Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca2+ nei miociti dei roditori
Summary
Viene presentata una serie di protocolli che descrivono la misurazione della funzione contrattile tramite il rilevamento della lunghezza del sarcomero insieme alla misurazione transitoria del calcio (Ca2+) nei miociti isolati di ratto. È inclusa anche l’applicazione di questo approccio per studi su modelli animali di insufficienza cardiaca.
Abstract
La disfunzione contrattile e i transitori di Ca2+ sono spesso analizzati a livello cellulare come parte di una valutazione completa della lesione indotta da cuore e / o del rimodellamento. Un approccio per valutare queste alterazioni funzionali utilizza l’accorciamento a vuoto e le analisi transitorie di Ca2+ nei miociti cardiaci primari adulti. Per questo approccio, i miociti adulti vengono isolati dalla digestione della collagenasi, resi tolleranti al Ca2+ e quindi aderenti a vetrini di copertura rivestiti di laminina, seguiti da stimolazione elettrica in mezzi privi di siero. Il protocollo generale utilizza miociti cardiaci di ratto adulto, ma può essere facilmente adattato per miociti primari di altre specie. Le alterazioni funzionali nei miociti da cuori feriti possono essere paragonate a miociti fittizi e/o a trattamenti terapeutici in vitro . La metodologia include gli elementi essenziali necessari per la stimolazione dei miociti, insieme alla camera cellulare e ai componenti della piattaforma. Il protocollo dettagliato per questo approccio incorpora le fasi per misurare l’accorciamento a vuoto mediante rilevamento della lunghezza del sarcomero e transitori cellulari Ca2+ misurati con l’indicatore raziometrico Fura-2 AM, nonché per l’analisi dei dati grezzi.
Introduction
L’analisi della funzione della pompa cardiaca richiede spesso una serie di approcci per ottenere una visione adeguata, in particolare per i modelli animali di insufficienza cardiaca (HF). L’ecocardiografia o le misurazioni emodinamiche forniscono informazioni sulla disfunzione cardiaca in vivo 1, mentre gli approcci in vitro sono spesso impiegati per identificare se la disfunzione deriva da cambiamenti nel miofilamento e / o nel transitorio Ca2+ responsabile dell’eccitazione dell’accoppiamento, o del potenziale d’azione, con la funzione contrattile (ad esempio, accoppiamento eccitazione-contrazione [E-C]). Gli approcci in vitro offrono anche l’opportunità di esaminare la risposta funzionale ai neuroormoni, alle alterazioni genetiche indotte da vettori e ai potenziali agenti terapeutici2 prima di perseguire strategie di trattamento in vivo costose e/o laboriose.
Sono disponibili diversi approcci per studiare la funzione contrattile in vitro, comprese le misurazioni della forza nelle trabecole intatte3 o nei miociti permeabilizzati4, nonché l’accorciamento a vuoto e i transitori di Ca2+ in miociti intatti in presenza e assenza di HF 5,6. Ciascuno di questi approcci si concentra sulla funzione contrattile dei miociti cardiaci, che è direttamente responsabile della funzione della pompa cardiaca 2,7. Tuttavia, l’analisi sia della contrazione che dell’accoppiamento E-C insieme viene spesso eseguita misurando l’accorciamento della lunghezza muscolare e dei transitori di Ca 2+ in miociti adulti isolati e tolleranti a Ca2+. Il laboratorio utilizza un protocollo dettagliato pubblicato per isolare i miociti dai cuori di ratto per questa fase8.
Sia il Ca2+ transitorio che i miofilamenti contribuiscono ad accorciare e riallungare i miociti intatti e possono contribuire alla disfunzione contrattile 2,7. Pertanto, questo approccio è raccomandato quando l’analisi funzionale in vitro richiede un miocita intatto contenente il meccanismo ciclico Ca2+ più i miofilamenti. Ad esempio, miociti isolati intatti sono desiderabili per studiare la funzione contrattile dopo aver modificato il miofilamento o la funzione ciclica di Ca2+ tramite trasferimento genico9. Inoltre, viene suggerito un approccio miocitario intatto per analizzare l’impatto funzionale dei neuroormoni quando si studia l’impatto delle vie di segnalazione del secondo messaggero a valle e/o della risposta agli agenti terapeutici2. Una misura alternativa della forza dipendente dal carico nei singoli miociti viene spesso eseguita dopo la permeabilizzazione della membrana (o scuoiatura) a basse temperature (≤15 °C) per rimuovere il contributo transitorio di Ca2+ e concentrarsi sulla funzione del miofilamento10. La misurazione della forza dipendente dal carico più transitori Ca2+ nei miociti intatti è rara a causa in gran parte della sfida complessa e tecnica dell’approccio11, specialmente quando è necessaria una maggiore produttività, come per misurare le risposte alla segnalazione neuroormonale o come schermo per agenti terapeutici. L’analisi delle trabecole cardiache supera queste sfide tecniche, ma può anche essere influenzata da non-miociti, fibrosi e/o rimodellamento della matrice extracellulare2. Ciascuno degli approcci sopra descritti richiede una preparazione contenente miociti adulti perché i miociti neonatali e i miociti derivati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC) non esprimono ancora l’intero complemento delle proteine del miofilamento adulto e di solito mancano del livello di organizzazione del miofilamento presente nel miocita adulto a forma di bastoncello2. Ad oggi, l’evidenza nelle iPSC indica che la transizione completa alle isoforme adulte supera più di 134 giorni nella coltura12.
Dato il focus di questa raccolta sull’HF, i protocolli includono approcci e analisi per differenziare la funzione contrattile nei miociti intatti in fallimento rispetto a quelli non falliti. Esempi rappresentativi sono forniti da miociti di ratto studiati 18-20 settimane dopo una coartazione surrenale, descritta in precedenza 5,13. Vengono quindi effettuati confronti con miociti di ratti trattati con finzione.
Il protocollo e la piattaforma di imaging qui descritti sono utilizzati per analizzare e monitorare i cambiamenti nell’accorciamento e nei transitori Ca2+ nei miociti cardiaci a forma di bastoncello durante lo sviluppo di HF. Per questa analisi, 2 x 10 miociti tolleranti a forma di bastoncellotolleranti a 4 Ca 2+ sono placcati su vetrini (CS) rivestiti di laminina da22 mm e coltivati durante la notte, come descritto in precedenza8. I componenti assemblati per questa piattaforma di imaging, insieme ai supporti e ai buffer utilizzati per l’imaging ottimale, sono forniti nella tabella dei materiali. Qui viene fornita anche una guida per l’analisi dei dati utilizzando un software e i risultati rappresentativi. Il protocollo generale è suddiviso in sottosezioni separate, con le prime tre sezioni incentrate sui miociti isolati di ratto e sull’analisi dei dati, seguite da esperimenti transitori cellulari di Ca2+ e analisi dei dati nei miociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di stimolazione cronica delineato nella fase 1 estende il tempo utile per studiare miociti isolati e valutare l’impatto di trattamenti più lunghi. Nel nostro laboratorio, sono stati ottenuti risultati coerenti fino a 4 giorni dopo l’isolamento durante la misurazione della funzione contrattile utilizzando la lunghezza del sarcomero su miociti cronicamente stimolati. Tuttavia, la funzione contrattile dei miociti si deteriora rapidamente quando si utilizzano mezzi più vecchi di 1 settimana per accelerare i m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione R01 HL144777 (MVW) del National Institutes of Health (NIH).
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
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