वैक्यूम लाइन चालू करें और एक पूर्ण मुहर सुनिश्चित करें। खंडित हाइड्रोगेल निलंबन को भंवर करें ताकि माइक्रोगेल पीबीएस में निलंबित हो जाएं।
    3. एक 1,000 μL विंदुक का उपयोग कर, झिल्ली फिल्टर (0.22 μm) पर खंडित हाइड्रोगेल निलंबन हस्तांतरण। पूरे माइक्रोगेल निलंबन को स्थानांतरित करने के बाद, खंडित हाइड्रोगेल निलंबन से पीबीएस को खींचने के लिए वैक्यूम के लिए ~ 30 एस की प्रतीक्षा करें। वैक्यूम लाइन बंद करें।
      नोट: वैक्यूम खींचने के दौरान खंडित हाइड्रोगेल निलंबन झिल्ली फिल्टर पर बैठता है कि समय विविध हो सकता है। अधिक जानकारी और समस्या निवारण सुझावों के लिए चर्चा देखें.
    4. एक ताजा 3 मिलीलीटर सिरिंज प्राप्त करें और सवार को हटा दें। फिल्टर से खंडित दानेदार हाइड्रोगेल को स्कूप करने और इसे खाली सिरिंज बैरल के पीछे स्थानांतरित करने के लिए एक धातु स्पैटुला का उपयोग करें। सिरिंज में दानेदार हाइड्रोगेल को स्थानांतरित करने में सहायता के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग किया जा सकता है। सवार सिरिंज के लिए वापस करो. खंडित दानेदार हाइड्रोगेल को सिरिंज में लोड करें, और यह अब उपयोग के लिए तैयार है।

Figure 4
चित्रा 4: कसकर पैक खंडित दानेदार हाइड्रोगेल बनाने के लिए वैक्यूम संचालित निस्पंदन द्वारा जामिंग माइक्रोगेल का अवलोकन। आंकड़ा (ए) वैक्यूम निस्पंदन तंत्र पर एक झिल्ली फिल्टर रखता है, (बी) फिल्टर पर खंडित माइक्रोगेल निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करना, (सी) वैक्यूम खींचना और माइक्रोगेल को जाम करने और दानेदार हाइड्रोगेल बनाने की प्रतीक्षा करना, (डी) वैक्यूम को बंद करना और धातु स्पैटुला का उपयोग करके खंडित दानेदार हाइड्रोगेल को हटाना, और (ई) सिरिंज में दानेदार हाइड्रोगेल को स्थानांतरित करने के लिए धातु स्पैटुला का उपयोग करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. दानेदार हाइड्रोगेल स्याही के साथ बाहर निकालना मुद्रण

नोट: एक्सट्रूज़न प्रिंटिंग प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 5 में दिखाया गया है, जिसमें वैक्यूम-संचालित निस्पंदन के साथ जाम किए गए खंडित दानेदार हाइड्रोगेल का उपयोग करके स्टार के आकार के निर्माण का प्रतिनिधि प्रिंट शामिल है। मुद्रण वर्कफ़्लो में एक स्याही तैयार करना, प्रिंट डिज़ाइन की योजना बनाना और फिर वांछित डिज़ाइन41 के आधार पर स्याही मुद्रित करना शामिल है। यदि वांछित है, तो मुद्रित दानेदार हाइड्रोगेल निर्माणों को जैमिंग से पहले खंडित माइक्रोगेल निलंबन में अतिरिक्त डीटीटी (5 एमएम) और आई 2 9 5 9 (0.05 डब्ल्यूटी) जोड़कर फोटोक्रॉसलिंकिंग पोस्ट-एक्सट्रूज़न का उपयोग करके स्थिर किया जा सकता है। इसके परिणामस्वरूप माइक्रोगेल के बीच फोटोक्रॉसलिंक्ड सहसंयोजक बंधन बनेंगे, जिससे दानेदार हाइड्रोगेल निर्माण का स्थायी स्थिरीकरण होगा।

  1. स्याही का निर्माण
    1. नियोजन प्रक्रिया के दौरान, उपयोग की जाने वाली स्याही के गुणों को ध्यान में रखें। स्याही को चिह्नित करने के लिए, प्रिंट डिजाइन प्रक्रिया को सूचित करने में मदद करने के लिए खंडित हाइड्रोगेल के रियोलॉजिकल विश्लेषण को पूरा करें। दानेदार हाइड्रोगेल के रियोलॉजिकल लक्षण वर्णन का वर्णन करने वाले तरीके कहीं और वर्णित हैं और इस अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकताहै 40.
    2. रियोलॉजिकल विश्लेषण से, एक प्रिंटिंग प्लेटफ़ॉर्म और प्रारंभिक प्रिंट मापदंडों की एक श्रृंखला का चयन करें।
      नोट: दानेदार हाइड्रोगेल स्याही के समग्र उच्च चिपचिपाहट और कतरनी-पतले गुणों के कारण, स्क्रू-आधारित एक्सट्रूज़न प्रिंटर आमतौर पर उपयोग किए जाते हैं।
  2. मुद्रण डिज़ाइन
    नोट: रिपीटियर होस्ट सॉफ़्टवेयर (अब से 3 डी प्रिंटिंग सॉफ़्टवेयर के रूप में संदर्भित) का उपयोग 3 डी प्रिंटिंग एप्लिकेशन (चरण 5.2-5.3) के लिए किया जाता है।
    1. कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ़्टवेयर के माध्यम से प्रिंट डिज़ाइन बनाएं। उपयोगकर्ता खरोंच से उपन्यास डिज़ाइन बना सकते हैं या पहले से मौजूद डिज़ाइनों को संशोधित कर सकते हैं, जैसे कि रोगी ऊतक स्कैन से या अन्य उपयोगकर्ताओं से। सीएडी डिजाइन बनाने के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया निम्नलिखित संदर्भ 41,42,43 देखें।
    2. सीएडी मॉडल को जी-कोड में संसाधित करने के लिए, सुनिश्चित करें कि सीएडी फ़ाइल को ".stl" प्रारूप (पूरक फ़ाइल 1) में सहेजा गया है और शीर्ष पैनल में लोड बटन का चयन करके या मेनू बार में फ़ाइल > लोड का चयन करके 3 डी प्रिंटिंग सॉफ़्टवेयर पर अपलोड किया गया है। यह जी-कोड स्याही के जमाव के लिए मुद्रण पथ को परिभाषित करता है। एक खोखले सिलेंडर का एक उदाहरण .stl फ़ाइल पूरक फ़ाइलों में शामिल किया गया है।
    3. एक बार जब एक एसटीएल फ़ाइल 3 डी प्रिंटिंग सॉफ़्टवेयर पर अपलोड हो जाती है, तो स्लाइसर पैनल पर नेविगेट करें और स्लाइसर विकल्प के रूप में स्लिक 3 आर का चयन करें। यहां, नोजल व्यास, परत ऊंचाई, प्रिंट गति और एक्सट्रूज़न दर जैसी सेटिंग्स को स्याही लक्षण वर्णन और वांछित मुद्रण परिणामों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एक 18 जी सुई (838 μm का आंतरिक व्यास) का उपयोग किया जाता है। परत की ऊंचाई 1 मिमी पर सेट है, प्रिंट गति 8 मिमी / सेकंड पर सेट है, और प्रवाह दर पिछले अनुकूलन39 के आधार पर 9 μL / सेकंड पर सेट है। दानेदार हाइड्रोगेल स्याही के गुणों में भिन्नता के लिए मापदंडों के संख्यात्मक मूल्यों को 20% ± द्वारा समायोजित किया जा सकता है।
      नोट: यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन सेटिंग्स और प्रिंट डिज़ाइन को पुनरावृत्ति प्रयोगात्मक परीक्षणों के माध्यम से समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, जो स्याही निर्माण, वांछित प्रिंट रिज़ॉल्यूशन या प्रिंटिंग प्लेटफ़ॉर्म के समायोजन पर निर्भर करता है। इन मापदंडों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, साथ ही एक उपन्यास स्याही सूत्रीकरण के साथ प्रिंट सेटिंग्स के लक्षण वर्णन पर, कृपया अन्य संदर्भ 40,44,45,46 देखें।
  3. खंडित दानेदार हाइड्रोगेल के साथ एक्सट्रूज़न प्रिंटिंग
    1. खंडित दानेदार हाइड्रोगेल के साथ सिरिंज लोड करने के लिए, 4.2.4, साथ ही चित्रा 4 और चित्रा 5 देखें।
    2. टिप कैप निकालें और इसे पसंद की सुई से बदलें।
    3. पसंद के मुद्रण मंच में सिरिंज लोड करें। यहां, एक कस्टम-निर्मित स्क्रू-आधारित एक्सट्रूज़न प्रिंटर का उपयोग किया जाता है।
      नोट: कस्टम बायोप्रिंटर के निर्माण के बारे में जानकारी के लिए, कृपया अन्य संदर्भ44,47 देखें।
    4. 3 डी प्रिंटिंग सॉफ़्टवेयर में योजना चरण से तैयार जी-कोड फ़ाइल लोड करें। मुद्रण पूर्वावलोकन फलक पर नेविगेट करें और मुद्रण दबाएँ.
    5. जैसे ही मुद्रण जमाव पूरा हो जाता है, फोटोक्रॉसलिंकिंग और स्थिरीकरण के लिए यूवी प्रकाश में खंडित दानेदार हाइड्रोगेल निर्माणों को उजागर करें।
    6. एक बार क्रॉसलिंकिंग पूरा हो जाने के बाद, नमूने को पीबीएस में तीन बार धोकर संसाधित करें।

Figure 5
चित्रा 5: खंडित दानेदार हाइड्रोगेल के साथ बाहर निकालना मुद्रण का अवलोकन। आंकड़ा (ए) खंडित दानेदार हाइड्रोगेल को एक सिरिंज बैरल में स्थानांतरित करने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करके दर्शाता है, (बी) एक कुंद-टिप सुई संलग्न करता है (18 जी दिखाया गया है) और नमूने को शीर्ष पर धकेलना, (सी) मुद्रण के लिए कंप्यूटर सॉफ्टवेयर से कनेक्शन का प्रतिनिधित्व करने वाला एक ग्राफिक, और (डी) खंडित दानेदार हाइड्रोगेल के साथ स्टार के आकार के निर्माण की छपाई को पूरा करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

इन प्रोटोकॉल से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 और चित्रा 6 में दिखाया गया है। एक्सट्रूज़न विखंडन 10-300 μm (चित्रा 3) से लेकर व्यास के साथ दांतेदार, बहुभुज आकार के साथ माइक्रोगेल पैदावार। इसके अलावा, परिपत्रता 0.2 (परिपत्र नहीं) से लगभग 1 (पूर्ण वृत्त) तक होती है, और पहलू अनुपात 1-3 (चित्रा 3) से होता है। ये पैरामीटर विखंडन प्रक्रिया द्वारा गठित अनियमित और दांतेदार माइक्रोगेल आकृतियों का वर्णन करते हैं।

जब सेंट्रीफ्यूजेशन या वैक्यूम-चालित निस्पंदन का उपयोग करके एक साथ पैक किया जाता है, तो इकट्ठे दानेदार हाइड्रोगेल कतरनी-पतला और आत्म-उपचार होता है, जैसा कि पिछले काम39 में वर्णित है। इसके अलावा, खंडित दानेदार हाइड्रोगेल में एक इंजेक्शन योग्य हाइड्रोगेल के लिए उच्च आकार की निष्ठा और यांत्रिक अखंडता होती है, जैसा कि चित्रा 6 में मुद्रित 2 सेमी की ऊंचाई के साथ एक खोखले सिलेंडर के जमाव द्वारा दिखाया गया है। इन सरल और लागत प्रभावी तरीकों से निर्मित खंडित दानेदार हाइड्रोगेल इंजेक्शन चिकित्सीय और 3 डी प्रिंटिंग स्याही सहित कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हैं।

Figure 6
चित्रा 6: प्रोटोकॉल सिंहावलोकन और प्रतिनिधि परिणाम। आंकड़ा (ए) विखंडन, (बी) निलंबन में माइक्रोगेल, (सी) वैक्यूम संचालित निस्पंदन द्वारा जाम, और (डी) जाम दानेदार हाइड्रोगेल को सुई के माध्यम से बाहर निकाला जा रहा है और एक खोखले सिलेंडर में मुद्रित किया जा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: उदाहरण .stl फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इसमें, एक्सट्रूज़न खंडित माइक्रोगेल का उपयोग करके दानेदार हाइड्रोगेल बनाने के तरीकों और सेंट्रीफ्यूजेशन या वैक्यूम-संचालित निस्पंदन द्वारा पैकिंग का वर्णन किया गया है। अन्य माइक्रोगेल निर्माण विधियों (यानी, माइक्रोफ्लुइडिक्स, बैच इमल्शन, इलेक्ट्रोस्प्रेइंग, फोटोलिथोग्राफी) की तुलना में, एक्सट्रूज़न विखंडन माइक्रोगेल निर्माण अत्यधिक तेजी से, कम लागत वाला, आसानी से स्केलेबल और विभिन्न प्रकार के हाइड्रोगेल सिस्टम के लिए उत्तरदायी है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल न्यूनतम बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता के साथ अत्यधिक दोहराने योग्य है, जिसे पिछले काम39 में विशेषता दी गई थी।

यह प्रोटोकॉल फोटो-मध्यस्थता थियोल-एन प्रतिक्रिया का उपयोग करके थोक हाइड्रोगेल बनाने के लिए नॉरबोर्न-संशोधित हाइलूरोनिक एसिड (नॉरएचए) का उपयोग करता है। नोरहा के संश्लेषण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को कहीं और वर्णित किया गया है38. हालांकि, कई हाइड्रोगेल रसायन विज्ञान का उपयोग यहां वर्णित विधियों का उपयोग करके खंडित माइक्रोगेल बनाने के लिए किया जा सकता है यदि सिरिंज के बैरल के भीतर एक थोक हाइड्रोगेल का गठन किया जा सकता है। थोक हाइड्रोगेल यांत्रिक गुणों (जैसे, संपीड़ित मापांक) को समझना भी उपयोगी है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले थोक हाइड्रोगेल में लगभग 30 केपीए39 का थोक संपीड़न मापांक होता है। एक उच्च संपीड़न मापांक के साथ एक थोक हाइड्रोगेल को विखंडन चरणों के दौरान बाहर निकालने के लिए अधिक बल की आवश्यकता होगी, जिससे सिरिंज के क्लॉगिंग या ओवर-प्रेशराइजेशन में वृद्धि हो सकती है; इस प्रकार, 80 केपीए से कम संपीड़ित मॉड्यूली के साथ हाइड्रोगेल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, 10 केपीए से कम संपीड़ित मॉड्यूली के साथ एक थोक हाइड्रोगेल विखंडन चरणों के दौरान विकृत हो सकता है, जिससे इसे टुकड़ा करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है।

इस प्रोटोकॉल को यूवी स्पॉट इलाज दीपक के लिए अनुकूलित किया गया है। यूवी प्रकाश स्रोत और यूवी-उत्तरदायी फोटोइनिशिएटर के विकल्प के रूप में, दृश्यमान प्रकाश स्रोतों का उपयोग दृश्यमान प्रकाश-उत्तरदायी फोटोइनिशिएटर के साथ भी किया जा सकता है, जैसे कि पानी में घुलनशील लिथियम फिनाइल -2,4,6-ट्राइमिथाइलबेंज़ोइल-फॉस्फिनेट (एलएपी)। सर्जक एकाग्रता, प्रकाश तीव्रता और नमूना मात्रा बहुलक और क्रॉसलिंकिंग सिस्टम के आधार पर क्रॉसलिंकिंग समय को प्रभावित करेगी। इसके अलावा, कई दीपक स्रोतों का उपयोग स्पॉट क्योर सिस्टम के विकल्प के रूप में किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम छोटे और छोटे सुई गेज के माध्यम से धारावाहिक बाहर निकालना है। इस प्रक्रिया में, 18 जी (838 μm आंतरिक व्यास) से 30 G (159 μm आंतरिक व्यास) तक सुई गेज का उपयोग करने का सुझाव दिया जाता है। सुइयों के माध्यम से बाहर निकालने से पहले खंडित थोक हाइड्रोगेल में पीबीएस जोड़ना बाहर निकालने और टुकड़ा करने के लिए आवश्यक बल को काफी कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। हाइड्रोगेल को बाहर निकालने के लिए कोई अत्यधिक बल का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि अत्यधिक बल सिरिंज में वापस दबाव डाल सकता है और हाइड्रोगेल को सिरिंज से बाहर निकालने का जोखिम उठा सकता है। एक्सट्रूड करने के लिए आवश्यक बल को कम करने के लिए अतिरिक्त रणनीतियों में टुकड़े के आकार को धीरे-धीरे कम करने के लिए श्रृंखला में अधिक सुइयों का उपयोग करना शामिल है, साथ ही खंडित चरणों के बीच अतिरिक्त पीबीएस जोड़ना भी शामिल है।

वैक्यूम-चालित निस्पंदन का उपयोग करके खंडित माइक्रोगेल को जाम करते समय, प्रक्रिया में परिवर्तनशीलता हो सकती है। कुछ सामग्री प्रणालियों को पीबीएस को हटाने और माइक्रोगेल को पूरी तरह से जाम करने के लिए अधिक (या कम) समय की आवश्यकता हो सकती है। प्रयोगों में पुनरावृत्ति सुनिश्चित करने के लिए व्यक्तिगत सामग्री प्रणालियों के लिए आवश्यक समय रिकॉर्ड करने का सुझाव दिया जाता है। जाम करने का समय फिल्टर में जोड़े गए नमूने की मोटाई और आकार पर भी निर्भर करेगा। फिल्टर में समान रूप से नमूने को फैलाने से वर्दी जैमिंग में मदद मिल सकती है।

एक्सट्रूज़न विखंडन माइक्रोगेल निर्माण विधि को कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चिकित्सीय को हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान में शामिल किया जा सकता है और बाद में स्थानीयकृत चिकित्सीय वितरण के लिए एक कतरनी-पतला, आत्म-चिकित्सा दानेदार हाइड्रोगेल बनाने के लिए खंडित माइक्रोगेल के भीतर समझाया जा सकता है। इसके अलावा, खंडित माइक्रोगेल को दीर्घकालिक भंडारण और सीधी नसबंदी प्रथाओं की अनुमति देने के लिए सुखाया जा सकता है। हालांकि, एक्सट्रूज़न विखंडन की एक सीमा माइक्रोगेल के भीतर कोशिकाओं का समावेश है। एक्सट्रूज़न विखंडन के दौरान उच्च कतरनी दरों के कारण, विधि संभवतः माइक्रोगेल के भीतर सेल एनकैप्सुलेशन के लिए उत्तरदायी नहीं है, क्योंकि उच्च कतरनी से सेल व्यवहार्यता में काफी कमी आ सकती है। फिर भी, कोशिकाओं और स्फेरॉइड को इन विट्रो संस्कृति और विवो सेल डिलीवरी के लिए माइक्रोगेल के बीच आसानी से शामिल किया जा सकता है।

खंडित दानेदार हाइड्रोगेल जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक आशाजनक बायोमैटेरियल हैं। हाल के वर्षों में, विभिन्न विखंडन विधियों (यानी, मोर्टार और मूसल, ब्लेंडर, और मेष ग्रेटर) से बने दानेदार हाइड्रोगेल का उपयोग सेल-लेटे हुए 3 डी प्रिंटिंग स्याही48, चिकित्सीय वितरण वाहन29, इंजेक्शन ऊतक मरम्मत मचान30, और गोलाकार-संस्कृति प्लेटफार्मों39 के रूप में किया गया है। पहले रिपोर्ट किए गए विखंडन विधियों में से, यहां वर्णित एक्सट्रूज़न विखंडन विधि कई फायदों के साथ सबसे सरल और लागत प्रभावी तरीकों में से एक है। यहां विधियों को साझा करने से दानेदार हाइड्रोगेल निर्माण तक पहुंच में वृद्धि होगी और दानेदार हाइड्रोगेल बायोमैटेरियल्स के बढ़ते क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति होगी, जिससे अधिक शोधकर्ता खंडित दानेदार हाइड्रोगेल के साथ अभिनव जैव चिकित्सा समाधान इंजीनियर कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को यूपेन एमआरएसईसी कार्यक्रम (डीएमआर -1720530) और स्नातक अनुसंधान फैलोशिप (वीजीएम और एमईपी के लिए) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर 01 एआर 077362 से जेएबी) के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube Corning 430766
30 G NT Premium Series Dispensing Tip Jensen Global JG30-0.5HPX Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) Fisher Scientific 14-823-435 Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black folders Various Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") Grainger 5FVH5 Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") Grainger 5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") Grainger 5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 14190-250 Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µm Millipore GVWP04700
Epifluorescent or confocal microscope Various Vendors To visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes Fisher Scientific 05-402-25
Extrusion printer Custom-built Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter Adapters Fisher Scientific 05-888-107 Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter Flask Various Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) Sigma-Aldrich 52471
Glass microscope slide Various Vendors
ImageJ National Institutes of Health "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
Laptop Various Vendors
Luer-Lock Tip Caps Integrated Dispensin g Solutions 9991329
Metal spatula for scooping Various Vendors
Microcentrifuge Various Vendors Capable of speed up to 18,000 x g
Microscoft Execl Microsoft Other programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing System Excelitas Technologies S2000 Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate Fisher Scientific FB966C Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
Radiometer Various Vendors
Repetier Host Hot-World GmbH & Co. KG 3D printing software
Screw-based extrusion printer Various Vendors This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD software Dassault Systèmes SolidWorks Corporation Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line Various Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses) Various Vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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बायोइंजीनियरिंग अंक 183
जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए दानेदार हाइड्रोगेल में खंडित थोक हाइड्रोगेल और प्रसंस्करण
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Muir, V. G., Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (183), e63867, doi:10.3791/63867 (2022).

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