げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析
Summary
単離されたラット筋細胞におけるカルシウム(Ca2+)過渡測定とともに、サルコメア長検出による収縮機能の測定を説明する一連のプロトコルが提示されています。心不全の動物モデルでの研究へのこのアプローチの適用も含まれています。
Abstract
収縮性機能障害およびCa2+ 過渡性は、心臓誘発性損傷および/またはリモデリングの包括的な評価の一環として、細胞レベルで分析されることがよくあります。これらの機能的変化を評価するための1つのアプローチは、初代成人心筋細胞におけるアンロード短縮およびCa2+ 過渡分析を利用する。このアプローチでは、成体筋細胞をコラゲナーゼ消化によって単離し、Ca2+ 耐性にしてから、ラミニンコーティングされたカバーガラスに接着し、続いて無血清培地で電気ペーシングを行います。一般的なプロトコルは、成体ラット心筋細胞を利用しますが、他の種からの初代筋細胞に対して容易に調整することができます。損傷した心臓からの筋細胞の機能的変化は、偽の筋細胞および/または in vitro 治療と比較することができます。この方法論には、筋細胞のペーシングに必要な重要な要素と、細胞室およびプラットフォームコンポーネントが含まれています。このアプローチの詳細なプロトコルには、サルコメア長検出による無負荷短縮の測定、およびレシオメトリックインジケータFura-2 AMで測定されたセルラーCa2+ 過渡現象の測定、および生データ分析の手順が組み込まれています。
Introduction
心臓ポンプ機能の解析には、特に心不全(HF)の動物モデルについて、適切な洞察を得るためにさまざまなアプローチが必要になることがよくあります。心エコー検査または血行動態測定は、in vivo心機能障害1への洞察を提供しますが、in vitroアプローチは、機能障害が筋フィラメントおよび/または結合興奮に関与するCa2+過渡性の変化、または収縮機能(例えば、興奮収縮[E-C]結合)に起因するかどうかを特定するためにしばしば採用されます。in vitroアプローチはまた、費用のかかるおよび/または面倒なin vivo治療戦略を追求する前に、神経ホルモン、ベクター誘発性遺伝子変化、および潜在的な治療薬2に対する機能的応答をスクリーニングする機会を提供します。
インビトロ収縮機能を調査するために、無傷の小柱3または透過処理された筋細胞4での力測定、ならびにHF 5,6の存在下および非存在下での無傷の筋細胞における無負荷短縮およびCa2+過渡現象を含むいくつかのアプローチが利用可能です。これらのアプローチのそれぞれは、心臓ポンプ機能に直接関与する心筋細胞収縮機能に焦点を当てています2,7。しかしながら、収縮およびE−C結合の両方を一緒に分析することは、単離されたCa2+耐性成体筋細胞における筋肉長の短縮およびCa2+過渡性を測定することによって最も頻繁に行われる。実験室は、このステップ8のためにラット心臓から筋細胞を単離するために詳細に公開されたプロトコルを利用します。
Ca2+一過性および筋フィラメントの両方が、無傷の筋細胞の短縮および再延長に寄与し、収縮機能障害に寄与する可能性がある2,7。したがって、このアプローチは、in vitro機能解析で、Ca2+サイクリング機構と筋フィラメントを含む無傷の筋細胞が必要な場合に推奨されます。例えば、無傷の単離された筋細胞は、遺伝子導入9を介して筋フィラメントまたはCa2+サイクリング機能を改変した後の収縮機能を研究するために望ましい。さらに、下流のセカンドメッセンジャーシグナル伝達経路および/または治療薬への応答の影響を研究する際に、神経ホルモンの機能的影響を分析するために、無傷の筋細胞アプローチが提案されています2。単一筋細胞における負荷依存力の代替測定は、ほとんどの場合、低温(≤15°C)での膜透過処理(またはスキニング)後に行われ、Ca2+過渡寄与を除去し、筋フィラメント機能に焦点を当てます10。無傷の筋細胞における負荷依存力とCa2+過渡現象の測定は、特に神経ホルモンシグナル伝達に対する応答の測定や治療薬のスクリーニングなど、より高いスループットが必要な場合に、アプローチ11の複雑で技術的な課題のために主にまれです。心臓小柱の解析は、これらの技術的課題を克服しますが、非筋細胞、線維症、および/または細胞外マトリックスリモデリングの影響を受ける可能性があります2。新生児筋細胞および誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋細胞は、成体筋フィラメントタンパク質の完全な補体をまだ発現しておらず、通常、成体桿体状筋細胞に存在する筋フィラメント組織のレベルを欠いているため、上記の各アプローチは成体筋細胞を含む調製物を必要とする2。現在までに、iPS細胞における証拠は、成体アイソフォームへの完全な移行が培養で134日以上を超えることを示しています12。
このコレクションの焦点がHFであることを考えると、プロトコルには、障害のある無傷の筋細胞と失敗していない無傷の筋細胞における収縮機能を区別するためのアプローチと分析が含まれています。代表的な例は、腎上縮窄の18〜20週後に研究されたラット筋細胞から提供され、5、13に記載される。次に、偽処理ラットの筋細胞と比較します。
ここで説明するプロトコルとイメージングプラットフォームは、HFの発生中の桿体状心筋細胞における短縮およびCa2+過渡現象の変化を分析および監視するために使用されます。この解析では、前述のように、2 x 104 Ca2+耐性の棒状筋細胞を22 mm2ラミニンコーティングガラスカバースリップ(CS)に播種し、一晩培養します8。このイメージングプラットフォーム用に組み立てられたコンポーネントは、最適なイメージングに使用されるメディアとバッファーとともに、材料の表に記載されています。ソフトウェアを使用したデータ分析のガイドと代表的な結果もここに提供されています。全体的なプロトコルは別々のサブセクションに分割され、最初の3つのセクションでは単離されたラット筋細胞とデータ分析に焦点を当て、続いて細胞Ca2+一過性実験と筋細胞におけるデータ分析が続きます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ステップ1で概説した慢性ペーシングプロトコルは、単離された筋細胞を研究し、より長い治療の影響を評価するための有用な時間を延長します。私たちの研究室では、慢性ペースの筋細胞のサルコメア長を使用して収縮機能を測定すると、分離後4日まで一貫した結果が得られました。しかし、筋細胞の収縮機能は、筋細胞のペースを合わせるために1週間以上経過した培地を使用すると急速?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01 HL144777(MVW)によってサポートされています。
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
References
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