Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca²⁺ en miocitos de roedores

Summary

Se presenta un conjunto de protocolos que describen la medición de la función contráctil a través de la detección de la longitud del sarcómero junto con la medición transitoria de calcio (Ca²⁺) en miocitos aislados de rata. También se incluye la aplicación de este enfoque para estudios en modelos animales de insuficiencia cardíaca.

Abstract

La disfunción contráctil y los transitorios de Ca²⁺ a menudo se analizan a nivel celular como parte de una evaluación integral de la lesión y / o remodelación inducida por el corazón. Un enfoque para evaluar estas alteraciones funcionales utiliza el acortamiento descargado y los análisis transitorios de Ca²⁺ en miocitos cardíacos adultos primarios. Para este enfoque, los miocitos adultos se aíslan mediante digestión de colagenasa, se hacen tolerantes al Ca²⁺ y luego se adhieren a cubreobjetos recubiertos de laminina, seguidos de estimulación eléctrica en medios sin suero. El protocolo general utiliza miocitos cardíacos de rata adulta, pero se puede ajustar fácilmente para miocitos primarios de otras especies. Las alteraciones funcionales en los miocitos de los corazones lesionados se pueden comparar con los miocitos simulados y/o con los tratamientos terapéuticos in vitro . La metodología incluye los elementos esenciales necesarios para la estimulación de los miocitos, junto con la cámara celular y los componentes de la plataforma. El protocolo detallado para este enfoque incorpora los pasos para medir el acortamiento descargado mediante la detección de longitud del sarcómero y los transitorios celulares de Ca²⁺ medidos con el indicador ratiométrico Fura-2 AM, así como para el análisis de datos sin procesar.

Introduction

El análisis de la función de la bomba cardíaca a menudo requiere una variedad de enfoques para obtener una visión adecuada, especialmente para modelos animales de insuficiencia cardíaca (IC). La ecocardiografía o las mediciones hemodinámicas proporcionan información sobre la disfunción cardíaca in vivo ¹, mientras que los enfoques in vitro a menudo se emplean para identificar si la disfunción surge de cambios en el miofilamento y / o el transitorio Ca²⁺ responsable de acoplar la excitación, o el potencial de acción, con la función contráctil (por ejemplo, acoplamiento excitación-contracción [E-C]). Los enfoques in vitro también brindan la oportunidad de detectar la respuesta funcional a las neurohormonas, las alteraciones genéticas inducidas por vectores, así como los posibles agentes terapéuticos² antes de seguir estrategias de tratamiento in vivo costosas y / o laboriosas.

Existen varios enfoques para investigar la función contráctil in vitro, incluyendo mediciones de fuerza en trabéculas^{intactas 3} o miocitos permeabilizados⁴, así como acortamiento descargado y transitorios de Ca²⁺ en miocitos intactos en presencia y ausencia de HF ^5,6. Cada uno de estos abordajes se centra en la función contráctil de los miocitos cardíacos, que es directamente responsable de la función de la bomba cardíaca ^2,7. Sin embargo, el análisis de la contracción y el acoplamiento E-C se realiza con mayor frecuencia midiendo el acortamiento de la longitud muscular y los transitorios de Ca 2+ en miocitos adultos aislados tolerantes a Ca²⁺. El laboratorio utiliza un protocolo detallado publicado para aislar miocitos de corazones de ratas para este paso⁸.

Tanto el transitorio Ca²⁺ como los miofilamentos contribuyen al acortamiento y re-alargamiento en los miocitos intactos y pueden contribuir a la disfunción contráctil ^2,7. Por lo tanto, este enfoque se recomienda cuando el análisis funcional in vitro requiere un miocito intacto que contenga la maquinaria ciclista Ca²⁺ más los miofilamentos. Por ejemplo, los miocitos aislados intactos son deseables para estudiar la función contráctil después de modificar la función cíclica del miofilamento o Ca²⁺ a través de la transferencia de genes⁹. Además, se sugiere un enfoque de miocitos intactos para analizar el impacto funcional de las neurohormonas cuando se estudia el impacto de las vías de señalización del segundo mensajero aguas abajo y / o la respuesta a los agentes terapéuticos². Una medición alternativa de la fuerza dependiente de la carga en miocitos individuales se realiza con mayor frecuencia después de la permeabilización de la membrana (o despellejamiento) a bajas temperaturas (≤15 ° C) para eliminar la contribución transitoria de Ca²⁺ y centrarse en la función del miofilamento¹⁰. La medición de la fuerza dependiente de la carga más los transitorios de Ca²⁺ en miocitos intactos es rara debido en gran parte al desafío complejo y técnico del enfoque¹¹, especialmente cuando se necesita un mayor rendimiento, como para medir las respuestas a la señalización de neurohormonas o como pantalla para agentes terapéuticos. El análisis de las trabéculas cardíacas supera estos desafíos técnicos, pero también puede estar influenciado por no miocitos, fibrosis y/o remodelación de la matriz extracelular². Cada uno de los enfoques descritos anteriormente requiere una preparación que contenga miocitos adultos porque los miocitos neonatales y los miocitos derivados de células madre pluripotentes inducibles (iPSC) aún no expresan el complemento completo de proteínas de miofilamentos adultos y generalmente carecen del nivel de organización de miofilamentos presente en el^{miocito 2} en forma de bastón adulto. Hasta la fecha, la evidencia en iPSCs indica que la transición completa a isoformas adultas excede más de 134 días en cultivo¹².

Dado el enfoque de esta colección en la IC, los protocolos incluyen enfoques y análisis para diferenciar la función contráctil en miocitos intactos fallidos versus no defectuosos. Se proporcionan ejemplos representativos de miocitos de rata estudiados 18-20 semanas después de una coartación suprarrenal, descrita anteriormente ^5,13. Luego se hacen comparaciones con miocitos de ratas tratadas con simulacro.

El protocolo y la plataforma de imágenes descritos aquí se utilizan para analizar y monitorear los cambios en el acortamiento y los transitorios de Ca²⁺ en los miocitos cardíacos en forma de bastón durante el desarrollo de IC. Para este análisis, 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerantes, miocitos en forma de bastoncillos se colocan en cubreobjetos de vidrio recubiertos de laminina (CS) de²² mm² y se cultivan durante la noche, como se describió anteriormente⁸. Los componentes ensamblados para esta plataforma de imágenes, junto con los medios y búferes utilizados para una imagen óptima, se proporcionan en la Tabla de materiales. Aquí también se proporciona una guía para el análisis de datos utilizando un software y los resultados representativos. El protocolo general se divide en subsecciones separadas, con las tres primeras secciones centradas en miocitos de rata aislados y análisis de datos, seguidas de experimentos transitorios celulares de Ca²⁺ y análisis de datos en miocitos.

Protocol

Los estudios realizados en roedores siguieron la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Para este estudio, se aislaron miocitos de ratas Sprague-Dawley y F344BN de 3-34 meses de edad con un peso ≥ de 200 g⁵. Se utilizaron tasas masculinas y femeninas.

1. Estimulación de miocitos para estudios de función contráctil

1. Haga medios frescos basados en M199 para cada conjunto de miocitos aislados (Tabla de materiales). 1 día antes de la estimulación, placa 2 x 10⁴ Miocitos tolerantes a Ca 2+, en forma de bastoncillos en cubredos de vidrio (CS) recubiertos de laminina de²² mm² , como se describió anteriormente⁸.
2. Para preparar las cámaras, remoje cada cámara en lejía al 10% durante 1 h. Luego, enjuague las cámaras con agua corriente del grifo durante 30-45 minutos, seguido de agua destilada reemplazada cada 5 minutos durante 30 minutos, seguida de agua desionizada reemplazada cada 5 minutos durante 30 minutos, y un enjuague final en agua desionizada.
3. Seque las cámaras sobre una superficie limpia durante 20-30 min (Figura suplementaria 1A-C). A continuación, trate las cámaras UV en un gabinete de bioseguridad durante 5 minutos en cada dirección (total = 20 min). Este paso no es necesario para cámaras preesterilizadas.
   PRECAUCIÓN: Abandone el área para minimizar la exposición a los rayos UV.
4. Retire la cubierta de la cámara, agregue 3 ml de medios a base de M199 (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo (Figura suplementaria 1B), reemplace la cubierta y precaliente la cámara en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 y 20% de_O2.
5. Esterilizar las pinzas en un esterilizador de perlas calientes a 250 °C durante 20-25 s. Transfiera la cámara de estimulación precalentada de la incubadora a un gabinete de bioseguridad.
6. Transfiera cada cubreobjetos (CS) que contiene miocitos cardíacos a pocillos individuales en la cámara de estimulación utilizando fórceps estériles. Transfiera los CS de cuatro en cuatro, seguidos de calentamiento durante 10 minutos antes de la transferencia de los cuatro CS restantes para mantener la temperatura del medio.
7. Conecte los gatos de plátano a la cámara de estimulación en un extremo (Figura suplementaria 1C) y al estimulador en el otro extremo (Figura suplementaria 1D).
8. Ajuste la frecuencia del estimulador a 0.2 Hz y ajuste el voltaje (~ 12 V) para lograr la contracción en ~ 10% -20% de todos los miocitos cardíacos en forma de bastón dentro de un pozo. Para determinar el número de miocitos que se contraen, coloque la cámara bajo un microscopio invertido con un aumento de 4x a 10x.
9. Colocar la cámara de estimulación en una incubadora a 37 °C en_CO2 al 5% (Figura suplementaria 1E). Cambiar los medios cada 12 h utilizando medios precalentados en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 20-25 min. Continúe la estimulación eléctrica durante un máximo de 3 días con el medio cambiado cada 12 h.

2. Análisis de la función contráctil de miocitos cardíacos de ratas adultas

1. Precaliente un paquete de gel y un medio en una incubadora a 37 °C durante 30 minutos antes del experimento.
2. Encienda los componentes de la plataforma de función contráctil enumerados en la Tabla de materiales y que se muestran en la Figura suplementaria 2, con especial atención a los componentes clave, que incluyen una tabla antivibración (Figura suplementaria 2A-1) con un microscopio invertido con un filtro rojo intenso (590 nm) (Figura suplementaria 2A-2,3) y una cámara CCD (Figura suplementaria 2A-4) conectada a un controlador CCD (Figura complementaria 2A-5 y Figura suplementaria 2C-5) e integrado con una computadora PC (Figura suplementaria 2B-14).
3. Montar el tubo en la bomba peristáltica (Figura suplementaria 2A-8; Figura suplementaria 2A-8), transfiera el paquete de gel precalentado al soporte del tubo (Figura suplementaria 2A-9) y encienda el vacío (Figura suplementaria 2A-11) y encienda el estimulador celular (Figura suplementaria 2B-13).
4. Coloque un tubo de 50 ml con medios en el soporte del tubo aislado (Figura suplementaria 2A-9) y comience la perfusión a ~0.5 ml / min a través del tubo de la bomba peristáltica (Figura suplementaria 2E-8).
5. Agregue una pequeña cantidad de medios precalentados a un bote de pesaje pequeño (~ 2 ml). Transfiera un CS que contenga miocitos de la cámara de estimulación al barco de pesaje. Devolver la cámara de estimulación a 37 °C en la incubadora de_CO2 al 5%.
6. Retire el CS del bote de pesaje y limpie suavemente la parte inferior. Transfiera el CS a una cámara CS recién engrasada (Figura suplementaria 2A, F-10; flecha negra) y agregue suavemente una gota de medio (~ 200 μL) al CS.
7. Coloque un soporte de electrodo de platino sobre el CS (Figura suplementaria 2F; flecha gris) y coloque un nuevo CS sobre la parte superior usando pinzas. Coloque un soporte superior (Figura suplementaria 2F; flecha blanca) sobre el sándwich CS y luego instale dos o cuatro tornillos de cabeza de bandeja #0 para terminar de ensamblar la cámara.
8. Una vez que el medio esté presente en todo el tubo de la bomba, conecte el tubo al precalentador y luego conecte el precalentador a la cámara CS ensamblada en el paso 2.7. Comience la perfusión a 0,5 ml/min y coloque una toallita de pañuelos debajo de la cámara para asegurarse de que no haya fugas.
9. Coloque la cámara CS en el adaptador de escenario. Los medios perfundidos se recogen en el extremo opuesto de la cámara con tubos conectados a un sistema de vacío. Encienda el sistema de calefacción (Figura suplementaria 2A, D-7) y equilibre la cámara, el objetivo y el precalentador durante ~ 5-10 min para lograr una temperatura constante del medio de 37 ° C. Visualice los miocitos con el objetivo de inmersión en agua 40x en el microscopio durante este tiempo de equilibrio.
10. Active el estimulador de estimulación (Figura suplementaria 2B-13) ajustando el voltaje a 1.5x el ajuste necesario para que el 80% de las células en forma de varilla se contraigan, que generalmente es de 35-40 V. Establezca la frecuencia de estimulación en 0.2 Hz para optimizar la función contráctil y la supervivencia de los miocitos.
11. Recolectar trazas de acortamiento y realargamiento contráctil de miocitos perfundidos y con ritmo continuo. Para recopilar mediciones de acortamiento, utilice una cámara CCD (Figura suplementaria 2A-4) conectada a un controlador CCD (Figura suplementaria 2B-5,C) y una computadora dedicada con una placa controladora de E/S (Figura suplementaria 2B-14; consulte la Tabla de materiales). La plataforma mide el acortamiento del sarcómero en miocitos de rata, aunque se obtienen resultados similares a partir de mediciones de miocitos recogidas de los bordes longitudinales de los miocitos (ver Ecklerle et ^al.14).
12. Para recopilar rastros de acortamiento de sarcómero, abra el software en el equipo, seleccione Aceptar y, a continuación, Archivo > Nuevo. Prepare una plantilla de pantalla seleccionando Trazas > Editar límites de usuario > longitud del sarcómero y, a continuación, establezca valores máximos y mínimos, que suelen estar entre 2,0 μm y 1,5 μm. Calibrar la cámara CCD con una retícula de 0,01 mm antes de realizar mediciones en los miocitos (Figura 1D).
13. Para registrar las trazas de longitud del sarcómero, seleccione Archivo > Nuevo. Identifique un miocito que se contrae y colóquelo a lo largo del eje longitudinal de la cámara de modo que el patrón de estriación sea vertical (Figura 1B).
14. Use el mouse de la computadora para colocar el cuadro de región de interés (ROI) (cuadro rosa) sobre el miocito (Figura 1C). Seleccione Recopilar y comenzar para registrar la función contráctil. Registrar el acortamiento durante 60 s de cada miocito a bajas frecuencias de estimulación (≤0,5 Hz).
15. Registre el acortamiento del sarcómero de 5 a 10 células por CS. Realice mediciones a 1 célula/CS si los estudios incluyen tratamiento con agonistas/antagonistas. Prepare un medio precalentado separado y una pieza diferente y dedicada de tubo de perfusión cargada en una bomba peristáltica multicanal y siga los pasos 2.9.-2.14. Medir el impacto de la administración de fármacos o neurohormonas sobre la función contráctil de los miocitos.
16. Para medir el acortamiento en un rango de frecuencias, mantenga el ritmo de los miocitos en cada frecuencia para obtener un acortamiento en estado estacionario antes de registrar⁵. Para estos estudios, duplique la tasa de perfusión y comience a registrar 15-20 s después de la estimulación a una nueva frecuencia para obtener respuestas contráctiles consistentes en estado estacionario para frecuencias en el rango de 0.2 Hz y 2 Hz. Por lo general, registre no más de 2 miocitos / CS para acortar en el rango dado de frecuencias de estimulación.
17. Registre al menos 7 contracciones/celda para obtener datos confiables promediados de señal al analizar las grabaciones (consulte el paso 3).

3. Análisis de datos de función contráctil en miocitos aislados

1. Para comenzar, seleccione Archivo, elija un seguimiento grabado y, a continuación, seleccione Abrir. Seleccione la pestaña 1 (lado izquierdo) de la traza base y, a continuación, establezca el panel amarillo en la parte superior de la traza en Sarc-Length. Seleccione Trazas y la plantilla de pantalla preparada en el paso 2.12.
2. Para preparar una plantilla de análisis, seleccione Operaciones, Opciones de análisis transitorio monotónico, Marca de evento TTL en el cuadro Definición de t0, así como las siguientes opciones del menú: Línea base (longitud del sarcómero en reposo), Velocidad de salida relativa a t0 (dep v), Pico (altura máxima y %altura pico/línea de base o bl%pico h), Velocidad de retorno relativa a tPeak (ret v), Tiempo hasta el pico 50% (TTP 50%) usando t0, y Tiempo hasta la línea de base 50% (TTR_50%) usando tPeak. Guarde estas opciones de análisis seleccionando Plantillas > Guardar plantilla de análisis con un identificador. Cargue esta plantilla de análisis antes de analizar cada seguimiento.
3. Para comenzar el análisis de datos, seleccione Marcas > puerta > Agregar > transitorio Convertir de marca de evento > Rango de análisis. Ahora establezca el rango de tiempo de -0.01 s a 1.20 s para los miocitos con ritmo de 0.2 Hz (Figura 2A, marcas rojas en la parte inferior de la traza cruda). Seleccione un rango de tiempo más corto para los miocitos estimulados a frecuencias más altas.
4. Genere un seguimiento promediado de señal seleccionando Operaciones > Eventos promedio. Aparece una grabación promediada por señal debajo de la traza base original.
5. Seleccione la pestaña 1 del seguimiento promediado de la señal (lado izquierdo de la pantalla) y, a continuación, seleccione Marcas en el menú superior, seguido de Agregar transitorio. Seleccione Operaciones en el menú superior y Análisis de transitorios monotónicos para mostrar los valores promediados de señal para la longitud del sarcómero de referencia, la altura del pico, bl%pico h, dep v, ret v, TTP 50% y TTR_50% en el panel de visualización promediado de señal.
6. Transfiera cada análisis transitorio de sarcómero a una hoja de cálculo para el análisis compuesto de múltiples miocitos seleccionando Exportar > análisis transitorio monotónico > Corriente del portapapeles. Pegue estos datos en la hoja de cálculo para cada seguimiento.
7. Para copiar el seguimiento promediado de señal, seleccione Exportar > Seguimiento actual > Opciones de > del portapapeles y establezca los decimales en 5, luego seleccione Delimitador de pestañas y haga clic en Aceptar y Aceptar. Pegue las trazas promediadas por señal para cada registro de miocitos en una segunda hoja de cálculo.

4. Registro de transitorios de Ca²⁺ en miocitos cardíacos adultos de rata

1. Antes de medir los transitorios de Ca 2+, encienda los componentes de la plataforma descritos en el paso 2.2., junto con los componentes adicionales de imágenes de fluorescencia (consulte los componentes adicionales para el análisis de imágenes de Ca²⁺ en la Tabla de materiales; Figura complementaria 2A-5,6; 2B-12).
2. Preparar la solución madre de Fura-2AM que contenga 1 mM de Fura-2AM más 0,5 M de probenecid en dimetilsulfóxido (DMSO). Probenecid minimiza la fuga de Fura-2AM¹⁵.
3. Diluir la solución madre a 5 μM de Fura-2AM y 2,5 mM de probenecid en 2,5 ml de medio (ver Tabla de materiales) en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Agregue 2.5 ml de medios solos (sin Fura-2AM) a tres pocillos adicionales en la placa, cubra la placa con papel de aluminio y precaliente el medio a 37 ° C.
4. Transfiera un CS que contenga miocitos de la cámara de estimulación al pocillo que contiene Fura-2AM, cubra y devuelva la placa a la incubadora de 37 °C con 5% de_CO2 durante 4 min. Monte el tubo en la bomba de perfusión y perfunda con medios durante el período de carga Fura-2AM, como se describe en el paso 2.4.
5. Apague o minimice las luces de la habitación para reducir el fotoblanqueo de fluorescencia y optimizar la señal de fluorescencia. Retire la placa de 6 pocillos de la incubadora y luego lave el CS durante 10 s en cada uno de los tres pocillos que contienen medios solos. Transfiera el CS a un bote de pesaje pequeño que contenga medios precalentados (sin Fura-2AM añadido).
6. Monte el CS en la cámara CS recién engrasada después de limpiar suavemente la parte inferior del CS. Agregue suavemente una gota de medio al CS y luego ensamble el soporte del electrodo sobre el CS, seguido de un segundo CS y el soporte superior. Utilice tornillos de cabeza de bandeja #0 para terminar de ensamblar la cámara celular, como se describe en los pasos 2.6.-2.7.
7. Conecte el tubo de la bomba lleno de medios al precalentador, conecte el precalentador a la cámara CS y colóquelo en un adaptador de etapa, como se describe en el paso 2.8. Recoja el medio con el sistema de tubos de vacío y encienda el sistema de calefacción (Figura suplementaria 2A, D-7) para equilibrar la cámara a 37 °C, como se describe en los pasos 2.8.-2.9.
8. Active el estimulador de estimulación (Figura suplementaria 2B-13) ajustado a 35-40 V y 0,2 Hz, como se describe en el paso 2.10.
9. Antes de grabar un transitorio Ca²⁺ , encienda una pequeña linterna o una luz de libro montada cerca del teclado de la computadora para ayudar a ver el teclado. Además, registre el fondo de fluorescencia en un área sin miocitos cardíacos. Para comenzar, seleccione Archivo > Iniciar > nuevo, como se describe en el paso 2.12.
10. Seleccione un ROI y establezca una pestaña (o barra de seguimiento, lado izquierdo) para el numerador sin procesar y una segunda pestaña para el denominador sin procesar, definida en la parte superior central de cada pestaña. Grabe el fondo durante 10-20 s. Haga clic con el botón derecho del ratón y arrastre sobre un panel de barra de seguimiento para obtener los valores de numerador y denominador promediados de señal sin procesar. Introduzca estos valores seleccionando las constantes Operaciones > E introduzca los valores sin procesar.
11. Prepare una nueva plantilla de pantalla para recopilar tanto el acortamiento como los transitorios Ca²⁺ . Para la longitud del sarcómero, seleccione Tab 1 y utilice el mismo proceso que se describe en el paso 2.13. Para imágenes de Ca²⁺ , seleccione Relación > de la pestaña 2 (centro superior de la pestaña) > Seguimientos > Editar límites de usuario para establecer los niveles mínimo y máximo para la proporción, que normalmente se establecen entre 1 y 5. Utilice el mismo proceso para definir los rangos de numerador y denominador para las pestañas 3 y 4 (lado izquierdo).
12. Coloque un cuadro de ROI sobre una imagen de miocitos, como se describe en el paso 2.14. Seleccione Archivo > Nueva > recopilar. Ahora seleccione Iniciar para recopilar datos de acortamiento y ratiométricos Ca²⁺ . Registre ≥7 contracciones / celda para el análisis promediado de señales.
13. Repita la grabación de seguimiento en segundo plano descrita en el paso 4.10. después de registrar 2-4 miocitos. Por lo general, registre 4-5 miocitos / CS o menos miocitos si hay cambios significativos en la lectura de fondo.

5. Análisis de datos de transitorios de Ca²⁺ en miocitos aislados.

1. Abra el archivo deseado para el análisis y seleccione Plantillas > Plantilla de pantalla para acortar más transitorios Ca²⁺ . A continuación, seleccione las pestañas 1 y 2 (izquierda) para mostrar la longitud del sarcómero y la relación Ca²⁺ , respectivamente. Seleccione Operaciones > Constantes e introduzca los valores del numerador y el denominador de la traza de fondo Ca²⁺ .
2. Prepare plantillas de análisis para acortar más datos transitorios de Ca²⁺ . Seleccione la pestaña 1 (lado izquierdo) y utilice el mismo proceso que se describe en el paso 3.2. para establecer la plantilla de análisis de longitud de sarcómero.
3. Seleccione la pestaña 2 (lado izquierdo) y seleccione Operaciones, Opciones de análisis transitorio monotónico, Marca de evento TTL en el cuadro Definición de t0 y las siguientes opciones del menú: Línea de base (relación basal), Velocidad de salida relativa a t0 (dep v), Pico (altura máxima y %altura máxima/línea de base o bl%pico h), Velocidad de decaimiento relativa a tPeak (ret v), Tiempo hasta el pico 50% (TTP 50%) usando t0, y Tiempo hasta la línea de base 50% (TTR_50%) usando tPeak. Guarde estas opciones de análisis seleccionando Plantillas y Guardar plantilla de análisis con un nuevo nombre de identificador. Cargue esta plantilla de análisis antes de analizar cada seguimiento.
4. Utilice el mismo proceso descrito en los pasos 3.3.-3.6. para promediar la señal y luego analizar la longitud del sarcómero, seguido de los mismos pasos para los transitorios de Ca²⁺ . Establezca marcas separadas para la longitud del sarcómero y para la traza de relación transitoria Ca²⁺ .

Representative Results

Los estudios de función contráctil se realizan en miocitos de rata comenzando el día después del aislamiento (día 2) hasta 4 días después del aislamiento. Aunque los miocitos pueden registrarse el día después del aislamiento (es decir, el día 2), a menudo se requieren tiempos de cultivo más largos después de la transferencia de genes o tratamientos para modificar la función contráctil⁸. Para los miocitos cultivados durante más de 18 h después del aislamiento, el protocolo de estimulación descrito en la sección 1 ayuda a mantener los túbulos T y a acortar y volver a alargar los resultados consistentes.

En la Figura 1A se muestra una porción representativa de un SC que contiene miocitos para estudios de acortamiento, junto con un miocito colocado adecuadamente antes de establecer el ROI (Figura 1B). Una vez que se identifica un ROI (Figura 1C; cuadro rosa), la información del algoritmo que se muestra debajo del miocito también ayuda a optimizar el posicionamiento de los miocitos antes de la grabación. Específicamente, la densidad óptica lineal (LOD; línea negra) es un indicador del número y el espaciado de los sarcómeros, y un espectro de potencia nítido en la traza rápida de la transformada de Fourier (FFT, línea roja) ayuda a lograr una alineación óptima para el registro de acortamiento y re-alargamiento. El patrón de retícula utilizado para la calibración de la longitud del sarcómero (y la detección de bordes) se muestra en la Figura 1D. En la Figura 2A (panel superior) se muestra un registro alineado típico del acortamiento de la longitud del sarcómero, junto con el análisis promediado por señal descrito en la sección 3 (panel inferior).

La disfunción se detecta a menudo en los miocitos cuando hay disfunción in vivo en modelos animales. Por ejemplo, la disfunción sistólica observada por ecocardiografía en respuesta a la sobrecarga de presión (PO)¹³ también se detecta en estudios de acortamiento de miocitos⁵. Para ilustrar las trazas de datos, se muestran trazas representativas en bruto (Figura 2; panel superior) y promediadas por señal (Figura 2; panel inferior) obtenidas a 0,2 Hz para miocitos de ratas simuladas (Figura 2A) y tratadas con PO (Figura 2B). Para probar si la función de los miocitos podría ser rescatada después de PO, la transferencia de genes mediada por virus en el momento del aislamiento de miocitos también se utilizó para reemplazar la troponina cardíaca endógena I (cTnI) con una sustitución fosfo-mimética cTnI T144D (T144D) en el sarcómero¹⁶. El análisis inicial muestra que la reducción inducida por PO en la función contráctil (Tabla 1, panel superior) regresó a los niveles simulados en los miocitos PO 4 días después de la transferencia génica de cTnIT144D (Tabla 1; panel inferior).

Esta plataforma también se puede utilizar para medir transitorios de Ca²⁺, junto con el acortamiento en miocitos aislados. El acortamiento y el Ca 2+ no se registraron después de la PO porque la PO reduce la adherencia de los miocitos de rata a la laminina¹³, y un modelo comparable mostró previamente que el manejo alterado de Ca²⁺ se desarrolla en un punto de tiempo similar¹⁷. En cambio, se realizaron experimentos representativos en miocitos cargados con Fura-2AM aislados de ratas de 2-3 meses de edad. En la Figura 3 se muestra un registro representativo y trazas promediadas por señal, junto con el análisis de datos en la Tabla 2. Para este conjunto de experimentos, se estudiaron miocitos aislados de ratas adultas 4 días después de la transferencia de genes mediada por adenovirus (multiplicidad de infección = 100) de cTnIT144D o cTnI de tipo salvaje. Tanto el acortamiento del sarcómero como los transitorios de Ca 2+ se midieron después de cargar miocitos con^Fura-2AM. La transferencia génica de cTnIT144D mejoró el acortamiento máximo y elevó los niveles diastólicos de Ca²⁺ en comparación con cTnI en estos estudios iniciales (Tabla 2). Si bien se necesita un análisis más extenso, los resultados iniciales sugieren que el reemplazo in vivo con cTnIT144D podría producir un fenotipo cardíaco complejo debido a los cambios tanto en la función contráctil como en el manejo de Ca²⁺ a lo largo del tiempo.

Figura 1: Miocitos cardíacos de rata adulta utilizados para estudios funcionales. (A) Miocitos cardíacos aislados representativos de una rata adulta (barra de escala = 50 μm). La flecha apunta a un miocito representativo fotografiado para el análisis de la función contráctil. (B) Miógeno representativo con un ROI (rosa) localizado en el lateral (barra de escala = 20 μm). (C) Miógeno representativo con un ROI (panel superior), el patrón sarcómero para este miocito (panel inferior, azul; barra de escala = 20 μm) y el pico agudo del espectro de potencia (panel inferior, rojo). (D) Captura de pantalla de retícula de 0,01 mm para calibrar las medidas de acortamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Registros representativos de miocitos de rata. Una traza de grabación cruda (panel superior) y promediada de señal (panel inferior) registrada a 0,2 Hz en miocitos de ratas tratadas con (A) sobrecarga de presión (PO) simulada y (B). Los miocitos fueron aislados 18-20 semanas después de la cirugía, con PO producida por coartación suprarrenal¹³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Registro y análisis representativos de la longitud del sarcómero (SL) y los transitorios de Ca 2+ de miocitos cardíacos adultos cargados con Fura-2AM. (A) Trazas brutas para SL, relación transitoria (relación) Ca 2+ y las trazas del numerador y el denominador utilizadas para producir la relación transitoria Ca²⁺. (B) Un ejemplo de trazas promediadas por señal para SL (traza superior) y la relación transitoria Ca²⁺ (traza inferior). (C) Las trazas se analizan para determinar la longitud del sarcómero (SL) y la relación transitoria Ca²⁺ utilizando el algoritmo de traza monótona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Grupo de ratas	Simulacro (n=30)	PO (n=32)
Longitud del sarcómero en reposo (mm; SL)	1.761 + 0.006	1.748 + 0.004
Altura máxima (% de la línea de base)	9.003 + 0.409	6.680 + 0.552*
Amplitud máxima (mm)	0.159 + 0.007	0.117 + 0.010*
Tasa de acortamiento (mm/s)	-4.674 + 0.285	-4.143 + 0.335
Velocidad de re-alargamiento (mm/s)	3.251 + 0.223	2.706 + 0.273
Tiempo hasta el pico (ms; TTP)	60 + 2	59 + 3
Tiempo hasta el 50% de re-alargamiento (ms; TTR50%)	35 + 2	37 + 3
Grupo de ratas	Simulacro + cTnIT144D (n=14)	PO + cTnIT144D (n=17)
Longitud del sarcómero en reposo (mm; SL)	1.768 + 0.009	1.776 + 0.004
Altura máxima (% de la línea de base)	9.038 + 1.339	8.414 + 0.960
Amplitud máxima (mm)	0.160 + 0.023	0.149 + 0.016
Tasa de acortamiento (mm/s)	-5.972 + 0.711	-4.173 + 0.726
Velocidad de re-alargamiento (mm/s)	3.925 + 0.577	3.055 + 0.403
Tiempo hasta el pico (ms; TTP)	51 + 5	59 + 2
Tiempo hasta el 50% de re-alargamiento (ms; TTR50%)	31 + 3	32 + 2

Tabla 1: Comparación de la función contráctil en miocitos cardíacos en respuesta a la sobrecarga de presión (PO) y la transferencia génica. Los resultados del acortamiento de miocitos provienen de corazones de ratas simuladas y PO 18-20 semanas después de la cirugía (panel superior)^5,13 y miocitos de ratas simuladas y PO 4 días después de la transferencia del gen cTnIT144D (panel inferior). La función contráctil se mide 4 días después del aislamiento de miocitos/transferencia de genes en todos los grupos. Los resultados se expresan como media ± SEM (n = número de miocitos). Cada conjunto de datos simulados y PO se compara mediante una prueba t de Student, con *p < 0,05 considerados estadísticamente significativos. Los resultados de amplitud máxima para los miocitos simulados y PO solos se informaron anteriormente en Ravichandran et ^al.5.

	Análisis de longitud del sarcómero
Grupo de transferencia de genes	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=16)
Longitud del sarcómero en reposo (mm; SL)	1.81 + 0.01	1.81 + 0.01
Amplitud máxima (mm)	0.11 + 0.01	0.14 + 0.02*
Tasa de acortamiento (mm/s)	-4.29 + 0.42	-4.67 + 0.77
Velocidad de re-alargamiento (mm/s)	2.92 + 0.43	3.71 + 0.64
Tiempo hasta el pico (ms; TTP)	50 + 4	84 + 28
Tiempo hasta el 50% de re-alargamiento (ms; TTR50%)	37 + 4	35 + 6
	Análisis transitorio de Ca2+
Grupo de transferencia de genes	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=19)
Relación de Ca2+ en reposo	0.89 + 0.02	1.04 + 0.04*
Ratio Peak Ca2+	0.50 + 0.05	0.42 + 0.07
Ca2+ Velocidad transitoria (D/seg)	45.24 + 5.85	40.53 + 10.95
Ca2+ Tasa de decaimiento (D/s)	-4.91 + 0.99	-2.87 + 0.57
Tiempo hasta el pico Ca2+ (ms; TTP)	34 + 2	41 + 3
Tiempo al 50% Ca2+ Decay(ms; TTD50%)	101 + 8	117 + 6

Tabla 2: Función contráctil y transitorios de Ca²⁺ en miocitos de rata adulta 4 días después de la transferencia del gen cTnIT144D. Un análisis de la función contráctil (panel superior) y transitorios de Ca²⁺ (panel inferior) se muestra en miocitos después de la transferencia génica de cTnIT144D en comparación con cTnI de tipo salvaje. Los miocitos se aíslan de ratas adultas de 2-3 meses de edad, y los datos se presentan como media ± SEM (n = número de miocitos). Las comparaciones estadísticas de la función contráctil (izquierda) y los transitorios de Ca²⁺ (derecha) se realizan utilizando una prueba t de Student no pareada con significación establecida en *p < 0,05.

Figura suplementaria 1: Componentes del sistema de estimulación para miocitos plateados en CS recubiertos de laminina. (A) Cámara de estimulación personalizada que contiene electrodos de platino en cada cámara. (B) Cámara de estimulación con las primeras cuatro cámaras llenas de medios. (C) Cámara de estimulación conectada a cables de toma de plátano, que están conectados a la cámara y (D) al estimulador. (E) La conexión entre el estimulador (derecha) y la incubadora a 37 °C (izquierda). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Componentes necesarios para la función contráctil de los miocitos y/o las mediciones transitorias de Ca²⁺. (A) La plataforma de función contráctil que muestra cada componente, con los elementos numerados explicados con más detalle en la Tabla de materiales. Los componentes de la plataforma incluyen una mesa antivibración , microscopio de campo claro invertido (# 2,3), cámara CCD (# 4), controlador CCD y fuente de alimentación de xenón (# 5), fuente de luz de emisión dual (# 6), controlador de temperatura # 7, bomba peristáltica # 8, soporte de tubo aislado # 9, cámara de perfusión montada en cubreobjetos (# 10) y sistema de vacío (# 11). (B) Los componentes adicionales incluyen la interfaz de fluorescencia (# 12), el estimulador de cámara (# 13) y la computadora PC (# 14), que se explican con más detalle en la Tabla de materiales. Las vistas en primer plano de los elementos numerados en el panel A se muestran en C-F. (C) Vista de la fuente de alimentación de xenón (izquierda) y el controlador CCD (derecha). (D) Controlador de temperatura. (E) Bomba peristáltica. (F) Vista de la base para la cámara de perfusión CS (flecha negra), el soporte del electrodo de platino (flecha gris) y el montaje superior (flecha blanca) con tornillos de cabeza panorámica #0. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El protocolo de estimulación crónica descrito en el paso 1 extiende el tiempo útil para estudiar miocitos aislados y evaluar el impacto de tratamientos más largos. En nuestro laboratorio, se obtuvieron resultados consistentes hasta 4 días después del aislamiento al medir la función contráctil utilizando la longitud del sarcómero en miocitos de ritmo crónico. Sin embargo, la función contráctil de los miocitos se deteriora rápidamente cuando se usan medios mayores de 1 semana para marcar el ritmo de los miocitos.

Para los estudios de función contráctil, los datos se recopilan a 37 ° C, que está cerca de la temperatura corporal para las ratas. Para optimizar la viabilidad de los miocitos y obtener trazas consistentes para cada miócito, estos experimentos se realizan a una frecuencia de estimulación inferior a la frecuencia cardíaca fisiológica de ~ 5 Hz en ratas. Estos ajustes producen datos consistentes de función contráctil, pero la temperatura de la cámara y / o la frecuencia de estimulación se pueden ajustar si las trazas de acortamiento permanecen consistentes en múltiples CS que contienen el mismo grupo de tratamiento de miocitos. Además, se obtienen resultados óptimos eligiendo miocitos que carecen de ampollas, se adhieren completamente a un SC y se contraen en ambos extremos de una célula en forma de bastón. Las células unidas en un solo extremo, aquellas con múltiples ampollas y / o miocitos que se contraen en un solo extremo no son deseables y a menudo son más difíciles de registrar debido al movimiento de fondo. Para estos estudios, se incluyen ≥20 sarcómeros en el ROI para lograr un pico de espectro de potencia agudo, longitudes de sarcómero en reposo reproducibles y una relación señal / ruido óptima para la traza de acortamiento. Se puede usar un ROI con tan solo siete sarcómeros si el pico del espectro de potencia permanece nítido. La longitud del sarcómero en reposo en miocitos de rata aislados generalmente oscila entre 2.00-1.80 μm. Si la longitud de un sarcómero en reposo es inferior a 1,5 μm, una contracción activa no es realista según nuestra comprensión de la arquitectura del sarcómero¹⁸ y generalmente es el resultado de una orientación subóptima de los miocitos.

La medición de la función contráctil con o sin mediciones transitorias de Ca²⁺ en miocitos intactos es un enfoque de mayor rendimiento que requiere menos inversión en el desarrollo de la experiencia técnica necesaria para las mediciones de fuerza en células individuales intactas¹¹. Los estudios de miocitos intactos también se centran exclusivamente en la función de los miocitos, sin la contribución de otros tipos de células en preparaciones multicelulares². Un área emergente en este campo es el desarrollo de análisis de mayor rendimiento mediante la medición simultánea de acortamiento y / o transitorios de Ca²⁺ en múltiples miocitos intactos para acelerar la detección de agentes terapéuticos a nivel celular antes de un análisis in vivo más extenso.

La función contráctil y las mediciones transitorias de Ca²⁺ también son posibles en miocitos intactos aislados de otros modelos de roedores, como ratones, aunque existen algunas consideraciones y diferencias importantes en comparación con los miocitos de rata. Los miocitos de ratón son viables en cultivo durante 24-36 h, pero la viabilidad disminuye progresivamente en los miocitos cultivados durante más de 48 h¹⁹. Este intervalo de cultivo truncado debe considerarse cuando se utiliza la transferencia de genes basada en vectores, especialmente para proteínas de miofilamentos que tienen una vida media en días en lugar de horas²⁰. A diferencia de los miocitos de rata, el aislamiento y cultivo exitosos de los miocitos de ratón también dependen de la adición de inhibidores de la ATPasa de miosina, como la monoxima de 2,3-butanodiona o la blebbistatina, a los medios de cultivo¹⁹. Como resultado, la estimulación crónica no es una opción viable en cultivos de miocitos de ratón. También se necesita un tiempo de equilibrio más largo de 15-20 minutos para eliminar el impacto funcional de estos inhibidores de miosina en miocitos de ratón aislados. Finalmente, los miocitos de ratón tienen un ritmo óptimo de 0,5 Hz para obtener trazas de acortamiento reproducibles en comparación con los 0,2 Hz utilizados para los miocitos de rata.

En estudios en ratas tratadas con PO, la disfunción contráctil se detecta consistentemente con estimulación de baja frecuencia en miocitos de rata. También se detecta una mayor reducción dependiente de la frecuencia en el acortamiento en los miocitos después de PO en comparación con las ratas simuladas cuando hay disfunción contráctil in vivo ^5,13. Durante un estudio que utilizó un rango de frecuencias, duplicar la velocidad de la bomba para proporcionar medios adecuados produjo un acortamiento en estado estacionario dentro de 15-20 s después de cambiar la frecuencia de estimulación entre 0.2 y 2 Hz. Los miocitos de rata también responden a la estimulación a corto plazo a frecuencias más altas de hasta 8 Hz, aunque la viabilidad celular se deteriora rápidamente a estas frecuencias más altas. En general, la función contráctil de los miocitos ha demostrado ser un enfoque reproducible para confirmar o validar la disfunción cardíaca in vivo en modelos de rata, como PO- en comparación con ratas tratadas con simulacro (Tabla 1; ver Kim et al.13). Además, esta plataforma puede probar si un tratamiento dirigido a los miocitos restaura o deteriora la función contráctil antes de seguir enfoques in vivo más costosos y / o laboriosos. Tanto la administración aguda como la exposición prolongada a agentes terapéuticos y/o después de la administración de genes durante el cultivo primario son posibles utilizando este enfoque. Por ejemplo, los experimentos de transferencia de genes para reemplazar cTnI endógeno con cTnIT144D no indican ningún cambio significativo en la amplitud de acortamiento en los miocitos de ratas simuladas. En contraste, cTnIT144D restaura la amplitud de acortamiento máximo hacia valores simulados en miocitos de ratas tratadas con PO (Tabla 1). Una debilidad inherente de este enfoque es la ausencia de la carga típica presente en los miocitos en condiciones in vivo. Como resultado, las respuestas pueden diferir de las respuestas funcionales dependientes de la carga, y el experimento de ejemplo indica que se necesitan enfoques in vivo para investigar más a fondo si cTnIT144D mejora el rendimiento cardíaco durante PO.

La medición tanto del acortamiento como de los transitorios de Ca²⁺ en el mismo miocito es una ventaja de esta plataforma. Por ejemplo, la dirección del cambio puede diferir para los transitorios de Ca²⁺ en comparación con la función contráctil. Como se muestra en la Tabla 2, el acortamiento máximo aumenta significativamente después de la transferencia génica de cTnIT144D a miocitos de ratas de 2-3 meses de edad. Este resultado difiere de los datos obtenidos en miocitos mayores tratados con simulacro (Tabla 1) y puede estar relacionado con la edad de la rata^{de 5} años. Sin embargo, se necesitan más pruebas para probar esta interpretación. Los datos de la Tabla 2 también muestran que cTnIT144D no cambia la amplitud máxima de Ca 2+ y, en cambio, tiende a disminuir la tasa de decaimiento de Ca 2+ y elevar el Ca ²⁺ en reposo. Estos hallazgos sugieren que la expresión de cTnIT144D mejora la función contráctil, mientras que la maquinaria ciclista de Ca²⁺ compensa para amortiguar este efecto. Estos resultados resaltan la capacidad de este enfoque para distinguir entre los cambios en la función contráctil y el ciclo de Ca²⁺. Si bien los resultados específicos presentados aquí aún no son definitivos, proporcionan una justificación sólida para desarrollar un modelo animal genético para expresar cTnIT144D miocárdico y evaluar si su expresión embota la disfunción causada por PO en el futuro. Una observación final de los datos transitorios de Ca 2⁺ es que los colorantes fluorescentes como Fura-2AM cambian la cinética de la función contráctil en los miocitos²¹. Aunque la respuesta relativa producida por un tratamiento dado o modelo animal es comparable dentro de los miocitos cargados con Fura-2, estos resultados no deben combinarse con mediciones de acortamiento realizadas en ausencia de Fura-2AM. Para optimizar el uso de Fura-2AM para el análisis transitorio de Ca 2+, el laboratorio mide con mayor frecuencia el acortamiento en ausencia de Fura-2AM y realiza un subconjunto de experimentos para medir transitorios de Ca²⁺.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11