Es wird eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die die Messung der kontraktilen Funktion mittels Sarkomerlängendetektion zusammen mit der transienten Messung von Kalzium (Ca2+) in isolierten Rattenmyozyten beschreiben. Die Anwendung dieses Ansatzes für Studien in Tiermodellen der Herzinsuffizienz ist ebenfalls enthalten.
Kontraktile Dysfunktion und Ca2+ Transienten werden häufig auf zellulärer Ebene als Teil einer umfassenden Bewertung von kardial-induzierten Verletzungen und / oder Umbauten analysiert. Ein Ansatz zur Beurteilung dieser funktionellen Veränderungen verwendet unbelastete Verkürzungs- und Ca2+ -Transientenanalysen in primären adulten kardialen Myozyten. Für diesen Ansatz werden adulte Myozyten durch Kollagenase-Verdauung isoliert, Ca2+ tolerant gemacht und dann an Laminin-beschichteten Deckgläsern haftet, gefolgt von elektrischem Pacing in serumfreien Medien. Das allgemeine Protokoll verwendet adulte Rattenherzmyozyten, kann aber leicht für primäre Myozyten anderer Spezies angepasst werden. Funktionelle Veränderungen in Myozyten verletzter Herzen können mit Scheinmyozyten und/oder mit In-vitro-Therapien verglichen werden. Die Methodik umfasst die wesentlichen Elemente, die für das Myozyten-Pacing benötigt werden, sowie die Zellkammer- und Plattformkomponenten. Das detaillierte Protokoll für diesen Ansatz umfasst die Schritte zur Messung der unbelasteten Verkürzung durch Sarkomerlängenerkennung und zelluläre Ca2+ -Transienten, die mit dem ratiometrischen Indikator Fura-2 AM gemessen wurden, sowie für die Rohdatenanalyse.
Die Analyse der Herzpumpenfunktion erfordert oft eine Reihe von Ansätzen, um adäquate Erkenntnisse zu gewinnen, insbesondere für Tiermodelle der Herzinsuffizienz (HF). Echokardiographie oder hämodynamische Messungen geben Einblick in die in vivo kardiale Dysfunktion1, während häufig In-vitro-Ansätze verwendet werden, um festzustellen, ob eine Dysfunktion durch Veränderungen des Myofilaments und/oder des Ca2+ -Transienten, der für die Kopplung der Erregung verantwortlich ist, oder des Aktionspotentials mit kontraktiler Funktion (z. B. Anregung-Kontraktion [E-C] -Kopplung) entsteht. In-vitro-Ansätze bieten auch die Möglichkeit, die funktionelle Reaktion auf Neurohormone, vektorinduzierte genetische Veränderungen sowie potenzielle Therapeutika2 zu untersuchen, bevor kostspielige und/oder mühsame In-vivo-Behandlungsstrategien verfolgt werden.
Zur Untersuchung der in vitro kontraktilen Funktion stehen mehrere Ansätze zur Verfügung, darunter Kraftmessungen in intakten Trabekeln3 oder permeabilisierten Myozyten4 sowie unbelastete Verkürzungen und Ca2+ Transienten in intakten Myozyten in Gegenwart und Abwesenheit von HF 5,6. Jeder dieser Ansätze konzentriert sich auf die kontraktile Funktion der kardialen Myozyten, die direkt für die Herzpumpenfunktion verantwortlich ist 2,7. Die Analyse sowohl der Kontraktion als auch der E-C-Kopplung zusammen wird jedoch am häufigsten durch Messung der Verkürzung der Muskellänge und Ca 2+ Transienten in isolierten, Ca2+ toleranten adulten Myozyten durchgeführt. Das Labor verwendet ein detailliertes veröffentlichtes Protokoll, um Myozyten aus Rattenherzen für diesen Schritt8 zu isolieren.
Sowohl die transienten Ca2+ als auch die Myofilamente tragen zur Verkürzung und Wiederverlängerung intakter Myozyten bei und können zur kontraktilen Dysfunktion beitragen 2,7. Daher wird dieser Ansatz empfohlen, wenn die In-vitro-Funktionsanalyse einen intakten Myozyten erfordert, der die Ca2+ Zyklusmaschinerie plus die Myofilamente enthält. Zum Beispiel sind intakte isolierte Myozyten wünschenswert, um die kontraktile Funktion nach Modifizierung der Myofilament- oder Ca2+-Zyklusfunktion durch Gentransferzu untersuchen 9. Darüber hinaus wird ein intakter Myozytenansatz vorgeschlagen, um den funktionellen Einfluss von Neurohormonen zu analysieren, wenn der Einfluss von nachgeschalteten Second-Messenger-Signalwegen und/oder das Ansprechen auf therapeutische Wirkstoffe untersuchtwird 2. Eine alternative Messung der lastabhängigen Kraft in einzelnen Myozyten wird am häufigsten nach Membranpermeabilisierung (oder Häutung) bei niedrigen Temperaturen (≤15 °C) durchgeführt, um den transienten Beitrag von Ca2+ zu entfernen und sich auf die myofilamente Funktion10 zu konzentrieren. Die Messung von lastabhängigen Kraft- plus Ca2+-Transienten in intakten Myozyten ist vor allem aufgrund der komplexen und technischen Herausforderung des Ansatzes11 selten, insbesondere wenn ein höherer Durchsatz erforderlich ist, z. B. zur Messung von Reaktionen auf Neurohormonsignale oder als Screening für Therapeutika. Die Analyse von Herztrabekeln überwindet diese technischen Herausforderungen, kann aber auch durch Nicht-Myozyten, Fibrose und/oder extrazellulären Matrixumbau beeinflusst werden2. Jeder der oben beschriebenen Ansätze erfordert ein Präparat, das adulte Myozyten enthält, da neonatale Myozyten und Myozyten, die von induzierbaren pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet sind, noch nicht das vollständige Komplement adulter Myofilamentproteine exprimieren und normalerweise nicht das Niveau der myofilamenten Organisation aufweisen, das in den adulten stäbchenförmigen Myozyten2 vorhanden ist. Bisher deuten Hinweise auf iPSCs darauf hin, dass der vollständige Übergang zu adulten Isoformen in Kultur mehr als 134 Tage überschreitet12.
Angesichts des Schwerpunkts dieser Sammlung auf HF enthalten die Protokolle Ansätze und Analysen zur Unterscheidung der kontraktilen Funktion bei versagenden und nicht versagenden intakten Myozyten. Repräsentative Beispiele sind Rattenmyozyten, die 18-20 Wochen nach einer suprarenalen Coarctation untersucht wurden, die zuvorbeschrieben wurde 5,13. Anschließend werden Vergleiche mit Myozyten von scheinbehandelten Ratten angestellt.
Das hier beschriebene Protokoll und die Bildgebungsplattform werden verwendet, um Veränderungen der Verkürzung und Ca2+ Transienten in stäbchenförmigen kardialen Myozyten während der Entwicklung von HF zu analysieren und zu überwachen. Für diese Analyse werden 2 x 104 Ca 2+-tolerante, stäbchenförmige Myozyten auf22 mm2 lamininbeschichtete Glasdeckgläser (CSs) plattiert und über Nacht kultiviert, wie zuvor beschrieben8. Die für diese Bildgebungsplattform zusammengebauten Komponenten sowie die Medien und Puffer, die für eine optimale Bildgebung verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Eine Anleitung zur Datenanalyse mittels Software und die repräsentativen Ergebnisse werden hier ebenfalls bereitgestellt. Das Gesamtprotokoll ist in separate Unterabschnitte unterteilt, wobei sich die ersten drei Abschnitte auf isolierte Rattenmyozyten und Datenanalyse konzentrieren, gefolgt von zellulären Ca2+ transienten Experimenten und Datenanalysen in Myozyten.
Das in Schritt 1 beschriebene Protokoll zur chronischen Stimulation verlängert die nützliche Zeit für die Untersuchung isolierter Myozyten und die Bewertung der Auswirkungen längerer Behandlungen. In unserem Labor wurden bis zu 4 Tage nach der Isolierung konsistente Ergebnisse erzielt, wenn die kontraktile Funktion anhand der Sarkomerlänge an chronisch schrittweisen Myozyten gemessen wurde. Die kontraktile Funktion der Myozyten verschlechtert sich jedoch schnell, wenn Medien verwendet werden, die älter als 1 Woche …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch den Zuschuss R01 HL144777 (MVW) der National Institutes of Health (NIH) unterstützt.
MEDIA | |||
Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
#1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |