Summary
Diese Arbeit beschreibt einfache, anpassungsfähige und kostengünstige Methoden, um Mikrogele mit Extrusionsfragmentierung herzustellen, die Mikrogele zu injizierbaren granularen Hydrogelen zu verarbeiten und die granularen Hydrogele als Extrusionsdruckfarben für biomedizinische Anwendungen aufzutragen.
Abstract
Granulare Hydrogele sind gestaute Anordnungen von Hydrogel-Mikropartikeln (d. h. "Mikrogelen"). Im Bereich der Biomaterialien haben granulare Hydrogele viele vorteilhafte Eigenschaften, einschließlich Injektionsfähigkeit, Mikroskalenporosität und Abstimmbarkeit durch Mischen mehrerer Mikrogelpopulationen. Verfahren zur Herstellung von Mikrogelen beruhen häufig auf Wasser-in-Öl-Emulsionen (z. B. Mikrofluidik, Batch-Emulsionen, Elektrospritzen) oder der Photolithographie, die hohe Anforderungen an Ressourcen und Kosten stellen können und möglicherweise nicht mit vielen Hydrogelen kompatibel sind. Diese Arbeit beschreibt einfache, aber hochwirksame Methoden, um Mikrogele unter Verwendung von Extrusionsfragmentierung herzustellen und sie zu granularen Hydrogelen zu verarbeiten, die für biomedizinische Anwendungen nützlich sind (z. B. 3D-Druckfarben). Zunächst werden Bulk-Hydrogele (am Beispiel photovernetzbare Hyaluronsäure (HA)) durch eine Reihe von Nadeln mit sequentiell kleineren Durchmessern extrudiert, um fragmentierte Mikrogele zu bilden. Diese Mikrogel-Herstellungstechnik ist schnell, kostengünstig und hochgradig skalierbar. Es werden Verfahren zum Einklemmen von Mikrogelen zu granularen Hydrogelen durch Zentrifugation und vakuumgetriebene Filtration beschrieben, mit optionaler Nachvernetzung zur Hydrogelstabilisierung. Schließlich werden granulare Hydrogele, die aus fragmentierten Mikrogelen hergestellt werden, als Extrusionsdruckfarben demonstriert. Während die hier beschriebenen Beispiele photovernetzbares HA für den 3D-Druck verwenden, sind die Methoden für eine Vielzahl von Hydrogeltypen und biomedizinischen Anwendungen leicht anpassbar.
Introduction
Granulare Hydrogele werden durch die Verpackung von Hydrogelpartikeln (d.h. Mikrogelen) hergestellt und sind eine spannende Klasse von Biomaterialien mit vielen vorteilhaften Eigenschaften für biomedizinische Anwendungen 1,2,3. Aufgrund ihrer partikulären Struktur sind granulare Hydrogele scherdünner und selbstheilend, was ihre Verwendung als Extrusionsdrucktinten, granulare Stützen für den eingebetteten Druck und injizierbare Therapeutika 4,5,6,7,8,9 ermöglicht. Zusätzlich bietet der Hohlraum zwischen den Mikrogelen eine mikroskalige Porosität für Zellbewegung und molekulare Diffusion 8,10,11. Darüber hinaus können mehrere Mikrogelpopulationen zu einer einzigen Formulierung kombiniert werden, um eine verbesserte Abstimmbarkeit und Materialfunktionalitätzu ermöglichen 8,10,12,13. Diese wichtigen Eigenschaften haben in den letzten Jahren den raschen Ausbau der granularen Hydrogelentwicklung motiviert.
Es gibt eine Reihe von Methoden, um Mikrogele für die granulare Hydrogelherstellung zu bilden, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Zum Beispiel werden Mikrogele oft aus Wasser-in-Öl-Emulsionen unter Verwendung von Tröpfchenmikrofluidik 4,11,13,14,15,16,17, Batch-Emulsionen 7,18,19,20,21,22 oder Elektrospritzen 6,23 gebildet. 24,25 Diese Methoden ergeben sphärische Mikrogele mit entweder gleichmäßigen (Mikrofluidik) oder polydispersen (Batch-Emulsionen, Elektrospritzen) Durchmessern. Es gibt einige Einschränkungen für diese Wasser-in-Öl-Emulsionsherstellungsmethoden, einschließlich der potenziell niedrigen Durchsatzproduktion, des Bedarfs an niedrigviskosen Hydrogel-Vorläuferlösungen und der hohen Kosten und Ressourcen für die Einrichtung. Darüber hinaus können diese Protokolle aggressive Öle und Tenside erfordern, die mit Verfahren, die Verarbeitungsschritte hinzufügen, aus den Mikrogelen gewaschen werden müssen, und es kann schwierig sein, sie in sterile Bedingungen für biomedizinische Anwendungen in vielen Labors umzusetzen. Um die Notwendigkeit von Wasser-in-Öl-Emulsionen zu beseitigen, kann auch die (Foto-)Lithographie verwendet werden, bei der Formen oder Fotomasken verwendet werden, um die Aushärtung von Mikrogelen aus Hydrogel-Vorläuferlösungen 1,26,27 zu kontrollieren. Wie die Mikrofluidik können diese Methoden in ihrem Produktionsdurchsatz begrenzt sein, was eine große Herausforderung darstellt, wenn große Mengen benötigt werden.
Als Alternative zu diesen Methoden wurde die mechanische Fragmentierung von Bulk-Hydrogelen verwendet, um Mikrogele mit unregelmäßigen Größen 19,28,29,30,31,32 herzustellen. Zum Beispiel können Bulk-Hydrogele vorgeformt und anschließend durch Netze oder Siebe geleitet werden, um fragmentierte Mikrogele zu bilden, ein Prozess, der sogar in Gegenwart von Zellen in Mikrogelsträngen33,34 durchgeführt wurde. Bulk-Hydrogele wurden auch zu Mikrogelen mit mechanischer Unterbrechung unter Verwendung von Techniken wie dem Mahlen mit Mörser und Stößel oder durch die Verwendung von kommerziellen Mixern35,36,37 verarbeitet. Andere haben auch mechanisches Rühren während der Hydrogelbildung verwendet, um fragmentierte Mikrogele (dh flüssige Gele) herzustellen31.
Die hierin enthaltenen Methoden erweitern diese mechanischen Fragmentierungstechniken und präsentieren einen einfachen Ansatz zur Herstellung von Mikrogelen mit Extrusionsfragmentierung am Beispiel photovernetzbarer Hyaluronsäure (HA)-Hydrogele. Bei der Extrusionsfragmentierung werden nur Spritzen und Nadeln verwendet, um fragmentierte Mikrogele in einer kostengünstigen, leicht skalierbaren Methode mit hohem Durchsatz herzustellen, die für eine breite Palette von Hydrogelen geeignet ist19,32. Weiterhin werden Verfahren beschrieben, um diese fragmentierten Mikrogele zu granularen Hydrogelen zusammenzusetzen, indem entweder Zentrifugation (Low Packing) oder vakuumgetriebene Filtration (High Packing) verwendet wird. Schließlich wird die Anwendung dieser fragmentierten granularen Hydrogele für die Verwendung als Extrusionsdruckfarbe diskutiert. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einfache Methoden einzuführen, die an eine Vielzahl von Hydrogelen anpassbar sind und in praktisch jedem Labor implementiert werden können, das sich für granulare Hydrogele interessiert.
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Protocol
1. Herstellung von Bulk-Hydrogelen in einer Spritze mittels Photocrosslinking
HINWEIS: Eine Übersicht über die Herstellung von Bulk-Hydrogel in einer Spritze mithilfe von Photocrosslinking ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll verwendet Norbornen-modifizierte Hyaluronsäure (NorHA), um Bulk-Hydrogele unter Verwendung einer photovermittelten Thiol-en-Reaktion herzustellen. Detaillierte Verfahren für die Synthese von NorHA werden an anderer Stelle38 beschrieben. Dieses Protokoll ist jedoch in hohem Maße an jedes photovernetzbare Hydrogel anpassbar. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion.
- Bestimmen Sie die gewünschten Konzentrationen von Polymer, Vernetzer und Initiatoren für die Bulk-Hydrogel-Formulierung. In diesem Protokoll besteht die Hydrogel-Vorläuferlösung aus NorHA (2 Gew.%, ~25% Grad Norbornen-Modifikation), Dithiothreitol (DTT, 6 mM) und Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 Gew.%). Stellen Sie sicher, dass die Komponenten (1 ml) vollständig in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem Mikrozentrifugenröhrchen gelöst sind.
HINWEIS: Bei der Herstellung der Hydrogel-Vorläuferlösung kann hochmolekulares FITC-Dextran (2 MDa, 0,1 Gew.%) der Lösung hinzugefügt werden, um Mikrogele zu visualisieren, die später im Protokoll mittels Fluoreszenzmikroskopie hergestellt werden. - Laden Sie eine 3-ml-Spritze mit der Hydrogel-Vorläuferlösung.
- Entfernen Sie den Kolben von der Rückseite einer leeren 3-ml-Spritze und fügen Sie eine Spitzenkappe an der Oberseite des Spritzenlaufs hinzu.
- Verwenden Sie eine 1.000-μL-Pipette, um die Hydrogel-Vorläuferlösung mit der Spitzenkappe in den Spritzenlauf zu übertragen.
- Halten Sie den Spritzenlauf mit Hydrogel-Vorläuferlösung in einer Hand, wobei die Spitzenkappe nach unten und das offene Ende des Laufs nach oben zeigt. Mit der anderen Hand bringen Sie den Spritzenkolben in die Öffnung der Rückseite des Spritzenlaufs zurück. Drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig in den Lauf, gerade genug, um die Öffnung an der Rückseite des Spritzenzylinders abzudichten.
- Halten Sie den Kolben und den Spritzenzylinder vorsichtig zusammen, um sicherzustellen, dass die Rückseite des Spritzenzylinders mit dem Kolben versiegelt ist, drehen Sie die Spritze so um, dass der Kolben nach unten zeigt und die Spitzenkappe jetzt nach oben zeigt. Entfernen Sie die Spitzenkappe und drücken Sie den Kolben vorsichtig in den Spritzenlauf, bis die gesamte Luft aus der Spritze entfernt ist (nur die Hydrogel-Vorläuferlösung bleibt übrig).
- Befestigen Sie die Spitzenkappe wieder an der Spritze. Stellen Sie sicher, dass die Hydrogel-Vorläuferlösung in der 3-ml-Spritze mit einer Spitzenkappe gesichert ist.
- Bilden Sie ein Bulk-Hydrogel in der 3-ml-Spritze.
- Stellen Sie sicher, dass vor dem Einschalten der UV-Lampe eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) und Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. Dazu gehört das Tragen einer UV-schützenden Brille und das Umschließen des Lampenbereichs, um andere vor UV-Licht zu schützen.
- Kalibrieren Sie die UV-Spot-Härtungslampe mit einem Radiometer auf eine Lichtintensität von 10 mW/cm2.
HINWEIS: Es wird eine leichte Dämpfung durch den Spritzenlauf geben. Bestimmen Sie vor der Herstellung den Prozentsatz der vorhandenen Lichtdämpfung mit einem Radiometer. Die Lichtintensität des Spothärtungssystems sollte entsprechend angepasst werden, um einer solchen Dämpfung Rechnung zu tragen. - Legen Sie die 3-ml-Spritze, die mit der Hydrogel-Vorläuferlösung beladen ist, für eine gewünschte Zeit unter die UV-Spot-Härtungslampe, um vollständig zu vernetzen. Für das hierin beschriebene System wird NorHA Hydrogel-Vorläuferlösung 5 min lang UV-Licht mit einer Intensität von 10 mW/cm2 belichtet, was auf der Grundlage früherer Studien39 ausreichend Zeit und Lichtintensität war, um eine vollständige Vernetzung zu gewährleisten, wie sie durch photocrosslinking oszillierende Scherrheologie-Zeitfeger bestimmt wurde.
HINWEIS: Um eine vollständige Fotovernetzung innerhalb der Spritze zu gewährleisten, kann die Spritze in der Mitte der Fotoverkettungsperiode umgedreht werden. - Schalten Sie die UV-Lampe aus und entfernen Sie die Spritze. Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel jetzt in der Spritze fotovernetzt ist. Dies kann erreicht werden, indem der Kolben zurückgezogen und beobachtet wird, wie sich das Hydrogel als fester Block und nicht als viskose Flüssigkeit bewegt.
Abbildung 1: Übersicht über die Herstellung von Bulk-Hydrogelen in einer Spritze mittels Fotovernetzung. Die Abbildung zeigt (A) das Entfernen des Kolbens aus der Spritze, (B) das Befestigen der Spitzenkappe am Spritzenfass, (C) das Hinzufügen von Hydrogelvorläufer zum Spritzenfass, (D) das Zurückführen des Kolbens in die Spritze, (E) das Entfernen überschüssiger Luft und das Sichern der Spitzenkappe und (F) das Photovernetzen von Hydrogel in der Spritze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Herstellung von Mikrogelen mittels Extrusionsfragmentierung
HINWEIS: Eine Übersicht über die Mikrogelherstellung mittels Extrusionsfragmentierung ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Entfernen Sie den Kolben von der Rückseite einer leeren 3-ml-Spritze. Befestigen Sie eine Tip Cap am Luer-Lock.
- Entfernen Sie die Spitzenkappe von der Spritze, die das photovernetzte Bulk-Hydrogel enthält. Richten Sie die Oberseite der Hydrogelspritze mit der Öffnung des Zylinders auf der leeren Spritze aus.
- Extrudieren Sie das Bulk-Hydrogel durch die Spritzenöffnung (keine Nadel angebracht) in den Lauf der leeren Spritze. Entsorgen Sie die jetzt leere Spritze (die früher das Hydrogel enthielt) ordnungsgemäß in den richtigen Abfallstrom.
- Halten Sie die Spritze, die das extrudierte Hydrogel enthält, so, dass die Spitzenkappe nach unten zeigt und die Fassöffnung nach oben zeigt. Mit einer 1.000-μL-Pipette 1,5 ml PBS in den Spritzenzylinder geben.
- Richten Sie den Spritzenkolben mit der Öffnung des Laufs aus und drücken Sie den Kolben gerade noch so weit ein, dass eine Abdichtung entsteht. Drehen Sie die Spritze so um, dass der Kolben jetzt nach unten zeigt und die Spitzenkappe nach oben zeigt, und stellen Sie sicher, dass der Kolben und der Spritzenlauf zusammengehalten werden, damit kein Hydrogel oder PBS austritt. Mehrmals invertieren, um das fragmentierte Hydrogel mit dem hinzugefügten PBS zu mischen.
- Halten Sie die Spritze so, dass die Spitzenkappe nach oben und der Kolben nach unten zeigt. Entfernen Sie die Spitzenkappe. Drücken Sie den Kolben sehr vorsichtig nach oben, um Luft aus dem Inneren der Spritze zu entfernen.
HINWEIS: Es wird wahrscheinlich eine Rille auf der Rückseite der 3-ml-Spritze geben, die zusätzliche Kraft erfordert, um den Kolben hineinzudrücken. Sehr vorsichtig den Kolben über die Nut schieben. Jede plötzliche oder harte Menge an Kraft führt dazu, dass sich der Kolben zu schnell bewegt und möglicherweise die fragmentierte Hydrogelsuspension ausstößt. - Extrudieren Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension durch eine Reihe von Nadeln, um fragmentierte Mikrogele zu erzeugen.
- Befestigen Sie eine 18-G-Nadel mit stumpfer Spitze an der Oberseite der Spritze, die das fragmentierte Hydrogel und PBS enthält. Entfernen Sie den Kolben aus einer frischen 3-ml-Spritze und befestigen Sie eine Spitzenkappe am leeren Spritzenlauf.
- Extrudieren Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension durch die 18 G-Nadel in die Rückseite des leeren Spritzenfasses. Entsorgen Sie die leere Spritze und die Nadel in den richtigen Abfallstrom für scharfe Gegenstände.
- Halten Sie die Spritze, die die fragmentierte Hydrogelsuspension enthält, so, dass die Spitzenkappe nach unten zeigt und die Lauföffnung nach oben zeigt. Richten Sie den Spritzenkolben mit der Öffnung des Laufs aus und drücken Sie den Kolben gerade noch so weit ein, dass eine Abdichtung entsteht.
- Drehen Sie die Spritze so um, dass der Kolben jetzt nach unten zeigt und die Spitzenkappe nach oben zeigt, und stellen Sie sicher, dass der Kolben und der Spritzenlauf zusammengehalten werden, damit kein Hydrogel oder PBS austritt.
- Halten Sie die Spritze so, dass die Spitzenkappe nach oben und der Kolben nach unten zeigt. Entfernen Sie die Spitzenkappe. Drücken Sie den Kolben sehr vorsichtig nach oben, um Luft aus dem Inneren der Spritze zu entfernen. Siehe den obigen HINWEIS zum sanften Drücken des Spritzenkolbens nach innen, um einen unerwünschten Ausstoß von Hydrogelmaterial zu verhindern.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.7.1-2.7.5 mit einer Nadel mit 23 G, 27 G und 30 G. Beim letzten Extrusionsschritt (30 G Nadel) extrudieren Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen. Für die hierin beschriebenen Volumina beträgt das endgültige fragmentierte Hydrogel-Suspensionsvolumen ~ 2,5 ml, was zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (gleichmäßige Volumenverteilung) erfordert.
HINWEIS: Es sollte keine übermäßige Kraft erforderlich sein, um fragmentierte Hydrogelsuspension durch die Nadeln zu extrudieren. Für bewährte Sicherheitspraktiken wird empfohlen, alle Extrusionsfragmentierungsschritte innerhalb einer chemischen Haube durchzuführen, um Schutz im Falle einer Überbeaufschlagung der Spritze während der Extrusion zu bieten. Darüber hinaus kann dieser Prozess problemlos in einer Biosicherheitswerkbank / Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um die Sterilität während der Herstellung aufrechtzuerhalten. Weitere Vorschläge zur Fehlerbehebung finden Sie unter Diskussion.
- Waschen und isolieren Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension.
HINWEIS: Das Waschen fragmentierter Mikrogele hilft, nicht umgesetztes Polymer und Vernetzer zu entfernen. Darüber hinaus hilft die Zentrifugierung, die Mikrogele aus der Suspension zu isolieren, indem ein Pellet gebildet wird.- Mit einer Mikrozentrifuge die fragmentierte Mikrogelsuspension mit 5.000 x g für 5 min nach unten drehen.
- Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 1 ml PBS zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, das fragmentierte Mikrogele und Wirbel für 5-10 s enthält.
- Wiederholen Sie das Zentrifugieren und Waschen mit PBS 3x.
Abbildung 2: Überblick über die Mikrogelherstellung mittels Extrusionsfragmentierung. Die Abbildung zeigt (A) das Extrudieren von Hydrogel in ein leeres Spritzenfass und das Zugabe von PBS, (B) das Sichern eines Kolbens in der Spritze mit fragmentiertem Hydrogel, (C) das Anbringen einer 18-G-Nadel und das Extrudieren einer fragmentierten Hydrogelsuspension in ein leeres Spritzenfass und (D) das Wiederholen von Extrusionsfragmentierungsschritten mit 23 G-, 27-G- und 30-G-Nadeln, Sammeln von fragmentierter Hydrogelsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen bei der endgültigen Extrusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Charakterisierung fragmentierter Mikrogele mit ImageJ
HINWEIS: Eine Übersicht über die Charakterisierung der fragmentierten Mikrogele mit ImageJ ist in Abbildung 3 dargestellt, ebenso wie repräsentative Ergebnisse zur Beschreibung von Größenverteilungen und Formen innerhalb einer Charge fragmentierter Mikrogele. Mikrogele sollten vor der Visualisierung fluoreszierend markiert werden. Zum Beispiel kann FITC-Dextran (2 MDa) mit hohem Molekülgewicht vor der Fragmentierung im Bulk-Hydrogel verkapselt werden, um fluoresceinmarkierte Mikrogele zu erzeugen.
- Kombinieren Sie 20 μL fragmentierte Mikrogelsuspension mit 180 μL PBS, um eine verdünnte fragmentierte Mikrogelsuspension zu erzeugen. Vortex zum gründlichen Mischen.
- Übertragen Sie 50 μL verdünnte fragmentierte Mikrogelsuspension auf einen Objektträger des Glasmikroskops.
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um Bilder von fluoreszierend markierten Mikrogelen mit 4-fachem oder 10-fachem Zoom aufzunehmen.
HINWEIS: Die Mikrogel-Suspension sollte so verdünnt sein, dass benachbarte Mikrogele nicht miteinander in Kontakt kommen, aber so konzentriert, dass Dutzende von Mikrogelen im Ansichtsfenster sichtbar sind. Die Verdünnung der Mikrogelsuspension kann entsprechend angepasst werden, um dies zu erreichen. - Verwenden von ImageJ zur Analyse fragmentierter Mikrogelpartikel. Weitere Informationen zur Verwendung der Funktion "Partikel analysieren" in ImageJ finden Sie unter dem Link in der Materialtabelle.
- Öffnen Sie die Bilder von Mikrogelen in Suspension in ImageJ.
- Wählen Sie Analysieren > Maße, Prüfbereich, Formdeskriptoren und Feret-Durchmesser festlegen. Klicken Sie auf OK.
- Wählen Sie Bild > Geben Sie > 8-Bit ein.
- Wählen Sie Bild > passen Sie > Schwellenwert an. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass Mikrogele von einer roten Maske bedeckt sind und der Hintergrund schwarz bleibt. Klicken Sie auf Übernehmen.
HINWEIS: Wenn sich Mikrogele leicht überlappen, zeichnen Sie mit dem Bleistiftwerkzeug eine dünne schwarze Linie (<5 Pixel) zwischen Mikrogelen, um sie im Schwarz-Weiß-Bild zu trennen. - Wählen Sie Analysieren > Partikel analysieren aus. Legen Sie die Größe (Pixel2) von 50-Infinity fest, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Setzen Sie die Zirkularität auf 0,00-1,00. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Umrisse anzeigen aus. Überprüfen Sie die Anzeigeergebnisse, schließen Sie sie an Kanten aus und schließen Sie Löcher ein. Lassen Sie die verbleibenden Kontrollkästchen deaktiviert. Klicken Sie auf OK.
- Es öffnet sich eine Ergebnisanzeige, einschließlich der Fläche, der Formbeschreibungen und der Feret-Durchmesserinformationen für jedes identifizierte Mikrogel. Kopieren Sie die Ergebnisse und fügen Sie sie in eine Tabelle ein.
- Bestimmen Sie den äquivalenten Kreisdurchmesser für jedes Partikel.
- Beziehen Sie die Bildskala in μm/Pixel aus der Skalenleiste oder den Instrumenteninformationen. Erstellen Sie eine Spalte in der Tabelle, die die Fläche jedes Mikrogels von Pixel 2 in μm2 umwandelt.
- Verwenden Sie die Fläche in μm2, um den äquivalenten Kreisdurchmesser des Mikrogels in μm zu bestimmen (d. h. nehmen Sie die Quadratwurzel der Fläche geteilt durch Pi und verdoppeln Sie sie).
- Verwenden Sie die μm/Pixel-Skala, um die Durchmesser des Feret (d. h. den längsten Abstand zwischen zwei beliebigen Punkten an der Partikelgrenze) für jedes Mikrogel in eine Einheit von μm umzuwandeln.
- Zirkularität ("Circ."), Seitenverhältnis ("AR"), Rundheit ("Rundheit") und Festigkeitswerte für jedes Mikrogel können so verwendet werden, wie es direkt aus ImageJ stammt.
- Analysieren Sie die Mikrogelpopulation wie gewünscht unter Berücksichtigung der Verteilung der Durchmesser (äquivalente kreisförmige und Feret-Durchmesser), der Zirkularität, des Seitenverhältnisses, der Rundheit und der Festigkeit.
Abbildung 3: Überblick über die Charakterisierung fragmentierter Mikrogelpartikel mit ImageJ. Die Abbildung zeigt (A) die Erstellung einer verdünnten Suspension von fragmentierten Mikrogelpartikeln und die Verwendung eines epifluoreszierenden oder konfokalen Mikroskops zur Abbildung von Mikrogelen in Suspension (Skalenbalken = 500 μm), (B) die Umwandlung in ein binäres Bild in ImageJ und die Analyse von Partikeln (Anzahl, Formdeskriptoren usw.) und (C) repräsentative Ergebnisse. Fehlerbalken zeigen min und max mit abgegrenzten inneren Quartilsbereichen. Es wird eine Populationsgröße von n = 100 Mikrogelen angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Zusammensetzen von fragmentierten Mikrogelen zu granularen Hydrogelen
HINWEIS: Es werden zwei Methoden zur Formulierung von granularen Hydrogelen aus fragmentierten Mikrogelen vorgestellt, die Zentrifugation und Filtration verwenden. Die verwendete Methode hängt von der gewünschten Mikrogelpackung ab (d. H. Filtrationspackungen Partikel dichter) und ob biologische Komponenten enthalten sind (dh die Zentrifugation hält Komponenten zwischen den Partikeln zurück, während diese bei der Filtration verloren gehen können). Frühere Arbeiten40 beschreiben ausführlich vergleichende Ergebnisse (d.h. Mechanik, Porosität) für granulare Hydrogele, die entweder durch Zentrifugen- oder vakuumgetriebene Filtration gebildet werden.
- Option 1: Marmeln fragmentierter Mikrogele mittels Zentrifugation.
- Nachdem Sie den PBS-Überstand aus dem letzten Waschschritt entfernt haben, geben Sie 1 ml PBS in jedes Mikrozentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Mikrogele.
- Drehen Sie die fragmentierte Hydrogel-Suspension bei 18.000 x g für 5 min herunter.
HINWEIS: Langsamere Zentrifugengeschwindigkeiten können für die Verklemmung von Mikrogelen in granulare Hydrogele mit weniger dichter Packung verwendet werden, falls gewünscht. - Entfernen Sie den PBS-Überstand.
- Besorgen Sie sich eine frische 3-ml-Spritze und entfernen Sie den Kolben. Verwenden Sie einen Metallspatel, um das fragmentierte körnige Hydrogel aus dem Mikrozentrifugenröhrchen zu schöpfen und in die Rückseite des leeren Spritzenfasses zu geben. Eine Pipettenspitze kann verwendet werden, um die Übertragung des granularen Hydrogels in die Spritze zu unterstützen. Bringen Sie den Kolben in die Spritze zurück. Laden Sie nun das fragmentierte körnige Hydrogel in die Spritze, und es ist einsatzbereit.
- Option 2: Stampfen fragmentierter Mikrogele mittels vakuumgetriebener Filtration. Eine Übersicht über das Stau durch vakuumbetriebene Filtration ist in Abbildung 4 dargestellt.
- Montieren und testen Sie die vakuumbetriebene Filtrationsvorrichtung.
- Befestigen Sie einen Buchner-Trichter in einem Filterkolben und platzieren Sie den Filteradapter zwischen dem Trichter und der Kolbenöffnung.
- Verwenden Sie Schläuche, um den Filterkolben an eine Vakuumleitung anzuschließen.
- Legen Sie einen Membranfilter (0,22 μm) in den Buchner Trichterbecher.
- Schalten Sie die Vakuumleitung ein, indem Sie das Wählschieber öffnen. Testen Sie die Verbindung, indem Sie ~ 0,5 ml PBS auf den Membranfilter pipettieren und beobachten Sie, dass das gesamte PBS durch den Filter geht und sich im Boden des Filterkolbens sammelt.
- Schalten Sie die Vakuumleitung ein und sorgen Sie für eine vollständige Abdichtung. Wirbeln Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension so auf, dass Mikrogele in PBS suspendiert werden.
- Mit einer 1.000 μL Pipette wird die fragmentierte Hydrogelsuspension auf den Membranfilter (0,22 μm) übertragen. Nachdem Sie die gesamte Mikrogelsuspension übertragen haben, warten Sie ~ 30 s, bis das Vakuum PBS aus der fragmentierten Hydrogelsuspension gezogen hat. Schalten Sie die Vakuumleitung aus.
HINWEIS: Die Zeit, in der die fragmentierte Hydrogelsuspension beim Ziehen des Vakuums auf dem Membranfilter sitzt, kann variiert werden. Weitere Informationen und Vorschläge zur Fehlerbehebung finden Sie unter Diskussion. - Besorgen Sie sich eine frische 3-ml-Spritze und entfernen Sie den Kolben. Verwenden Sie einen Metallspatel, um das fragmentierte körnige Hydrogel aus dem Filter zu schöpfen und in die Rückseite des leeren Spritzenfasses zu geben. Eine Pipettenspitze kann verwendet werden, um die Übertragung des granularen Hydrogels in die Spritze zu unterstützen. Bringen Sie den Kolben in die Spritze zurück. Laden Sie das fragmentierte körnige Hydrogel in die Spritze, und es ist jetzt einsatzbereit.
- Montieren und testen Sie die vakuumbetriebene Filtrationsvorrichtung.
Abbildung 4: Übersicht über das Stören von Mikrogelen durch vakuumgetriebene Filtration zur Herstellung dicht gepackter fragmentierter granularer Hydrogele. Die Abbildung zeigt (A) das Anbringen eines Membranfilters auf die Vakuumfiltrationsvorrichtung, (B) die Verwendung einer Pipette zum Übertragen einer fragmentierten Mikrogelsuspension auf den Filter, (C) das Ziehen des Vakuums und das Warten darauf, dass sich Mikrogele verklemmen und ein granulares Hydrogel bilden, (D) das Ausschalten des Vakuums und das Entfernen von fragmentiertem körnigem Hydrogel mit einem Metallspatel und (E) die Verwendung eines Metallspatels, um granulares Hydrogel auf die Spritze zu übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
5. Extrusionsdruck mit granularen Hydrogelfarben
HINWEIS: Eine Übersicht über den Extrusionsdruckprozess ist in Abbildung 5 dargestellt, einschließlich eines repräsentativen Drucks eines sternförmigen Konstrukts unter Verwendung fragmentierter granularer Hydrogele, die mit vakuumgetriebener Filtration verstopft sind. Der Druckworkflow besteht aus der Formulierung einer Tinte, der Planung des Druckdesigns und dem anschließenden Drucken der Tinte basierend auf dem gewünschten Design41. Auf Wunsch können gedruckte granulare Hydrogelkonstrukte mittels Photocrosslinking Post-Extrusion stabilisiert werden, indem überschüssiges DTT (5 mM) und I2959 (0,05 Gew.%) zu der fragmentierten Mikrogelsuspension vor dem Jammen. Dies führt zu photovernetzten kovalenten Bindungen, die zwischen den Mikrogelen gebildet werden, was zu einer dauerhaften Stabilisierung des granularen Hydrogelkonstrukts führt.
- Tintenformulierung
- Berücksichtigen Sie während des Planungsprozesses die Eigenschaften der zu verwendenden Tinte. Um die Tinte zu charakterisieren, führen Sie die rheologische Analyse der fragmentierten Hydrogele durch, um den Druckdesignprozess zu unterstützen. Methoden, die die rheologische Charakterisierung granularer Hydrogele beschreiben, werden an anderer Stelle beschrieben und können für diese Studieangepasst werden 40.
- Wählen Sie aus der rheologischen Analyse eine Druckplattform und eine Reihe von anfänglichen Druckparametern aus.
HINWEIS: Aufgrund der insgesamt hohen Viskosität und der scherdünnenden Eigenschaften von granularen Hydrogeltinten werden typischerweise schneckenbasierte Extrusionsdrucker verwendet.
- Print-Design
HINWEIS: Die Repetier Host-Software (im Folgenden als 3D-Drucksoftware bezeichnet) wird für 3D-Druckanwendungen verwendet (Schritte 5.2-5.3).- Erstellen Sie die Druckentwürfe mit CAD-Software (Computer Aided Design). Benutzer können neuartige Designs von Grund auf neu erstellen oder bereits vorhandene Designs ändern, z. B. aus Patientengewebescans oder von anderen Benutzern. Weitere Informationen zur Erstellung von CAD-Konstruktionen finden Sie unter den folgenden Referenzen41,42,43.
- Um CAD-Modelle in G-Code zu verarbeiten, stellen Sie sicher, dass die CAD-Datei im Format ".stl" (Supplemental File 1) gespeichert und in die 3D-Drucksoftware hochgeladen wird, indem Sie die Schaltfläche Laden im oberen Bereich oder Datei > Laden in der Menüleiste auswählen. Dieser G-Code definiert den Druckpfad für die Abscheidung der Tinte. Eine Beispiel-STL-Datei eines Hohlzylinders wurde in die ergänzenden Dateien aufgenommen.
- Sobald eine STL-Datei in die 3D-Drucksoftware hochgeladen wurde, navigieren Sie zum Slicer-Bedienfeld und wählen Sie Slic3r als Slicer-Option. Hier können Einstellungen wie Düsendurchmesser, Schichthöhe, Druckgeschwindigkeit und Extrusionsrate basierend auf der Tintencharakterisierung und den gewünschten Druckergebnissen angepasst werden. In diesem Protokoll wird eine 18 G Nadel (Innendurchmesser von 838 μm) verwendet. Die Schichthöhe ist auf 1 mm, die Druckgeschwindigkeit auf 8 mm/s und die Durchflussrate auf 9 μL/s eingestellt, basierend auf der vorherigen Optimierung39. Numerische Werte von Parametern können um ± 20% angepasst werden, um Variationen in den Eigenschaften von granularen Hydrogeltinten Rechnung zu tragen.
HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass diese Einstellungen und das Druckdesign möglicherweise durch iterative experimentelle Tests angepasst werden müssen, abhängig von Anpassungen an der Tintenformulierung, der gewünschten Druckauflösung oder der verwendeten Druckplattform. Weitere Informationen zu diesen Parametern sowie zur Charakterisierung von Druckeinstellungen mit einer neuartigen Farbrezeptur finden Sie unter anderen Referenzen40,44,45,46.
- Extrusionsdruck mit fragmentierten granularen Hydrogelen
- Zum Beladen von Spritzen mit fragmentierten körnigen Hydrogelen siehe 4.2.4 sowie Abbildung 4 und Abbildung 5.
- Entfernen Sie die Spitzenkappe und ersetzen Sie sie durch eine Nadel Ihrer Wahl.
- Laden Sie die Spritze in die Druckplattform Ihrer Wahl. Hier kommt ein speziell angefertigter schneckenbasierter Extrusionsdrucker zum Einsatz.
HINWEIS: Informationen zum Erstellen von benutzerdefinierten Bioprintern finden Sie unter Andere Referenzen44,47. - Laden Sie die vorbereitete G-Code-Datei aus der Planungsphase in die 3D-Drucksoftware. Navigieren Sie zum Bedienfeld "Druckvorschau" und drücken Sie auf Drucken.
- Sobald die Druckabscheidung abgeschlossen ist, setzen Sie die fragmentierten granularen Hydrogelkonstrukte UV-Licht aus, um sie zu vernetzen und zu stabilisieren.
- Sobald die Vernetzung abgeschlossen ist, verarbeiten Sie die Probe, indem Sie sie dreimal in PBS waschen.
Abbildung 5: Überblick über den Extrusionsdruck mit fragmentierten Granulathydrogelen. Die Abbildung zeigt (A) mit einem Spatel fragmentiertes granulares Hydrogel in einen Spritzenzylinder, (B) das Anbringen einer stumpfen Nadel (18 G gezeigt) und das Schieben der Probe nach oben, (C) eine Grafik, die die Verbindung zu Computersoftware zum Drucken darstellt, und (D) die Vervollständigung des Drucks eines sternförmigen Konstrukts mit fragmentiertem granuliertem Hydrogel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse dieser Protokolle sind in Abbildung 3 und Abbildung 6 dargestellt. Die Extrusionsfragmentierung ergibt Mikrogele mit gezackten Polygonformen mit Durchmessern von 10-300 μm (Abbildung 3). Darüber hinaus reicht die Zirkularität von 0,2 (nicht kreisförmig) bis fast 1 (perfekter Kreis), und das Seitenverhältnis reicht von 1 bis 3 (Abbildung 3). Diese Parameter beschreiben die unregelmäßigen und gezackten Mikrogelformen, die durch den Fragmentierungsprozess entstehen.
Wenn das zusammengesetzte körnige Hydrogel entweder durch Zentrifugation oder vakuumgetriebene Filtration zusammengepackt wird, ist es scherdünner und selbstheilend, wie in der vorherigen Arbeit39 beschrieben. Darüber hinaus weist das fragmentierte körnige Hydrogel eine hohe Formtreue und mechanische Integrität für ein injizierbares Hydrogel auf, wie die Abscheidung eines Hohlzylinders mit einer Höhe von 2 cm zeigt, der in Abbildung 6 extrudiert wird. Fragmentierte granulare Hydrogele, die mit diesen einfachen und kostengünstigen Methoden hergestellt werden, sind für viele biomedizinische Anwendungen nützlich, einschließlich injizierbarer Therapeutika und 3D-Druckfarben.
Abbildung 6: Protokollübersicht und repräsentative Ergebnisse. Die Abbildung zeigt (A) Fragmentierung, (B) Mikrogele in Suspension, (C) Verklemmung durch vakuumgetriebene Filtration und (D) gestautes körniges Hydrogel, das durch eine Nadel extrudiert und in einen hohlen Zylinder gedruckt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Supplemental File 1: Beispiel .stl Datei Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hierin werden Verfahren zur Herstellung granularer Hydrogele unter Verwendung von extrusionsfragmentierten Mikrogelen und zum Verpacken entweder durch Zentrifugation oder vakuumgetriebene Filtration beschrieben. Im Vergleich zu anderen Mikrogelherstellungsmethoden (z. B. Mikrofluidik, Batch-Emulsionen, Elektrospritzen, Photolithographie) ist die Herstellung von Extrusionsfragmentierung von Mikrogelen sehr schnell, kostengünstig, leicht skalierbar und für eine Vielzahl von Hydrogelsystemen zugänglich. Darüber hinaus ist dieses Protokoll in hohem Maße wiederholbar mit minimaler Variabilität von Charge zu Charge, die in der vorherigen Arbeit39 charakterisiert wurde.
Dieses Protokoll verwendet Norbornen-modifizierte Hyaluronsäure (NorHA), um Bulk-Hydrogele unter Verwendung einer photovermittelten Thiol-en-Reaktion herzustellen. Detaillierte Verfahren für die Synthese von NorHA werden an anderer Stelle38 beschrieben. Viele Hydrogel-Chemikalien können jedoch verwendet werden, um fragmentierte Mikrogele unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren herzustellen, wenn ein Bulk-Hydrogel im Fass einer Spritze gebildet werden kann. Es ist auch nützlich, die mechanischen Eigenschaften von Hydrogel (z. B. Druckmodul) zu verstehen. Die in diesem Protokoll verwendeten Bulk-Hydrogele haben einen Bulk-Druckmodul von etwa 30 kPa39. Ein Bulk-Hydrogel mit einem höheren Druckmodul benötigt mehr Kraft, um während der Fragmentierungsschritte zu extrudieren, was zu einer erhöhten Verstopfung oder Überbeaufschlagung der Spritzen führen kann; Daher wird empfohlen, Hydrogele mit Druckmodulen von weniger als 80 kPa zu verwenden. Darüber hinaus kann sich ein Bulk-Hydrogel mit Druckmodulen von weniger als 10 kPa während der Fragmentierungsschritte verformen, was die Fragmentierung erschwert.
Dieses Protokoll ist für eine UV-Spot-Härtungslampe optimiert. Als Alternative zur UV-Lichtquelle und UV-responsiven Photoinitiatoren können sichtbare Lichtquellen auch zusammen mit auf sichtbares Licht reagierenden Photoinitiatoren wie wasserlösliches Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoyl-phosphinat (LAP) verwendet werden. Die Initiatorkonzentration, die Lichtintensität und das Probenvolumen beeinflussen die Vernetzungszeiten in Abhängigkeit vom verwendeten Polymer und Vernetzungssystem. Darüber hinaus können viele Lampenquellen als Alternative zu Spot-Cure-Systemen verwendet werden.
Der kritischste Schritt im Protokoll ist die serielle Extrusion durch immer kleinere Nadellehren. Bei diesem Verfahren wird empfohlen, Nadelmessgeräte von 18 G (838 μm Innendurchmesser) bis 30 G (159 μm Innendurchmesser) zu verwenden. Die Zugabe von PBS zu dem fragmentierten Bulk-Hydrogel vor dem Extrudieren durch Nadeln ist entscheidend, um die zum Extrudieren und Fragmentieren erforderliche Kraft deutlich zu reduzieren. Es sollte keine übermäßige Kraft verwendet werden, um das Hydrogel zu extrudieren, da übermäßige Kraft zu Rückendruck in der Spritze führen kann und das Hydrogel aus der Spritze zurückplatzen kann. Weitere Strategien zur Reduzierung der zum Extrudieren erforderlichen Kraft umfassen die Verwendung von mehr Nadeln in der Serie, um die Fragmentgröße schrittweise zu reduzieren, sowie das Hinzufügen zusätzlicher PBS zwischen den Fragmentierungsschritten.
Beim Verklemmen der fragmentierten Mikrogele mittels vakuumgetriebener Filtration kann es zu Variabilitäten im Prozess kommen. Einige Materialsysteme benötigen möglicherweise mehr (oder weniger) Zeit, um PBS zu entfernen und die Mikrogele vollständig zu verstopfen. Es wird empfohlen, die Zeit aufzuzeichnen, die für einzelne Materialsysteme benötigt wird, um die Wiederholbarkeit über Experimente hinweg sicherzustellen. Die Zeit bis zum Verklemmen hängt auch von der Dicke und Größe der Probe ab, die dem Filter hinzugefügt wird. Die gleichmäßige Verteilung der Probe über den Filter kann bei gleichmäßiger Verklemmung helfen.
Das Verfahren zur Herstellung von Extrusionsfragmentierung von Mikrogelen kann für viele biomedizinische Anwendungen angepasst werden. Zum Beispiel können Therapeutika in die Hydrogel-Vorläuferlösung aufgenommen und anschließend in fragmentierten Mikrogelen verkapselt werden, um ein scherdünnendes, selbstheilendes granulares Hydrogel für die lokalisierte therapeutische Verabreichung herzustellen. Darüber hinaus können fragmentierte Mikrogele getrocknet werden, um eine langfristige Lagerung und einfache Sterilisationspraktiken zu ermöglichen. Eine Einschränkung der Extrusionsfragmentierung ist jedoch der Einbau von Zellen in Mikrogele. Aufgrund der hohen Scherraten während der Extrusionsfragmentierung ist die Methode wahrscheinlich nicht für die Zellverkapselung in Mikrogelen geeignet, da die hohe Scherung zu einer signifikant verminderten Zelllebensfähigkeit führen kann. Dennoch können Zellen und Sphäroide leicht zwischen Mikrogelen für die In-vitro-Kultur und die In-vivo-Zellabgabe eingearbeitet werden.
Fragmentierte granulare Hydrogele sind ein vielversprechendes Biomaterial für biomedizinische Anwendungen. In den letzten Jahren wurden granulare Hydrogele, die aus verschiedenen Fragmentierungsmethoden (z. B. Mörser und Stößel, Mixer und Netzreiben) hergestellt wurden, als zellbeladene 3D-Druckfarben48, therapeutische Lieferfahrzeuge29, injizierbare Gewebereparaturgerüste30 und Sphäroidekulturplattformen39 verwendet. Von den zuvor berichteten Fragmentierungsverfahren ist das hierin beschriebene Extrusionsfragmentierungsverfahren eines der einfachsten und kostengünstigsten Verfahren mit zahlreichen Vorteilen. Der Austausch der hierin enthaltenen Methoden wird den Zugang zur Herstellung von granularem Hydrogel verbessern und zu erheblichen Fortschritten auf dem wachsenden Gebiet der granularen Hydrogel-Biomaterialien führen, so dass mehr Forscher innovative biomedizinische Lösungen mit fragmentierten granularen Hydrogelen entwickeln können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation durch das UPenn MRSEC-Programm (DMR-1720530) und Graduiertenforschungsstipendien (für V.G.M und M.E.P.) und die National Institutes of Health (R01AR077362 bis J.A.B.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
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