Summary
이 작업은 압출 단편화로 마이크로 젤을 제조하고, 마이크로 젤을 주사용 과립 하이드로 젤로 처리하고, 과립 하이드로젤을 생물 의학 응용 분야를위한 압출 인쇄 잉크로 적용하는 간단하고 적응력이 뛰어나며 저렴한 방법을 설명합니다.
Abstract
과립형 하이드로겔은 하이드로겔 마이크로입자(즉, "마이크로겔")의 막힌 어셈블리이다. 생체 재료 분야에서, 과립형 하이드로겔은 주사성, 마이크로스케일 다공성, 및 다수의 마이크로겔 집단을 혼합함으로써 튜닝성을 포함하는 많은 유리한 특성을 갖는다. 마이크로겔을 제조하는 방법은 종종 유중수 에멀젼(예를 들어, 마이크로유체학, 배치 에멀젼, 전기 분무) 또는 포토리소그래피에 의존하는데, 이는 자원 및 비용 측면에서 높은 요구를 제시할 수 있고, 많은 하이드로겔과 양립할 수 없을 수 있다. 이 작업은 압출 단편화를 사용하여 마이크로 젤을 제조하고 생물 의학 응용 분야 (예 : 3D 인쇄 잉크)에 유용한 과립 하이드로 젤로 처리하는 간단하면서도 매우 효과적인 방법을 자세히 설명합니다. 먼저, 벌크 하이드로젤(일례로 광가교성 히알루론산(HA)을 사용)은 순차적으로 더 작은 직경의 일련의 바늘을 통해 압출되어 단편화된 마이크로겔을 형성한다. 이 마이크로 겔 제조 기술은 빠르고 저렴하며 확장성이 뛰어납니다. 원심분리 및 진공 구동 여과에 의해 마이크로겔을 과립형 하이드로겔로 잼하는 방법이 설명되며, 하이드로겔 안정화를 위한 선택적인 사후 가교결합이 기재되어 있다. 마지막으로, 단편화 된 마이크로 겔로 제조 된 과립 하이드로 젤은 압출 인쇄 잉크로 입증됩니다. 본원에 기재된 실시예가 3D 프린팅을 위해 광가교가능한 HA를 사용하는 반면, 상기 방법은 매우 다양한 하이드로겔 유형 및 생물의학적 응용에 쉽게 적응할 수 있다.
Introduction
과립형 하이드로겔은 하이드로겔 입자(즉, 마이크로겔)의 패킹을 통해 제조되며, 생물의학 응용1,2,3에 많은 유리한 특성을 갖는 흥미로운 종류의 생체재료이다. 미립자 구조로 인해 과립 형 하이드로 젤은 전단 얇아지고 자가 치유되어 압출 인쇄 (바이오) 잉크, 임베디드 인쇄를위한 세분화 된 지지대 및 주사 가능한 치료제 4,5,6,7,8,9로 사용할 수 있습니다. 추가적으로, 마이크로겔 사이의 공극 공간은 세포 이동 및 분자 확산8,10,11을 위한 마이크로스케일 다공도를 제공한다. 또한, 다수의 마이크로겔 집단이 단일 제형으로 조합될 수 있어서, 향상된 튜닝성 및 물질 기능성(8,10,12,13)을 허용한다. 이러한 중요한 특성은 최근 몇 년 동안 과립 하이드로겔 개발의 급속한 확장을 촉진했습니다.
과립 하이드로겔 제조를 위해 마이크로겔을 형성하기 위해 이용 가능한 다양한 방법이 있으며, 각각은 그 자체의 장점과 단점을 가지고 있다. 예를 들어, 마이크로겔은 종종 액적 마이크로유체학 4,11,13,14,15,16,17, 배치 에멀젼 7,18,19,20,21,22, 또는 전기 분 무 6,23을 사용하는 유중수 에멀젼으로부터 형성되고, 24,25. 이러한 방법은 균일 한 (마이크로 유체학) 또는 다분산 (배치 에멀젼, 전기 분무) 직경의 구형 마이크로 젤을 산출합니다. 이러한 유중수 에멀젼 제조 방법에는 잠재적으로 낮은 처리량 생산, 저점도 하이드로겔 전구체 솔루션의 필요성, 설치를위한 높은 비용 및 자원을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 추가적으로, 이들 프로토콜은 가공 단계를 추가하는 절차를 사용하여 마이크로겔로부터 세척되어야 하는 가혹한 오일 및 계면활성제를 필요로 할 수 있고, 많은 실험실에서 생물 의학 응용을 위한 멸균 상태로 변환하기 어려울 수 있다. 유중수 에멀젼의 필요성을 제거하고, (사진) 리소그래피를 사용할 수도 있으며, 여기서 몰드 또는 포토 마스크는 하이드로겔 전구체 용액 1,26,27로부터 마이크로겔의 경화를 제어하기 위해 사용된다. 미세 유체 공학과 마찬가지로 이러한 방법은 생산 처리량이 제한 될 수 있으며 이는 대량이 필요할 때 주요 과제입니다.
이들 방법의 대안으로서, 벌크 하이드로겔의 기계적 단편화는 불규칙한 크기가 19,28,29,30,31,32인 마이크로겔을 제조하는데 사용되어 왔다. 예를 들어, 벌크 하이드로겔은 미리 형성되고 후속적으로 메쉬 또는 체를 통과하여 단편화된 마이크로겔을 형성할 수 있으며, 이 과정은 마이크로겔 가닥(33,34) 내의 세포의 존재 하에서도 이루어졌다. 벌크 하이드로젤은 또한 모르타르 및 페슬로 분쇄하거나 상업용 블렌더35,36,37의 사용을 통해 분쇄와 같은 기술을 사용하여 기계적 파괴가있는 마이크로 겔로 가공되었습니다. 다른 것들은 또한 단편화된 마이크로겔(즉, 유체 겔)31을 제조하기 위해 하이드로겔 형성 동안 기계적 교반을 이용하였다.
본 명세서의 방법은 이러한 기계적 단편화 기술을 확장하고, 예를 들어 광가교성 히알루론산(HA) 하이드로젤을 사용하여 압출 단편화와 함께 마이크로겔을 제조하는 간단한 접근법을 제시한다. 압출 단편화는 주사기와 바늘만을 사용하여 광범위한 하이드로젤19,32에 적합한 저비용, 높은 처리량 및 쉽게 확장 가능한 방법으로 단편화된 마이크로겔을 제조한다. 또한, 이들 단편화된 마이크로겔을 과립형 하이드로겔로 조립하는 방법은 원심분리(low packing) 또는 진공 구동 여과(하이패킹)를 사용하여 기술된다. 마지막으로, 이들 단편화된 과립형 하이드로겔의 적용은 압출 인쇄 잉크로서 사용하기 위해 논의된다. 이 프로토콜의 목표는 다양한 하이드로젤에 적응할 수 있고 과립형 하이드로젤에 관심이 있는 거의 모든 실험실에서 구현할 수 있는 간단한 방법을 도입하는 것입니다.
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Protocol
1. 광가교를 사용하여 주사기 내부에 벌크 하이드로젤 제조
참고: 광가교를 사용하는 주사기 내부의 벌크 하이드로겔 제작에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 노보넨 변형 히알루론산(NorHA)을 사용하여 광매개 티올-엔 반응을 사용하여 벌크 하이드로젤을 제작합니다. NorHA의 합성을 위한 상세한 절차는 다른 곳에서 설명된다(38). 그러나, 이 프로토콜은 임의의 광가교가능한 하이드로겔에 고도로 적응할 수 있다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
- 벌크 하이드로겔 제형을 위한 중합체, 가교제 및 개시제의 원하는 농도를 미리 결정한다. 이 프로토콜에서, 하이드로겔 전구체 용액은 NorHA (2 wt.%, ~25% 정도의 노보넨 변성), 디티오트레이톨 (DTT, 6 mM), 및 이르가큐어 D-2959 (I2959, 0.05 wt.%)로 구성된다. 성분(1 mL)이 마이크로원심분리 튜브 내의 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 완전히 용해되었는지 확인하십시오.
참고: 하이드로겔 전구체 용액을 제조할 때, 고분자량 FITC-덱스트란(2 MDa, 0.1 wt.%)을 용액에 첨가하여 형광 현미경을 사용하여 프로토콜에서 나중에 제작된 마이크로겔을 시각화할 수 있습니다. - 3 mL 주사기를 하이드로겔 전구체 용액으로 로딩한다.
- 빈 3 mL 주사기 뒷면에서 플런저를 제거하고 주사기 배럴 상단에 팁 캡을 추가하십시오.
- 1,000 μL 피펫을 사용하여 하이드로겔 전구체 용액을 팁 캡이 있는 시린지 배럴 내로 옮깁니다.
- 한 손에 하이드로겔 전구체 용액으로 주사기 배럴을 잡고 팁 캡을 아래로 향하게하고 배럴의 열린 끝을 위로 향하게하십시오. 다른 한편으로는, 주사기 플런저를 주사기 배럴의 뒤쪽의 개구부로 돌려 보내십시오. 주사기 플런저를 배럴 안으로 부드럽게 밀어 넣어 주사기 배럴 뒤쪽의 개구부를 밀봉합니다.
- 주사기 배럴의 뒷면이 플런저로 밀봉되도록 플런저와 주사기 배럴을 조심스럽게 잡고 플런저가 아래로 향하도록 주사기를 반전시키고 팁 캡이 이제 위를 향하게하십시오. 팁 캡을 제거하고 모든 공기가 주사기에서 제거 될 때까지 플런저를 주사기 배럴에 부드럽게 밀어 넣으십시오 (하이드로 겔 전구체 용액 만 남음).
- 팁 캡을 주사기에 다시 부착합니다. 하이드로겔 전구체 용액이 팁 캡으로 3 mL 주사기 내에 고정되어 있는지 확인하십시오.
- 벌크 하이드로겔을 3 mL 주사기 내에 형성한다.
- UV 램프를 켜기 전에 적절한 개인 보호 장비 (PPE) 및 안전 장치를 착용하십시오. 여기에는 자외선 차단제 안경을 착용하고 자외선으로부터 다른 사람들을 보호하기 위해 램프 영역을 둘러싸는 것이 포함됩니다.
- 라디오미터를 사용하여 UV 스폿 경화 램프를 10mW/cm2 의 광도까지 교정합니다.
참고 : 주사기 배럴을 통해 가벼운 감쇠가있을 것입니다. 제작하기 전에 라디오미터를 사용하여 존재하는 광 감쇠의 비율을 결정하십시오. 스폿 경화 시스템으로부터의 광도 출력은 이러한 감쇠를 고려하여 그에 따라 조정되어야 한다. - 하이드로겔 전구체 용액이 로딩된 3 mL 주사기를 UV 스폿 경화 램프 아래에 원하는 시간 동안 두어 완전히 광가교시킨다. 본원에 기재된 시스템의 경우, NorHA 하이드로겔 전구체 용액은 10 mW/cm2의 강도로 5분 동안 자외선에 노출되며, 이는 선행 연구(39)에 기초하여, 광가교 진동 전단 유변학 시간 스윕에 의해 결정된 바와 같이 완전한 가교결합을 보장하기에 충분한 시간 및 광 강도였다.
참고: 주사기 내에서 완전한 광가교를 보장하기 위해, 주사기는 광가교 기간 동안 중간에 뒤집힐 수 있습니다. - UV 램프를 끄고 주사기를 제거하십시오. 하이드로겔이 이제 주사기 내에서 광가교되어 있는지 확인하십시오. 이것은 플런저를 뒤로 당기고 하이드로겔이 점성 액체가 아닌 고체 블록으로 이동하는 것을 관찰함으로써 수행 될 수 있습니다.
그림 1: 광가교를 사용하여 주사기 내부에 벌크 하이드로젤을 제조하는 방법에 대한 개요. 도면은 (A) 주사기로부터 플런저를 제거하고, (B) 팁 캡을 주사기 배럴에 고정시키고, (C) 시린지 배럴에 하이드로겔 전구체를 추가하고, (D) 플런저를 주사기로 복귀시키고, (E) 과량의 공기를 제거하고 팁 캡을 고정하고, (F) 주사기 내부의 광가교 벌크 하이드로젤을 묘사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 압출 단편화를 이용한 마이크로겔 제조
참고: 압출 단편화를 이용한 마이크로겔 제작에 대한 개요는 그림 2에 나와 있습니다.
- 빈 3 mL 주사기 뒷면에서 플런저를 제거하십시오. Luer-Lock에 팁 캡을 고정합니다.
- 광가교된 벌크 하이드로겔을 함유하는 주사기로부터 팁 캡을 제거한다. 하이드로겔 주사기의 상단을 빈 주사기의 배럴 개구부와 정렬하십시오.
- 벌크 하이드로겔을 주사기 개구부(바늘이 부착되지 않음)를 통해 빈 주사기의 배럴 내로 밀어낸다. 현재 비어있는 주사기 (이전에는 하이드로 젤이 포함됨)를 적절한 폐기물 흐름으로 적절하게 폐기하십시오.
- 압출된 하이드로겔이 들어있는 주사기를 잡고 팁 캡이 아래를 향하도록 하고 배럴 개구부가 위를 향하도록 합니다. 1,000 μL 피펫을 사용하여, PBS 1.5 mL를 주사기 배럴에 첨가한다.
- 주사기 플런저를 배럴의 개구부와 정렬하고 플런저를 간신히 밀어 씰을 만들 수 있습니다. 플런저가 이제 아래로 향하고 팁 캡이 위를 향하도록 주사기를 반전시켜 플런저와 주사기 배럴을 제자리에 고정시켜 하이드로젤이나 PBS가 새어 나오지 않도록하십시오. 여러 번 반전시켜 단편화된 하이드로겔을 PBS 첨가와 혼합한다.
- 팁 캡이 위를 향하고 플런저가 아래를 향하도록 주사기를 잡으십시오. 팁 캡을 분리합니다. 플런저를 위쪽으로 매우 부드럽게 밀어 주사기 내부에서 공기를 제거하십시오.
참고: 3mL 주사기 뒷면에 플런저를 밀어 넣기 위해 추가 힘이 필요한 홈이 있을 수 있습니다. 플런저를 매우 조심스럽게 그루브 위로 밀어 넣으십시오. 갑작스럽거나 가혹한 양의 힘은 플런저가 너무 빨리 움직이게하고 단편화 된 하이드로겔 현탁액을 추방 할 수 있습니다. - 단편화된 하이드로겔 현탁액을 일련의 바늘을 통해 압출하여 단편화된 마이크로겔을 생성한다.
- 무딘 팁 18 G 바늘을 단편화된 하이드로겔 및 PBS를 함유하는 주사기의 상부에 고정시켰다. 신선한 3 mL 주사기에서 플런저를 제거하고 팁 캡을 빈 주사기 배럴에 고정하십시오.
- 단편화된 하이드로겔 현탁액을 18 G 바늘을 통해 빈 주사기 배럴의 뒤쪽으로 밀어내었다. 빈 주사기와 바늘을 적절한 날카로운 폐기물 흐름에 버리십시오.
- 파편화된 하이드로겔 현탁액이 들어 있는 주사기를 잡고 팁 캡이 아래를 향하고 배럴 개구부가 위를 향하도록 합니다. 주사기 플런저를 배럴의 개구부와 정렬하고 플런저를 간신히 밀어 씰을 만들 수 있습니다.
- 플런저가 이제 아래를 향하도록 주사기를 반전시키고 팁 캡이 위를 향하게하고 플런저와 주사기 배럴을 함께 잡고 하이드로 젤이나 PBS가 누출되지 않도록하십시오.
- 팁 캡이 위를 향하고 플런저가 아래를 향하도록 주사기를 잡으십시오. 팁 캡을 분리합니다. 플런저를 위쪽으로 매우 부드럽게 밀어 주사기 내부에서 공기를 제거하십시오. 하이드로겔 물질의 원치 않는 배출을 방지하기 위해 주사기 플런저를 안쪽으로 부드럽게 밀어내는 것에 관한 위의 노트를 참조하십시오.
- 23G, 27G 및 30G 바늘로 2.7.1-2.7.5단계를 반복합니다. 마지막 압출 단계 (30 G 바늘)시에, 단편화된 하이드로겔 현탁액을 마이크로원심분리 튜브 내로 압출한다. 본원에 기재된 부피에 대해, 최종 단편화된 하이드로겔 현탁액 부피는 ∼2.5 mL일 것이고, 2개의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브(부피가 동등하게 분할됨)를 필요로 한다.
참고 : 파편화 된 하이드로 겔 현탁액을 바늘을 통해 밀어내는 데 과도한 힘이 필요하지 않습니다. 최상의 안전 관행을 위해, 압출 중 주사기 과다 가압의 경우 보호를 제공하기 위해 화학 후드 내부의 모든 압출 단편화 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 또한,이 공정은 제조 중 멸균을 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛 / 층류 후드에서 쉽게 수행 할 수 있습니다. 추가 문제 해결 제안은 토론을 참조하십시오.
- 단편화된 하이드로겔 현탁액을 세척하고 분리한다.
참고: 단편화된 마이크로겔을 세척하면 미반응 폴리머와 가교제를 제거하는 데 도움이 됩니다. 또한, 원심분리는 펠렛을 형성함으로써 마이크로겔을 현탁액으로부터 분리하는 것을 도울 것이다.- 마이크로원심분리기를 사용하여, 단편화된 마이크로겔 현탁액을 5분 동안 5,000 x g 에서 스핀다운시킨다.
- 피펫을 사용하여 상층액을 제거하십시오. 1 mL의 PBS를 단편화된 마이크로겔을 함유하는 각각의 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고 5-10초 동안 와류시킨다.
- 원심분리 및 PBS 3x로 세척을 반복한다.
그림 2: 압출 단편화를 이용한 마이크로겔 제조 개요. 도면은 (A) 벌크 하이드로젤을 빈 시린지 배럴로 압출하고 PBS를 첨가하고, (B) 단편화된 하이드로겔로 주사기에 플런저를 고정시키고, (C) 18 G 바늘을 부착하고, 단편화된 하이드로겔 현탁액을 빈 주사기 배럴로 압출하고, (D) 23 G, 27 G, 및 30 G 바늘로 압출 단편화 단계를 반복하고, 단편화된 하이드로겔 현탁액을 최종 압출 상의 마이크로원심분리 튜브에 수집한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. ImageJ를 사용하여 단편화된 마이크로젤의 특성화
참고: ImageJ를 사용하여 조각난 마이크로젤을 특성화하는 개요는 그림 3에 나와 있을 뿐만 아니라 조각난 마이크로겔 배치 내에서 크기 분포 및 모양을 설명하기 위한 대표적인 결과도 나와 있습니다. 마이크로겔은 시각화 전에 형광 표지되어야 한다. 예를 들어, 고분자 중량 FITC-덱스트란 (2 MDa)은 단편화 전에 벌크 하이드로겔에 캡슐화되어 플루오레세인 표지된 마이크로겔을 생성할 수 있다.
- 20 μL의 단편화된 마이크로겔 현탁액을 180 μL의 PBS와 결합하여 희석된 단편화된 마이크로겔 현탁액을 생성한다. 소용돌이가 완전히 섞여 있습니다.
- 50 μL의 묽은 단편화된 마이크로겔 현탁액을 유리 현미경 슬라이드로 옮긴다.
- 에피형광 현미경을 사용하여 4x 또는 10x 줌에서 형광 표지된 마이크로젤의 이미지를 획득합니다.
참고: 마이크로겔 현탁액은 이웃하는 마이크로겔이 서로 접촉하지 않도록 충분히 희석되어야 하지만, 수십 개의 마이크로겔이 뷰포트에서 볼 수 있도록 충분히 농축되어야 한다. 마이크로겔 현탁액의 희석은 이를 달성하기 위해 그에 따라 조정될 수 있다. - ImageJ를 사용하여 단편화된 마이크로겔 입자를 분석합니다. ImageJ에서 입자 분석 기능을 사용하는 방법에 대한 추가 정보는 재료 표에 제공된 링크에서 찾을 수 있습니다.
- ImageJ에서 현탁액에있는 마이크로 젤의 이미지를 엽니 다.
- 분석을 선택> 측정을 설정하고, 영역, 형상 설명자 및 Feret의 지름을 확인합니다. 확인을 클릭합니다.
- 8비트> 유형> 이미지를 선택합니다.
- 이미지를 선택> 여 임계값> 조정합니다. 마이크로겔이 빨간색 마스크로 덮여 있고 배경이 검은 색으로 유지되도록 임계 값을 조정하십시오. 적용을 클릭합니다.
참고: 마이크로젤이 약간 겹치는 경우 연필 도구를 사용하여 마이크로겔 사이에 얇은(<5픽셀) 검정색 선을 그려 흑백 이미지에서 분리합니다. - 파티클 분석> 분석(Analyze Particles)을 선택합니다. 배경 소음을 줄이기 위해 크기(픽셀2)를 50-무한대에서 설정합니다. 원형성을 0.00-1.00으로 설정합니다. 드롭다운 메뉴에서 윤곽선 표시를 선택합니다. 표시 결과를 확인하고, 가장자리에서 제외하고, 구멍을 포함합니다. 나머지 상자는 선택하지 않은 상태로 둡니다. 확인을 클릭합니다.
- 식별된 각 마이크로겔에 대한 영역, 형상 디스크립터 및 Feret의 직경 정보를 포함하는 결과 디스플레이가 열립니다. 결과를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.
- 각 입자에 대해 동등한 원형 직경을 결정합니다.
- 스케일 바 또는 계측기 정보에서 μm/픽셀 단위의 이미지 스케일을 가져옵니다. 스프레드 시트에 각 마이크로 젤의 면적을 픽셀 2에서μm 2로 변환하는 열을 만듭니다.
- μm2의 면적을 사용하여 마이크로겔의 등가 원형 직경을 μm로 결정한다(즉, 파이로 나눈 영역의 제곱근을 취한 다음 두 배로 늘린다).
- μm/픽셀 스케일을 사용하여 각 마이크로겔에 대한 Feret의 직경(즉, 입자 경계에 있는 두 점 사이의 가장 긴 거리)을 μm 단위로 변환합니다.
- 각 마이크로겔에 대한 원형도("Circ."), 종횡비("AR"), 둥글음("라운드"), 및 고형도 값은 ImageJ로부터 직접 사용되는 바와 같이 사용될 수 있다.
- 직경의 분포 (동등한 원형 및 Feret's), 원형, 종횡비, 원형도 및 견고성을 고려하여 원하는대로 마이크로 겔 집단을 분석하십시오.
그림 3: ImageJ를 사용하여 단편화된 마이크로겔 입자를 특성화하는 개요. 도면은 (A) 단편화된 마이크로겔 입자의 희석된 현탁액을 생성하고, 에피형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 현탁액 중의 마이크로겔을 이미지화하고(스케일 바 = 500 μm), (B) ImageJ에서 이진 이미지로 변환하고, 입자를 분석(카운트, 형상 디스크립터 등), 및 (C) 대표적인 결과를 묘사한다. 오류 막대는 최소 및 최대값을 나타내며 내부 사분위수 범위가 구분됩니다. n=100 마이크로겔의 집단 크기가 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 단편화된 마이크로겔을 과립형 하이드로젤로 조립하기
참고: 단편화된 마이크로겔로부터 과립형 하이드로젤을 제형화하는 두 가지 방법이 제시되며, 원심분리 및 여과를 사용한다. 사용된 방법은 원하는 마이크로겔 패킹 (즉, 여과 팩 입자를 더 조밀하게 여과)과 생물학적 성분이 포함되는지 여부에 의존할 것이다 (즉, 원심분리는 입자 사이에 성분을 보유하는 반면, 여과에서는 이들은 손실될 수 있다). 선행 작업(40 )은 원심분리기 또는 진공 구동 여과로부터 형성된 과립형 하이드로겔에 대한 비교 결과(즉, 역학, 다공성)를 철저하게 기술한다.
- 옵션 1: 원심분리를 사용하여 단편화된 마이크로겔을 잼.
- 마지막 세척 단계에서 PBS 상층액을 제거한 후, PBS 1 mL를 각 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고, 마이크로겔을 재현탁시켰다.
- 단편화된 하이드로겔 현탁액을 18,000 x g 에서 5분 동안 스핀다운한다.
참고 : 느린 원심 분리기 속도는 원하는 경우 마이크로 젤을 덜 조밀 한 포장으로 과립 형 하이드로 젤로 재밍하는 데 사용할 수 있습니다. - PBS 상청액을 제거한다.
- 신선한 3 mL 주사기를 얻고 플런저를 제거하십시오. 금속 주걱을 사용하여 단편화 된 과립 하이드로 겔을 마이크로 원심분리 튜브에서 꺼내어 빈 주사기 배럴의 뒤쪽으로 옮깁니다. 피펫 팁은 과립 하이드로겔을 주사기로 옮기는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 플런저를 주사기로 돌려 보냅니다. 이제 조각난 과립 하이드로젤을 주사기에 넣으면 사용할 준비가되었습니다.
- 옵션 2: 진공 구동 여과를 사용하여 단편화된 마이크로겔을 잼. 진공 구동 여과에 의한 방해에 대한 개요는 그림 4에 도시되어 있다.
- 진공 구동 여과 장치를 조립하고 시험한다.
- Buchner 깔때기를 필터 플라스크 내부에 고정하고 필터 어댑터를 깔때기와 플라스크 개구부 사이에 놓습니다.
- 튜브를 사용하여 필터 플라스크를 진공 라인에 연결하십시오.
- 멤브레인 필터(0.22 μm)를 부흐너 깔때기 컵에 넣습니다.
- 다이얼 밸브를 열어 진공 라인을 켭니다. 멤브레인 필터 상에 ∼0.5 mL의 PBS를 피펫팅하여 연결을 시험하고, 모든 PBS가 필터를 통과하고 필터 플라스크의 바닥에 수집되는 것을 관찰한다.
- 진공 라인을 켜고 완전한 밀봉을 보장하십시오. 단편화된 하이드로겔 현탁액을 소용돌이쳐 마이크로겔이 PBS에 현탁되도록 한다.
- 1,000 μL 피펫을 사용하여, 단편화된 하이드로겔 현탁액을 멤브레인 필터(0.22 μm) 상으로 옮긴다. 전체 마이크로겔 현탁액을 옮긴 후, 진공이 단편화된 하이드로겔 현탁액으로부터 PBS를 끌어낼 수 있도록 ∼30 s 동안 기다린다. 진공 라인을 끕니다.
참고: 파편화된 하이드로겔 현탁액이 진공을 당기는 동안 멤브레인 필터에 놓이는 시간은 다양할 수 있습니다. 자세한 내용과 문제 해결 제안은 토론을 참조하십시오. - 신선한 3 mL 주사기를 얻고 플런저를 제거하십시오. 금속 주걱을 사용하여 파편화 된 과립 하이드로 겔을 필터에서 스쿠핑하고 빈 주사기 배럴의 뒤쪽으로 옮깁니다. 피펫 팁은 과립 하이드로겔을 주사기로 옮기는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 플런저를 주사기로 돌려 보냅니다. 단편화 된 과립 하이드로 젤을 주사기에 넣으면 이제 사용할 준비가되었습니다.
- 진공 구동 여과 장치를 조립하고 시험한다.
그림 4: 단단히 패킹된 단편화된 과립형 하이드로젤을 제조하기 위한 진공 구동 여과에 의한 방해 마이크로겔의 개요. 도면은 (A) 진공 여과 장치 상에 막 필터를 배치하고, (B) 피펫을 이용하여 단편화된 마이크로겔 현탁액을 필터 상으로 옮기고, (C) 진공을 당기고 마이크로겔이 잼이 될 때까지 기다렸다가 과립형 하이드로겔을 형성하고, (D) 진공을 끄고 금속 주걱을 이용하여 파편화된 과립형 하이드로겔을 제거하고, (E) 금속 주걱을 사용하여 과립형 하이드로겔을 주사기로 옮기는 것을 묘사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 과립 하이드로 겔 잉크로 압출 인쇄
참고: 압출 인쇄 공정의 개요는 진공 구동 여과로 막힌 단편화된 과립형 하이드로젤을 사용하는 별모양 구조체의 대표적인 인쇄물을 포함하여 도 5에 도시되어 있다. 인쇄 워크플로우는 잉크를 공식화하고, 인쇄 디자인을 계획한 다음, 원하는 설계(41)에 기초하여 잉크를 인쇄하는 것으로 구성된다. 원하는 경우, 인쇄된 과립형 하이드로겔 구축물은 재밍 전에 단편화된 마이크로겔 현탁액에 과량의 DTT(5 mM) 및 I2959(0.05 wt.%)를 첨가함으로써 압출 후 광가교를 사용하여 안정화될 수 있다. 이는 마이크로겔 사이에 형성된 광가교된 공유 결합을 초래하여, 과립형 하이드로겔 구축물의 영구적인 안정화를 유도할 것이다.
- 잉크 제형
- 계획 프로세스 중에 사용할 잉크의 속성을 염두에 두십시오. 잉크를 특성화하려면 조각난 하이드로젤의 유변학 분석을 완료하여 인쇄 설계 프로세스를 알리십시오. 과립형 하이드로겔의 유변학적 특성화를 기술하는 방법은 다른 곳에서 기술되어 있으며, 본 연구(40)에 적합할 수 있다.
- 유변학 분석에서 인쇄 플랫폼과 일련의 초기 인쇄 매개 변수를 선택하십시오.
참고: 과립형 하이드로겔 잉크의 전반적인 높은 점도 및 전단 박막화 특성으로 인해 스크류 기반 압출 프린터가 일반적으로 사용됩니다.
- 인쇄 디자인
참고: Repetier Host 소프트웨어(이하 3D 인쇄 소프트웨어라고 함)는 3D 인쇄 응용 프로그램에 사용됩니다(단계 5.2-5.3).- CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 통해 인쇄 디자인을 만듭니다. 사용자는 처음부터 새로운 디자인을 만들거나 환자 조직 스캔 또는 다른 사용자와 같은 기존 디자인을 수정할 수 있습니다. CAD 설계 작성에 대한 자세한 내용은 다음 참조41,42,43을 참조하십시오.
- CAD 모델을 G-Code로 처리하려면 상단 패널에서 로드 단추를 선택하거나 메뉴 막대에서 파일 > 로드를 선택하여 CAD 파일이 ".stl" 형식(보조 파일 1) 으로 저장되고 3D 인쇄 소프트웨어에 업로드되었는지 확인합니다. 이 G 코드는 잉크 증착을 위한 인쇄 경로를 정의합니다. 중공 실린더의 예제 .stl 파일이 보조 파일에 포함되어 있습니다.
- STL 파일이 3D 인쇄 소프트웨어에 업로드되면 슬라이서 패널로 이동하여 슬라이서 옵션으로 Slic3r 을 선택합니다. 여기서 노즐 직경, 레이어 높이, 인쇄 속도 및 압출 속도와 같은 설정은 잉크 특성화 및 원하는 인쇄 결과에 따라 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 18G 바늘 (838 μm의 내경)이 사용됩니다. 층 높이는 1mm로 설정되고, 인쇄 속도는 8mm/s로 설정되고, 유량은 이전 최적화(39)에 따라 9μL/s로 설정됩니다. 파라미터의 수치 값은 과립형 하이드로겔 잉크의 특성의 변동을 설명하기 위해 ± 20%로 조정될 수 있다.
참고: 이러한 설정과 인쇄 디자인은 잉크 배합, 원하는 인쇄 해상도 또는 사용된 인쇄 플랫폼에 대한 조정에 따라 반복적인 실험 테스트를 통해 조정해야 할 수도 있습니다. 이러한 매개 변수에 대한 자세한 내용과 새로운 잉크 배합을 사용한 인쇄 설정의 특성화에 대한 자세한 내용은 다른 참조 문헌40,44,45,46을 참조하십시오.
- 단편화 된 과립 하이드로 젤을 사용한 압출 인쇄
- 단편화된 과립형 하이드로겔을 사용한 로딩 주사기에 대해서는 4.2.4 및 그림 4 및 그림 5를 참조하십시오.
- 팁 캡을 제거하고 선택한 바늘로 교체하십시오.
- 주사기를 선택한 인쇄 플랫폼에로드하십시오. 여기에서는 맞춤형 스크류 기반 압출 프린터가 사용됩니다.
참고: 맞춤형 바이오프린터 제작에 대한 자세한 내용은 다른 참고 문헌44,47을 참조하십시오. - 계획 단계에서 준비된 G-Code 파일을 3D 인쇄 소프트웨어로 로드합니다. [인쇄 미리 보기 ] 패널로 이동하여 [인쇄]를 누릅니다.
- 인쇄 증착이 완료되자마자, 단편화된 과립형 하이드로겔 구축물을 광가교 및 안정화를 위해 UV 광에 노출시킨다.
- 가교결합이 완료되면, 샘플을 PBS로 세 번 세척하여 처리한다.
그림 5: 단편화된 과립형 하이드로젤을 사용한 압출 인쇄의 개요. 도면은 (A) 주걱을 사용하여 단편화된 과립형 하이드로겔을 주사기 배럴로 옮기고, (B) 무딘 팁 바늘(18 G을 도시함)을 부착하고 샘플을 상부로 밀어내고, (C) 인쇄를 위한 컴퓨터 소프트웨어에 대한 연결을 나타내는 그래픽, 및 (D) 단편화된 과립형 하이드로겔로 별모양 구조물의 인쇄를 완료하는 것을 묘사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
이러한 프로토콜의 대표적인 결과는 도 3 및 도 6에 도시되어 있다. 압출 단편화는 직경이 10-300 μm 범위인 들쭉날쭉한 다각형 모양의 마이크로젤을 생성합니다(그림 3). 또한 원형도는 0.2 (원형이 아님)에서 거의 1 (완벽한 원)까지이며 종횡비는 1-3 (그림 3)입니다. 이러한 파라미터는 단편화 과정에 의해 형성된 불규칙하고 들쭉날쭉한 마이크로겔 형태를 기술한다.
원심분리 또는 진공 구동 여과를 사용하여 함께 포장될 때, 조립된 과립형 히드로겔은 이전 작업(39)에 기술된 바와 같이 전단-얇아지고 자기-치유된다. 또한, 단편화된 과립형 하이드로젤은 압출 인쇄되는 높이 2 cm의 중공 실린더의 증착에 의해 도 6에 도시된 바와 같이 주사용 하이드로겔에 대한 높은 형상 충실도 및 기계적 무결성을 갖는다. 이러한 간단하고 비용 효율적인 방법으로 제조 된 단편화 된 과립 하이드로 젤은 주사용 치료제 및 3D 인쇄 잉크를 포함한 많은 생물 의학 응용 분야에 유용합니다.
그림 6: 프로토콜 개요 및 대표 결과. 도면은 (A) 단편화, (B) 현탁액 중의 마이크로겔, (C) 진공 구동 여과에 의한 방해, 및 (D) 바늘을 통해 압출되고 중공 실린더로 인쇄되는 걸림이 있는 과립형 하이드로겔을 묘사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 예 .stl 파일이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본원에는, 압출 단편화된 마이크로겔을 사용하여 과립형 하이드로겔을 제조하고 원심분리 또는 진공 구동 여과에 의해 패킹하는 방법이 기재되어 있다. 다른 마이크로겔 제조 방법(즉, 마이크로유체학, 배치 에멀젼, 전기 분무, 포토리소그래피)과 비교하여, 압출 단편화 마이크로겔 제조는 매우 빠르고, 저비용이며, 쉽게 확장가능하며, 매우 다양한 하이드로겔 시스템에 순응할 수 있다. 또한, 이 프로토콜은 최소한의 배치-배치 가변성으로 고도로 반복가능하며, 이는 이전 작업(39)에서 특성화되었다.
이 프로토콜은 노보넨 변형 히알루론산(NorHA)을 사용하여 광매개 티올-엔 반응을 사용하여 벌크 하이드로젤을 제작합니다. NorHA의 합성을 위한 상세한 절차는 다른 곳에서 설명된다(38). 그러나, 벌크 하이드로겔이 주사기의 배럴 내에 형성될 수 있는 경우 본원에 기술된 방법을 사용하여 단편화된 마이크로겔을 제조하는데 많은 히드로겔 화학이 사용될 수 있다. 벌크 하이드로겔의 기계적 특성(예를 들어, 압축 모듈러스)을 이해하는 것도 유용하다. 이 프로토콜에 사용된 벌크 히드로겔은 약 30kPa39의 벌크 압축 모듈러스를 갖는다. 더 높은 압축 모듈러스를 갖는 벌크 하이드로겔은 단편화 단계 동안 압출하기 위해 더 많은 힘을 필요로 할 것이며, 이는 주사기의 증가된 막힘 또는 과도한 가압을 야기할 수 있다; 따라서 압축 모듈리가 80kPa 미만인 하이드로젤을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 압축 모듈리가 10 kPa보다 낮은 벌크 하이드로젤은 단편화 단계 동안 변형될 수 있어, 단편화하기가 어렵다.
이 프로토콜은 UV 스폿 경화 램프에 최적화되어 있습니다. UV 광원 및 UV 반응성 광개시제에 대한 대안으로서, 가시광선 광원은 또한 가시광선 반응성 광개시제, 예컨대 수용성 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)와 함께 사용될 수 있다. 개시제 농도, 광도 및 샘플 부피는 사용되는 중합체 및 가교 시스템에 따라 가교 시간에 영향을 미칠 것이다. 또한, 많은 램프 소스가 스팟 큐어 시스템의 대안으로 사용될 수 있습니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 더 작고 작은 바늘 게이지를 통한 직렬 압출입니다. 이 절차에서는 18G (838 μm 내경)에서 30 G (159 μm 내경)까지의 바늘 게이지를 사용하는 것이 좋습니다. 바늘을 통해 압출하기 전에 단편화된 벌크 하이드로겔에 PBS를 첨가하는 것은 압출 및 단편화에 필요한 힘을 상당히 감소시키는데 결정적이다. 과도한 힘은 주사기에서 다시 가압을 유발할 수 있고 하이드로젤을 다시 주사기에서 파열시킬 위험이 있으므로 하이드로젤을 압출하는 데 과도한 힘을 사용해서는 안됩니다. 압출에 필요한 힘을 줄이기 위한 추가적인 전략에는 단편 크기를 점진적으로 줄이기 위해 계열에서 더 많은 바늘을 사용하고 단편화 단계 사이에 PBS를 추가하는 것이 포함됩니다.
진공 구동 여과를 사용하여 단편화된 마이크로겔을 재밍할 때, 공정에 가변성이 있을 수 있다. 일부 물질 시스템은 PBS를 제거하고 마이크로겔을 완전히 걸림돌하기 위해 더 많은(또는 적은) 시간을 필요로 할 수 있다. 개별 재료 시스템에 필요한 시간을 기록하여 실험 전반에 걸쳐 반복성을 보장하는 것이 좋습니다. 잼 시간은 필터에 추가 된 샘플의 두께와 크기에 따라 달라집니다. 필터를 가로질러 샘플을 고르게 펼치면 균일한 방해에 도움이 될 수 있습니다.
압출 단편화 마이크로겔 제조 방법은 많은 생물의학적 응용에 적합할 수 있다. 예를 들어, 치료제는 하이드로겔 전구체 용액에 포함될 수 있고, 후속적으로 단편화된 마이크로겔 내에 캡슐화되어 국부적인 치료 전달을 위해 전단 얇아지고 자가 치유 과립형 하이드로겔을 제조할 수 있다. 또한, 단편화된 마이크로겔은 장기간 보관 및 간단한 멸균 관행을 허용하도록 건조될 수 있다. 그러나, 압출 단편화에 대한 하나의 제한은 마이크로겔 내에 세포의 혼입이다. 압출 단편화 동안 높은 전단 속도로 인해, 이 방법은 마이크로겔 내에서 세포 캡슐화를 시행할 수 없을 가능성이 높으며, 높은 전단은 세포 생존율을 상당히 감소시킬 수 있기 때문이다. 여전히, 세포 및 구상체는 시험관 내 배양 및 생체내 세포 전달을 위한 마이크로겔 사이에 용이하게 혼입될 수 있다.
단편화 된 과립 하이드로 젤은 생물 의학 응용 분야에 유망한 생체 재료입니다. 최근 몇 년 동안, 다양한 단편화 방법(즉, 모르타르 및 페슬, 블렌더 및 메쉬 강판)으로부터 제조된 과립형 하이드로겔이 세포-함유 3D 프린팅 잉크(48), 치료 전달 비히클(29), 주사용 조직 복구 스캐폴드(30), 및 스페로이드-배양 플랫폼(39)으로서 사용되어 왔다. 이전에 보고된 단편화 방법 중에서, 본원에 기재된 압출 단편화 방법은 수많은 장점을 갖는 가장 간단하고 비용 효율적인 방법 중 하나이다. 여기에서 방법을 공유하면 과립 하이드로 겔 제조에 대한 접근성이 증가하고 과립 하이드로 겔 생체 재료의 성장 분야에서 상당한 발전으로 이어지며 더 많은 연구자가 단편화 된 과립 하이드로 젤로 혁신적인 생물 의학 솔루션을 엔지니어링 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 UPenn MRSEC 프로그램 (DMR-1720530)과 대학원 연구 펠로우십 (V.G.M 및 M.E.P.) 및 국립 보건원 (R01AR077362 ~ J.A.B.)을 통해 국립 과학 재단의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
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