Summary
В этой работе описываются простые, адаптируемые и недорогие методы изготовления микрогелей с экструзионной фрагментацией, переработки микрогелей в инъекционные гранулированные гидрогели и применения гранулированных гидрогелей в качестве экструзионных печатных красок для биомедицинских применений.
Abstract
Гранулированные гидрогели представляют собой застрявшие сборки микрочастиц гидрогеля (т.е. «микрогелей»). В области биоматериалов гранулированные гидрогели обладают многими преимущественными свойствами, включая инъекционную способность, микромасштабную пористость и настраиваемость путем смешивания нескольких популяций микрогелей. Способы изготовления микрогелей часто полагаются на эмульсии «вода в масле» (например, микрофлюидика, периодические эмульсии, электросмайли) или фотолитографию, которая может представлять высокие требования с точки зрения ресурсов и затрат и может быть несовместима со многими гидрогелями. В этой работе подробно описываются простые, но высокоэффективные методы изготовления микрогелей с использованием экструзионной фрагментации и их переработки в гранулированные гидрогели, полезные для биомедицинских применений (например, чернила для 3D-печати). Во-первых, объемные гидрогели (с использованием фотосмешиваемой гиалуроновой кислоты (ГК) в качестве примера) экструдируют через серию игл с последовательно меньшими диаметрами с образованием фрагментированных микрогелей. Этот метод изготовления микрогелей является быстрым, недорогим и высокомасштабируемым. Описаны способы замаскивания микрогелей в гранулированные гидрогели методом центрифугирования и вакуумной фильтрации с возможностью пост-сшивки для стабилизации гидрогеля. Наконец, гранулированные гидрогели, изготовленные из фрагментированных микрогелей, демонстрируются как экструзионные печатные краски. В то время как примеры, описанные в настоящем описании, используют фотосклеиваемую ГК для 3D-печати, способы легко адаптируются для широкого спектра типов гидрогелей и биомедицинских применений.
Introduction
Гранулированные гидрогели изготавливаются путем упаковки частиц гидрогеля (т.е. микрогелей) и представляют собой захватывающий класс биоматериалов со многими выгодными свойствами для биомедицинских применений 1,2,3. Благодаря своей структуре твердых частиц гранулированные гидрогели истончаются и самовосстанавливаются, что позволяет использовать их в качестве экструзионных печатных (био)чернил, гранулированных опор для встроенной печати и инъекционных терапевтических средств 4,5,6,7,8,9. Кроме того, пустое пространство между микрогелями обеспечивает микромасштабную пористость для движения клеток и молекулярной диффузии 8,10,11. Кроме того, несколько популяций микрогелей могут быть объединены в одну формулу, чтобы обеспечить улучшенную настраиваемость и функциональность материала 8,10,12,13. Эти важные свойства побудили к быстрому расширению разработки гранулированного гидрогеля в последние годы.
Существует ряд методов, доступных для формирования микрогелей для производства гранулированного гидрогеля, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Например, микрогели часто образуются из эмульсий «вода в масле» с использованием капельной микрофлюидики 4,11,13,14,15,16,17, периодических эмульсий 7,18,19,20,21,22 или электромолящих 6,23, 24,25. Эти методы дают сферические микрогели с однородным (микрофлюидика) или полидисперсным (периодические эмульсии, электромолы) диаметрами. Существуют некоторые ограничения для этих методов изготовления эмульсий «вода в масле», включая потенциально низкопроизводительное производство, потребность в растворах гидрогелевых прекурсоров с низкой вязкостью, а также высокую стоимость и ресурсы для установки. Кроме того, эти протоколы могут потребовать резких масел и поверхностно-активных веществ, которые должны быть вымыты из микрогелей с использованием процедур, которые добавляют этапы обработки, и могут быть трудно перевести в стерильные условия для биомедицинских применений во многих лабораториях. Устраняя необходимость в эмульсиях «вода в масле», также может быть использована (фото)литография, где плесени или фотомаски используются для контроля отверждения микрогелей из растворов предшественников гидрогеля 1,26,27. Как и микрофлюидика, эти методы могут быть ограничены в их производительности, что является серьезной проблемой, когда требуются большие объемы.
В качестве альтернативы этим методам механическая фрагментация объемных гидрогелей была использована для изготовления микрогелей с неправильными размерами 19,28,29,30,31,32. Например, объемные гидрогели могут быть предварительно сформированы и впоследствии пропущены через сетки или сита с образованием фрагментированных микрогелей, процесс, который даже был выполнен в присутствии клеток внутри микрогелевых нитей33,34. Объемные гидрогели также были переработаны в микрогели с механическим разрушением с использованием таких методов, как измельчение раствором и пестиком или с использованием коммерческих блендеров 35,36,37. Другие также использовали механическое перемешивание во время образования гидрогеля для изготовления фрагментированных микрогелей (т.е. жидких гелей)31.
Способы в настоящем описании расширяют эти методы механической фрагментации и представляют собой простой подход к изготовлению микрогелей с экструзионной фрагментацией, используя в качестве примера фотосмешивающиеся гидрогели гиалуроновой кислоты (ГК). Экструзионная фрагментация использует только шприцы и иглы для изготовления фрагментированных микрогелей недорогим, высокопроизводительным и легко масштабируемым методом, который подходит для широкого спектра гидрогелей 19,32. Кроме того, описаны способы сборки этих фрагментированных микрогелей в гранулированные гидрогели с использованием центрифугирования (низкая упаковка) или вакуумной фильтрации (высокая упаковка). Наконец, обсуждается применение этих фрагментированных гранулированных гидрогелей для использования в качестве экструзионной печатной краски. Целью этого протокола является внедрение простых методов, которые адаптируются к широкому спектру гидрогелей и могут быть реализованы практически в любой лаборатории, заинтересованной в гранулированных гидрогелях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление объемных гидрогелей внутри шприца с использованием фотосшивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор изготовления объемного гидрогеля внутри шприца с использованием фотосшивания показан на рисунке 1. Этот протокол использует норборнен-модифицированную гиалуроновую кислоту (NorHA) для изготовления объемных гидрогелей с использованием фотоопосредованной тиол-еновой реакции. Подробные процедуры синтеза NorHA описаны в другом месте38. Тем не менее, этот протокол легко адаптируется к любому фотосшиваемому гидрогелю. Дополнительные сведения см. в разделе Обсуждение.
- Предопределить желаемые концентрации полимера, сшивки и инициаторов для объемного гидрогелевого состава. В этом протоколе раствор предшественника гидрогеля состоит из NorHA (2 мас.%, ~25% степень модификации норборнена), дитиотрейтола (DTT, 6 мМ) и Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 мас.%). Убедитесь, что компоненты (1 мл) полностью растворены в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) в микроцентрифужной трубке.
ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении раствора-предшественника гидрогеля к раствору можно добавить высокомолекулярный FITC-декстран (2 МДа, 0,1 мас.%) для визуализации микрогелей, изготовленных позже в протоколе с использованием флуоресцентной микроскопии. - Загрузите шприц объемом 3 мл раствором предшественника гидрогеля.
- Снимите поршень с задней части пустого шприца объемом 3 мл и добавьте крышку наконечника к верхней части ствола шприца.
- Используйте пипетку объемом 1000 мкл для переноса раствора предшественника гидрогеля в бочку шприца с крышкой наконечника.
- Держите шприцевую бочку с раствором гидрогелевого предшественника в одной руке, крышкой наконечника обращенным вниз, а открытый конец ствола обращенным вверх. С другой стороны, верните поршень шприца в отверстие задней части ствола шприца. Осторожно протолкните шприц-поршень в ствол, ровно столько, чтобы запечатать отверстие в задней части шприцевого ствола.
- Осторожно удерживая поршень и шприц-ствол вместе, чтобы убедиться, что задняя часть ствола шприца герметизирована плунжером, переверните шприц так, чтобы плунжер был обращен вниз, а крышка наконечника теперь обращена вверх. Снимите крышку наконечника и осторожно протолкните поршень в ствол шприца до тех пор, пока весь воздух не будет удален из шприца (останется только раствор предшественника гидрогеля).
- Прикрепите колпачок наконечника к шприцу. Убедитесь, что раствор предшественника гидрогеля закреплен в шприце объемом 3 мл с помощью колпачка наконечника.
- Образуют объемный гидрогель в шприце объемом 3 мл.
- Убедитесь, что перед включением ультрафиолетовой лампы принимаются надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и средства защиты. Это включает в себя ношение УФ-защитных очков и закрытие области лампы для защиты других от ультрафиолетового света.
- Откалибруйте лампу точечного отверждения УФ-излучения до интенсивности света 10 мВт/см2 с помощью радиометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через шприцевой ствол будет происходить легкое затухание. Перед изготовлением определите процент ослабления света с помощью радиометра. Интенсивность света от системы точечного отверждения должна быть соответствующим образом отрегулирована с учетом такого затухания. - Поместите шприц объемом 3 мл, загруженный раствором предшественника гидрогеля, под лампу УФ-точечного отверждения в течение желаемого периода времени для полного фотоскрещивания. Для системы, описанной в настоящем описании, раствор гидрогеля NorHA подвергают воздействию ультрафиолетового излучения в течение 5 мин с интенсивностью 10 мВт/см2, что, исходя из предыдущих исследований39, было достаточно времени и интенсивности света для обеспечения полного сшивания, как это определяется путем фотосшивания колебательного сдвига реологических разверток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить полное фотосшивание внутри шприца, шприц можно перевернуть на полпути в течение периода фотоскрытия. - Выключите ультрафиолетовую лампу и снимите шприц. Убедитесь, что гидрогель теперь сшит в шприце. Это можно сделать, оттянув плунжер и наблюдая, как гидрогель движется как твердый блок, а не вязкая жидкость.
Рисунок 1: Обзор изготовления объемных гидрогелей внутри шприца с использованием фотосшивания. На рисунке изображены (А) извлечение плунжера из шприца, (В) закрепление крышки наконечника на стволе шприца, (В) добавление предшественника гидрогеля в ствол шприца, (D) возвращение плунжера в шприц, (Е) удаление избыточного воздуха и закрепление крышки наконечника и (F) фотосклеивание объемного гидрогеля внутри шприца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Изготовление микрогелей с использованием экструзионной фрагментации
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор изготовления микрогелей с использованием экструзионной фрагментации показан на рисунке 2.
- Снимите поршень с задней части пустого шприца объемом 3 мл. Закрепите крышку наконечника на Luer-Lock.
- Снимите колпачок наконечника со шприца, содержащего фотосшитый объемный гидрогель. Выровняйте верхнюю часть шприца гидрогеля с открытием ствола на пустом шприце.
- Выдавливайте объемный гидрогель через шприцевое отверстие (без прикрепленной иглы) в ствол пустого шприца. Правильно выбросьте шприц, который теперь пуст (ранее содержал гидрогель), в соответствующий поток отходов.
- Держите шприц, содержащий экструдированный гидрогель, так, чтобы крышка наконечника была обращена вниз, а отверстие ствола было обращено вверх. Используя пипетку объемом 1000 мкл, добавьте 1,5 мл PBS в ствол шприца.
- Выровняйте шприц-плунжер с отверстием ствола, едва вдавливая плунжер достаточно, чтобы создать уплотнение. Переверните шприц таким образом, чтобы плунжер теперь был обращен вниз, а крышка наконечника была обращена вверх, убедившись, что плунжер и шприц-ствол находятся вместе, чтобы не просачивались гидрогель или PBS. Инвертировать несколько раз, чтобы смешать фрагментированный гидрогель с добавленным PBS.
- Держите шприц так, чтобы колпачок наконечника был обращен вверх, а плунжер был обращен вниз. Снимите колпачок наконечника. Очень осторожно нажмите поршень вверх, чтобы удалить воздух из внутренней части шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорее всего, в задней части шприца объемом 3 мл будет канавка, которая потребует дополнительного усилия для проталкивания плунжера. Очень осторожно надавите плунжером на канавку. Любое внезапное или резкое количество силы заставит плунжер двигаться слишком быстро и, возможно, вытеснит фрагментированную суспензию гидрогеля. - Экструдируйте фрагментированную суспензию гидрогеля через ряд игл для создания фрагментированных микрогелей.
- Прикрепите иглу с тупым наконечником 18 г к верхней части шприца, содержащую фрагментированный гидрогель и PBS. Извлеките поршень из свежего шприца объемом 3 мл и прикрепите крышку наконечника к пустому стволу шприца.
- Выдавливайте фрагментированную суспензию гидрогеля через иглу весом 18 г в заднюю часть пустого ствола шприца. Выбросьте пустой шприц и иглу в соответствующий поток отходов острых предметов.
- Держите шприц, содержащий фрагментированную гидрогелевую суспензию, так, чтобы крышка наконечника была обращена вниз, а отверстие ствола было обращено вверх. Выровняйте шприц-плунжер с отверстием ствола, едва вдавливая плунжер достаточно, чтобы создать уплотнение.
- Переверните шприц так, чтобы плунжер теперь был обращен вниз, а крышка наконечника была обращена вверх, убедившись, что плунжер и шприц-ствол вместе, чтобы не просачивались гидрогель или PBS.
- Держите шприц так, чтобы колпачок наконечника был обращен вверх, а плунжер был обращен вниз. Снимите колпачок наконечника. Очень осторожно нажмите поршень вверх, чтобы удалить воздух из внутренней части шприца. См. ПРИМЕЧАНИЕ выше относительно осторожного проталкивания плунжера шприца внутрь, чтобы предотвратить нежелательное изгнание гидрогелевого материала.
- Повторите шаги 2.7.1-2.7.5 с иглой 23 Г, 27 Г и 30 Г. На последней стадии экструзии (игла 30 г) экструдируют фрагментированную суспензию гидрогеля в микроцентрифужные трубки. Для объемов, описанных в настоящем описании, конечный фрагментированный объем суспензии гидрогеля составит ~2,5 мл, что потребует двух микроцентрифужных трубок объемом 1,5 мл (объем разделен поровну).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выдавливания фрагментированной гидрогелевой суспензии через иглы не требуется чрезмерного усилия. Для обеспечения наилучшей практики безопасности рекомендуется выполнять все этапы экструзионной фрагментации внутри химической вытяжки, чтобы обеспечить защиту в случае избыточного давления шприца во время экструзии. Кроме того, этот процесс может быть легко выполнен в шкафу биобезопасности / ламинарной вытяжке для поддержания стерильности во время изготовления. Дополнительные рекомендации по устранению неполадок см. в разделе Обсуждение.
- Промыть и изолировать фрагментированную суспензию гидрогеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка фрагментированных микрогелей поможет удалить любой непрореагировавший полимер и сшивку. Кроме того, центрифугирование поможет выделить микрогели из суспензии путем образования гранулы.- Используя микроцентрифугу, раскрутите фрагментированную микрогелевую суспензию на 5000 х г в течение 5 мин.
- Используйте пипетку, чтобы удалить супернатант. Добавьте 1 мл PBS в каждую микроцентрифужную трубку, содержащую фрагментированные микрогели и вихрь в течение 5-10 с.
- Повторите центрифугирование и промывку с помощью PBS 3x.
Рисунок 2: Обзор изготовления микрогелей с использованием экструзионной фрагментации. На рисунке изображены (А) экструдирование объемного гидрогеля в пустой ствол шприца и добавление PBS, (B) закрепление поршня в шприце фрагментированным гидрогелем, (C) прикрепление иглы 18 G и экструдирование фрагментированной суспензии гидрогеля в пустой ствол шприца и (D) повторение этапов фрагментации экструзии с иглами 23 G, 27 G и 30 G, сбор фрагментированной суспензии гидрогеля в микроцентрифужных трубках при окончательной экструзии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Характеристика фрагментированных микрогелей с помощью ImageJ
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор характеристики фрагментированных микрогелей с использованием ImageJ показан на рисунке 3, а также репрезентативные результаты для описания распределения размеров и форм в партии фрагментированных микрогелей. Микрогели должны быть флуоресцентно помечены перед визуализацией. Например, высокомолекулярный FITC-декстран (2 МДа) может быть инкапсулирован в объемный гидрогель перед фрагментацией для создания флуоресцеин-меченых микрогелей.
- Соедините 20 мкл фрагментированной микрогелевой суспензии со 180 мкл PBS для создания разбавленной фрагментированной микрогелевой суспензии. Вихрь тщательно перемешать.
- Перенесите 50 мкл разбавленной фрагментированной микрогелевой суспензии на предметное стекло микроскопа.
- Используйте эпифлуоресцентный микроскоп для получения изображений флуоресцентно меченых микрогелей с 4-кратным или 10-кратным зумом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензия микрогеля должна быть достаточно разбавлена таким образом, чтобы соседние микрогели не контактировали друг с другом, но достаточно концентрированной, чтобы в окне просмотра были видны десятки микрогелей. Для этого можно соответствующим образом отрегулировать разбавление микрогелевой суспензии. - Использование ImageJ для анализа фрагментированных частиц микрогеля. Дополнительную информацию об использовании функции «Анализировать частицы» в ImageJ можно найти по ссылке, приведенной в Таблице материалов.
- Откройте изображения микрогелей в суспензии в ImageJ.
- Выберите «Анализировать > «Набор измерений», «Контрольная область», «Дескрипторы фигур» и «Диаметр Ферета». Нажмите кнопку ОК.
- Выберите Тип > изображения > 8-разрядная версия.
- Выберите «Изображение > «Настроить пороговое значение >». Отрегулируйте порог так, чтобы микрогели были покрыты красной маской, а фон оставался черным. Нажмите кнопку Применить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если какие-либо микрогели слегка перекрываются, используйте инструмент «Карандаш», чтобы нарисовать тонкую (<5 пикселей) черную линию между микрогелями, чтобы разделить их на черно-белом изображении. - Выберите Анализировать > анализировать частицы. Установите размер (пиксель2) с 50-Infinity, чтобы уменьшить фоновый шум. Установите для параметра Цикличность значение 0,00-1,00. Выберите Показать контуры в раскрывающемся меню. Установите флажки Отображаемые результаты, Исключить по краям и Включить отверстия. Оставьте остальные флажки снятыми. Нажмите OK.
- Откроется дисплей результатов, включающий область, дескрипторы формы и информацию о диаметре Ферета для каждого идентифицированного микрогеля. Скопируйте и вставьте результаты в электронную таблицу.
- Определите эквивалентный диаметр круга для каждой частицы.
- Получите шкалу изображения в мкм/пиксель из шкалы или информации об инструменте. Создайте столбец в электронной таблице, который преобразует площадь каждого микрогеля из пикселя2 в мкм2.
- Используйте площадь в мкм2 для определения эквивалентного круглого диаметра микрогеля в мкм (т. е. возьмите квадратный корень из площади, разделенной на пи, а затем удвоите его).
- Используйте шкалу мкм/пиксель для преобразования диаметров Ферета (т.е. самого большого расстояния между любыми двумя точками на границе частицы) для каждого микрогеля в единицу мкм.
- Циркулярность («Окружность»), соотношение сторон («AR»), округлость («Круглый») и значения твердости для каждого микрогеля могут использоваться непосредственно из ImageJ.
- Проанализируйте популяцию микрогелей по своему усмотрению, учитывая распределение диаметров (эквивалентных круглых и Ферета), циркулярности, соотношения сторон, округлости и твердости.
Рисунок 3: Обзор характеристики фрагментированных микрогелевых частиц с помощью ImageJ. На рисунке изображено (A) создание разбавленной суспензии фрагментированных микрогелевых частиц и использование эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа для изображения микрогелей в суспензии (шкала = 500 мкм), (B) преобразование в двоичное изображение в ImageJ и анализ частиц (количество, дескрипторы формы и т. Д.), И (C) репрезентативные результаты. На панелях ошибок изображены min и max с разграниченными внутренними квартильными диапазонами. Показан размер популяции n = 100 микрогелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Сборка фрагментированных микрогелей в гранулированные гидрогели
ПРИМЕЧАНИЕ: Представлены два способа получения гранулированных гидрогелей из фрагментированных микрогелей с использованием центрифугирования и фильтрации. Используемый способ будет зависеть от желаемой микрогелевой упаковки (т.е. фильтрационной упаковки частиц более плотно) и от того, включены ли биологические компоненты (т.е. центрифугирование будет удерживать компоненты между частицами, тогда как при фильтрации они могут быть потеряны). Предыдущая работа40 подробно описывает сравнительные результаты (т.е. механику, пористость) для гранулированных гидрогелей, образованных либо центрифугой, либо вакуумной фильтрацией.
- Вариант 1: Заклинивание фрагментированных микрогелей с помощью центрифугирования.
- После удаления супернатанта PBS с последней стадии промывки добавьте 1 мл PBS в каждую микроцентрифужную трубку и повторно суспендируйте микрогели.
- Открутите фрагментированную суспензию гидрогеля при 18 000 х г в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более медленные скорости центрифуги могут быть использованы для глушения микрогелей в гранулированные гидрогели с менее плотной упаковкой, если это необходимо. - Удалите супернатант PBS.
- Возьмите свежий шприц объемом 3 мл и извлеките поршень. Используйте металлический шпатель, чтобы зачерпнуть фрагментированный гранулированный гидрогель из трубки микроцентрифуги и перенести его в заднюю часть пустого ствола шприца. Наконечник пипетки может быть использован для оказания помощи в переносе гранулированного гидрогеля в шприц. Верните поршень в шприц. Теперь загрузите фрагментированный гранулированный гидрогель в шприц, и он готов к использованию.
- Вариант 2: Заклинивание фрагментированных микрогелей с использованием вакуумной фильтрации. Обзор помех вакуумной фильтрацией показан на рисунке 4.
- Соберите и протестируйте фильтрационный аппарат с вакуумным приводом.
- Закрепите воронку Бюхнера внутри колбы фильтра, поместив адаптер фильтра между воронкой и отверстием колбы.
- Используйте трубку для подключения колбы фильтра к вакуумной линии.
- Поместите мембранный фильтр (0,22 мкм) в воронкообразную чашку Бюхнера.
- Включите вакуумную линию, открыв циферблатный клапан. Проверьте соединение путем пипетки ~ 0,5 мл PBS на мембранный фильтр и обратите внимание, что весь PBS проходит через фильтр и собирается в нижней части колбы фильтра.
- Включите вакуумную линию и обеспечьте полное уплотнение. Вихрь фрагментированной гидрогелевой суспензии так, что микрогели суспендируются в PBS.
- Используя пипетку объемом 1000 мкл, перенесите фрагментированную суспензию гидрогеля на мембранный фильтр (0,22 мкм). После переноса всей микрогелевой суспензии подождите ~ 30 с, пока вакуум вытащит PBS из фрагментированной гидрогелевой суспензии. Выключите вакуумную линию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время, в течение которого фрагментированная суспензия гидрогеля находится на мембранном фильтре при вытягивании вакуума, может варьироваться. Дополнительные сведения и рекомендации по устранению неполадок см. в разделе Обсуждение. - Возьмите свежий шприц объемом 3 мл и извлеките поршень. Используйте металлический шпатель, чтобы зачерпнуть фрагментированный гранулированный гидрогель из фильтра и перенести его в заднюю часть пустого шприцевого ствола. Наконечник пипетки может быть использован для оказания помощи в переносе гранулированного гидрогеля в шприц. Верните поршень в шприц. Загрузите фрагментированный гранулированный гидрогель в шприц, и теперь он готов к использованию.
- Соберите и протестируйте фильтрационный аппарат с вакуумным приводом.
Рисунок 4: Обзор микрогелей заклинивания вакуумной фильтрацией для изготовления плотно упакованных фрагментированных гранулированных гидрогелей. На рисунке изображены (А) размещение мембранного фильтра на вакуумном фильтрационном аппарате, (В) использование пипетки для переноса фрагментированной микрогелевой суспензии на фильтр, (В) вытягивание вакуума и ожидание заклинивания микрогелей и образования гранулированного гидрогеля, (Г) отключение вакуума и удаление фрагментированного гранулированного гидрогеля с помощью металлического шпателя и (Е) использование металлического шпателя для переноса гранулированного гидрогеля в шприц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
5. Экструзионная печать гранулированными гидрогелевыми чернилами
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор процесса экструзионной печати показан на рисунке 5, включая репрезентативный отпечаток звездообразной конструкции с использованием фрагментированных гранулированных гидрогелей, застрявших вакуумной фильтрацией. Рабочий процесс печати состоит из формулирования чернил, планирования дизайна печати и последующей печати чернил на основе желаемого дизайна41. При желании напечатанные гранулированные гидрогелевые конструкции могут быть стабилизированы с использованием фотосмещивания после экструзии путем добавления избыточного DTT (5 мМ) и I2959 (0,05 мас.%) к фрагментированной микрогелевой суспензии перед заклиниванием. Это приведет к образованию фотосшитых ковалентных связей между микрогелями, что приведет к постоянной стабилизации гранулированной гидрогелевой конструкции.
- Состав чернил
- В процессе планирования учитывайте свойства используемых чернил. Чтобы охарактеризовать чернила, завершите реологический анализ фрагментированных гидрогелей, чтобы помочь информировать процесс проектирования печати. Методы, описывающие реологическую характеристику гранулированных гидрогелей, описаны в другом месте и могут быть адаптированы для данного исследования40.
- Из реологического анализа выберите платформу печати и ряд исходных параметров печати.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за общей высокой вязкости и свойств гранулированных гидрогелевых чернил обычно используются винтовые экструзионные принтеры.
- Дизайн печати
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение Repetier Host (далее именуемое программным обеспечением для 3D-печати) используется для приложений 3D-печати (шаги 5.2-5.3).- Создавайте печатные проекты с помощью программного обеспечения автоматизированного проектирования (CAD). Пользователи могут создавать новые проекты с нуля или изменять уже существующие проекты, например, из сканирования тканей пациента или от других пользователей. Для получения дополнительной информации о создании проектов САПР, пожалуйста, обратитесь к следующим ссылкам 41,42,43.
- Чтобы обработать модели CAD в G-Code, убедитесь, что файл CAD сохранен в формате «.stl» (Дополнительный файл 1) и загружен в программное обеспечение для 3D-печати, нажав кнопку загрузки на верхней панели или выбрав Файл > Загрузить в строке меню. Этот G-код определяет путь печати для нанесения чернил. Пример файла .stl полого цилиндра был включен в дополнительные файлы.
- После загрузки STL-файла в программное обеспечение для 3D-печати перейдите на панель «Срез» и выберите Slic3r в качестве параметра среза. Здесь такие параметры, как диаметр сопла, высота слоя, скорость печати и скорость экструзии, могут быть скорректированы на основе характеристик чернил и желаемых результатов печати. В этом протоколе используется игла 18 Г (внутренний диаметр 838 мкм). Высота слоя установлена на 1 мм, скорость печати установлена на 8 мм/с, а скорость потока установлена на 9 мкл/с, исходя из предыдущей оптимизации39. Числовые значения параметров могут быть скорректированы на ± 20% с учетом изменений свойств гранулированных гидрогелевых чернил.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что эти настройки и дизайн печати, возможно, потребуется скорректировать с помощью итеративных экспериментальных испытаний в зависимости от корректировки состава чернил, желаемого разрешения печати или используемой платформы печати. Для получения дополнительной информации об этих параметрах, а также о характеристике настроек печати с новой формулировкой чернил, пожалуйста, обратитесь к другим ссылкам 40,44,45,46.
- Экструзионная печать фрагментированными гранулированными гидрогелями
- Для загрузки шприцев фрагментированными гранулированными гидрогелями см. 4.2.4, а также Рисунок 4 и Рисунок 5.
- Снимите колпачок наконечника и замените его иглой по выбору.
- Загрузите шприц в выбранную платформу для печати. Здесь используется изготовленный на заказ экструзионный принтер на основе шнеков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения информации о создании пользовательских биопринтеров, пожалуйста, смотрите другие ссылки44,47. - Загрузите подготовленный файл G-Code с этапа планирования в программное обеспечение для 3D-печати. Перейдите на панель «Предварительный просмотр» и нажмите кнопку Печать.
- Как только нанесение печати будет завершено, подвергайте фрагментированные гранулированные гидрогелевые конструкции ультрафиолетовому свету для фотосшивки и стабилизации.
- После завершения сшивки обработайте образец, промыв его в PBS три раза.
Рисунок 5: Обзор экструзионной печати фрагментированными гранулированными гидрогелями. На рисунке изображены (A) использование шпателя для переноса фрагментированного гранулированного гидрогеля в шприцевой ствол, (B) прикрепление иглы с тупым наконечником (показано 18 G) и проталкивание образца к вершине, (C) изображение, представляющее соединение с компьютерным программным обеспечением для печати, и (D) завершение печати звездообразной конструкции фрагментированным гранулированным гидрогелем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные результаты этих протоколов показаны на рисунках 3 и 6. Экструзионная фрагментация дает микрогели с зубчатыми, полигональными формами диаметром от 10 до 300 мкм (рисунок 3). Кроме того, циркулярность колеблется от 0,2 (не круглая) до почти 1 (идеальный круг), а соотношение сторон колеблется от 1 до 3 (рисунок 3). Эти параметры описывают неправильные и зубчатые формы микрогелей, образованные процессом фрагментации.
При упаковке с использованием центрифугирования или фильтрации с вакуумным приводом собранный гранулированный гидрогель истончается и самовосстанавливается, как описано в предыдущей работе39. Кроме того, фрагментированный гранулированный гидрогель обладает высокой точностью формы и механической целостностью для инъекционного гидрогеля, о чем свидетельствует осаждение полого цилиндра высотой 2 см, экструзионно напечатанного на рисунке 6. Фрагментированные гранулированные гидрогели, изготовленные с помощью этих простых и экономически эффективных методов, полезны для многих биомедицинских применений, включая инъекционные терапевтические средства и чернила для 3D-печати.
Рисунок 6: Обзор протокола и репрезентативные результаты. На рисунке изображены (А) фрагментация, (В) микрогели в суспензии, (С) заклинивание вакуумной фильтрацией и (D) застрявший гранулированный гидрогель, экструдируемый через иглу и напечатанный в полый цилиндр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Пример файла .stl Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем описаны способы изготовления гранулированных гидрогелей с использованием экструзионных фрагментированных микрогелей и упаковки либо центрифугированием, либо вакуумной фильтрацией. По сравнению с другими методами изготовления микрогелей (т.е. микрофлюидикой, периодическими эмульсиями, электросмайли, фотолитографией), экструзионное фрагментационное изготовление микрогелей является очень быстрым, недорогим, легко масштабируемым и поддающимся широкому спектру гидрогелевых систем. Кроме того, этот протокол является высоковоспроизводимым с минимальной вариабельностью от партии к партии, которая была охарактеризована в предыдущей работе39.
Этот протокол использует норборнен-модифицированную гиалуроновую кислоту (NorHA) для изготовления объемных гидрогелей с использованием фотоопосредованной тиол-еновой реакции. Подробные процедуры синтеза NorHA описаны в другом месте38. Однако многие химические гидрогели могут быть использованы для изготовления фрагментированных микрогелей с использованием способов, описанных в настоящем описании, если объемный гидрогель может быть сформирован в стволе шприца. Также полезно понимать механические свойства объемного гидрогеля (например, модуль сжатия). Объемные гидрогели, используемые в этом протоколе, имеют модуль объемного сжатия около 30 кПа39. Объемный гидрогель с более высоким модулем сжатия потребует большего усилия для экструзии на этапах фрагментации, что может привести к увеличению засорения или избыточного давления шприцев; таким образом, рекомендуется использовать гидрогели с модулями сжатия менее 80 кПа. Кроме того, объемный гидрогель с модулями сжатия ниже 10 кПа может деформироваться на этапах фрагментации, что затрудняет его фрагментацию.
Этот протокол оптимизирован для лампы УФ-точечного отверждения. В качестве альтернативы источнику ультрафиолетового света и УФ-чувствительным фотоинициаторам, источники видимого света также могут использоваться вместе с фотоинициаторами, реагирующими на видимый свет, такими как водорастворимый литий фенил-2,4,6-триметилбензоил-фосфинат (LAP). Концентрация инициатора, интенсивность света и объем образца будут влиять на время сшивания в зависимости от используемого полимера и системы сшивания. Кроме того, многие источники ламп могут использоваться в качестве альтернативы системам точечного отверждения.
Наиболее важным шагом в протоколе является последовательная экструзия через все меньшие и меньшие игольчатые датчики. В этой процедуре рекомендуется использовать игольчатые датчики от 18 G (внутренний диаметр 838 мкм) до 30 G (внутренний диаметр 159 мкм). Добавление PBS к фрагментированному объемному гидрогелю перед экструдированием через иглы имеет решающее значение для значительного уменьшения силы, необходимой для экструзии и фрагментации. Не следует использовать чрезмерное усилие для экструзии гидрогеля, так как чрезмерная сила может привести к обратному давлению в шприце и риску вырвать гидрогель из спинки шприца. Дополнительные стратегии для уменьшения силы, необходимой для экструзии, включают использование большего количества игл в серии для более постепенного уменьшения размера фрагмента, а также добавление дополнительных PBS между этапами фрагментации.
При глушении фрагментированных микрогелей с помощью вакуумной фильтрации может наблюдаться изменчивость процесса. Некоторым системам материалов может потребоваться больше (или меньше) времени, чтобы удалить PBS и полностью заглушить микрогели. Предлагается регистрировать время, необходимое для отдельных материальных систем, чтобы обеспечить повторяемость в экспериментах. Время заклинивания также будет зависеть от толщины и размера образца, добавленного в фильтр. Равномерное распределение образца по фильтру может помочь с равномерным заклиниванием.
Метод изготовления микрогелей экструзионной фрагментации может быть адаптирован для многих биомедицинских применений. Например, терапевтические средства могут быть включены в раствор предшественника гидрогеля и впоследствии инкапсулированы в фрагментированные микрогели для изготовления разжижающего сдвиг, самовосстанавливающегося гранулированного гидрогеля для локализованной терапевтической доставки. Кроме того, фрагментированные микрогели могут быть высушены для обеспечения длительного хранения и простой практики стерилизации. Однако одним из ограничений экструзионной фрагментации является включение клеток в микрогели. Из-за высокой скорости сдвига во время экструзионной фрагментации метод, вероятно, не поддается инкапсуляции клеток в микрогелях, поскольку высокий сдвиг может привести к значительному снижению жизнеспособности клеток. Тем не менее, клетки и сфероиды могут быть легко включены между микрогелями для культуры in vitro и доставки клеток in vivo .
Фрагментированные гранулированные гидрогели являются перспективным биоматериалом для биомедицинских применений. В последние годы гранулированные гидрогели, изготовленные из различных методов фрагментации (т.е. раствора и пестика, блендеров и сетчатых терок), использовались в качестве нагруженных клетками 3D-печатных чернил48, терапевтических средств доставки29, инъекционных каркасов для восстановлениятканей 30 и платформсфероидных культур 39. Из ранее сообщенных способов фрагментации способ экструзионной фрагментации, описанный в настоящем описании, является одним из наиболее простых и экономически эффективных методов с многочисленными преимуществами. Совместное использование методов в настоящем документе повысит доступность производства гранулированного гидрогеля и приведет к значительным достижениям в растущей области гранулированных гидрогелевых биоматериалов, что позволит большему количеству исследователей разрабатывать инновационные биомедицинские решения с фрагментированными гранулированными гидрогелями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом через программу UPenn MRSEC (DMR-1720530) и аспирантские исследовательские стипендии (для V.G.M и M.E.P.) и Национальных институтов здравоохранения (R01AR077362 для J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
