تحليل ضعف انقباض القلب و Ca2+ عابر في الخلايا العضلية القوارض
Summary
يتم تقديم مجموعة من البروتوكولات التي تصف قياس وظيفة الانقباض عن طريق الكشف عن طول القطعة العضلية جنبا إلى جنب مع قياس الكالسيوم (Ca2+) العابر في الخلايا العضلية للفئران المعزولة. كما يتم تضمين تطبيق هذا النهج للدراسات في النماذج الحيوانية لفشل القلب.
Abstract
غالبا ما يتم تحليل ضعف الانقباض و Ca2+ العابر على المستوى الخلوي كجزء من تقييم شامل للإصابة الناجمة عن القلب و / أو إعادة البناء. يستخدم أحد الأساليب لتقييم هذه التعديلات الوظيفية تقصير غير محمل وتحليلات عابرة Ca2+ في الخلايا العضلية القلبية الأولية للبالغين. لهذا النهج ، يتم عزل الخلايا العضلية البالغة عن طريق هضم الكولاجيناز ، وجعلها متسامحة مع Ca2+ ، ثم تلتصق بأغطية مغلفة باللامينين ، تليها سرعة كهربائية في وسائط خالية من المصل. يستخدم البروتوكول العام الخلايا العضلية القلبية للفئران البالغة ولكن يمكن تعديلها بسهولة للخلايا العضلية الأولية من الأنواع الأخرى. يمكن مقارنة التغيرات الوظيفية في الخلايا العضلية من القلوب المصابة بالخلايا العضلية الوهمية و / أو العلاجات العلاجية في المختبر . تتضمن المنهجية العناصر الأساسية اللازمة لسرعة الخلايا العضلية ، جنبا إلى جنب مع غرفة الخلية ومكونات المنصة. يتضمن البروتوكول التفصيلي لهذا النهج خطوات قياس التقصير غير المحمل عن طريق الكشف عن طول القطعة العضلية وعابرات Ca2+ الخلوية المقاسة بمؤشر القياس النسبي Fura-2 AM ، وكذلك لتحليل البيانات الأولية.
Introduction
غالبا ما يتطلب تحليل وظيفة مضخة القلب مجموعة من الأساليب لاكتساب رؤية كافية ، خاصة بالنسبة للنماذج الحيوانية لفشل القلب (HF). يوفر تخطيط صدى القلب أو قياسات الدورة الدموية نظرة ثاقبة على الخلل الوظيفي القلبي في الجسم الحي 1 ، بينما غالبا ما يتم استخدام الأساليب في المختبر لتحديد ما إذا كان الخلل الوظيفي ينشأ عن التغيرات في الخيوط العضلية و / أو Ca2+ العابر المسؤول عن إثارة الاقتران ، أو جهد الفعل ، مع وظيفة انقباض (على سبيل المثال ، اقتران الإثارة والانكماش [E-C]). توفر الأساليب في المختبر أيضا فرصة لفحص الاستجابة الوظيفية للهرمونات العصبية ، والتغيرات الجينية التي يسببها النواقل ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية المحتملة2 قبل متابعة استراتيجيات العلاج المكلفة و / أو الشاقة في الجسم الحي.
تتوفر عدة طرق للتحقيق في وظيفة الانقباض في المختبر ، بما في ذلك قياسات القوة في الترابيق السليم 3 أو الخلايا العضلية4 ، بالإضافة إلى التقصير غير المحمل و Ca2+ العابر في الخلاياالعضلية السليمة في وجود وغياب HF 5,6. يركز كل من هذه الأساليب على وظيفة انقباض الخلايا العضلية القلبية ، المسؤولة مباشرة عن وظيفة مضخة القلب 2,7. ومع ذلك ، غالبا ما يتم إجراء تحليل كل من الانكماش واقتران E-C معا عن طريق قياس تقصير طول العضلات و Ca 2+ عابرة في الخلايا العضلية البالغة المعزولة والمتسامحة مع Ca2+. يستخدم المختبر بروتوكولا منشورا مفصلا لعزل الخلايا العضلية من قلوب الفئران لهذه الخطوة8.
يساهم كل من Ca2+ العابر والخيوط العضلية في تقصير وإعادة إطالة الخلايا العضلية السليمة ويمكن أن يساهم في اختلال وظيفي مقلص 2,7. وبالتالي ، يوصى بهذا النهج عندما يتطلب التحليل الوظيفي في المختبر خلية عضلية سليمة تحتوي على آلات ركوب الدراجات Ca2+ بالإضافة إلى خيوط العضلات. على سبيل المثال ، الخلايا العضلية المعزولة السليمة مرغوبة لدراسة وظيفة الانقباض بعد تعديل الخيوط العضلية أو وظيفة ركوب الدراجات Ca2+ عبر نقل الجينات9. بالإضافة إلى ذلك ، يقترح نهج الخلايا العضلية السليمة لتحليل التأثير الوظيفي للهرمونات العصبية عند دراسة تأثير مسارات إشارات المصب الثاني و / أو الاستجابة للعوامل العلاجية2. غالبا ما يتم إجراء قياس بديل للقوة المعتمدة على الحمل في الخلايا العضلية المفردة بعد نفاذية الغشاء (أو السلخ) في درجات حرارة منخفضة (≤15 درجة مئوية) لإزالة المساهمة العابرة Ca2+ والتركيز على وظيفة الخيوط العضلية10. يعد قياس القوة المعتمدة على الحمل بالإضافة إلى Ca2+ العابرة في الخلايا العضلية السليمة أمرا نادرا إلى حد كبير بسبب التحدي المعقد والتقني للنهج11 ، خاصة عند الحاجة إلى إنتاجية أعلى ، مثل قياس الاستجابات لإشارات الهرمونات العصبية أو كشاشة للعوامل العلاجية. يتغلب تحليل التربيق القلبي على هذه التحديات التقنية ولكنه قد يتأثر أيضا بالخلايا غير العضلية والتليف و / أو إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية2. يتطلب كل نهج من الأساليب الموضحة أعلاه إعدادا يحتوي على خلايا عضلية بالغة لأن الخلايا العضلية الوليدية والخلايا العضلية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) لا تعبر بعد عن المكمل الكامل لبروتينات الخيوط العضلية البالغة وعادة ما تفتقر إلى مستوى تنظيم الخيوط العضلية الموجودة في الخلية العضلية البالغة على شكل قضيب2. حتى الآن ، تشير الأدلة في iPSCs إلى أن الانتقال الكامل إلى الأشكال المتساوية للبالغين يتجاوز أكثر من 134 يوما في الثقافة12.
بالنظر إلى تركيز هذه المجموعة على HF ، تتضمن البروتوكولات مناهج وتحليلات للتمييز بين وظيفة الانقباض في الخلايا العضلية السليمة الفاشلة مقابل الخلايا العضلية السليمة غير الفاشلة. يتم تقديم أمثلة تمثيلية من الخلايا العضلية للفئران التي تمت دراستها بعد 18-20 أسبوعا من التضيق فوق الكلوي ، الموصوف سابقا5،13. ثم يتم إجراء مقارنات مع الخلايا العضلية من الفئران المعالجة بالخداع.
يتم استخدام البروتوكول ومنصة التصوير الموصوفة هنا لتحليل ومراقبة التغيرات في التقصير و Ca2+ العابرة في الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب أثناء تطور HF. لهذا التحليل ، يتم طلاء الخلايا العضلية على شكل قضيب 2 × 104 Ca 2+ على شكل قضيب على أغطية زجاجية مطلية بالصفيحة مقاس 22 مم2 (CSs) ويتم زراعتها طوال الليل ، كما هو موضح سابقا8. يتم توفير المكونات المجمعة لمنصة التصوير هذه ، جنبا إلى جنب مع الوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة للتصوير الأمثل ، في جدول المواد. يتم أيضا توفير دليل لتحليل البيانات باستخدام برنامج والنتائج التمثيلية هنا. يتم تقسيم البروتوكول العام إلى أقسام فرعية منفصلة ، حيث تركز الأقسام الثلاثة الأولى على الخلايا العضلية للفئران المعزولة وتحليل البيانات ، تليها تجارب Ca2+ الخلوية العابرة وتحليل البيانات في الخلايا العضلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعمل بروتوكول السرعة المزمن الموضح في الخطوة 1 على إطالة الوقت المفيد لدراسة الخلايا العضلية المعزولة وتقييم تأثير العلاجات الأطول. في مختبرنا ، تم الحصول على نتائج متسقة تصل إلى 4 أيام بعد العزل عند قياس وظيفة الانقباض باستخدام طول القطعة العضلية على الخلايا العضلية ذات الخطى المزمنة. وم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL144777 (MVW).
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
References
- Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Rossman, E. I., et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).
- McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts. Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).
- Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).
- Chaudhary, K. W., et al. Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).
- Walker, C. A., Spinale, F. G. The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).
- Lang, S. E., Westfall, M. V. Gene transfer into cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).
- Davis, J., et al. Designing heart performance by gene transfer. Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).
- Sweitzer, N. K., Moss, R. L. Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin. Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).
- Yasuda, S., et al. Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).
- Racca, A. W., et al. Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle. The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).
- Kim, E. H., et al. Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure. Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).
- Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).
- Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).
- Sakthivel, S., et al. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).
- Qi, M., et al. Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy. The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).
- Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. The ultrastructure basis of Starling’s law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume. American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).
- Zak, R. Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart. Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).
- Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats. Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).
