Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi
Summary
İzole sıçan miyositlerinde kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümü ile birlikte sarkomer uzunluğu tespiti yoluyla kontraktil fonksiyonun ölçümünü tanımlayan bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşımın kalp yetmezliğinin hayvan modellerindeki çalışmalar için uygulanması da dahil edilmiştir.
Abstract
Kontraktil disfonksiyon ve Ca2+ geçicileri genellikle kardiyak kaynaklı yaralanma ve / veya yeniden modellemenin kapsamlı bir değerlendirmesinin bir parçası olarak hücresel düzeyde analiz edilir. Bu fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için bir yaklaşım, primer erişkin kardiyak miyositlerde yüksüz kısaltma ve Ca2+ geçici analizleri kullanır. Bu yaklaşım için, yetişkin miyositler kollajenaz sindirimi ile izole edilir, Ca2 + toleranslı hale getirilir ve daha sonra laminin kaplı kapaklara yapıştırılır, ardından serumsuz ortamlarda elektriksel pacing yapılır. Genel protokol yetişkin sıçan kardiyak miyositlerini kullanır, ancak diğer türlerden birincil miyositler için kolayca ayarlanabilir. Yaralı kalplerden kaynaklanan miyositlerdeki fonksiyonel değişiklikler, sahte miyositler ve / veya in vitro terapötik tedavilerle karşılaştırılabilir. Metodoloji, hücre odası ve platform bileşenleri ile birlikte miyosit pacing için gerekli temel unsurları içerir. Bu yaklaşım için ayrıntılı protokol, sarkomer uzunluğu tespiti ile yüksüz kısalmayı ölçme adımlarını ve oranmetrik gösterge Fura-2 ile ölçülen hücresel Ca2 + geçicileri ve ham veri analizini içerir.
Introduction
Kardiyak pompa fonksiyonunun analizi, özellikle kalp yetmezliğinin (HF) hayvan modelleri için yeterli içgörü elde etmek için genellikle bir dizi yaklaşım gerektirir. Ekokardiyografi veya hemodinamik ölçümler in vivo kardiyak disfonksiyon1 hakkında fikir verirken, in vitro yaklaşımlar genellikle disfonksiyonun miyofilament ve / veya uyarma eşleşmesinden sorumlu Ca2 + geçici veya kontraktil fonksiyonlu aksiyon potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için kullanılır (örneğin, uyarma-kasılma [E-C] bağlantısı). İn vitro yaklaşımlar ayrıca, pahalı ve / veya zahmetli in vivo tedavi stratejilerini takip etmeden önce nörohormonlara, vektör kaynaklı genetik değişikliklere ve potansiyel terapötik ajanlara2 fonksiyonel yanıtı tarama fırsatı sunar.
İn vitro kontraktil fonksiyonu araştırmak için, sağlam trabekül3 veya geçirgenleştirilmiş miyositler4’te kuvvet ölçümlerinin yanı sıra, HF 5,6’nın varlığında ve yokluğunda sağlam miyositlerde yüksüz kısalma ve Ca2 + geçicileri de dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Bu yaklaşımların her biri, kardiyak pompa fonksiyonu 2,7’den doğrudan sorumlu olan kardiyak miyosit kontraktil fonksiyonuna odaklanmaktadır. Bununla birlikte, hem kasılma hem de E-C eşleşmesinin birlikte analizi, çoğunlukla izole edilmiş, Ca 2 + toleranslı yetişkin miyositlerde kas uzunluğunun ve Ca2 + geçicilerinin kısalmasını ölçerek gerçekleştirilir. Laboratuvar, bu adım8 için miyositleri sıçan kalplerinden izole etmek için ayrıntılı bir yayınlanmış protokol kullanmaktadır.
Hem Ca2+ geçici hem de miyofilamentler, sağlam miyositlerde kısalmaya ve yeniden uzamaya katkıda bulunur ve kontraktil disfonksiyona katkıda bulunabilir 2,7. Bu nedenle, in vitro fonksiyonel analiz, Ca2+ bisiklet makinesini ve miyofilamentleri içeren sağlam bir miyosit gerektirdiğinde bu yaklaşım önerilir. Örneğin, bozulmamış izole miyositler, gen transferi9 yoluyla miyofilament veya Ca2 + döngü fonksiyonunu değiştirdikten sonra kasılma fonksiyonunu incelemek için arzu edilir. Ek olarak, aşağı akış ikinci haberci sinyal yollarının ve / veya terapötik ajanlara yanıtın etkisini incelerken nörohormonların fonksiyonel etkisini analiz etmek için sağlam bir miyosit yaklaşımı önerilmektedir2. Tek miyositlerde yüke bağlı kuvvetin alternatif bir ölçümü, Ca2 + geçici katkısını ortadan kaldırmak ve miyofilamentfonksiyonuna odaklanmak için en sık düşük sıcaklıklarda (≤15 ° C) membran geçirgenliğinden (veya deriden kaplamadan) sonra gerçekleştirilir. Sağlam miyositlerde yüke bağımlı kuvvet artı Ca2 + geçicilerinin ölçümü, özellikle nörohormon sinyallemesine verilen yanıtları ölçmek veya terapötik ajanlar için bir ekran olarak daha yüksek verime ihtiyaç duyulduğunda, yaklaşım11’in karmaşık ve teknik zorluğu nedeniyle nadirdir. Kardiyak trabeküllerin analizi bu teknik zorlukların üstesinden gelir, ancak miyosit olmayan, fibroz ve / veya hücre dışı matriks yeniden şekillenmesinden de etkilenebilir2. Yukarıda açıklanan yaklaşımların her biri, yetişkin miyositleri içeren bir preparat gerektirir, çünkü yenidoğan miyositleri ve indüklenebilir pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) türetilen miyositler, yetişkin miyofilament proteinlerinin tam tamamlayıcısını henüz ifade etmemektedir ve genellikle yetişkin çubuk şeklindeki miyosit2’de bulunan miyofilament organizasyon seviyesinden yoksundur. Bugüne kadar, iPSC’lerdeki kanıtlar, yetişkin izoformlarına tam geçişin kültür12’de 134 günden fazla olduğunu göstermektedir.
Bu koleksiyonun HF üzerindeki odağı göz önüne alındığında, protokoller, başarısız olan ve başarısız olmayan sağlam miyositlerdeki kontraktil fonksiyonu ayırt etmek için yaklaşımlar ve analizler içerir. Temsili örnekler, daha önce5,13 olarak tarif edilen, böbrek üstü koarktasyondan 18-20 hafta sonra çalışılan sıçan miyositlerinden verilmiştir. Daha sonra sahte muamele görmüş sıçanlardan miyositlerle karşılaştırmalar yapılır.
Burada tarif edilen protokol ve görüntüleme platformu, HF gelişimi sırasında çubuk şeklindeki kardiyak miyositlerde kısalma ve Ca2+ geçicilerindeki değişiklikleri analiz etmek ve izlemek için kullanılır. Bu analiz için, 2 x 104 Ca2 + toleranslı, çubuk şeklindeki miyositler, 22mm2 laminin kaplı cam kapaklar (CSs) üzerine kaplanır ve daha önce açıklandığı gibi gece boyunca kültürlenir8. Bu görüntüleme platformu için monte edilen bileşenler, optimum görüntüleme için kullanılan ortam ve tamponlarla birlikte, Malzeme Tablosunda verilmiştir. Bir yazılım kullanarak veri analizi için bir kılavuz ve temsili sonuçlar da burada sağlanmaktadır. Genel protokol ayrı alt bölümlere ayrılmıştır, ilk üç bölüm izole sıçan miyositlerine ve veri analizine odaklanır, bunu miyositlerde hücresel Ca2 + geçici deneyler ve veri analizi izler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adım 1’de özetlenen kronik pacing protokolü, izole miyositleri incelemek ve daha uzun tedavilerin etkisini değerlendirmek için yararlı süreyi uzatır. Laboratuvarımızda kronik tempolu miyositlerde sarkomer uzunluğu kullanılarak kontraktil fonksiyon ölçülürken izolasyondan 4 gün sonrasına kadar tutarlı sonuçlar elde edilmiştir. Bununla birlikte, miyositleri hızlandırmak için 1 haftadan daha eski medya kullanıldığında miyosit kontraktil fonksiyonu hızla bozulur.
Kası…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe R01 HL144777 (MVW) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
References
- Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Rossman, E. I., et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).
- McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts. Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).
- Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).
- Chaudhary, K. W., et al. Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).
- Walker, C. A., Spinale, F. G. The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).
- Lang, S. E., Westfall, M. V. Gene transfer into cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).
- Davis, J., et al. Designing heart performance by gene transfer. Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).
- Sweitzer, N. K., Moss, R. L. Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin. Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).
- Yasuda, S., et al. Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).
- Racca, A. W., et al. Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle. The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).
- Kim, E. H., et al. Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure. Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).
- Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).
- Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).
- Sakthivel, S., et al. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).
- Qi, M., et al. Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy. The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).
- Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. The ultrastructure basis of Starling’s law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume. American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).
- Zak, R. Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart. Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).
- Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats. Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).
