Представлен набор протоколов, которые описывают измерение сократительной функции с помощью обнаружения длины саркомера наряду с переходным измерением кальция (Ca2+) в изолированных миоцитах крыс. Применение этого подхода для исследований на животных моделях сердечной недостаточности также включено.
Сократительная дисфункция и транзиторы Ca2+ часто анализируются на клеточном уровне в рамках комплексной оценки сердечно-индуцированной травмы и / или ремоделирования. Один из подходов к оценке этих функциональных изменений использует ненагруженное укорочение и транзиторный анализ Ca2+ в первичных взрослых сердечных миоцитах. Для этого подхода взрослые миоциты выделяют путем переваривания коллагеназы, делают устойчивыми к Ca2+ , а затем прилипают к покрытым ламинином покровам с последующим электрическим темпом в средах, свободных от сыворотки. Общий протокол использует сердечные миоциты взрослых крыс, но может быть легко скорректирован для первичных миоцитов других видов. Функциональные изменения в миоцитах от поврежденных сердец можно сравнить с фиктивными миоцитами и / или с терапевтическим лечением in vitro . Методология включает в себя необходимые элементы, необходимые для кардиоцитарной стимуляции, а также клеточную камеру и компоненты платформы. Подробный протокол для этого подхода включает в себя этапы измерения ненагруженного укорочения путем обнаружения длины саркомера и сотовых переходных процессов Ca2+ , измеренных с помощью ратиометрического индикатора Fura-2 AM, а также для анализа необработанных данных.
Анализ функции сердечного насоса часто требует ряда подходов для получения адекватного понимания, особенно для животных моделей сердечной недостаточности (HF). Эхокардиография или гемодинамические измерения дают представление о сердечной дисфункции in vivo 1, в то время как подходы in vitro часто используются для определения того, возникает ли дисфункция из-за изменений в миофиламенте и / или транзиторе Ca2+ , ответственном за возбуждение связи, или потенциале действия со сократительной функцией (например, связь возбуждение-сокращение [E-C]). Подходы in vitro также дают возможность скрининга функционального ответа на нейрогормоны, векторно-индуцированные генетические изменения, а также потенциальные терапевтические агенты2 до проведения дорогостоящих и/или трудоемких стратегий лечения in vivo .
Существует несколько подходов к исследованию сократительной функции in vitro, включая измерения силы в интактных трабекулах3 или пермеабилизированных миоцитах4, а также ненагруженное укорочение и транзиторы Ca2+ в интактных миоцитах в присутствии и отсутствии HF 5,6. Каждый из этих подходов фокусируется на сократительной функции сердечных миоцитов, которая непосредственно отвечает за функцию сердечного насоса 2,7. Тем не менее, анализ как сокращения, так и связи E-C вместе чаще всего выполняется путем измерения укорочения длины мышцы и переходных процессов Ca2+ в изолированных, устойчивых к Ca2+ взрослых миоцитах. Лаборатория использует подробный опубликованный протокол для выделения миоцитов из сердец крыс для этого шага8.
Как транзитор Ca2+, так и миофиламенты способствуют укорочению и повторному удлинению в интактных миоцитах и могут способствовать сократительной дисфункции 2,7. Таким образом, этот подход рекомендуется, когда функциональный анализ in vitro требует интактного миоцита, содержащего велосипедный механизм Ca2 + плюс миофиламенты. Например, интактные изолированные миоциты желательны для изучения сократительной функции после модификации миофиламента или циклической функции Ca2+ посредством переноса генов9. Кроме того, интактный миоцитарный подход предлагается для анализа функционального воздействия нейрогормонов при изучении влияния нисходящих вторичных сигнальных путей мессенджера и/или ответа на терапевтические агенты2. Альтернативное измерение нагрузочно-зависимой силы в отдельных миоцитах чаще всего выполняется после мембранной пермеабилизации (или снятия кожи) при низких температурах (≤15 °C) для удаления переходного вклада Ca2+ и фокусировки на функции миофиламента10. Измерение зависящей от нагрузки силы плюс переходные процессы Ca2+ в интактных миоцитах встречается редко из-за сложной и технической проблемы подхода11, особенно когда требуется более высокая пропускная способность, например, для измерения реакций на передачу сигналов нейрогормона или в качестве экрана для терапевтических агентов. Анализ сердечных трабекул преодолевает эти технические проблемы, но также может зависеть от немиоцитов, фиброза и / или ремоделирования внеклеточного матрикса2. Каждый из описанных выше подходов требует препарата, содержащего взрослые миоциты, поскольку неонатальные миоциты и миоциты, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), еще не экспрессируют полный комплемент взрослых белков миофиламента и обычно не имеют уровня организации миофиламента, присутствующего во взрослом палочковидном миоците2. На сегодняшний день данные в иПСК указывают на то, что полный переход к взрослым изоформам превышает более 134 дней в культуре12.
Учитывая акцент этой коллекции на HF, протоколы включают подходы и анализ для дифференциации сократительной функции в неисправных и недееспособных интактных миоцитах. Репрезентативные примеры приведены из крысиных миоцитов, изученных через 18-20 недель после надпочечниковой коарктации, описанной ранее 5,13. Затем проводятся сравнения с миоцитами у крыс, обработанных фикцией.
Протокол и платформа визуализации, описанные здесь, используются для анализа и мониторинга изменений укорочения и транзиторов Ca2+ в палочковидных сердечных миоцитах во время развития HF. Для этого анализа 2 x 104 Ca2+ -толерантные, палочковидные миоциты покрыты 22 мм2 стеклянными крышками (CSs) с покрытием ламинин и культивируются в течение ночи, как описано ранее8. Компоненты, собранные для этой платформы визуализации, наряду с носителями и буферами, используемыми для оптимальной визуализации, представлены в Таблице материалов. Руководство по анализу данных с использованием программного обеспечения и репрезентативные результаты также представлены здесь. Общий протокол разбит на отдельные подразделы, причем первые три раздела посвящены изолированным миоцитам крыс и анализу данных, за которыми следуют клеточные эксперименты Ca2 + и анализ данных в миоцитах.
Протокол хронической кардиостимуляции, описанный в шаге 1, продлевает полезное время для изучения изолированных миоцитов и оценки влияния более длительного лечения. В нашей лаборатории были получены последовательные результаты до 4 дней после изоляции при измерении сократительной фу…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается грантом Национальных институтов здравоохранения (NIH) R01 HL144777 (MVW).
MEDIA | |||
Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
#1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |