Анализ сердечной сократительной дисфункции и транзиторов Ca²⁺ в миоцитах грызунов

Summary

Представлен набор протоколов, которые описывают измерение сократительной функции с помощью обнаружения длины саркомера наряду с переходным измерением кальция (Ca²⁺) в изолированных миоцитах крыс. Применение этого подхода для исследований на животных моделях сердечной недостаточности также включено.

Abstract

Сократительная дисфункция и транзиторы Ca²⁺ часто анализируются на клеточном уровне в рамках комплексной оценки сердечно-индуцированной травмы и / или ремоделирования. Один из подходов к оценке этих функциональных изменений использует ненагруженное укорочение и транзиторный анализ Ca²⁺ в первичных взрослых сердечных миоцитах. Для этого подхода взрослые миоциты выделяют путем переваривания коллагеназы, делают устойчивыми к Ca²⁺ , а затем прилипают к покрытым ламинином покровам с последующим электрическим темпом в средах, свободных от сыворотки. Общий протокол использует сердечные миоциты взрослых крыс, но может быть легко скорректирован для первичных миоцитов других видов. Функциональные изменения в миоцитах от поврежденных сердец можно сравнить с фиктивными миоцитами и / или с терапевтическим лечением in vitro . Методология включает в себя необходимые элементы, необходимые для кардиоцитарной стимуляции, а также клеточную камеру и компоненты платформы. Подробный протокол для этого подхода включает в себя этапы измерения ненагруженного укорочения путем обнаружения длины саркомера и сотовых переходных процессов Ca²⁺ , измеренных с помощью ратиометрического индикатора Fura-2 AM, а также для анализа необработанных данных.

Introduction

Анализ функции сердечного насоса часто требует ряда подходов для получения адекватного понимания, особенно для животных моделей сердечной недостаточности (HF). Эхокардиография или гемодинамические измерения дают представление о сердечной дисфункции in vivo ¹, в то время как подходы in vitro часто используются для определения того, возникает ли дисфункция из-за изменений в миофиламенте и / или транзиторе Ca²⁺ , ответственном за возбуждение связи, или потенциале действия со сократительной функцией (например, связь возбуждение-сокращение [E-C]). Подходы in vitro также дают возможность скрининга функционального ответа на нейрогормоны, векторно-индуцированные генетические изменения, а также потенциальные терапевтические агенты² до проведения дорогостоящих и/или трудоемких стратегий лечения in vivo .

Существует несколько подходов к исследованию сократительной функции in vitro, включая измерения силы в интактных трабекулах³ или пермеабилизированных миоцитах⁴, а также ненагруженное укорочение и транзиторы Ca²⁺ в интактных миоцитах в присутствии и отсутствии HF ^5,6. Каждый из этих подходов фокусируется на сократительной функции сердечных миоцитов, которая непосредственно отвечает за функцию сердечного насоса ^2,7. Тем не менее, анализ как сокращения, так и связи E-C вместе чаще всего выполняется путем измерения укорочения длины мышцы и переходных процессов Ca²⁺ в изолированных, устойчивых к Ca²⁺ взрослых миоцитах. Лаборатория использует подробный опубликованный протокол для выделения миоцитов из сердец крыс для этого шага⁸.

Как транзитор Ca²⁺, так и миофиламенты способствуют укорочению и повторному удлинению в интактных миоцитах и могут способствовать сократительной дисфункции ^2,7. Таким образом, этот подход рекомендуется, когда функциональный анализ in vitro требует интактного миоцита, содержащего велосипедный механизм Ca^{2 +} плюс миофиламенты. Например, интактные изолированные миоциты желательны для изучения сократительной функции после модификации миофиламента или циклической функции Ca²⁺ посредством переноса генов⁹. Кроме того, интактный миоцитарный подход предлагается для анализа функционального воздействия нейрогормонов при изучении влияния нисходящих вторичных сигнальных путей мессенджера и/или ответа на терапевтические агенты². Альтернативное измерение нагрузочно-зависимой силы в отдельных миоцитах чаще всего выполняется после мембранной пермеабилизации (или снятия кожи) при низких температурах (≤15 °C) для удаления переходного вклада Ca²⁺ и фокусировки на функции миофиламента¹⁰. Измерение зависящей от нагрузки силы плюс переходные процессы Ca²⁺ в интактных миоцитах встречается редко из-за сложной и технической проблемы подхода¹¹, особенно когда требуется более высокая пропускная способность, например, для измерения реакций на передачу сигналов нейрогормона или в качестве экрана для терапевтических агентов. Анализ сердечных трабекул преодолевает эти технические проблемы, но также может зависеть от немиоцитов, фиброза и / или ремоделирования внеклеточного матрикса². Каждый из описанных выше подходов требует препарата, содержащего взрослые миоциты, поскольку неонатальные миоциты и миоциты, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), еще не экспрессируют полный комплемент взрослых белков миофиламента и обычно не имеют уровня организации миофиламента, присутствующего во взрослом палочковидном миоците². На сегодняшний день данные в иПСК указывают на то, что полный переход к взрослым изоформам превышает более 134 дней в культуре¹².

Учитывая акцент этой коллекции на HF, протоколы включают подходы и анализ для дифференциации сократительной функции в неисправных и недееспособных интактных миоцитах. Репрезентативные примеры приведены из крысиных миоцитов, изученных через 18-20 недель после надпочечниковой коарктации, описанной ранее ^5,13. Затем проводятся сравнения с миоцитами у крыс, обработанных фикцией.

Протокол и платформа визуализации, описанные здесь, используются для анализа и мониторинга изменений укорочения и транзиторов Ca²⁺ в палочковидных сердечных миоцитах во время развития HF. Для этого анализа 2 x 10⁴ Ca²⁺ -толерантные, палочковидные миоциты покрыты 22 мм² стеклянными крышками (CSs) с покрытием ламинин и культивируются в течение ночи, как описано ранее⁸. Компоненты, собранные для этой платформы визуализации, наряду с носителями и буферами, используемыми для оптимальной визуализации, представлены в Таблице материалов. Руководство по анализу данных с использованием программного обеспечения и репрезентативные результаты также представлены здесь. Общий протокол разбит на отдельные подразделы, причем первые три раздела посвящены изолированным миоцитам крыс и анализу данных, за которыми следуют клеточные эксперименты Ca^{2 +} и анализ данных в миоцитах.

Protocol

Исследования, проведенные на грызунах, проводились в соответствии с Политикой службы общественного здравоохранения в отношении гуманного ухода и использования лабораторных животных и были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Мичиганского университета. Для этого исследования миоциты были выделены у 3-34-месячных крыс Sprague-Dawley и F344BN весом ≥ 200 г⁵. Использовались как мужские, так и женские показатели.

1. Стимуляция миоцитов для исследования сократительной функции

1. Сделайте свежие среды на основе M199 для каждого набора изолированных миоцитов (Таблица материалов). За 1 день до стимуляции, пластина 2 x 10⁴ Ca²⁺-толерантные, палочковидные миоциты на 22 мм² покрытых ламинином стеклянных покровах (CSs), как описано ранее⁸.
2. Для подготовки камер замочите каждую камеру в 10% отбеливателе в течение 1 ч. Затем промывайте камеры проточной водопроводной водой в течение 30-45 мин, затем дистиллированную воду заменяют каждые 5 мин в течение 30 мин, затем деионизированную воду заменяют каждые 5 мин в течение 30 мин, и заключительную промывку в деионизированной воде.
3. Высушите камеры на чистой поверхности в течение 20-30 мин (дополнительный рисунок 1А-С). Далее УФ обрабатывают камеры в шкафу биобезопасности в течение 5 мин в каждом направлении (итого = 20 мин). Этот шаг не нужен для предварительно стерилизованных камер.
   ВНИМАНИЕ: Покиньте область, чтобы свести к минимуму воздействие ультрафиолета.
4. Снимите крышку с камеры, добавьте 3 мл среды на основе M199 (см. Таблицу материалов) в каждую скважину (дополнительный рисунок 1B), замените крышку и предварительно разогрейте камеру в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO₂ и 20% O₂.
5. Стерилизуйте щипцы в горячем стерилизаторе при 250 °C в течение 20-25 с. Перенесите предварительно нагретую стимулирующую камеру из инкубатора в шкаф биобезопасности.
6. Перенесите каждый покров (CS), содержащий сердечные миоциты, в отдельные колодцы в камере стимуляции с помощью стерильных щипцов. Передавайте КС по четыре за раз, с последующим нагревом в течение 10 мин перед передачей оставшихся четырех КС для поддержания температуры среды.
7. Прикрепите банановые домкраты к камере стимуляции на одном конце (дополнительный рисунок 1C) и к стимулятору на другом конце (дополнительный рисунок 1D).
8. Установите частоту стимулятора на 0,2 Гц и установите напряжение (~12 В) для достижения сокращения в ~10%-20% всех палочковидных сердечных миоцитов внутри лунки. Чтобы определить количество сокращающихся миоцитов, поместите камеру под инвертированный микроскоп с увеличением от 4 до 10 раз.
9. Поместите камеру стимуляции в инкубатор при 37 °C в 5% CO₂ (дополнительный рисунок 1E). Меняйте среду каждые 12 ч с помощью среды, предварительно нагретой в инкубаторе 37 °C, 5% CO₂ в течение 20-25 мин. Продолжайте электростимуляцию до 3 дней с изменением среды каждые 12 ч.

2. Анализ сократительной функции сердечных миоцитов взрослых крыс

1. Разогрейте гелевую упаковку и среду в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 мин перед экспериментом.
2. Включите компоненты платформы с контрактильной функцией, перечисленные в таблице материалов и показанные на дополнительном рисунке 2, с особым вниманием к ключевым компонентам, которые включают антивибрационную таблицу (дополнительный рисунок 2A-1) с инвертированным микроскопом с темно-красным (590 нм) фильтром (дополнительный рисунок 2A-2,3) и ПЗС-камеру (дополнительный рисунок 2A-4), подключенную к контроллеру CCD (дополнительный рисунок 2A-5 и Дополнительный рисунок 2C-5) и интегрированный с ПК-компьютером (Дополнительный рисунок 2В-14).
3. Вмонтируйте трубку в перистальтический насос (дополнительный рисунок 2А-8; Дополнительный рисунок 2А-8), перенесите предварительно нагретую гелевую упаковку в держатель трубки (дополнительный рисунок 2А-9) и включите вакуум (дополнительный рисунок 2А-11) и питание на клеточный стимулятор (дополнительный рисунок 2В-13).
4. Поместите трубку объемом 50 мл со средой в изолированный держатель трубки (дополнительный рисунок 2А-9) и начните перфузию со скоростью ~0,5 мл/мин через трубку перистальтического насоса (дополнительный рисунок 2E-8).
5. Добавьте небольшое количество предварительно нагретой среды в небольшую весовую лодку (~ 2 мл). Перенесите один КС, содержащий миоциты, из стимулирующей камеры в весовую лодку. Верните камеру стимуляции к 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ .
6. Снимите CS с весовой лодки и аккуратно протрите нижнюю часть. Переложите CS в свежесмазанную камеру CS (дополнительный рисунок 2A, F-10; черная стрелка) и осторожно добавьте каплю среды (~200 мкл) на CS.
7. Поместите платиновый электрод поверх CS (дополнительный рисунок 2F; серая стрелка) и положите новый CS сверху с помощью щипцов. Поместите верхнее крепление (дополнительный рисунок 2F; белая стрелка) над сэндвичем CS, а затем установите два или четыре винта #0, чтобы закончить сборку камеры.
8. Как только среда появится во всей трубке насоса, прикрепите трубку к предпусковому подогревателю, а затем подключите предпусковой подогреватель к камере CS, собранной на этапе 2.7. Начните перфузию со скоростью 0,5 мл / мин и поместите салфетку под камеру, чтобы убедиться в отсутствии утечек.
9. Поместите камеру CS в адаптер сцены. Перфузированная среда собирается на противоположном конце камеры с трубкой, подключенной к вакуумной системе. Включите систему отопления (дополнительный рисунок 2A, D-7) и уравновешивайте камеру, объектив и подогреватель в течение ~ 5-10 мин для достижения постоянной температуры среды 37 °C. Визуализируйте миоциты с помощью 40-кратного объекта погружения в воду на микроскопе в течение этого времени равновесия.
10. Активируйте стимулятор кардиостимулятора (дополнительный рисунок 2B-13), установив напряжение в 1,5 раза больше, чем необходимо для сокращения 80% палочковидных клеток, что обычно составляет 35-40 В. Установите частоту стимуляции на 0,2 Гц для оптимизации сократительной функции и выживаемости миоцитов.
11. Соберите сократительные укороченные и удлиняющие следы от непрерывно перфузированных и ускоренных миоцитов. Для сбора измерений сокращения используйте ПЗС-камеру (дополнительный рисунок 2A-4), подключенную к контроллеру CCD (дополнительный рисунок 2B-5, C), и специальный компьютер с платой контроллера ввода/вывода (дополнительный рисунок 2B-14; см. Таблицу материалов). Платформа измеряет укорочение саркомера в миоцитах крыс, хотя аналогичные результаты получены из измерений миоцитов, собранных из продольных краев миоцитов (см. Ecklerle et ^al.14).
12. Чтобы собрать следы сокращения саркомера, откройте программное обеспечение на компьютере, нажмите кнопку ОК, а затем Файл > Создать. Подготовьте шаблон экрана, выбрав Трассировки > Изменить ограничения пользователя > Длину саркомера , а затем установив максимальное и минимальное значения, которые обычно составляют от 2,0 мкм до 1,5 мкм. Откалибруйте ПЗС-камеру с помощью гратикулы 0,01 мм перед проведением измерений в миоцитах (рисунок 1D).
13. Чтобы записать трассировки длины саркомера, выберите Файл > Создать. Определите сокращающийся миоцит и расположите миоцит вдоль продольной оси камеры, чтобы рисунок полосы был вертикальным (рисунок 1B).
14. Используйте компьютерную мышь, чтобы поместить область интереса (ROI) (розовая коробка) над миоцитом (рисунок 1C). Выберите Собрать и Начать , чтобы записать сократительную функцию. Запись укорочения в течение 60 с с каждого миоцита на низких частотах стимуляции (≤0,5 Гц).
15. Регистрируйте укорочение саркомера от 5-10 клеток на КС. Выполняйте измерения при 1 клетке/КС, если исследования включают лечение агонистами/антагонистами. Подготовьте отдельные предварительно нагретые среды и другой специальный кусок перфузионной трубки, загруженный в многоканальный перистальтический насос, и выполните шаги 2.9.-2.14. для измерения влияния доставки препарата или нейрогормона на сократительную функцию миоцитов.
16. Чтобы измерить укорочение в диапазоне частот, разместите миоциты на каждой частоте, чтобы получить устойчивое укорочение до записи⁵. Для этих исследований удваивают скорость перфузии и начинают запись через 15-20 с после стимуляции на новой частоте для получения последовательных стационарных сократительных откликов для частот в диапазоне 0,2 Гц и 2 Гц. Как правило, регистрируют не более 2 миоцитов/КС для укорочения в заданном диапазоне частот стимуляции.
17. Запишите не менее 7 сокращений на клетку для получения надежных усредненных по сигналу данных при анализе записей (см. шаг 3.).

3. Анализ данных сократительной функции в изолированных миоцитах

1. Для начала выберите Файл, выберите записанную трассировку и нажмите кнопку Открыть. Выберите вкладку 1 (левая сторона) базовой трассировки, а затем установите для желтой панели в верхней части трассировки значение Sarc-Length. Выберите Трассировки и шаблон экрана, подготовленный на шаге 2.12.
2. Чтобы подготовить шаблон анализа, выберите Операции, Параметры монотонного анализа переходных процессов, Отметка события TTL в поле Определение t0, а также следующие опции в меню: Базовая линия (длина саркомера покоя), Скорость вылета относительно t0 (dep v), Пик (пиковая высота и %пиковая высота/базовая линия или bl%пик h), Обратная скорость относительно tPeak (ret v), Время достижения пика 50% (TTP_50%) с использованием t0 и время до базового уровня 50% (TTR_50%)) с помощью tPeak. Сохраните эти параметры анализа, выбрав Шаблоны > Сохранить шаблон анализа с идентификатором. Загрузите этот шаблон анализа перед анализом каждой трассировки.
3. Чтобы начать анализ данных, выберите Marks > Gate > Add Transient > Convert from Event Mark > Analysis Range. Теперь установите временной диапазон от -0,01 с до 1,20 с для миоцитов с частотой 0,2 Гц (рисунок 2А, красные отметки на нижней части сырого следа). Выберите более короткий временной диапазон для миоцитов, стимулируемых на более высоких частотах.
4. Создайте трассировку с усредненным сигналом, выбрав Операции > Средние события. Усредненная по сигналу запись отображается ниже исходного базового следа.
5. Выберите вкладку 1 трассировки усредненного сигнала (левая часть экрана), а затем выберите Метки в верхнем меню, а затем Добавить переходный. Выберите «Операции» в верхнем меню и «Монотонный анализ переходных процессов », чтобы отобразить усредненные по сигналу значения базовой длины саркомера, высоты пика, bl%peak h, dep v, ret v, TTP_50% и TTR_50% на панели отображения усредненного сигнала.
6. Перенесите каждый анализ переходных процессов саркомера в электронную таблицу для композитного анализа нескольких миоцитов, выбрав Экспорт > Монотонный переходный анализ > Ток буфера обмена. Вставьте эти данные в электронную таблицу для каждой трассировки.
7. Чтобы скопировать трассировку, усредненную по сигналу, выберите «Экспортировать > «Текущую трассировку» > > «Параметры буфера обмена» и установите для десятичных знаков значение 5, затем выберите «Разделитель табуляции» и нажмите кнопки «ОК» и «ОК». Вставьте усредненные по сигналу следы для каждой записи миоцитов во вторую электронную таблицу.

4. Запись транзиторов Ca²⁺ в миоцитах сердца взрослых крыс

1. Перед измерением переходных процессов Ca²⁺ включите компоненты платформы, описанные на шаге 2.2., вместе с дополнительными компонентами флуоресцентной визуализации (см. Дополнительные компоненты для анализа изображений Ca²⁺ в Таблице материалов; Дополнительный рисунок 2А-5,6; 2В-12).
2. Готовят Фура-2АМ стоковый раствор, содержащий 1 мМ Фура-2АМ плюс 0,5 М пробенецида в диметилсульфоксиде (ДМСО). Probenecid минимизирует утечку Fura-2AM¹⁵.
3. Разбавляют исходный раствор до 5 мкМ Фура-2АМ и 2,5 мМ пробенецида в 2,5 мл среды (см. Таблицу материалов) в одной скважине 6-луночной пластины. Добавьте только 2,5 мл среды (без Fura-2AM) в три дополнительные скважины в пластине, покройте пластину алюминиевой фольгой и предварительно нагрейте среду до 37 °C.
4. Перенесите CS, содержащий миоциты, из камеры кардиостимуляции в колодец, содержащий Fura-2AM, накройте крышкой и верните пластину в инкубатор 37 °C с 5% CO₂ в течение 4 мин. Установите трубку в перфузионный насос и перфьюируйте со средой в течение периода загрузки Fura-2AM, как описано в шаге 2.4.
5. Выключите или сведите к минимуму освещение помещения, чтобы уменьшить флуоресцентное фотоотбеливание и оптимизировать флуоресцентный сигнал. Извлеките 6-луночную пластину из инкубатора, а затем промывайте CS в течение 10 с в каждой из трех скважин, содержащих только среду. Переложите CS на небольшую весовую лодку, содержащую предварительно обработанные носители (без добавления Fura-2AM).
6. Установите CS в свежесмазанную камеру CS после осторожного протирания нижней стороны CS. Аккуратно добавьте каплю среды в CS, а затем соберите крепление электрода над CS, а затем второе CS и верхнее крепление. Используйте винты No0 для завершения сборки камеры ячейки, как описано в шагах 2.6.-2.7.
7. Подключите насосную трубку, заполненную средой, к предпусковому подогревателю, подключите предпусковой подогреватель к камере CS и поместите в каскадный адаптер, как описано в шаге 2.8. Соберите среду с помощью системы вакуумных трубок и включите систему отопления (дополнительный рисунок 2A, D-7), чтобы уравновесить камеру до 37°C, как описано в шагах 2.8.-2.9.
8. Активируйте стимулятор темпа (дополнительный рисунок 2B-13), установленный на 35-40 В и 0,2 Гц, как описано в шаге 2.10.
9. Перед записью переходного ca²⁺ включите небольшой фонарик или книжный фонарик, установленный рядом с клавиатурой компьютера, чтобы помочь увидеть клавиатуру. Кроме того, регистрируют фон флуоресценции в области без сердечных миоцитов. Для начала выберите Файл > Запустить > Создать, как описано в шаге 2.12.
10. Выберите рентабельность инвестиций и установите одну вкладку (или панель трассировки, слева) для необработанного числителя и вторую вкладку для необработанного знаменателя, определенного в верхнем центре каждой вкладки. Записывайте фон в течение 10-20 с. Щелкните правой кнопкой мыши и перетащите указатель мыши на одну панель трассировки, чтобы получить необработанные значения усредненного по сигналу числителя и знаменателя. Введите эти значения, выбрав Операции > Константы, и введите необработанные значения.
11. Подготовьте новый шаблон экрана, чтобы собрать как укорочение, так и переходные процессы Ca²⁺ . Для длины саркомера выберите Tab 1 и используйте тот же процесс, что описан в шаге 2.13. Для изображения Ca²⁺ выберите Tab 2 > Ratio (верхний центр вкладки) > Traces > Edit User Limits (Изменить пользовательские ограничения ), чтобы установить минимальный и максимальный уровни для соотношения, которые обычно устанавливаются между 1 и 5. Используйте тот же процесс для определения диапазонов числителя и знаменателя для вкладок 3 и 4 (левая сторона).
12. Поместите коробку ROI над изображением миоцитов, как описано в шаге 2.14. Выберите Файл > Новый сбор >. Теперь выберите Пуск , чтобы собрать укороченные и ратиометрические данные Ca²⁺ . Запись ≥7 сокращений на клетку для усредненного анализа сигнала.
13. Повторите запись фоновой трассировки, описанную в шаге 4.10. после записи 2-4 миоцитов. Как правило, регистрируют 4-5 миоцитов / CS или меньше миоцитов, если есть значительные изменения в фоновом чтении.

5. Анализ данных переходных процессов Ca²⁺ в изолированных миоцитах.

1. Откройте нужный файл для анализа и выберите Шаблоны > Шаблон экрана для сокращения плюс Ca²⁺ переходные процессы. Затем выберите вкладки 1 и 2 (слева), чтобы показать длину саркомера и соотношение Ca²⁺ соответственно. Выберите Операции > Константы и введите значения числителя и знаменателя из фоновой трассировки Ca²⁺ .
2. Подготовьте шаблоны анализа для сокращения плюс ca²⁺ переходные данные. Выберите вкладку 1 (левая сторона) и используйте тот же процесс, что описан в шаге 3.2. , чтобы задать шаблон анализа длины саркомера.
3. Выберите вкладку 2 (слева) и выберите Операции, Параметры монотонного анализа переходных процессов, Отметку события TTL в поле Определение t0 и следующие параметры в меню: Базовая линия (базальное отношение), Скорость вылета относительно t0 (dep v), Пик (пиковая высота и %пиковая высота/базовая линия или bl%пик h), Скорость распада относительно tPeak (ret v), Время достижения пика 50% (TTP_50%) с использованием t0 и время до базового уровня 50% (TTR_50%)) с помощью tPeak. Сохраните эти параметры анализа, выбрав Шаблоны и Сохранить шаблон анализа , используя новое имя идентификатора. Загрузите этот шаблон анализа перед анализом каждой трассировки.
4. Используйте тот же процесс, что описан в шагах 3.3.-3.6. , чтобы усреднить сигнал, а затем проанализировать длину саркомера, после чего следуют те же шаги для переходных процессов Ca²⁺ . Установите отдельные отметки для длины саркомера и для трассировки переходного соотношения Ca²⁺ .

Representative Results

Исследования сократительной функции проводятся на миоцитах крыс, начиная со дня после выделения (день 2) до 4 дней после изоляции. Хотя миоциты могут быть зарегистрированы на следующий день после выделения (т. Е. День 2), часто требуется более длительное время культивирования после переноса генов или лечения для изменения сократительной функции⁸. Для миоцитов, культивируемых в течение более 18 ч после выделения, протокол кардиостимуляции, описанный в разделе 1, помогает поддерживать Т-канальцы и последовательные результаты укорочения и повторного удлинения.

Репрезентативная часть CS, содержащая миоциты для укороченных исследований, показана на рисунке 1A вместе с соответствующим расположением миоцита до установки ROI (рисунок 1B). Как только ROI идентифицирован (рисунок 1C; розовая коробка), информация алгоритма, показанная ниже миоцита, также помогает оптимизировать позиционирование миоцитов до записи. В частности, линейная оптическая плотность (LOD; черная линия) является индикатором количества и интервала саркомеров, а резкий спектр мощности в быстрой трассе преобразования Фурье (FFT, красная линия) помогает достичь оптимального выравнивания для записи укорочения и повторного удлинения. Рисунок гратикул, используемый для калибровки длины саркомера (и обнаружения краев), показан на рисунке 1D. Типичная выровненная запись сокращения длины саркомера показана на рисунке 2A (верхняя панель) вместе с усредненным по сигналу анализом, описанным в разделе 3 (нижняя панель).

Дисфункция часто обнаруживается в миоцитах, когда есть дисфункция in vivo на животных моделях. Например, систолическая дисфункция, наблюдаемая эхокардиографией в ответ на перегрузку давлением (PO)¹³ , также обнаруживается в исследованиях укорочения миоцитов⁵. Чтобы проиллюстрировать следы данных, репрезентативные необработанные (рисунок 2; верхняя панель) и усредненные по сигналу (рисунок 2; нижняя панель) следы, полученные при 0,2 Гц, показаны для миоцитов фиктивных (рисунок 2A) и обработанных PO (рисунок 2B) крыс. Чтобы проверить, может ли функция миоцитов быть спасена после PO, вирусно-опосредованный перенос генов во время выделения миоцитов также использовался для замены эндогенного сердечного тропонина I (cTnI) фосфо-миметической заменой cTnI T144D (T144D) в саркомере¹⁶. Первоначальный анализ показывает, что ВЫЗВАННОЕ PO снижение сократительной функции (таблица 1, верхняя панель) вернулось к фиктивным уровням в миоцитах PO через 4 дня после переноса генов cTnIT144D (таблица 1; нижняя панель).

Эта платформа также может быть использована для измерения транзитиентов Ca²⁺ , наряду с укорочением в изолированных миоцитах. Укорочение и Ca²⁺ не были зарегистрированы после PO, потому что PO снижает прилипание миоцитов крыс к ламинину¹³, а сопоставимая модель, ранее показывавшая, что измененная обработка Ca²⁺ развивается в аналогичной точке^{времени 17}. Вместо этого были проведены репрезентативные эксперименты на миоцитах, загруженных Fura-2AM, выделенных у 2-3-месячных крыс. Репрезентативная запись и усредненные по сигналу следы показаны на рисунке 3 вместе с анализом данных в таблице 2. Для этого набора экспериментов миоциты, выделенные у взрослых крыс, изучали через 4 дня после аденовирусно-опосредованного переноса генов (кратность инфекции = 100) cTnIT144D или cTnI дикого типа. Как укорочение саркомера, так и транзиторы Ca²⁺ были измерены после загрузки миоцитов Fura-2AM. Перенос генов cTnIT144D усиливал пиковое укорочение и повышенные диастолические уровни Ca²⁺ по сравнению с cTnI в этих первоначальных исследованиях (таблица 2). Хотя необходим более обширный анализ, первоначальные результаты показывают, что замена in vivo cTnIT144D может привести к сложному сердечному фенотипу из-за изменений как в сократительной функции, так и в^{обработке Ca 2 +} с течением времени.

Рисунок 1: Сердечные миоциты взрослых крыс, используемые для функциональных исследований. (А) Репрезентативный изолированный сердечный миоцит от взрослой крысы (шкала бар = 50 мкм). Стрелка указывает на репрезентативный миоцит, изображенный для анализа сократительной функции. (B) Репрезентативный миоцит с ROI (розовый), расположенный сбоку (шкала = 20 мкм). (C) Репрезентативный миоцит с ROI (верхняя панель), саркомерным рисунком для этого миоцита (нижняя панель, синий; шкала = 20 мкм) и резким пиком спектра мощности (нижняя панель, красная). (D) Захват экрана 0,01 мм гратикулы для калибровки измерений укорочения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные записи из миоцитов крыс. Необработанный регистрирующий (верхняя панель) и усредненный по сигналу (нижняя панель) след, зарегистрированный при 0,2 Гц в миоцитах крыс, обработанных (A) фиктивной и (B) перегрузкой давления (PO). Миоциты были выделены через 18-20 недель после операции, причем PO продуцировали путем надпочечниковой коарктации¹³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативная регистрация и анализ длины саркомера (SL) и переходных процессов Ca²⁺ из взрослых сердечных миоцитов, нагруженных Fura-2AM. (A) Необработанные следы для SL, переходное отношение Ca^{2 +} (ratio), а также следы числителя и знаменателя, используемые для получения переходного отношения Ca^{2 +} . (B) Пример усредненных по сигналу следов для SL (верхний след) и переходного отношения Ca²⁺ (нижний след). (C) Следы анализируются на длину саркомера (SL) и переходное отношение Ca²⁺ с использованием алгоритма монотонной трассировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Крысиная группа	Шам (n=30)	ПО (n=32)
Длина саркомера покоя (мм; СЛ)	1.761 + 0.006	1.748 + 0.004
пиковая высота (% от базового уровня)	9.003 + 0.409	6.680 + 0.552*
Пиковая амплитуда (мм)	0.159 + 0.007	0.117 + 0.010*
Скорость укорочения (мм/с)	-4.674 + 0.285	-4.143 + 0.335
Скорость повторного удлинения (мм/с)	3.251 + 0.223	2.706 + 0.273
Время достижения пика (мс; ТТП)	60 + 2	59 + 3
Время до 50% повторного удлинения (мс; ТТР50%)	35 + 2	37 + 3
Крысиная группа	Шам + cTnIT144D (n=14)	PO + cTnIT144D (n=17)
Длина саркомера покоя (мм; СЛ)	1.768 + 0.009	1.776 + 0.004
пиковая высота (% от базового уровня)	9.038 + 1.339	8.414 + 0.960
Пиковая амплитуда (мм)	0.160 + 0.023	0.149 + 0.016
Скорость укорочения (мм/с)	-5.972 + 0.711	-4.173 + 0.726
Скорость повторного удлинения (мм/с)	3.925 + 0.577	3.055 + 0.403
Время достижения пика (мс; ТТП)	51 + 5	59 + 2
Время до 50% повторного удлинения (мс; ТТР50%)	31 + 3	32 + 2

Таблица 1: Сравнение сократительной функции в сердечных миоцитах в ответ на перегрузку давлением (PO) и перенос генов. Результаты укорочения миоцитов получены из фиктивных и PO-крысиных сердец через 18-20 недель после операции (верхняя панель)^5,13 и миоцитов от фиктивных и PO крыс через 4 дня после переноса генов cTnIT144D (нижняя панель). Сократительная функция измеряется через 4 дня после выделения миоцитов/переноса генов во всех группах. Результаты выражаются как среднее ± SEM (n = количество миоцитов). Каждый набор фиктивных и PO данных сравнивается t-тестом студента, при этом *p < 0,05 считается статистически значимым. Результаты пиковой амплитуды только для миоцитов sham и PO были опубликованы ранее в Ravichandran et ^al.5.

	Анализ длины саркомера
Группа переноса генов	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=16)
Длина саркомера покоя (мм; СЛ)	1.81 + 0.01	1.81 + 0.01
Пиковая амплитуда (мм)	0.11 + 0.01	0.14 + 0.02*
Скорость укорочения (мм/с)	-4.29 + 0.42	-4.67 + 0.77
Скорость повторного удлинения (мм/с)	2.92 + 0.43	3.71 + 0.64
Время достижения пика (мс; ТТП)	50 + 4	84 + 28
Время до 50% повторного удлинения (мс; ТТР50%)	37 + 4	35 + 6
	Анализ переходных процессов Ca2+
Группа переноса генов	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=19)
Коэффициент покоя Ca2+	0.89 + 0.02	1.04 + 0.04*
Пиковое соотношение Ca2+	0.50 + 0.05	0.42 + 0.07
Ca2+ Переходная скорость (d/sec)	45.24 + 5.85	40.53 + 10.95
Скорость распада Ca2+ (d/s)	-4.91 + 0.99	-2.87 + 0.57
Время достижения пика Ca2+ (мс; ТТП)	34 + 2	41 + 3
Время до 50% Ca2+ распада (мс; ТТД50%)	101 + 8	117 + 6

Таблица 2: Сократительная функция и транзиторы Ca²⁺ в миоцитах взрослых крыс через 4 дня после переноса гена cTnIT144D. Показан анализ сократительной функции (верхняя панель) и переходных процессов Ca²⁺ (нижняя панель) в миоцитах после переноса генов cTnIT144D по сравнению с cTnI дикого типа. Миоциты выделяют у 2-3-месячных взрослых крыс, а данные представлены как среднее ± SEM (n = количество миоцитов). Статистические сравнения сократительной функции (слева) и переходных процессов Ca²⁺ (справа) выполняются с использованием непарного t-теста Стьюдента со значимостью, установленной *p < 0,05.

Дополнительный рисунок 1: Компоненты системы кардиостимуляции для миоцитов, покрытых КС, покрытыми ламинином. (A) Специальная камера, содержащая платиновые электроды в каждой камере. (B) Камера для темпа с первыми четырьмя камерами, заполненными средствами массовой информации. (C) Кардиостимулятор, прикрепленный к банановым кабелям, которые соединены с камерой и (D) стимулятором. (E) Соединение между стимулятором (справа) и инкубатором 37 °C (слева). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Компоненты, необходимые для сократительной функции миоцитов и/или переходных измерений Ca²⁺. (A) Платформа контрактильной функции, показывающая каждый компонент, с пронумерованными элементами, более подробно объясненными в Таблице материалов. Компоненты платформы включают в себя антивибрационный стол (No 1), инвертированный микроскоп brightfield (No 2,3), ПЗС-камеру (No 4), ПЗС-контроллер и ксеноновый источник питания (No 5), источник света с двойным излучением (No 6), регулятор температуры (No 7), перистальтический насос (No 8), держатель изолированной трубки (No 9), перфузионную камеру с крышкой (No 10) и вакуумную систему (No 11). (B) Дополнительные компоненты включают флуоресцентный интерфейс (#12), камерный стимулятор (#13) и компьютер ПК (#14), которые более подробно описаны в Таблице материалов. Виды нумерованных элементов на панели A крупным планом показаны в C-F. (C) Вид ксенонового блока питания (слева) и ПЗС-контроллера (справа). (D) Регулятор температуры. (E) Перистальтический насос. (F) Вид основания для перфузионной камеры CS (черная стрелка), платинового электродного крепления (серая стрелка) и верхнего крепления (белая стрелка) с винтами No0 с панорамной головкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Протокол хронической кардиостимуляции, описанный в шаге 1, продлевает полезное время для изучения изолированных миоцитов и оценки влияния более длительного лечения. В нашей лаборатории были получены последовательные результаты до 4 дней после изоляции при измерении сократительной функции с использованием длины саркомера на хронически развивающихся миоцитах. Тем не менее, сократительная функция миоцитов быстро ухудшается при использовании сред старше 1 недели для ускорения миоцитов.

Для исследований сократительной функции данные собираются при 37 °C, что близко к температуре тела крыс. Чтобы оптимизировать жизнеспособность миоцитов и получить последовательные следы для каждого миоцита, эти эксперименты проводятся с частотой темпа ниже, чем физиологическая частота сердечных сокращений ~ 5 Гц у крыс. Эти настройки дают согласованные данные о сократительной функции, но температура камеры и / или частота темпа могут быть отрегулированы, если следы укорочения остаются последовательными на нескольких КС, содержащих одну и ту же группу лечения миоцитов. Кроме того, оптимальные результаты получаются при выборе миоцитов, у которых отсутствуют блебы, которые полностью прилипают к КС и сокращаются на обоих концах палочковидной клетки. Клетки, прикрепленные только на одном конце, клетки с несколькими блебами и / или миоциты, сжимающиеся только на одном конце, нежелательны и часто их труднее записывать из-за фонового движения. Для этих исследований саркомеры ≥20 включены в ROI для достижения резкого пика спектра мощности, воспроизводимых длин саркомера покоя и оптимального соотношения сигнал/шум для укорочения следа. Рентабельность инвестиций с семью саркомерами может быть использована, если пик спектра мощности остается резким. Длина саркомера покоя у изолированных миоцитов крыс обычно колеблется в пределах 2,00-1,80 мкм. Если длина саркомера в состоянии покоя составляет менее 1,5 мкм, активное сокращение нереально на основе нашего понимания архитектуры саркомера¹⁸ и обычно является результатом неоптимальной ориентации миоцитов.

Измерение сократительной функции с или без измерений переходных процессов Ca²⁺ в интактных миоцитах является подходом с более высокой пропускной способностью, требующим меньших инвестиций в разработку технических знаний, необходимых для измерения силы в неповрежденных одиночных клетках¹¹. Исследования интактных миоцитов также сосредоточены исключительно на функции миоцитов, без вклада других типов клеток в мультиклеточные препараты². Новой областью в этой области является разработка анализа с более высокой пропускной способностью путем одновременного измерения укорочения и / или переходных процессов Ca^{2 +} в нескольких интактных миоцитах для ускорения скрининга терапевтических агентов на клеточном уровне до более обширного анализа in vivo .

Сократительная функция и преходящие измерения Ca²⁺ также возможны в интактных миоцитах, выделенных из других моделей грызунов, таких как мыши, хотя есть некоторые важные соображения и различия по сравнению с миоцитами крыс. Мышиные миоциты жизнеспособны в культуре в течение 24-36 ч, но жизнеспособность постепенно снижается в миоцитах, культивируемых более 48 ч¹⁹. Этот усеченный интервал культуры следует учитывать при использовании векторного переноса генов, особенно для белков миофиламента, которые имеют период полураспада в днях, а не в^{часах 20}. В отличие от крысиных миоцитов, успешное выделение и культивирование мышиных миоцитов также зависят от добавления ингибиторов миозина АТФазы, таких как моноксим 2,3-бутандиона или блеббистатин, к культуральной среде¹⁹. В результате хроническая стимуляция не является жизнеспособным вариантом в культурах миоцитов мышей. Более длительное время уравновешивания 15-20 мин также необходимо для устранения функционального воздействия этих ингибиторов миозина на изолированные мышиные миоциты. Наконец, мышиные миоциты оптимально оцениваются при 0,5 Гц для получения воспроизводимых следов укорочения по сравнению с 0,2 Гц, используемыми для миоцитов крыс.

В исследованиях на крысах, получавших PO, сократительная дисфункция последовательно обнаруживается при низкочастотном темпе в миоцитах крыс. Более частотно-зависимое снижение укорочения также обнаруживается в миоцитах после ПО по сравнению с фиктивными крысами при наличии in vivo сократительной дисфункции ^5,13. Во время исследования с использованием диапазона частот удвоение скорости насоса для обеспечения адекватной среды производило стационарное укорочение в течение 15-20 с после изменения частоты стимуляции между 0,2 и 2 Гц. Миоциты крыс также реагируют на кратковременную стимуляцию на более высоких частотах до 8 Гц, хотя жизнеспособность клеток быстро ухудшается на этих более высоких частотах. В целом, сократительная функция миоцитов оказалась воспроизводимым подходом для подтверждения или подтверждения in vivo сердечной дисфункции в моделях крыс, таких как PO- по сравнению с крысами, получавшими фиктивное лечение (таблица 1; см. Kim et al.13). Кроме того, эта платформа может проверить, восстанавливает ли лечение, нацеленное на миоциты, или ухудшает сократительную функцию, прежде чем использовать более дорогие и / или трудоемкие подходы in vivo. При использовании этого подхода возможны как острая доставка, так и более длительное воздействие терапевтических агентов и/или после доставки генов во время первичной культуры. Например, эксперименты по переносу генов для замены эндогенного cTnI на cTnIT144D не указывают на существенное изменение амплитуды укорочения миоцитов у фиктивных крыс. Напротив, cTnIT144D восстанавливает пиковую амплитуду укорочения в сторону фиктивных значений в миоцитах у крыс, получавших PO (таблица 1). Неотъемлемой слабостью такого подхода является отсутствие типичной нагрузки, присутствующей в миоцитах в условиях in vivo. В результате ответы могут отличаться от зависящих от нагрузки функциональных реакций, и пример эксперимента показывает, что для дальнейшего изучения того, улучшает ли cTnIT144D работу сердца во время PO, необходимы подходы in vivo.

Измерение как укорочения, так и переходных процессов Ca²⁺ в одном и том же миоците является преимуществом этой платформы. Например, направление изменения может отличаться для переходных процессов Ca²⁺ по сравнению с сократительной функцией. Как показано в таблице 2, пиковое укорочение значительно увеличивается после переноса гена cTnIT144D в миоциты у 2-3-месячных крыс. Этот исход отличается от данных, полученных в более старых, фиктивных миоцитах (таблица 1) и может быть связан с возрастом крыс^{5 лет}. Однако для доказательства этой интерпретации необходимо дальнейшее тестирование. Данные в таблице 2 также показывают, что cTnIT144D не изменяет пиковую амплитуду Ca²⁺ и вместо этого имеет тенденцию замедлять скорость распада Ca²⁺ и повышать уровень покоя Ca²⁺. Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия cTnIT144D усиливает сократительную функцию, в то время как велосипедные механизмы Ca²⁺ компенсируют, чтобы ослабить этот эффект. Эти результаты подчеркивают способность этого подхода различать изменения в сократительной функции и цикличность Ca²⁺ . Хотя конкретные результаты, представленные здесь, еще не являются окончательными, они обеспечивают убедительное обоснование для разработки генетической модели животного для экспрессии миокарда cTnIT144D и оценки того, притупляет ли его экспрессия дисфункцию, вызванную PO в будущем. Последнее наблюдение из переходных данных Ca²⁺ заключается в том, что флуоресцентные красители, такие как Fura-2AM, изменяют кинетику сократительной функции в миоцитах²¹. Хотя относительный ответ, полученный при данном лечении или животной модели, сопоставим в миоцитах, нагруженных Fura-2, эти результаты не следует сочетать с измерениями сокращения, сделанными в отсутствие Fura-2AM. Чтобы оптимизировать использование Fura-2AM для переходного анализа Ca²⁺ , лаборатория чаще всего измеряет укорочение в отсутствие Fura-2AM и выполняет подмножество экспериментов по измерению переходных процессов Ca²⁺ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11