Summary
Bu çalışma, ekstrüzyon parçalanması ile mikrojelleri üretmek, mikrojelleri enjekte edilebilir granüler hidrojellere işlemek ve granüler hidrojelleri biyomedikal uygulamalar için ekstrüzyon baskı mürekkepleri olarak uygulamak için basit, uyarlanabilir ve düşük maliyetli yöntemleri açıklamaktadır.
Abstract
Granüler hidrojeller, hidrojel mikropartiküllerinin (yani, "mikrojeller") sıkışmış montajlarıdır. Biyomalzemeler alanında, granüler hidrojeller, enjekte edilebilirlik, mikro ölçekli gözeneklilik ve çoklu mikrojel popülasyonlarını karıştırarak ayarlanabilirlik gibi birçok avantajlı özelliğe sahiptir. Mikrojelleri üretme yöntemleri genellikle yağda su emülsiyonlarına (örneğin, mikroakışkanlar, toplu emülsiyonlar, elektropüskürtme) veya fotolitografiye dayanır, bu da kaynaklar ve maliyetler açısından yüksek talepler sunabilir ve birçok hidrojelle uyumlu olmayabilir. Bu çalışma, ekstrüzyon parçalanması kullanarak mikrojelleri üretmek ve bunları biyomedikal uygulamalar için yararlı granüler hidrojellere (örneğin, 3D baskı mürekkepleri) işlemek için basit ama oldukça etkili yöntemleri detaylandırmaktadır. İlk olarak, dökme hidrojeller (örnek olarak fotokrolinklenebilir hyaluronik asit (HA) kullanılarak), parçalanmış mikrojeller oluşturmak için sırayla daha küçük çaplara sahip bir dizi iğne yoluyla ekstrüde edilir. Bu mikrojel üretim tekniği hızlı, düşük maliyetli ve yüksek oranda ölçeklenebilir. Santrifüjleme ve vakumla çalışan filtreleme yoluyla mikrojelleri granüler hidrojellere sıkıştırma yöntemleri, hidrojel stabilizasyonu için isteğe bağlı çapraz bağlama sonrası ile açıklanmaktadır. Son olarak, parçalanmış mikrojellerden imal edilen granüler hidrojeller, ekstrüzyon baskı mürekkepleri olarak gösterilmektedir. Burada açıklanan örnekler 3D baskı için fotokros bağlanabilir HA kullanırken, yöntemler çok çeşitli hidrojel türleri ve biyomedikal uygulamalar için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Granüler hidrojeller, hidrojel partiküllerinin (yani mikrojellerin) paketlenmesiyle üretilir ve biyomedikal uygulamalar için birçok avantajlı özelliğe sahip heyecan verici bir biyomalzeme sınıfıdır 1,2,3. Partikül yapıları nedeniyle, granüler hidrojeller kesme inceltici ve kendi kendini iyileştiricidir, ekstrüzyon baskı (biyo) mürekkepleri, gömülü baskı için granüler destekler ve enjekte edilebilir terapötikler 4,5,6,7,8,9 olarak kullanılmalarına izin verir. Ek olarak, mikrojeller arasındaki boşluk, hücre hareketi ve moleküler difüzyon8,10,11 için mikro ölçekli bir gözeneklilik sağlar. Ayrıca, çoklu mikrojel popülasyonları, gelişmiş ayarlanabilirlik ve malzeme işlevselliğisağlamak için tek bir formülasyonda birleştirilebilir 8,10,12,13. Bu önemli özellikler, son yıllarda granüler hidrojel gelişiminin hızlı genişlemesini motive etmiştir.
Granüler hidrojel üretimine yönelik mikrojeller oluşturmak için, her biri kendi avantaj ve dezavantajlarına sahip bir dizi yöntem mevcuttur. Örneğin, mikrojeller genellikle damlacık mikroakışkanları 4,11,13,14,15,16,17, toplu emülsiyonlar 7,18,19,20,21,22 veya elektropüskürtme 6,23 kullanılarak yağda su emülsiyonlarından oluşturulur. 24,25. Bu yöntemler, üniform (mikroakışkanlar) veya polidispers (toplu emülsiyonlar, elektropüskürtme) çaplara sahip küresel mikrojeller verir. Bu yağda su emülsiyonu üretim yöntemlerinde, potansiyel olarak düşük verimli üretim, düşük viskoziteli hidrojel öncü çözümlerine duyulan ihtiyaç ve kurulum için yüksek maliyet ve kaynaklar dahil olmak üzere bazı sınırlamalar vardır. Ek olarak, bu protokoller, işleme adımları ekleyen prosedürler kullanılarak mikrojellerden yıkanması gereken sert yağlar ve yüzey aktif maddeler gerektirebilir ve birçok laboratuvarda biyomedikal uygulamalar için steril koşullara çevrilmesi zor olabilir. Yağda su emülsiyonlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, mikrojellerin hidrojel öncü çözeltilerinden kürlenmesini kontrol etmek için kalıpların veya fotomaskelerin kullanıldığı (foto) litografi de kullanılabilir 1,26,27. Mikroakışkanlar gibi, bu yöntemler de üretim çıktılarında sınırlı olabilir, bu da büyük hacimlere ihtiyaç duyulduğunda büyük bir zorluktur.
Bu yöntemlere alternatif olarak, dökme hidrojellerin mekanik parçalanması, düzensiz boyutlarda 19,28,29,30,31,32 mikrojellerin üretilmesinde kullanılmıştır. Örneğin, dökme hidrojeller önceden oluşturulabilir ve daha sonra parçalanmış mikrojeller oluşturmak için ağlardan veya eleklerden geçirilebilir, bu işlem mikrojel iplikçikleri içindeki hücrelerin varlığında bile yapılmıştır33,34. Dökme hidrojeller ayrıca harç ve havaneli ile taşlama gibi teknikler kullanılarak veya ticari karıştırıcılar kullanılarak mekanik bozulma ile mikrojellere işlenmiştir35,36,37. Diğerleri ayrıca parçalanmış mikrojelleri (yani sıvı jelleri) üretmek için hidrojel oluşumu sırasında mekanik ajitasyon kullanmışlardır31.
Buradaki yöntemler, bu mekanik parçalanma tekniklerini genişletmekte ve örnek olarak fotokrolinklenebilir hyaluronik asit (HA) hidrojelleri kullanarak, ekstrüzyon fragmanı ile mikrojellerin üretilmesi için basit bir yaklaşım sunmaktadır. Ekstrüzyon parçalanması, parçalanmış mikrojelleri çok çeşitli hidrojeller için uygun olan düşük maliyetli, yüksek verimli ve kolayca ölçeklenebilir bir yöntemle üretmek için yalnızca şırıngalar ve iğneler kullanır19,32. Ayrıca, bu parçalanmış mikrojelleri granüler hidrojellere monte etme yöntemleri, santrifüjleme (düşük paketleme) veya vakum tahrikli filtreleme (yüksek paketleme) kullanılarak tanımlanmıştır. Son olarak, bu parçalanmış granüler hidrojellerin uygulanması, ekstrüzyon baskı mürekkebi olarak kullanılmak üzere tartışılmıştır. Bu protokolün amacı, çok çeşitli hidrojellere uyarlanabilen ve granüler hidrojellerle ilgilenen hemen hemen her laboratuvarda uygulanabilen basit yöntemler sunmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fotoçapraz bağlama kullanarak bir şırınganın içinde dökme hidrojellerin üretilmesi
NOT: Fotoçapraz bağlama kullanılarak bir şırınga içindeki dökme hidrojel imalatına genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, foto-aracılı tiol-en reaksiyonu kullanarak dökme hidrojelleri üretmek için norbornen modifiye hyaluronik asit (NorHA) kullanır. NorHA sentezi için ayrıntılı prosedürler başka bir yerde açıklanmıştır38. Bununla birlikte, bu protokol herhangi bir fotoçapraz bağlanabilir hidrojele oldukça uyarlanabilir. Daha fazla bilgi için Tartışma bölümüne bakın.
- Dökme hidrojel formülasyonu için istenen polimer, çapraz bağlayıcı ve başlatıcı konsantrasyonlarını önceden belirleyin. Bu protokolde, hidrojel öncü çözeltisi NorHA (ağırlıkça% 2, ~% 25 norbornen modifikasyonu derecesi), dithiothreitol (DTT, 6 mM) ve Irgacure D-2959'dan (I2959, ağırlıkça% 0.05) oluşur. Bileşenlerin (1 mL) bir mikrosantrifüj tüpü içinde fosfat tamponlu salin (PBS) içinde tamamen çözündüğünden emin olun.
NOT: Hidrojel öncü çözeltisini hazırlarken, floresan mikroskopi kullanılarak protokolde daha sonra üretilen mikrojelleri görselleştirmek için çözeltiye yüksek moleküler ağırlıklı FITC-dextran (2 MDa, ağırlıkça% 0.1) eklenebilir. - Hidrojel öncü çözeltisi ile 3 mL'lik bir şırınga yükleyin.
- Pistonu boş bir 3 mL şırınganın arkasından çıkarın ve şırınga namlusunun üstüne bir uç kapağı ekleyin.
- Hidrojel öncü çözeltisini uç kapağıyla şırınga namlusuna aktarmak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın.
- Şırınga namlusunu bir elinizde hidrojel öncü çözeltisi ile, uç kapağı aşağı bakacak ve namlunun açık ucu yukarı bakacak şekilde tutun. Öte yandan, şırınga pistonunu şırınga namlusunun arkasının açıklığına geri getirin. Şırınga pistonunu yavaşça namluya itin, şırınga namlusunun arkasındaki açıklığı kapatacak kadar.
- Şırınga namlusunun arkasının pistonla kapatıldığından emin olmak için pistonu ve şırınga namlusunu dikkatlice bir arada tutarak, şırıngayı piston aşağı bakacak şekilde ters çevirin ve uç kapağı şimdi yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Uç kapağını çıkarın ve tüm hava şırıngadan çıkarılana kadar pistonu yavaşça şırınga namlusuna itin (sadece hidrojel öncü çözeltisi kalır).
- Uç kapağını şırıngaya yeniden takın. Hidrojel öncü çözeltisinin, 3 mL şırınga içinde bir uç kapağı ile sabitlendiğinden emin olun.
- 3 mL şırınga içinde toplu bir hidrojel oluşturun.
- UV lambasını açmadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ve önlemlerin alındığından emin olun. Bu, UV koruyucu gözlükler takmayı ve başkalarını UV ışığından korumak için lamba alanını kapatmayı içerir.
- UV spot kür lambasını bir radyometre kullanarak 10 mW/cm2 ışık yoğunluğuna kalibre edin.
NOT: Şırınga namlusu boyunca hafif zayıflama olacaktır. Üretimden önce, bir radyometre kullanarak mevcut ışık zayıflama yüzdesini belirleyin. Spot kürleme sisteminden gelen ışık yoğunluğu çıkışı, bu zayıflamayı hesaba katmak için buna göre ayarlanmalıdır. - Hidrojel öncü çözeltisi ile yüklenen 3 mL şırıngayı UV spot kür lambasının altına tamamen fotokros bağlamak için istenen süre boyunca yerleştirin. Burada açıklanan sistem için, NorHA hidrojel öncü çözeltisi, 10 mW /cm2'lik bir yoğunlukta 5 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılır; bu, önceki çalışmalaradayanarak 39, fotoçapraz bağlama salınımlı kesme reolojisi zaman taramaları ile belirlenen tam çapraz bağlamayı sağlamak için yeterli zaman ve ışık yoğunluğudur.
NOT: Şırınga içinde tam fotoçapraz bağlama sağlamak için, şırınga fotoçapraz bağlama süresinin yarısına kadar çevrilebilir. - UV lambasını kapatın ve şırıngayı çıkarın. Hidrojelin artık şırınga içinde fotokros bağlantılı olduğundan emin olun. Bu, pistonu geri çekerek ve hidrojelin viskoz bir sıvı yerine katı bir blok olarak hareket ettiğini gözlemleyerek yapılabilir.
Resim 1: Fotoçapraz bağlama kullanarak bir şırınga içinde dökme hidrojellerin üretilmesine genel bakış. Şekil, (A) pistonu şırıngadan çıkarmayı, (B) uç kapağını şırınga namlusuna sabitlemeyi, (C) şırınga namlusuna hidrojel öncüsü eklemeyi, (D) pistonu şırıngaya geri döndürmeyi, (E) fazla havayı çıkarmayı ve uç kapağını sabitlemeyi ve (F) şırınganın içindeki toplu hidrojeli fotoçapraz bağlamayı göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Ekstrüzyon parçalanması kullanarak mikrojellerin üretilmesi
NOT: Ekstrüzyon parçalanması kullanılarak mikrojel üretimine genel bir bakış Şekil 2'de gösterilmiştir.
- Pistonu boş bir 3 mL şırınganın arkasından çıkarın. Luer-Lock'a bir uç kapağı takın.
- Uç kapağını, fotoçapraz bağlı dökme hidrojeli içeren şırıngadan çıkarın. Hidrojel şırınganın üst kısmını, namlunun boş şırınga üzerindeki açıklığı ile hizalayın.
- Toplu hidrojeli şırınga açıklığından (iğne takılı değil) boş şırınganın namlusuna ekstrüde edin. Şimdi boş olan (eskiden hidrojeli içeren) şırıngayı uygun atık akışına uygun şekilde atın.
- Ekstrüde hidrojeli içeren şırıngayı, uç kapağı aşağı bakacak ve namlu açıklığı yukarı bakacak şekilde tutun. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak şırınga namlusuna 1,5 mL PBS ekleyin.
- Şırınga pistonunu namlunun açıklığıyla hizalayın, sadece pistonu bir conta oluşturacak kadar zar zor itin. Şırıngayı, piston şimdi aşağı bakacak ve uç kapağı yukarı bakacak şekilde ters çevirin, pistonu ve şırınga namlusunu bir arada tuttuğunuzdan emin olun, böylece hiçbir hidrojel veya PBS sızmaz. Parçalanmış hidrojeli eklenen PBS ile karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
- Şırıngayı, uç kapağı yukarı bakacak ve piston aşağı bakacak şekilde tutun. Uç kapağını çıkarın. Şırınganın içindeki havayı çıkarmak için pistonu çok nazikçe yukarı doğru itin.
NOT: 3 mL şırınganın arkasında, pistonu içeri itmek için ekstra kuvvet gerektiren bir oluk olması muhtemeldir. Pistonu oluğun üzerine çok dikkatli bir şekilde itin. Herhangi bir ani veya sert kuvvet miktarı, pistonun çok hızlı hareket etmesine ve muhtemelen parçalanmış hidrojel süspansiyonunu dışarı atmasına neden olacaktır. - Parçalanmış mikrojeller oluşturmak için parçalanmış hidrojel süspansiyonunu bir dizi iğneden ekstrüzyon yapın.
- Parçalanmış hidrojel ve PBS içeren şırınganın üstüne künt uçlu 18 G iğne sabitleyin. Pistonu taze bir 3 mL şırıngadan çıkarın ve boş şırınga namlusuna bir uç kapağı sabitleyin.
- Parçalanmış hidrojel süspansiyonunu 18 G iğneden boş şırınga namlusunun arkasına ekstrüzyon yapın. Boş şırıngayı ve iğneyi uygun keskin atık akışına atın.
- Parçalanmış hidrojel süspansiyonu içeren şırıngayı, uç kapağı aşağı bakacak ve namlu açıklığı yukarı bakacak şekilde tutun. Şırınga pistonunu namlunun açıklığıyla hizalayın, sadece pistonu bir conta oluşturacak kadar zar zor itin.
- Şırıngayı, piston şimdi aşağı bakacak şekilde ters çevirin ve uç kapağı yukarı bakacak şekilde, pistonu ve şırınga namlusunu bir arada tuttuğunuzdan emin olun, böylece hiçbir hidrojel veya PBS sızmaz.
- Şırıngayı, uç kapağı yukarı bakacak ve piston aşağı bakacak şekilde tutun. Uç kapağını çıkarın. Şırınganın içindeki havayı çıkarmak için pistonu çok nazikçe yukarı doğru itin. Hidrojel malzemenin istenmeyen şekilde dışarı atılmasını önlemek için şırınga pistonunu yavaşça içeri doğru itmekle ilgili yukarıdaki nota bakın.
- 2.7.1-2.7.5 arasındaki adımları 23 G, 27 G ve 30 G iğneyle tekrarlayın. Son ekstrüzyon adımında (30 G iğne), parçalanmış hidrojel süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine ekstrüzyon yapın. Burada açıklanan hacimler için, son parçalanmış hidrojel süspansiyon hacmi, iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü gerektiren ~ 2,5 mL olacaktır (hacim eşit olarak bölünür).
NOT: Parçalanmış hidrojel süspansiyonu iğnelerden ekstrüzyon yapmak için aşırı kuvvet gerekmemelidir. En iyi güvenlik uygulamaları için, ekstrüzyon sırasında şırınganın aşırı basınçlandırılması durumunda koruma sağlamak için tüm ekstrüzyon parçalanma adımlarının bir kimyasal davlumbazın içinde gerçekleştirilmesi önerilir. Ek olarak, bu işlem imalat sırasında steriliteyi korumak için bir biyogüvenlik kabininde / laminer akış davlumbazında kolayca gerçekleştirilebilir. Ek sorun giderme önerileri için Tartışma'ya bakın.
- Parçalanmış hidrojel süspansiyonunu yıkayın ve izole edin.
NOT: Parçalanmış mikrojellerin yıkanması, reaksiyona girmemiş polimer ve çapraz bağlayıcıların çıkarılmasına yardımcı olacaktır. Ek olarak, santrifüjleme, bir pelet oluşturarak mikrojellerin süspansiyondan izole edilmesine yardımcı olacaktır.- Bir mikrosantrifüj kullanarak, parçalanmış mikrojel süspansiyonunu 5 dakika boyunca 5.000 x g'de döndürün.
- Süper nantantı çıkarmak için bir pipet kullanın. Parçalanmış mikrojeller ve 5-10 s vorteks içeren her bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mL PBS ekleyin.
- Santrifüj ve yıkamayı PBS 3x ile tekrarlayın.
Şekil 2: Ekstrüzyon parçalanması kullanılarak mikrojel üretimine genel bakış. Şekil, (A) dökme hidrojelin boş bir şırınga namlusuna ekstrüzyon yapılması ve PBS eklenmesi, (B) parçalanmış hidrojel ile şırıngadaki bir pistonun sabitlenmesi, (C) 18 G'lik bir iğnenin takılması ve parçalanmış hidrojel süspansiyonunun boş bir şırınga namlusuna ekstrüzyon edilmesinin ve (D) 23 G, 27 G ve 30 G iğneleriyle ekstrüzyon parçalanma adımlarının tekrarlanması, nihai ekstrüzyon üzerinde mikrosantrifüj tüplerinde parçalanmış hidrojel süspansiyonun toplanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. ImageJ kullanarak parçalanmış mikrojellerin karakterize edilmesi
NOT: ImageJ kullanarak parçalanmış mikrojellerin karakterize edilmesine genel bir bakış, Şekil 3'te ve parçalanmış mikrojeller grubu içindeki boyut dağılımlarını ve şekilleri tanımlamak için temsili sonuçlar gösterilmiştir. Mikrojeller, görselleştirmeden önce floresan olarak etiketlenmelidir. Örneğin, yüksek molekül ağırlıklı FITC-dekstran (2 MDa), floresein etiketli mikrojeller oluşturmak için parçalanmadan önce dökme hidrojel içinde kapsüllenebilir.
- Seyreltik parçalanmış mikrojel süspansiyonu oluşturmak için 20 μL parçalanmış mikrojel süspansiyonunu 180 μL PBS ile birleştirin. İyice karıştırmak için vorteks.
- 50 μL seyreltik parçalanmış mikrojel süspansiyonunu bir cam mikroskop slaydına aktarın.
- 4x veya 10x zoom'da floresan etiketli mikrojellerin görüntülerini elde etmek için bir epifloresan mikroskop kullanın.
NOT: Mikrojel süspansiyonu, komşu mikrojellerin birbirleriyle temas halinde olmayacağı şekilde yeterince seyreltilmeli, ancak görüş alanında düzinelerce mikrojelin görülebileceği şekilde konsantre edilmelidir. Mikrojel süspansiyonun seyreltilmesi, bunu başarmak için buna göre ayarlanabilir. - Parçalanmış mikrojel parçacıklarını analiz etmek için ImageJ'yi kullanma. ImageJ'deki Parçacıkları Analiz Et işlevini kullanma hakkında ek bilgi, Malzeme Tablosu'nda sağlanan bağlantıda bulunabilir.
- Süspansiyondaki mikrojellerin görüntülerini ImageJ'de açın.
- Analiz Et> Ölçümleri Ayarla, Alanı Kontrol Et, Şekil Tanımlayıcıları ve Feret'in Çapı'nı seçin. Tamam'ı tıklatın.
- Image (Görüntü > Türü > 8 bit) öğesini seçin.
- Image (Görüntü) > Adjust > Threshold (Eşik Değerini) seçin. Eşiği, mikrojeller kırmızı bir maske ile kaplanacak ve arka plan siyah kalacak şekilde ayarlayın. Uygula'ya tıklayın.
NOT: Herhangi bir mikrojel hafifçe üst üste biniyorsa, siyah beyaz görüntüde ayırmak üzere mikrojeller arasında ince (<5 piksel) siyah bir çizgi çizmek için Kalem Aracı'nı kullanın. - Parçacıkları Analiz Et > Analiz Et'i seçin. Arka plan gürültüsünü azaltmak için Boyut'u (piksel2) 50-Sonsuz'dan ayarlayın. Döngüselliği 0,00-1,00 olarak ayarlayın. Açılır menüden Anahatları Göster'i seçin. Sonuçları görüntüle'yi işaretleyin, kenarları hariç tutun ve delikleri dahil edin. Kalan kutuları işaretlemeden bırakın. Tamam'a tıklayın.
- Tanımlanan her mikrojel için alan, şekil tanımlayıcıları ve Feret'in çap bilgilerini içeren bir sonuç ekranı açılacaktır. Sonuçları kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın.
- Her parçacık için eşdeğer dairesel çapı belirleyin.
- Görüntü ölçeğini ölçek çubuğundan veya cihaz bilgilerinden μm/piksel cinsinden elde edin. E-tabloda, her mikrojelin alanını piksel2'den μm2'ye dönüştüren bir sütun oluşturun.
- Mikrojelin μm'deki eşdeğer dairesel çapını belirlemek için μm2'deki alanı kullanın (yani, pi ile bölünmüş alanın karekökünü alın, sonra iki katına çıkarın).
- Her mikrojel için Feret'in çaplarını (yani, parçacık sınırındaki herhangi iki nokta arasındaki en uzun mesafeyi) bir μm birimine dönüştürmek için μm / piksel ölçeğini kullanın.
- Her mikrojel için dairesellik ("Dairesel"), en boy oranı ("AR"), yuvarlaklık ("Yuvarlak") ve sağlamlık değerleri doğrudan ImageJ'den olduğu gibi kullanılabilir.
- Mikrojel popülasyonunu, çapların dağılımını (eşdeğer dairesel ve Feret'in), daireselliği, en boy oranını, yuvarlaklığı ve katılığı göz önünde bulundurarak istediğiniz gibi analiz edin.
Şekil 3: ImageJ kullanarak parçalanmış mikrojel parçacıklarını karakterize etmeye genel bakış. Şekil, (A) parçalanmış mikrojel parçacıklarının seyreltik bir süspansiyonunu oluşturmayı ve süspansiyondaki mikrojelleri görüntülemek için bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanmayı (ölçek çubuğu = 500 μm), (B) ImageJ'de ikili bir görüntüye dönüştürmeyi ve parçacıkları analiz etmeyi (sayım, şekil tanımlayıcıları, vb.) ve (C) temsili sonuçları göstermektedir. Hata çubukları, minimum ve maksimumu, iç çeyrek aralıkları ayrılmış olarak gösterir. N = 100 mikrojel popülasyon büyüklüğü gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Parçalanmış mikrojellerin granüler hidrojellere montajı
NOT: Parçalanmış mikrojellerden granüler hidrojellerin formülasyonu için santrifüjleme ve filtreleme kullanılarak iki yöntem sunulmaktadır. Kullanılan yöntem, istenen mikrojel ambalajına (yani, filtrasyon paketleri parçacıklarını daha yoğun) ve biyolojik bileşenlerin dahil edilip edilmediğine (yani, santrifüjleme parçacıklar arasındaki bileşenleri koruyacak, oysa filtrasyonda bunlar kaybolabilir) bağlı olacaktır. Önceki çalışma40 , santrifüj veya vakumla çalışan filtrasyondan oluşan granüler hidrojeller için karşılaştırmalı sonuçları (yani mekanik, gözeneklilik) ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
- Seçenek 1: Santrifüjleme kullanarak parçalanmış mikrojelleri reçel haline getirin.
- PBS süpernatantını son yıkama adımından çıkardıktan sonra, her bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mL PBS ekleyin ve mikrojelleri yeniden askıya alın.
- Parçalanmış hidrojel süspansiyonunu 5 dakika boyunca 18.000 x g'de döndürün.
NOT: İstenirse mikrojellerin daha az yoğun ambalaja sahip granüler hidrojellere sıkışması için daha yavaş santrifüj hızları kullanılabilir. - PBS süpernatantını çıkarın.
- Taze bir 3 mL şırınga alın ve pistonu çıkarın. Parçalanmış granüler hidrojeli mikrosantrifüj tüpünden çıkarmak ve boş şırınga namlusunun arkasına aktarmak için metal bir spatula kullanın. Granüler hidrojelin şırıngaya aktarılmasına yardımcı olmak için bir pipet ucu kullanılabilir. Pistonu şırıngaya geri döndürün. Şimdi parçalanmış granüler hidrojeli şırıngaya yükleyin ve kullanıma hazır.
- Seçenek 2: Vakumla çalışan filtreleme kullanarak parçalanmış mikrojelleri reçel haline getirin. Vakumla çalışan filtreleme ile sıkışmaya genel bir bakış Şekil 4'te gösterilmiştir.
- Vakumla çalışan filtreleme aparatını monte edin ve test edin.
- Bir Buchner hunisini bir filtre şişesinin içine sabitleyin ve filtre adaptörünü huni ile şişe açıklığı arasına yerleştirin.
- Filtre şişesini bir vakum hattına bağlamak için boru kullanın.
- Buchner huni kabına bir membran filtre (0,22 μm) yerleştirin.
- Kadran valfini açarak vakum hattını açın. Membran filtreye ~0,5 mL PBS pipetleyerek bağlantıyı test edin ve tüm PBS'nin filtreden geçtiğini ve filtre şişesinin dibinde toplandığını gözlemleyin.
- Vakum hattını açın ve tam bir sızdırmazlık sağlayın. Parçalanmış hidrojel süspansiyonunu vorteksleyin, böylece mikrojeller PBS'de askıya alınır.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak, parçalanmış hidrojel süspansiyonu membran filtresine (0,22 μm) aktarın. Tüm mikrojel süspansiyonunu aktardıktan sonra, vakumun PBS'yi parçalanmış hidrojel süspansiyonundan çekmesi için ~ 30 s bekleyin. Vakum hattını kapatın.
NOT: Parçalanmış hidrojel süspansiyonun, vakum çekerken membran filtresine oturduğu süre değişebilir. Daha fazla bilgi ve sorun giderme önerileri için Tartışma'ya bakın. - Taze bir 3 mL şırınga alın ve pistonu çıkarın. Parçalanmış granüler hidrojeli filtreden çıkarmak ve boş şırınga varilinin arkasına aktarmak için metal bir spatula kullanın. Granüler hidrojelin şırıngaya aktarılmasına yardımcı olmak için bir pipet ucu kullanılabilir. Pistonu şırıngaya geri döndürün. Parçalanmış granüler hidrojeli şırıngaya yükleyin ve şimdi kullanıma hazırdır.
- Vakumla çalışan filtreleme aparatını monte edin ve test edin.
Şekil 4: Sıkıca paketlenmiş parçalanmış granüler hidrojelleri imal etmek için vakumla çalışan filtreleme ile mikrojellerin sıkışmasına genel bakış. Şekil, (A) vakum filtrasyon aparatına bir membran filtre yerleştirmeyi, (B) parçalanmış mikrojel süspansiyonunu filtreye aktarmak için bir pipet kullanmayı, (C) vakumu çekmeyi ve mikrojellerin sıkışmasını ve granüler bir hidrojel oluşturmasını beklemeyi, (D) vakumu kapatmayı ve metal bir spatula kullanarak parçalanmış granüler hidrojeli çıkarmayı ve (E) granüler hidrojeli şırıngaya aktarmak için metal bir spatula kullanmayı göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Granül hidrojel mürekkeplerle ekstrüzyon baskısı
NOT: Ekstrüzyon baskı işlemine genel bir bakış, vakumla çalışan filtrasyonla sıkışmış parçalanmış granüler hidrojeller kullanılarak yıldız şeklindeki bir yapının temsili baskısı da dahil olmak üzere Şekil 5'te gösterilmiştir. Yazdırma iş akışı, bir mürekkebin formüle edilmesinden, baskı tasarımının planlanmasından ve ardından mürekkebin istenen tasarıma göre yazdırılmasından oluşur41. İstenirse, baskılı granüler hidrojel yapılar, sıkışmadan önce parçalanmış mikrojel süspansiyonuna fazla DTT (5 mM) ve I2959 (ağırlıkça% 0.05) eklenerek ekstrüzyon sonrası fotoçapraz bağlama kullanılarak stabilize edilebilir. Bu, mikrojeller arasında oluşan fotoçapraz bağlı kovalent bağlarla sonuçlanacak ve granüler hidrojel yapısının kalıcı stabilizasyonuna yol açacaktır.
- Mürekkep formülasyonu
- Planlama sürecinde, kullanılacak mürekkebin özelliklerini aklınızda bulundurun. Mürekkebi karakterize etmek için, baskı tasarım sürecini bilgilendirmeye yardımcı olmak için parçalanmış hidrojellerin reolojik analizini tamamlayın. Granüler hidrojellerin reolojik karakterizasyonunu tanımlayan yöntemler başka bir yerde tanımlanmıştır ve bu çalışma için uyarlanabilir40.
- Reolojik analizden, bir baskı platformu ve bir dizi ilk baskı parametresi seçin.
NOT: Granüler hidrojel mürekkeplerin genel yüksek viskozitesi ve kesme inceltme özellikleri nedeniyle, tipik olarak vida bazlı ekstrüzyon yazıcılar kullanılır.
- Baskı tasarımı
NOT: Repetier Host yazılımı (bundan böyle 3D baskı yazılımı olarak anılacaktır) 3D baskı uygulamaları için kullanılmaktadır (adım 5.2-5.3).- Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı aracılığıyla baskı tasarımları oluşturun. Kullanıcılar sıfırdan yeni tasarımlar oluşturabilir veya hasta doku taramaları veya diğer kullanıcılar gibi önceden var olan tasarımları değiştirebilir. CAD tasarımları oluşturma hakkında daha fazla bilgi için lütfen aşağıdaki41,42,43 referanslarına bakın.
- CAD modellerini G-Koduna işlemek için, CAD dosyasının ".stl" formatında (Ek Dosya 1) kaydedildiğinden ve üst paneldeki yükle düğmesini seçerek veya menü çubuğunda Dosya > Yükle'yi seçerek 3B baskı yazılımına yüklendiğinden emin olun. Bu G kodu, mürekkebin birikmesi için yazdırma yolunu tanımlar. İçi boş bir silindirin örnek bir .stl dosyası ek dosyalara eklenmiştir.
- Bir STL dosyası 3B baskı yazılımına yüklendikten sonra, Dilimleyici paneline gidin ve dilimleyici seçeneği olarak Slic3r'yi seçin. Burada, nozul çapı, katman yüksekliği, baskı hızı ve ekstrüzyon hızı gibi ayarlar mürekkep karakterizasyonuna ve istenen baskı sonuçlarına göre ayarlanabilir. Bu protokolde, 18 G'lik bir iğne (838 μm iç çap) kullanılır. Önceki optimizasyon39'a göre katman yüksekliği 1 mm, baskı hızı 8 mm/sn ve akış hızı 9 μL/sn olarak ayarlanmıştır. Parametrelerin sayısal değerleri, granüler hidrojel mürekkeplerin özelliklerindeki değişiklikleri hesaba katmak için ± %20 oranında ayarlanabilir.
NOT: Bu ayarların ve baskı tasarımının, mürekkep formülasyonundaki, istenen baskı çözünürlüğündeki veya kullanılan baskı platformundaki ayarlamalara bağlı olarak yinelemeli deneysel testlerle ayarlanması gerekebileceğini unutmayın. Bu parametreler ve baskı ayarlarının yeni bir mürekkep formülasyonu ile karakterizasyonu hakkında daha fazla bilgi için lütfen diğer referanslara bakın40,44,45,46.
- Parçalanmış granüler hidrojellerle ekstrüzyon baskısı
- Şırıngaları parçalanmış granüler hidrojellerle yüklemek için, bakınız 4.2.4, ayrıca Şekil 4 ve Şekil 5.
- Uç kapağını çıkarın ve seçtiğiniz bir iğneyle değiştirin.
- Şırıngayı tercih ettiğiniz baskı platformuna yükleyin. Burada, özel yapım vida tabanlı bir ekstrüzyon yazıcı kullanılır.
NOT: Özel biyoyazıcılar oluşturma hakkında bilgi için lütfen diğer referanslara bakın44,47. - Hazırlanan G-Code dosyasını planlama aşamasından 3D baskı yazılımına yükleyin. Baskı Önizleme paneline gidin ve Print (Yazdır) düğmesine basın.
- Baskı biriktirme işlemi tamamlanır tamamlanmaz, parçalanmış granüler hidrojel yapılarını fotoçapraz bağlama ve stabilizasyon için UV ışığına maruz bırakın.
- Çapraz bağlama tamamlandıktan sonra, numuneyi PBS'de üç kez yıkayarak işleyin.
Şekil 5: Parçalanmış granüler hidrojellerle ekstrüzyon baskısına genel bakış. Şekil, (A) parçalanmış granüler hidrojeli bir şırınga namlusuna aktarmak için bir spatula kullanmak, (B) künt uçlu bir iğne (18 G gösterilmiştir) ve numuneyi üste itmek, (C) baskı için bilgisayar yazılımına bağlantıyı temsil eden bir grafik ve (D) parçalanmış granüler hidrojel ile yıldız şeklindeki bir yapının baskısını tamamlamak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokollerden elde edilen temsili sonuçlar Şekil 3 ve Şekil 6'da gösterilmiştir. Ekstrüzyon parçalanması, çapları 10-300 μm arasında değişen pürüzlü, çokgen şekillere sahip mikrojeller verir (Şekil 3). Ayrıca, dairesellik 0,2 (dairesel değil) ile neredeyse 1 (mükemmel daire) arasında değişir ve en boy oranı 1-3 arasında değişir (Şekil 3). Bu parametreler, parçalanma işleminin oluşturduğu düzensiz ve pürüzlü mikrojel şekillerini tanımlar.
Santrifüjleme veya vakumla çalışan filtreleme kullanılarak bir araya getirildiğinde, monte edilmiş granüler hidrojel,önceki çalışmada açıklandığı gibi kesme inceltici ve kendi kendini iyileştiricidir. Ek olarak, parçalanmış granüler hidrojel, Şekil 6'da ekstrüzyon baskısı yapılan 2 cm yüksekliğindeki içi boş bir silindirin birikmesiyle gösterildiği gibi, enjekte edilebilir bir hidrojel için yüksek şekil doğruluğuna ve mekanik bütünlüğe sahiptir. Bu basit ve uygun maliyetli yöntemlerle üretilen parçalanmış granüler hidrojeller, enjekte edilebilir terapötikler ve 3D baskı mürekkepleri de dahil olmak üzere birçok biyomedikal uygulama için yararlıdır.
Şekil 6: Protokole genel bakış ve temsili sonuçlar. Şekil (A) parçalanmayı, (B) süspansiyondaki mikrojelleri, (C) vakumla çalışan filtrasyonla sıkışmayı ve (D) sıkışmış granüler hidrojelin bir iğneden ekstrüde edilmesini ve içi boş bir silindire basılmasını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Örnek .stl dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, ekstrüzyon parçalı mikrojeller kullanılarak granüler hidrojellerin üretilmesi ve santrifüjleme veya vakum tahrikli filtrasyon yoluyla ambalajlanması yöntemleri açıklanmaktadır. Diğer mikrojel üretim yöntemleriyle (yani, mikroakışkanlar, toplu emülsiyonlar, elektropüskürtme, fotolitografi) karşılaştırıldığında, ekstrüzyon parçalanması mikrojel üretimi oldukça hızlı, düşük maliyetli, kolayca ölçeklenebilir ve çok çeşitli hidrojel sistemlerine uygundur. Ayrıca, bu protokol, önceki çalışma39'da karakterize edilen minimum partiden partiye değişkenlik ile oldukça tekrarlanabilir.
Bu protokol, foto-aracılı tiol-en reaksiyonu kullanarak dökme hidrojelleri üretmek için norbornen modifiye hyaluronik asit (NorHA) kullanır. NorHA sentezi için ayrıntılı prosedürler başka bir yerde açıklanmıştır38. Bununla birlikte, bir şırınganın namlusu içinde toplu bir hidrojel oluşturulabiliyorsa, burada açıklanan yöntemleri kullanarak parçalanmış mikrojelleri üretmek için birçok hidrojel kimyası kullanılabilir. Dökme hidrojel mekanik özelliklerini (örneğin, basınç modülü) anlamak da yararlıdır. Bu protokolde kullanılan dökme hidrojeller, yaklaşık 30 kPa39'luk bir toplu basınç modülüne sahiptir. Daha yüksek bir basınç modülüne sahip bir dökme hidrojel, parçalanma adımları sırasında ekstrüzyon yapmak için daha fazla kuvvet gerektirecektir, bu da şırıngaların tıkanmasına veya aşırı basınçlandırılmasına neden olabilir; Bu nedenle, 80 kPa'dan daha az basınç modülüne sahip hidrojellerin kullanılması önerilir. Ayrıca, 10 kPa'dan daha düşük basınç modülüne sahip bir dökme hidrojel, parçalanma adımları sırasında deforme olabilir ve parçalanmayı zorlaştırabilir.
Bu protokol UV nokta kür lambası için optimize edilmiştir. UV ışık kaynağına ve UV'ye duyarlı fotobaşlatıcılara alternatif olarak, görünür ışık kaynakları, suda çözünür lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoil-fosfinat (LAP) gibi görünür ışığa duyarlı fotobaşlatıcılarla birlikte de kullanılabilir. Başlatıcı konsantrasyonu, ışık yoğunluğu ve numune hacmi, kullanılan polimere ve çapraz bağlama sistemine bağlı olarak çapraz bağlama sürelerini etkileyecektir. Ayrıca, birçok lamba kaynağı spot kürleme sistemlerine alternatif olarak kullanılabilir.
Protokoldeki en kritik adım, daha küçük ve daha küçük iğne göstergeleri aracılığıyla seri ekstrüzyondur. Bu prosedürde, 18 G'den (838 μm iç çap) 30 G'ye (159 μm iç çap) kadar iğne göstergelerinin kullanılması önerilmektedir. İğneler yoluyla ekstrüzyon yapmadan önce parçalanmış dökme hidrojele PBS eklenmesi, ekstrüzyon ve parçalama için gereken kuvveti önemli ölçüde azaltmak için çok önemlidir. Hidrojeli ekstrüzyon yapmak için aşırı kuvvet kullanılmamalıdır, çünkü aşırı kuvvet şırıngada geri basınçlandırmaya neden olabilir ve hidrojelin şırıngadan geri patlama riski olabilir. Ekstrüzyon yapmak için gereken kuvveti azaltmaya yönelik ek stratejiler, parça boyutunu daha kademeli olarak azaltmak için seride daha fazla iğne kullanmayı ve parçalama adımları arasında ek PBS eklemeyi içerir.
Parçalanmış mikrojelleri vakumla çalışan filtrasyon kullanarak sıkıştırırken, işlemde değişkenlik olabilir. Bazı malzeme sistemleri, PBS'yi çıkarmak ve mikrojelleri tamamen sıkıştırmak için daha fazla (veya daha az) zaman gerektirebilir. Deneyler arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için bireysel malzeme sistemleri için gereken sürenin kaydedilmesi önerilir. Sıkışma süresi, filtreye eklenen numunenin kalınlığına ve boyutuna da bağlı olacaktır. Numuneyi filtre boyunca eşit olarak yaymak, düzgün sıkışmaya yardımcı olabilir.
Ekstrüzyon parçalanma mikrojel üretim yöntemi birçok biyomedikal uygulama için uyarlanabilir. Örneğin, terapötikler hidrojel öncü çözeltisine dahil edilebilir ve daha sonra lokalize terapötik dağıtım için kesme inceltici, kendi kendini iyileştiren granüler bir hidrojel üretmek için parçalanmış mikrojeller içinde kapsüllenebilir. Ek olarak, uzun süreli depolama ve basit sterilizasyon uygulamalarına izin vermek için parçalanmış mikrojeller kurutulabilir. Bununla birlikte, ekstrüzyon parçalanmasının bir sınırlaması, hücrelerin mikrojeller içine dahil edilmesidir. Ekstrüzyon parçalanması sırasındaki yüksek kesme oranları nedeniyle, yüksek kesme hücre canlılığının önemli ölçüde azalmasına yol açabileceğinden, yöntem muhtemelen mikrojeller içindeki hücre kapsüllemesine uygun değildir. Yine de, hücreler ve sferoidler, in vitro kültür ve in vivo hücre dağıtımı için mikrojeller arasına kolayca dahil edilebilir.
Parçalanmış granüler hidrojeller, biyomedikal uygulamalar için umut verici bir biyomalzemedir. Son yıllarda, çeşitli parçalanma yöntemlerinden (yani, harç ve havane, karıştırıcılar ve ağ rendeleri) yapılan granüler hidrojeller, hücre yüklü 3D baskı mürekkepleri48, terapötik dağıtım araçları29, enjekte edilebilir doku onarım iskeleleri 30 ve küresel kültür platformları39 olarak kullanılmıştır. Daha önce bildirilen parçalanma yöntemleri arasında, burada açıklanan ekstrüzyon parçalanma yöntemi, sayısız avantajı olan en basit ve uygun maliyetli yöntemlerden biridir. Buradaki yöntemlerin paylaşılması, granüler hidrojel üretimine erişilebilirliği artıracak ve granüler hidrojel biyomalzemelerin büyüyen alanında önemli ilerlemelere yol açacak ve daha fazla araştırmacının parçalanmış granüler hidrojellerle yenilikçi biyomedikal çözümler üretmesini sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı tarafından UPenn MRSEC programı (DMR-1720530) ve lisansüstü araştırma bursları (V.G.M ve M.E.P.) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01AR077362 ila J.A.B.) aracılığıyla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
