Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحليل ضعف انقباض القلب و Ca2+ عابر في الخلايا العضلية القوارض

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/64055
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cardiac Surgery, Michigan Medicine, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

يتم تقديم مجموعة من البروتوكولات التي تصف قياس وظيفة الانقباض عن طريق الكشف عن طول القطعة العضلية جنبا إلى جنب مع قياس الكالسيوم (Ca2+) العابر في الخلايا العضلية للفئران المعزولة. كما يتم تضمين تطبيق هذا النهج للدراسات في النماذج الحيوانية لفشل القلب.

Abstract

غالبا ما يتم تحليل ضعف الانقباض و Ca2+ العابر على المستوى الخلوي كجزء من تقييم شامل للإصابة الناجمة عن القلب و / أو إعادة البناء. يستخدم أحد الأساليب لتقييم هذه التعديلات الوظيفية تقصير غير محمل وتحليلات عابرة Ca2+ في الخلايا العضلية القلبية الأولية للبالغين. لهذا النهج ، يتم عزل الخلايا العضلية البالغة عن طريق هضم الكولاجيناز ، وجعلها متسامحة مع Ca2+ ، ثم تلتصق بأغطية مغلفة باللامينين ، تليها سرعة كهربائية في وسائط خالية من المصل. يستخدم البروتوكول العام الخلايا العضلية القلبية للفئران البالغة ولكن يمكن تعديلها بسهولة للخلايا العضلية الأولية من الأنواع الأخرى. يمكن مقارنة التغيرات الوظيفية في الخلايا العضلية من القلوب المصابة بالخلايا العضلية الوهمية و / أو العلاجات العلاجية في المختبر . تتضمن المنهجية العناصر الأساسية اللازمة لسرعة الخلايا العضلية ، جنبا إلى جنب مع غرفة الخلية ومكونات المنصة. يتضمن البروتوكول التفصيلي لهذا النهج خطوات قياس التقصير غير المحمل عن طريق الكشف عن طول القطعة العضلية وعابرات Ca2+ الخلوية المقاسة بمؤشر القياس النسبي Fura-2 AM ، وكذلك لتحليل البيانات الأولية.

Introduction

غالبا ما يتطلب تحليل وظيفة مضخة القلب مجموعة من الأساليب لاكتساب رؤية كافية ، خاصة بالنسبة للنماذج الحيوانية لفشل القلب (HF). يوفر تخطيط صدى القلب أو قياسات الدورة الدموية نظرة ثاقبة على الخلل الوظيفي القلبي في الجسم الحي 1 ، بينما غالبا ما يتم استخدام الأساليب في المختبر لتحديد ما إذا كان الخلل الوظيفي ينشأ عن التغيرات في الخيوط العضلية و / أو Ca2+ العابر المسؤول عن إثارة الاقتران ، أو جهد الفعل ، مع وظيفة انقباض (على سبيل المثال ، اقتران الإثارة والانكماش [E-C]). توفر الأساليب في المختبر أيضا فرصة لفحص الاستجابة الوظيفية للهرمونات العصبية ، والتغيرات الجينية التي يسببها النواقل ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية المحتملة2 قبل متابعة استراتيجيات العلاج المكلفة و / أو الشاقة في الجسم الحي.

تتوفر عدة طرق للتحقيق في وظيفة الانقباض في المختبر ، بما في ذلك قياسات القوة في الترابيق السليم 3 أو الخلايا العضلية4 ، بالإضافة إلى التقصير غير المحمل و Ca2+ العابر في الخلاياالعضلية السليمة في وجود وغياب HF 5,6. يركز كل من هذه الأساليب على وظيفة انقباض الخلايا العضلية القلبية ، المسؤولة مباشرة عن وظيفة مضخة القلب 2,7. ومع ذلك ، غالبا ما يتم إجراء تحليل كل من الانكماش واقتران E-C معا عن طريق قياس تقصير طول العضلات و Ca 2+ عابرة في الخلايا العضلية البالغة المعزولة والمتسامحة مع Ca2+. يستخدم المختبر بروتوكولا منشورا مفصلا لعزل الخلايا العضلية من قلوب الفئران لهذه الخطوة8.

يساهم كل من Ca2+ العابر والخيوط العضلية في تقصير وإعادة إطالة الخلايا العضلية السليمة ويمكن أن يساهم في اختلال وظيفي مقلص 2,7. وبالتالي ، يوصى بهذا النهج عندما يتطلب التحليل الوظيفي في المختبر خلية عضلية سليمة تحتوي على آلات ركوب الدراجات Ca2+ بالإضافة إلى خيوط العضلات. على سبيل المثال ، الخلايا العضلية المعزولة السليمة مرغوبة لدراسة وظيفة الانقباض بعد تعديل الخيوط العضلية أو وظيفة ركوب الدراجات Ca2+ عبر نقل الجينات9. بالإضافة إلى ذلك ، يقترح نهج الخلايا العضلية السليمة لتحليل التأثير الوظيفي للهرمونات العصبية عند دراسة تأثير مسارات إشارات المصب الثاني و / أو الاستجابة للعوامل العلاجية2. غالبا ما يتم إجراء قياس بديل للقوة المعتمدة على الحمل في الخلايا العضلية المفردة بعد نفاذية الغشاء (أو السلخ) في درجات حرارة منخفضة (≤15 درجة مئوية) لإزالة المساهمة العابرة Ca2+ والتركيز على وظيفة الخيوط العضلية10. يعد قياس القوة المعتمدة على الحمل بالإضافة إلى Ca2+ العابرة في الخلايا العضلية السليمة أمرا نادرا إلى حد كبير بسبب التحدي المعقد والتقني للنهج11 ، خاصة عند الحاجة إلى إنتاجية أعلى ، مثل قياس الاستجابات لإشارات الهرمونات العصبية أو كشاشة للعوامل العلاجية. يتغلب تحليل التربيق القلبي على هذه التحديات التقنية ولكنه قد يتأثر أيضا بالخلايا غير العضلية والتليف و / أو إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية2. يتطلب كل نهج من الأساليب الموضحة أعلاه إعدادا يحتوي على خلايا عضلية بالغة لأن الخلايا العضلية الوليدية والخلايا العضلية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) لا تعبر بعد عن المكمل الكامل لبروتينات الخيوط العضلية البالغة وعادة ما تفتقر إلى مستوى تنظيم الخيوط العضلية الموجودة في الخلية العضلية البالغة على شكل قضيب2. حتى الآن ، تشير الأدلة في iPSCs إلى أن الانتقال الكامل إلى الأشكال المتساوية للبالغين يتجاوز أكثر من 134 يوما في الثقافة12.

بالنظر إلى تركيز هذه المجموعة على HF ، تتضمن البروتوكولات مناهج وتحليلات للتمييز بين وظيفة الانقباض في الخلايا العضلية السليمة الفاشلة مقابل الخلايا العضلية السليمة غير الفاشلة. يتم تقديم أمثلة تمثيلية من الخلايا العضلية للفئران التي تمت دراستها بعد 18-20 أسبوعا من التضيق فوق الكلوي ، الموصوف سابقا5،13. ثم يتم إجراء مقارنات مع الخلايا العضلية من الفئران المعالجة بالخداع.

يتم استخدام البروتوكول ومنصة التصوير الموصوفة هنا لتحليل ومراقبة التغيرات في التقصير و Ca2+ العابرة في الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب أثناء تطور HF. لهذا التحليل ، يتم طلاء الخلايا العضلية على شكل قضيب 2 × 104 Ca 2+ على شكل قضيب على أغطية زجاجية مطلية بالصفيحة مقاس 22 مم2 (CSs) ويتم زراعتها طوال الليل ، كما هو موضح سابقا8. يتم توفير المكونات المجمعة لمنصة التصوير هذه ، جنبا إلى جنب مع الوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة للتصوير الأمثل ، في جدول المواد. يتم أيضا توفير دليل لتحليل البيانات باستخدام برنامج والنتائج التمثيلية هنا. يتم تقسيم البروتوكول العام إلى أقسام فرعية منفصلة ، حيث تركز الأقسام الثلاثة الأولى على الخلايا العضلية للفئران المعزولة وتحليل البيانات ، تليها تجارب Ca2+ الخلوية العابرة وتحليل البيانات في الخلايا العضلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت الدراسات التي أجريت على القوارض سياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ميشيغان. في هذه الدراسة ، تم عزل الخلايا العضلية من الفئران Sprague-Dawley و F344BN البالغة من العمر 3-34 شهرا والتي تزن ≥ 200 جم5. تم استخدام كل من معدلات الذكور والإناث.

1. سرعة الخلايا العضلية لدراسات وظيفة انقباض

  1. اصنع وسائط جديدة قائمة على M199 لكل مجموعة من الخلايا العضلية المعزولة (جدول المواد). 1 يوم قبل السرعة ، لوحة 2 × 104 Ca 2+ - خلايا عضلية على شكل قضيب على 22 مم2 أغطية زجاجية مطلية باللامينين (CSs) ، كما هو موضح سابقا8.
  2. لتحضير الغرف ، انقع كل غرفة في مبيض 10٪ لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الغرف بماء الصنبور الجاري لمدة 30-45 دقيقة ، متبوعا بالماء المقطر الذي يتم استبداله كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة ، يليه الماء منزوع الأيونات الذي يتم استبداله كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة ، والشطف النهائي بالماء منزوع الأيونات.
  3. جفف الغرف على سطح نظيف لمدة 20-30 دقيقة (الشكل التكميلي 1A-C). بعد ذلك ، عالج الأشعة فوق البنفسجية الغرف في خزانة السلامة الحيوية لمدة 5 دقائق في كل اتجاه (المجموع = 20 دقيقة). ليست هناك حاجة لهذه الخطوة للغرف المعقمة مسبقا.
    تنبيه: اترك المنطقة لتقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
  4. قم بإزالة الغطاء من الغرفة ، وأضف 3 مل من الوسائط القائمة على M199 (انظر جدول المواد) إلى كل بئر (الشكل التكميلي 1B) ، واستبدل الغطاء ، وقم بتسخين الغرفة مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 20٪ O2.
  5. تعقيم ملقط في معقم حبة ساخنة على حرارة 250 درجة مئوية لمدة 20-25 ثانية. انقل غرفة التحفيز المسخنة مسبقا من الحاضنة إلى خزانة السلامة البيولوجية.
  6. انقل كل غطاء (CS) يحتوي على خلايا عضلية قلبية إلى آبار فردية في غرفة التحفيز باستخدام ملقط معقم. انقل CSs أربعة في كل مرة ، متبوعا بالتسخين لمدة 10 دقائق قبل نقل CSs الأربعة المتبقية للحفاظ على درجة حرارة الوسائط.
  7. قم بتوصيل رافعات الموز بغرفة التحفيز من أحد طرفيها (الشكل التكميلي 1C) وبالمحفز على الطرف الآخر (الشكل التكميلي 1D).
  8. اضبط تردد المحفز على 0.2 هرتز واضبط الجهد (~ 12 فولت) لتحقيق الانكماش في ~ 10٪ -20٪ من جميع الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب داخل البئر. لتحديد عدد الخلايا العضلية المتعاقدة، ضع الغرفة تحت مجهر مقلوب مع تكبير من 4x إلى 10x.
  9. ضع غرفة التحفيز في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 (الشكل التكميلي 1E). قم بتغيير الوسائط كل 12 ساعة باستخدام وسائط مسخنة مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20-25 دقيقة. استمر في التحفيز الكهربائي لمدة تصل إلى 3 أيام مع تغيير الوسائط كل 12 ساعة.

2. تحليل وظيفة انقباض الخلايا العضلية القلبية الفئران البالغة

  1. سخن عبوة جل ووسائط في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل التجربة.
  2. قم بتشغيل مكونات منصة وظيفة الانقباض المدرجة في جدول المواد والموضحة في الشكل التكميلي 2 ، مع إيلاء اهتمام خاص للمكونات الرئيسية ، والتي تشمل جدولا مضادا للاهتزاز (الشكل التكميلي 2A-1) مع مجهر مقلوب مع مرشح أحمر غامق (590 نانومتر) (الشكل التكميلي 2A-2,3) وكاميرا CCD (الشكل التكميلي 2A-4) متصلة بوحدة تحكم CCD (الشكل التكميلي 2A-5 و الشكل التكميلي 2C-5) ومتكامل مع جهاز كمبيوتر (الشكل التكميلي 2B-14).
  3. تجميع الأنابيب في المضخة التمعجية (الشكل التكميلي 2A-8 ؛ الشكل التكميلي 2A-8) ، انقل عبوة الجل المسخنة مسبقا إلى حامل الأنبوب (الشكل التكميلي 2A-9) ، وقم بتشغيل الفراغ (الشكل التكميلي 2A-11) والطاقة إلى محفز الخلية (الشكل التكميلي 2B-13).
  4. ضع أنبوبا سعة 50 مل مع وسائط في حامل الأنبوب المعزول (الشكل التكميلي 2A-9) وابدأ التروية عند ~ 0.5 مل / دقيقة من خلال أنبوب المضخة التمعجية (الشكل التكميلي 2E-8).
  5. أضف كمية صغيرة من الوسائط المسخنة مسبقا إلى قارب وزن صغير (~ 2 مل). انقل CS واحدا يحتوي على خلايا عضلية من غرفة التحفيز إلى قارب الوزن. أعد غرفة التحفيز إلى 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
  6. قم بإزالة CS من وعاء الوزن وامسح الجانب السفلي برفق. انقل CS إلى غرفة CS مدهونة حديثا (الشكل التكميلي 2A ، F-10 ؛ السهم الأسود) وأضف قطرة من الوسائط برفق (~ 200 ميكرولتر) إلى CS.
  7. ضع حامل قطب كهربائي بلاتيني فوق CS (الشكل التكميلي 2F ؛ سهم رمادي) وضع CS جديدا فوق الجزء العلوي باستخدام ملقط. ضع حاملا علويا (الشكل التكميلي 2F ؛ السهم الأبيض) فوق شطيرة CS ثم قم بتثبيت اثنين أو أربعة مسامير # 0 ذات رأس عموم لإنهاء تجميع الغرفة.
  8. بمجرد وجود الوسائط في جميع أنحاء أنبوب المضخة ، قم بتوصيل الأنبوب بالتسخين المسبق ، ثم قم بتوصيل التسخين الأولي بغرفة CS المجمعة في الخطوة 2.7. ابدأ التروية بمعدل 0.5 مل / دقيقة وضع منديل منديل أسفل الحجرة للتأكد من عدم وجود تسرب.
  9. ضع حجرة CS في محول المسرح. يتم جمع الوسائط المتدفقة في الطرف الآخر من الغرفة مع أنابيب متصلة بنظام فراغ. قم بتشغيل نظام التسخين (الشكل التكميلي 2A ، D-7) وقم بموازنة الغرفة والهدف والتسخين المسبق لمدة ~ 5-10 دقائق لتحقيق درجة حرارة وسائط ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية. تصور الخلايا العضلية مع هدف الغمر في الماء 40x على المجهر خلال وقت التوازن هذا.
  10. قم بتنشيط محفز السرعة (الشكل التكميلي 2B-13) عن طريق ضبط الجهد على 1.5x الإعداد اللازم لتقلص 80٪ من الخلايا على شكل قضيب ، والتي عادة ما تكون 35-40 فولت. اضبط تردد التحفيز على 0.2 هرتز لتحسين وظيفة الانقباض وبقاء الخلايا العضلية.
  11. جمع آثار تقصير مقلص وإعادة إطالة من الخلايا العضلية المنتشرة والمتقلبة باستمرار. لجمع قياسات التقصير ، استخدم كاميرا CCD (الشكل التكميلي 2A-4) متصلة بوحدة تحكم CCD (الشكل التكميلي 2B-5 ، C) وجهاز كمبيوتر مخصص مع لوحة تحكم إدخال / إخراج (الشكل التكميلي 2B-14 ؛ انظر جدول المواد). تقيس المنصة تقصير القطعة العضلية في الخلايا العضلية للفئران ، على الرغم من الحصول على نتائج مماثلة من قياسات الخلايا العضلية التي تم جمعها من الحواف الطولية للخلايا العضلية (انظر Ecklerle et al.14).
  12. لجمع آثار تقصير القطعة العضلية، افتح البرنامج على الكمبيوتر، وحدد موافق، ثم قم بتقديم ملف > جديد. قم بإعداد قالب شاشة عن طريق تحديد عمليات التتبع > تحرير حدود المستخدم > طول القطعة العضلية ثم تعيين القيم القصوى والدنيا ، والتي تتراوح عادة بين 2.0 ميكرومتر و 1.5 ميكرومتر. قم بمعايرة كاميرا CCD ب 0.01 مم graticule قبل إجراء القياسات في الخلايا العضلية (الشكل 1D).
  13. لتسجيل آثار طول القطعة العضلية، اختر ملف > جديد. حدد الخلية العضلية المنقبضة وضع الخلية العضلية على طول المحور الطولي للكاميرا بحيث يكون نمط التشقق رأسيا (الشكل 1 ب).
  14. استخدم فأرة الكمبيوتر لوضع مربع منطقة الاهتمام (ROI) (المربع الوردي) فوق الخلية العضلية (الشكل 1C). حدد تجميع وابدأ لتسجيل وظيفة الانقباض. سجل تقصيرا لمدة 60 ثانية من كل خلية عضلية بترددات تحفيز منخفضة (≤0.5 هرتز).
  15. سجل تقصير القطعة العضلية من 5-10 خلايا لكل CS. قم بإجراء القياسات في 1 خلية / CS إذا كانت الدراسات تشمل العلاج بمنبهات / مضادات. قم بإعداد وسائط منفصلة مسبقة التسخين وقطعة مختلفة ومخصصة من أنابيب التروية المحملة في مضخة تمعجية متعددة القنوات واتبع الخطوات 2.9.-2.14. لقياس تأثير توصيل الدواء أو الهرمونات العصبية على وظيفة انقباض الخلايا العضلية.
  16. لقياس التقصير على نطاق من الترددات ، قم بتسريع الخلايا العضلية عند كل تردد للحصول على تقصير الحالة المستقرة قبل التسجيل5. بالنسبة لهذه الدراسات ، ضاعف معدل التروية وابدأ في تسجيل 15-20 ثانية بعد التحفيز بتردد جديد للحصول على استجابات انقباضية ثابتة الحالة للترددات في نطاق 0.2 هرتز و 2 هرتز. عادة ، لا تسجل أكثر من 2 خلية عضلية / CS للتقصير عبر نطاق معين من ترددات التحفيز.
  17. سجل ما لا يقل عن 7 انقباضات / خلية للحصول على بيانات موثوقة بمتوسط الإشارة عند تحليل التسجيلات (انظر الخطوة 3.).

3. تحليل بيانات وظيفة انقباض في الخلايا العضلية المعزولة

  1. للبدء، حدد ملف، واختر تتبعا مسجلا، ثم حدد فتح. حدد علامة التبويب 1 (الجانب الأيسر) من التتبع الأساسي ثم اضبط اللوحة الصفراء في أعلى التتبع على Sarc-Length. حدد عمليات التتبع وقالب الشاشة المعد في الخطوة 2.12.
  2. لإعداد قالب تحليل، حدد العمليات، خيارات التحليل العابر الأحادي، علامة حدث TTL في المربع تعريف t0، بالإضافة إلى الخيارات التالية من القائمة: خط الأساس (طول القطعة العضلية أثناء الراحة) ، سرعة المغادرة بالنسبة إلى t0 (dep v) ، الذروة (ارتفاع الذروة و٪ ارتفاع الذروة / خط الأساس أو bl٪ الذروة h) ، سرعة العودة بالنسبة إلى tPeak (ret v) ، الوقت إلى الذروة 50٪ (TTP 50٪) باستخدام t0 ، والوقت إلى خط الأساس 50٪ (TTR50٪) باستخدام tPeak. احفظ خيارات التحليل هذه عن طريق تحديد القوالب > حفظ قالب التحليل بمعرف. قم بتحميل قالب التحليل هذا قبل تحليل كل تتبع.
  3. لبدء تحليل البيانات، حدد العلامات > البوابة > إضافة > عابرة تحويل من علامة الحدث > نطاق التحليل. الآن اضبط النطاق الزمني من -0.01 ثانية إلى 1.20 ثانية للخلايا العضلية التي تسير بسرعة 0.2 هرتز (الشكل 2 أ ، علامات حمراء على الجزء السفلي من التتبع الخام). حدد نطاقا زمنيا أقصر للخلايا العضلية المحفزة بترددات أعلى.
  4. قم بإنشاء تتبع متوسط الإشارة عن طريق تحديد العمليات > متوسط الأحداث. يظهر تسجيل متوسط الإشارة أسفل تتبع القاعدة الأصلي.
  5. حدد علامة التبويب 1 من تتبع متوسط الإشارة (الجانب الأيسر من الشاشة)، ثم حدد علامات في القائمة العلوية، متبوعة بإضافة عابر. حدد العمليات من القائمة العلوية والتحليل العابر الأحادي لعرض القيم المتوسطة للإشارة لطول القطعة العضلية الأساسية وارتفاع الذروة و bl٪ peak h و dep v و ret v و TTP50٪ و TTR50٪ في لوحة العرض ذات متوسط الإشارة.
  6. انقل كل تحليل عابر للقطعة العضلية إلى جدول بيانات للتحليل المركب للخلايا العضلية المتعددة عن طريق تحديد تصدير > تحليل عابر أحادي > تيار الحافظة. الصق هذه البيانات في جدول البيانات لكل تتبع.
  7. لنسخ تتبع متوسط الإشارة، حدد تصدير > التتبع الحالي > خيارات الحافظة > واضبط المنازل العشرية على 5، ثم حدد محدد علامات الجدولة، وانقر فوق موافق وموافق. الصق آثار متوسط الإشارة لكل تسجيل خلية عضلية في جدول بيانات ثان.

4. تسجيل Ca2+ عابرين في الخلايا العضلية القلبية البالغة للفئران

  1. قبل قياس Ca2+ العابرين ، قم بتشغيل مكونات النظام الأساسي الموضحة في الخطوة 2.2 ، جنبا إلى جنب مع مكونات التصوير الفلوري الإضافية (انظر المكونات الإضافية لتحليل التصوير Ca2 + في جدول المواد ؛ الشكل التكميلي 2A-5,6 ؛ 2B-12).
  2. تحضير محلول مخزون Fura-2AM يحتوي على 1 mM Fura-2AM بالإضافة إلى 0.5 M بروبينسيد في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يقلل Probenecid من تسرب Fura-2AM15.
  3. قم بتخفيف محلول المخزون إلى 5 ميكرومتر Fura-2AM و 2.5 mM probenecid في 2.5 مل من الوسائط (انظر جدول المواد) في بئر واحد من لوحة 6 آبار. أضف وسائط سعة 2.5 مل وحدها (بدون Fura-2AM) إلى ثلاثة آبار إضافية في اللوحة ، وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم ، وقم بتسخين الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  4. انقل CS الذي يحتوي على الخلايا العضلية من غرفة السرعة إلى البئر الذي يحتوي على Fura-2AM ، وقم بتغطيته ، وأعد اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 دقائق. قم بتركيب الأنابيب في مضخة التروية واستخدمها مع الوسائط أثناء فترة تحميل Fura-2AM ، كما هو موضح في الخطوة 2.4.
  5. قم بإيقاف تشغيل أو تقليل مصابيح الغرفة لتقليل التبييض الضوئي الفلوري ولتحسين إشارة التألق. قم بإزالة اللوحة المكونة من 6 آبار من الحاضنة ، ثم اغسل CS لمدة 10 ثوان في كل من الآبار الثلاثة التي تحتوي على وسائط وحدها. انقل CS إلى قارب وزن صغير يحتوي على وسائط مسبقة التسخين (بدون إضافة Fura-2AM).
  6. قم بتركيب CS على حجرة CS مدهونة حديثا بعد مسح الجانب السفلي من CS برفق. أضف قطرة من الوسائط برفق إلى CS ، ثم قم بتجميع حامل القطب فوق CS ، متبوعا ب CS ثان والحامل العلوي. استخدم مسامير #0 ذات الرأس لإنهاء تجميع حجرة الخلية ، كما هو موضح في الخطوات 2.6.-2.7.
  7. قم بتوصيل أنبوب المضخة المملوء بالوسائط بالتسخين الأولي ، وقم بتوصيل التسخين الأولي بحجرة CS ، وضعه في محول مرحلة ، كما هو موضح في الخطوة 2.8. اجمع الوسائط باستخدام نظام الأنابيب المفرغة وقم بتشغيل نظام التسخين (الشكل التكميلي 2A ، D-7) لموازنة الغرفة إلى 37 درجة مئوية ، كما هو موضح في الخطوات 2.8.-2.9.
  8. قم بتنشيط محفز السرعة (الشكل التكميلي 2B-13) المضبوط على 35-40 فولت و 0.2 هرتز ، كما هو موضح في الخطوة 2.10.
  9. قبل تسجيل Ca2+ عابر ، قم بتشغيل مصباح يدوي صغير أو مصباح كتب مثبت بالقرب من لوحة مفاتيح الكمبيوتر للمساعدة في رؤية لوحة المفاتيح. بالإضافة إلى ذلك ، سجل خلفية مضان في منطقة خالية من الخلايا العضلية القلبية. للبدء، حدد ملف > ابدأ > جديد، كما هو موضح في الخطوة 2.12.
  10. حدد عائد استثمار، وقم بتعيين علامة تبويب واحدة (أو شريط تتبع، الجانب الأيسر) للبسط الأولي وعلامة تبويب ثانية للمقام الخام، محددة في أعلى منتصف كل علامة تبويب. سجل الخلفية لمدة 10-20 ثانية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس واسحب فوق لوحة شريط تتبع واحدة للحصول على قيم البسط والمقام بمتوسط الإشارة الأولية. أدخل هذه القيم عن طريق تحديد العمليات > الثوابت، وأدخل القيم الأولية.
  11. قم بإعداد قالب شاشة جديد لجمع كل من التقصير و Ca2+ العابرين. بالنسبة لطول القطعة العضلية، حدد علامة التبويب 1 واستخدم العملية نفسها الموضحة في الخطوة 2.13. بالنسبة للتصوير ب Ca2+ ، حدد نسبة > Tab 2 (أعلى منتصف علامة التبويب) > عمليات التتبع > تحرير حدود المستخدم لتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لمستويات النسبة، والتي يتم تعيينها عادة بين 1 و5. استخدم نفس العملية لتحديد نطاقات البسط والمقام لعلامات التبويب 3 و 4 (الجانب الأيسر).
  12. ضع مربع عائد استثمار فوق صورة خلية عضلية، كما هو موضح في الخطوة 2.14. حدد ملف > تجميع > جديد. الآن حدد ابدأ لجمع بيانات Ca2+ القصيرة والتناسبية. سجل ≥7 انقباضات / خلية لتحليل متوسط الإشارة.
  13. كرر تسجيل تتبع الخلفية الموضح في الخطوة 4.10. بعد تسجيل 2-4 خلايا عضلية. عادة ، سجل 4-5 خلايا عضلية / CS أو عدد أقل من الخلايا العضلية إذا كانت هناك تغييرات كبيرة في قراءة الخلفية.

5. تحليل بيانات Ca2+ العابرين في الخلايا العضلية المعزولة.

  1. افتح الملف المطلوب للتحليل وحدد قوالب > قالب الشاشة للتقصير بالإضافة إلى Ca2+ العابرين. بعد ذلك ، حدد علامات التبويب 1 و 2 (يسار) لإظهار طول القطعة العضلية ونسبة Ca2+ ، على التوالي. حدد العمليات > الثوابت وأدخل قيم البسط والمقام من تتبع الخلفية Ca2+ .
  2. قم بإعداد قوالب التحليل لتقصير البيانات العابرة بالإضافة إلى Ca2+ . حدد علامة التبويب 1 (الجانب الأيسر) واستخدم نفس العملية كما هو موضح في الخطوة 3.2. لتعيين قالب تحليل طول القطعة العضلية.
  3. حدد علامة التبويب 2 (الجانب الأيسر)، وحدد العمليات، وخيارات التحليل العابر الأحادي، وعلامة الحدث TTL في المربع تعريف t0، والخيارات التالية من القائمة: خط الأساس (النسبة الأساسية)، سرعة المغادرة بالنسبة إلى t0 (dep v)، الذروة (ارتفاع الذروة و٪ ارتفاع الذروة / خط الأساس أو bl٪ الذروة h) ، سرعة الاضمحلال بالنسبة إلى tPeak (ret v) ، الوقت إلى الذروة 50٪ (TTP 50٪) باستخدام t0 ، والوقت إلى خط الأساس 50٪ (TTR50٪) باستخدام tPeak. احفظ خيارات التحليل هذه عن طريق تحديد القوالب وحفظ قالب التحليل باستخدام اسم معرف جديد. قم بتحميل قالب التحليل هذا قبل تحليل كل تتبع.
  4. استخدم نفس العملية كما هو موضح في الخطوات 3.3.-3.6. لحساب متوسط الإشارة ثم تحليل طول القطعة العضلية، متبوعا بنفس الخطوات لعابري Ca2+ . ضع علامات منفصلة لطول القطعة العضلية ولتتبع النسبة العابرة Ca2+ .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم إجراء دراسات وظيفة انقباض على الخلايا العضلية الفئران بدءا من اليوم التالي للعزل (اليوم 2) حتى 4 أيام بعد العزلة. على الرغم من أنه يمكن تسجيل الخلايا العضلية في اليوم التالي للعزل (أي اليوم 2) ، إلا أن أوقات الاستزراع الأطول غالبا ما تكون مطلوبة بعد نقل الجينات أو العلاجات لتعديل وظيفة الانقباض8. بالنسبة للخلايا العضلية المستزرعة لأكثر من 18 ساعة بعد العزل ، يساعد بروتوكول السرعة الموصوف في القسم 1 في الحفاظ على الأنابيب التائية ونتائج التقصير وإعادة الإطالة المتسقة.

يظهر جزء تمثيلي من CS يحتوي على خلايا عضلية لتقصير الدراسات في الشكل 1A ، جنبا إلى جنب مع خلية عضلية في وضع مناسب قبل تحديد عائد الاستثمار (الشكل 1B). بمجرد تحديد عائد الاستثمار (الشكل 1C ؛ المربع الوردي) ، تساعد معلومات الخوارزمية الموضحة أسفل الخلية العضلية أيضا على تحسين وضع الخلية العضلية قبل التسجيل. على وجه التحديد ، تعد الكثافة الضوئية الخطية (LOD ؛ الخط الأسود) مؤشرا لعدد وتباعد القطع العضلية ، ويساعد طيف الطاقة الحاد في تتبع تحويل فورييه السريع (FFT ، الخط الأحمر) على تحقيق المحاذاة المثلى لتسجيل التقصير وإعادة الإطالة. يوضح الشكل 1 د النمط الجراتيكول المستخدم لمعايرة طول القطعة العضلية (واكتشاف الحواف). يظهر تسجيل محاذاة نموذجي لتقصير طول القطعة العضلية في الشكل 2A (اللوحة العلوية) ، جنبا إلى جنب مع تحليل متوسط الإشارة الموصوف في القسم 3 (اللوحة السفلية).

غالبا ما يتم اكتشاف الخلل الوظيفي في الخلايا العضلية عندما يكون هناك خلل وظيفي في الجسم الحي في النماذج الحيوانية. على سبيل المثال ، تم الكشف أيضا عن الخلل الوظيفي الانقباضي الذي لاحظه تخطيط صدى القلب استجابة للضغط الزائد (PO)13 في دراسات تقصير الخلايا العضلية5. لتوضيح آثار البيانات ، يتم عرض آثار خام تمثيلية (الشكل 2 ؛ اللوحة العلوية) ومتوسط الإشارة (الشكل 2 ؛ اللوحة السفلية) تم الحصول عليها عند 0.2 هرتز للخلايا العضلية من الفئران الوهمية (الشكل 2 أ) والفئران المعالجة ب PO (الشكل 2 ب). لاختبار ما إذا كان يمكن إنقاذ وظيفة الخلية العضلية بعد الفم، تم أيضا استخدام نقل الجينات بوساطة فيروسية في وقت عزل الخلايا العضلية لاستبدال تروبونين القلب الداخلي I (cTnI) باستبدال cTnI T144D المحاكي للفوسفو (T144D) في القطعة العضلية16. يظهر التحليل الأولي أن الانخفاض الناجم عن PO في وظيفة الانقباض (الجدول 1 ، اللوحة العلوية) عاد نحو مستويات الوهمية في الخلايا العضلية PO بعد 4 أيام من نقل الجينات ل cTnIT144D (الجدول 1 ؛ اللوحة السفلية).

يمكن أيضا استخدام هذه المنصة لقياس العابرين Ca2+ ، إلى جانب التقصير في الخلايا العضلية المعزولة. لم يتم تسجيل التقصير و Ca 2+ بعد PO لأن PO يقلل من التصاق الخلايا العضلية للفئران ب laminin 13 ، وأظهر نموذج مشابه سابقا أن معالجة Ca2+ المتغيرة تتطور في نقطة زمنية مماثلة 17. بدلا من ذلك ، تم إجراء تجارب تمثيلية في الخلايا العضلية المحملة ب Fura-2AM المعزولة من الفئران البالغة من العمر 2-3 أشهر. يظهر تسجيل تمثيلي وآثار متوسط الإشارة في الشكل 3 ، جنبا إلى جنب مع تحليل البيانات في الجدول 2. بالنسبة لهذه المجموعة من التجارب ، تمت دراسة الخلايا العضلية المعزولة من الفئران البالغة بعد 4 أيام من نقل الجينات بوساطة غدية (تعدد العدوى = 100) من cTnIT144D أو cTnI من النوع البري. تم قياس كل من تقصير القطعة العضلية و Ca 2+ العابر بعد تحميل الخلايا العضلية بFura-2AM. عزز نقل الجينات ل cTnIT144D تقصير الذروة وارتفاع مستويات الكالسيوم2+ الانبساطي مقارنة ب cTnI في هذه الدراسات الأولية (الجدول 2). في حين أن هناك حاجة إلى تحليل أكثر شمولا ، تشير النتائج الأولية إلى أن الاستبدال في الجسم الحي ب cTnIT144D يمكن أن ينتج نمطا ظاهريا قلبيا معقدا بسبب التغيرات في كل من وظيفة الانقباض والتعامل مع Ca2+ بمرور الوقت.

Figure 1
الشكل 1: الخلايا العضلية القلبية للفئران البالغة المستخدمة في الدراسات الوظيفية. (أ) خلايا عضلية قلبية معزولة تمثيلية من فأر بالغ (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). يشير السهم إلى خلية عضلية تمثيلية تم تصويرها لتحليل الدالة الانقلابية. (ب) خلية عضلية تمثيلية ذات عائد استثمار (وردي) تقع على الجانب (شريط المقياس = 20 ميكرومتر). (ج) خلية عضلية تمثيلية ذات عائد استثمار (اللوحة العلوية)، ونمط القطعة العضلية لهذه الخلية العضلية (اللوحة السفلية، زرقاء؛ شريط المقياس = 20 ميكرومتر)، والذروة الحادة لطيف القدرة (اللوحة السفلية، حمراء). (د) التقاط شاشة 0.01 مم graticule لمعايرة قياسات التقصير. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تسجيلات تمثيلية من الخلايا العضلية للفئران. تم تسجيل تسجيل خام (اللوحة العلوية) وتتبع متوسط الإشارة (اللوحة السفلية) عند 0.2 هرتز في الخلايا العضلية من الفئران المعالجة بالضغط الزائد (A) و (B) الزائد للضغط (PO). تم عزل الخلايا العضلية بعد 18-20 أسبوعا من الجراحة ، مع إنتاج PO عن طريق التضيق فوق الكلوي13. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التسجيل والتحليل التمثيليان لطول القطعة العضلية (SL) وCa 2+ العابرين من الخلايا العضلية القلبية البالغة المحملة ب Fura-2AM. (أ) الآثار الخام ل SL و Ca 2+ نسبة عابرة (نسبة) وآثار البسط والمقام المستخدمة لإنتاج نسبة Ca2+ العابرة. (ب) مثال على آثار متوسط الإشارة ل SL (التتبع العلوي) ونسبة Ca2+ العابرة (التتبع السفلي). (ج) يتم تحليل الآثار لطول القطعة العضلية (SL) والنسبة العابرة Ca2+ باستخدام خوارزمية التتبع الرتيب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مجموعة الفئران الشام (ن = 30) أمر الشراء (ن = 32)
طول القطعة العضلية أثناء الراحة (مم; SL) 1.761 + 0.006 1.748 + 0.004
ارتفاع الذروة (٪ من خط الأساس) 9.003 + 0.409 6.680 + 0.552*
سعة الذروة (مم) 0.159 + 0.007 0.117 + 0.010*
معدل التقصير (مم / ثانية) -4.674 + 0.285 -4.143 + 0.335
معدل إعادة الإطالة (مم / ثانية) 3.251 + 0.223 2.706 + 0.273
وقت الذروة (ms; TTP) 60 + 2 59 + 3
الوقت لإعادة الإطالة بنسبة 50٪ (مللي ثانية ؛ TTR50٪) 35 + 2 37 + 3
مجموعة الفئران شام + cTnIT144D (ن = 14) PO + cTnIT144D (ن = 17)
طول القطعة العضلية أثناء الراحة (مم; SL) 1.768 + 0.009 1.776 + 0.004
ارتفاع الذروة (٪ من خط الأساس) 9.038 + 1.339 8.414 + 0.960
سعة الذروة (مم) 0.160 + 0.023 0.149 + 0.016
معدل التقصير (مم / ثانية) -5.972 + 0.711 -4.173 + 0.726
معدل إعادة الإطالة (مم / ثانية) 3.925 + 0.577 3.055 + 0.403
وقت الذروة (ms; TTP) 51 + 5 59 + 2
الوقت لإعادة الإطالة بنسبة 50٪ (مللي ثانية ؛ TTR50٪) 31 + 3 32 + 2

الجدول 1: مقارنة وظيفة انقباض في الخلايا العضلية القلبية استجابة للضغط الزائد (PO) ونقل الجينات. نتائج تقصير الخلايا العضلية هي من قلوب الفئران الوهمية و PO بعد 18-20 أسبوعا من الجراحة (اللوحة العلوية) 5،13 والخلايا العضلية من الفئران الوهمية و PO بعد 4 أيام من نقل الجينات cTnIT144D (اللوحة السفلية). يتم قياس وظيفة انقباض بعد 4 أيام من عزل الخلايا العضلية / نقل الجينات في جميع المجموعات. يتم التعبير عن النتائج كمتوسط ± SEM (n = عدد الخلايا العضلية). تتم مقارنة كل مجموعة من البيانات الوهمية و PO بواسطة اختبار t للطالب ، مع اعتبار * p < 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم الإبلاغ عن نتائج سعة الذروة للخلايا العضلية الوهمية والخلايا العضلية PO وحدها في وقت سابق في Ravichandran et al.5.

تحليل طول القطعة العضلية
مجموعة نقل الجينات cTnI (ن = 21) cTnIT144D (ن = 16)
طول القطعة العضلية أثناء الراحة (مم; SL) 1.81 + 0.01 1.81 + 0.01
سعة الذروة (مم) 0.11 + 0.01 0.14 + 0.02*
معدل التقصير (مم / ثانية) -4.29 + 0.42 -4.67 + 0.77
معدل إعادة الإطالة (مم / ثانية) 2.92 + 0.43 3.71 + 0.64
وقت الذروة (ms; TTP) 50 + 4 84 + 28
الوقت لإعادة الإطالة بنسبة 50٪ (مللي ثانية ؛ TTR50٪) 37 + 4 35 + 6
تحليل عابر Ca2+
مجموعة نقل الجينات cTnI (ن = 21) cTnIT144D (ن = 19)
يستريح الكالسيوم2+ نسبة 0.89 + 0.02 1.04 + 0.04*
ذروة الكالسيوم2+ نسبة 0.50 + 0.05 0.42 + 0.07
Ca2+ معدل عابر (D / ثانية) 45.24 + 5.85 40.53 + 10.95
الكالسيوم2+ معدل الاضمحلال (D / s) -4.91 + 0.99 -2.87 + 0.57
الوقت اللازم للوصول إلى الذروة Ca2+ (مللي ثانية ؛ TTP) 34 + 2 41 + 3
الوقت إلى 50٪ الكالسيوم2+ الاضمحلال (مللي ثانية ؛ 50٪ TTD) 101 + 8 117 + 6

الجدول 2: وظيفة انقباض و Ca2+ عابرة في الخلايا العضلية للفئران البالغة بعد 4 أيام من نقل الجينات cTnIT144D. يظهر تحليل وظيفة الانقباض (اللوحة العلوية) و Ca2+ العابرة (اللوحة السفلية) في الخلايا العضلية بعد نقل الجينات ل cTnIT144D مقارنة ب cTnI من النوع البري. يتم عزل الخلايا العضلية من الفئران البالغة من العمر 2-3 أشهر ، ويتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM (n = عدد الخلايا العضلية). يتم إجراء مقارنات إحصائية لدالة انقباض (يسار) و Ca2+ عابرة (يمين) باستخدام اختبار t للطالب غير المزاوج مع تعيين الدلالة على * p < 0.05.

الشكل التكميلي 1: مكونات نظام سرعة الخلايا العضلية المطلية على CSs المغلفة باللامينين. (أ) غرفة سرعة مخصصة تحتوي على أقطاب بلاتينية في كل غرفة. (ب) غرفة السرعة مع الغرف الأربع الأولى المملوءة بالوسائط. (ج) غرفة السرعة المتصلة بكابلات مقبس الموز ، والتي يتم توصيلها بالغرفة و (د) المحفز. (ه) الوصلة بين المحفز (يمين) والحاضنة 37 درجة مئوية (يسار). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: المكونات اللازمة لوظيفة انقباض الخلايا العضلية و / أو قياسات Ca2+ العابرة. (أ) منصة وظيفة انقباض توضح كل مكون ، مع شرح العناصر المرقمة بمزيد من التفصيل في جدول المواد. تشتمل المكونات الموجودة في المنصة على طاولة مضادة للاهتزاز (# 11) ، مجهر برايتفيلد مقلوب (# 2،3) ، كاميرا CCD (# 4) ، وحدة تحكم CCD ومصدر طاقة زينون (# 5) ، مصدر ضوء انبعاث مزدوج ، تحكم في درجة الحرارة ، مضخة تمعجية ، حامل أنبوب معزول ، غرفة تروية مثبتة على الغطاء (# 10) ، ونظام فراغ (# 11). (ب) تشمل المكونات الإضافية واجهة التألق (# 12) ، ومحفز الغرفة (# 13) ، وكمبيوتر الكمبيوتر الشخصي (# 14) ، والتي يتم شرحها بمزيد من التفصيل في جدول المواد. تظهر المناظر المقربة للعناصر المرقمة في اللوحة A في C-F. (C) منظر لمصدر طاقة الزينون (يسار) ووحدة التحكم في CCD (يمين). (د) جهاز التحكم في درجة الحرارة. (ه) المضخة التمعجية. (F) منظر لقاعدة غرفة التروية CS (السهم الأسود) ، وحامل القطب البلاتيني (السهم الرمادي) ، والحامل العلوي (السهم الأبيض) مع مسامير رأس # 0. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعمل بروتوكول السرعة المزمن الموضح في الخطوة 1 على إطالة الوقت المفيد لدراسة الخلايا العضلية المعزولة وتقييم تأثير العلاجات الأطول. في مختبرنا ، تم الحصول على نتائج متسقة تصل إلى 4 أيام بعد العزل عند قياس وظيفة الانقباض باستخدام طول القطعة العضلية على الخلايا العضلية ذات الخطى المزمنة. ومع ذلك ، تتدهور وظيفة انقباض الخلايا العضلية بسرعة عند استخدام الوسائط التي يزيد عمرها عن 1 أسبوع لتسريع الخلايا العضلية.

بالنسبة لدراسات وظيفة الانقباض ، يتم جمع البيانات عند 37 درجة مئوية ، وهي قريبة من درجة حرارة الجسم للفئران. لتحسين صلاحية الخلايا العضلية والحصول على آثار متسقة لكل خلية عضلية ، يتم إجراء هذه التجارب بتردد سرعة أقل من معدل ضربات القلب الفسيولوجي ~ 5 هرتز في الفئران. تنتج هذه الإعدادات بيانات دالة انقباضية متسقة ، ولكن يمكن ضبط درجة حرارة الغرفة و / أو تردد السرعة إذا ظلت آثار التقصير متسقة عبر CSs متعددة تحتوي على نفس مجموعة العلاج من الخلايا العضلية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الحصول على أفضل النتائج عن طريق اختيار الخلايا العضلية التي تفتقر إلى الفقاعات ، وتلتزم تماما ب CS ، وتقلص في طرفي خلية على شكل قضيب. الخلايا المرتبطة في نهاية واحدة فقط ، وتلك التي تحتوي على فقاعات متعددة ، و / أو تقلص الخلايا العضلية في نهاية واحدة فقط غير مرغوب فيها وغالبا ما يكون تسجيلها أكثر صعوبة بسبب حركة الخلفية. بالنسبة لهذه الدراسات ، يتم تضمين ≥20 قطعة عضلية في عائد الاستثمار لتحقيق ذروة طيف طاقة حادة ، وأطوال قطع عضلية قابلة للتكرار ، ونسبة إشارة / ضوضاء مثالية لتتبع التقصير. يمكن استخدام عائد استثمار مع ما لا يقل عن سبع قطع عضلية إذا ظلت ذروة طيف الطاقة حادة. يتراوح طول القطعة العضلية أثناء الراحة في الخلايا العضلية للفئران المعزولة عادة من 2.00 إلى 1.80 ميكرومتر. إذا كان طول القطعة العضلية أثناء الراحة أقل من 1.5 μm، فإن الانقباض النشط ليس واقعيا بناء على فهمنا لبنية القطعة العضلية18، وعادة ما يكون ناتجا عن اتجاه الخلية العضلية دون المستوى الأمثل.

يعد قياس وظيفة الانقباض مع أو بدون قياسات عابرة Ca2+ في الخلايا العضلية السليمة نهجا أعلى إنتاجية يتطلب استثمارا أقل في تطوير الخبرة الفنية اللازمة لقياسات القوة في الخلايا المفردة السليمة11. تركز دراسات الخلايا العضلية السليمة أيضا بشكل حصري على وظيفة الخلايا العضلية ، دون مساهمة أنواع الخلايا الأخرى في المستحضرات متعددة الخلايا2. مجال ناشئ في هذا المجال هو تطوير تحليل إنتاجية أعلى عن طريق قياس تقصير و / أو عابرات Ca2+ في وقت واحد في خلايا عضلية متعددة سليمة لتسريع فحص العوامل العلاجية على المستوى الخلوي قبل تحليل أكثر شمولا في الجسم الحي .

وظيفة انقباض وقياسات Ca2+ العابرة ممكنة أيضا في الخلايا العضلية السليمة المعزولة عن نماذج القوارض الأخرى مثل الفئران ، على الرغم من وجود بعض الاعتبارات والاختلافات المهمة مقارنة بالخلايا العضلية للفئران. الخلايا العضلية للفأر قابلة للحياة في الثقافة لمدة 24-36 ساعة ، ولكن الجدوى تنخفض تدريجيا في الخلايا العضلية المستزرعة لأكثر من 48 ساعة19. يجب مراعاة هذا الفاصل الزمني للثقافة المقطوعة عند استخدام نقل الجينات القائم على النواقل ، خاصة بالنسبة لبروتينات الخيوط العضلية التي لها عمر نصف بالأيام بدلا من الساعات20. على عكس الخلايا العضلية للفئران ، يعتمد العزل الناجح وثقافة الخلايا العضلية للفأر أيضا على إضافة مثبطات الميوسين ATPase ، مثل 2،3-butanedione monoxime أو blebbistatin ، إلى وسائط الثقافة19. نتيجة لذلك ، فإن السرعة المزمنة ليست خيارا قابلا للتطبيق في ثقافات الخلايا العضلية للفأر. هناك حاجة أيضا إلى وقت توازن أطول من 15-20 دقيقة لإزالة التأثير الوظيفي لمثبطات الميوسين هذه على الخلايا العضلية للفأر المعزولة. أخيرا ، يتم تخطيط الخلايا العضلية للفأر على النحو الأمثل عند 0.5 هرتز للحصول على آثار تقصير قابلة للتكرار مقارنة ب 0.2 هرتز المستخدمة في الخلايا العضلية للفئران.

في الدراسات التي أجريت على الفئران المعالجة ب PO ، يتم اكتشاف ضعف الانقباض باستمرار مع سرعة التردد المنخفض في الخلايا العضلية للفئران. كما تم الكشف عن انخفاض أكبر يعتمد على التردد في التقصير في الخلايا العضلية بعد PO مقارنة بالفئران الوهمية عندما يكون هناك خلل وظيفي مقلص في الجسم الحي 5,13. أثناء دراسة باستخدام مجموعة من الترددات ، أدت مضاعفة سرعة المضخة لتوفير وسائط كافية إلى تقصير الحالة المستقرة في غضون 15-20 ثانية بعد تغيير تردد التحفيز بين 0.2 و 2 هرتز. تستجيب الخلايا العضلية للفئران أيضا للتحفيز قصير المدى عند ترددات أعلى تصل إلى 8 هرتز ، على الرغم من أن صلاحية الخلية تتدهور بسرعة عند هذه الترددات الأعلى. بشكل عام ، أثبتت وظيفة انقباض الخلايا العضلية أنها نهج قابل للتكرار لتأكيد أو التحقق من صحة الخلل الوظيفي في القلب في الجسم الحي في نماذج الفئران ، مثل PO- مقارنة بالفئران المعالجة بالخداع (الجدول 1 ؛ انظر Kim et al.13). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه المنصة اختبار ما إذا كان العلاج الذي يستهدف الخلايا العضلية يستعيد أو يضعف وظيفة الانقباض قبل متابعة مناهج أكثر تكلفة و / أو شاقة في الجسم الحي. يمكن استخدام هذا النهج كل من الولادة الحادة والتعرض الطويل للعوامل العلاجية و / أو بعد الولادة الجينية أثناء الزراعة الأولية. على سبيل المثال ، تشير تجارب نقل الجينات لاستبدال cTnI الداخلي ب cTnIT144D إلى عدم وجود تغيير كبير في تقصير السعة في الخلايا العضلية من الفئران الوهمية. في المقابل ، يستعيد cTnIT144D سعة تقصير الذروة نحو القيم الوهمية في الخلايا العضلية من الفئران المعالجة ب PO (الجدول 1). الضعف المتأصل في هذا النهج هو عدم وجود الحمل النموذجي الموجود في الخلايا العضلية في ظل ظروف الجسم الحي. نتيجة لذلك ، قد تختلف الاستجابات عن الاستجابات الوظيفية المعتمدة على الحمل ، وتشير التجربة النموذجية إلى أن هناك حاجة إلى نهج في الجسم الحي لمزيد من التحقيق فيما إذا كان cTnIT144D يحسن أداء القلب أثناء PO.

يعد قياس كل من التقصير و Ca2+ العابر في نفس الخلية العضلية ميزة لهذه المنصة. على سبيل المثال ، قد يختلف اتجاه التغيير بالنسبة للعابرين Ca2+ مقارنة بوظيفة الانقباض. كما هو موضح في الجدول 2 ، يزداد تقصير الذروة بشكل ملحوظ بعد نقل الجينات من cTnIT144D إلى الخلايا العضلية من الفئران البالغة من العمر 2-3 أشهر. تختلف هذه النتيجة عن البيانات التي تم الحصول عليها في الخلايا العضلية الأكبر سنا والمعالجة بالخداع (الجدول 1) وقد تكون مرتبطة بعمرالفئران 5. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات لإثبات هذا التفسير. تظهر البيانات الواردة في الجدول 2 أيضا أن cTnIT144D لا يغير سعة الذروة Ca 2+ ، وبدلا من ذلك ، يميل إلى إبطاء معدل اضمحلال Ca 2+ ورفع راحة Ca 2+. تشير هذه النتائج إلى أن تعبير cTnIT144D يعزز وظيفة الانقباض ، بينما تعوض آلية ركوب الدراجات Ca2+ لتخفيف هذا التأثير. تسلط هذه النتائج الضوء على قدرة هذا النهج على التمييز بين التغيرات في وظيفة الانقباض ودورة Ca2+. في حين أن النتائج المحددة المقدمة هنا ليست نهائية بعد ، إلا أنها توفر أساسا منطقيا قويا لتطوير نموذج حيواني وراثي للتعبير عن عضلة القلب cTnIT144D وتقييم ما إذا كان تعبيره يضعف الخلل الوظيفي الناجم عن PO في المستقبل. الملاحظة الأخيرة من بيانات Ca 2+ العابرة هي أن الأصباغ الفلورية مثل Fura-2AM تغير حركية وظيفة الانقباض في الخلايا العضلية21. على الرغم من أن الاستجابة النسبية الناتجة عن علاج معين أو نموذج حيواني يمكن مقارنتها داخل الخلايا العضلية المحملة ب Fura-2 ، إلا أنه لا ينبغي دمج هذه النتائج مع قياسات التقصير التي يتم إجراؤها في غياب Fura-2AM. لتحسين استخدام Fura-2AM للتحليل العابر Ca 2+ ، غالبا ما يقيس المختبر التقصير في غياب Fura-2AM ويقوم بإجراء مجموعة فرعية من التجارب لقياس عابري Ca2+.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL144777 (MVW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEDIA
Bovine serum albumin Sigma (Roche) 3117057001 Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione Sigma G-6529 Final concentration = 10 mM
HEPES Sigma H-7006 Final concentration = 15 mM
M199 Sigma M-2520 1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3 Sigma S-8875 Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin Fisher 15140122 Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma  D2650
Fura-2AM Invitrogen (Molecular Probes) F1221 50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid Invitrogen (Fisher) P36400 Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips Corning 2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks Pomona Electronics B-36-2 Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2  Forma 3110 Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp Forma 1286 Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45 Fine Science Tools 11251-35
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 1800-45
Low magnification inverted microscope Leica DM-IL  Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber Custom Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator Ionoptix Myopacer Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis Ionoptix Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface  - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s) Ionoptix  Myocam with CCD controller  Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).                                                                                               
 Chamber stimulator Ionoptix  Myopacer Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F) Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients Ionoptix PC with Ionwizard PC board and software Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes.
- A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI Fine Science Tools 11252-40 Panel F
Insulated tube holder for media Custom Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope Nikon TE-2000S Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table TMC Vibration Control 30 x 36 inches Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding  
Microscope eyepieces & objective Nikon 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.  
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 Panel A #8 and panel E
small weigh boat Fisher  08-732-112
Temperature controller Cell MicroControls TC2BIP Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor  Sylvania #72423 LED light Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter Fisher Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90 Panel A #11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
  2. Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
  3. Rossman, E. I., et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).
  4. McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts. Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).
  5. Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).
  6. Chaudhary, K. W., et al. Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).
  7. Walker, C. A., Spinale, F. G. The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).
  8. Lang, S. E., Westfall, M. V. Gene transfer into cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).
  9. Davis, J., et al. Designing heart performance by gene transfer. Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).
  10. Sweitzer, N. K., Moss, R. L. Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin. Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).
  11. Yasuda, S., et al. Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).
  12. Racca, A. W., et al. Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle. The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).
  13. Kim, E. H., et al. Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure. Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).
  14. Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).
  15. Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).
  16. Sakthivel, S., et al. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).
  17. Qi, M., et al. Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy. The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).
  18. Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume. American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).
  19. Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).
  20. Zak, R. Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart. Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).
  21. Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats. Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).

Tags

الطب ، العدد 183 ،
تحليل ضعف انقباض القلب و Ca<sup>2+</sup> عابر في الخلايا العضلية القوارض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavey, E. A., Westfall, M. V.… More

Lavey, E. A., Westfall, M. V. Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes. J. Vis. Exp. (183), e64055, doi:10.3791/64055 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter