설치류 근육 세포에서 심장 수축 기능 장애 및Ca 2+ 과도 현상 분석
Summary
분리된 쥐 근세포에서 칼슘(Ca 2+) 과도 측정과 함께 근절 길이 검출을 통한 수축 기능의 측정을 설명하는 일련의 프로토콜이 제시됩니다. 심부전 동물 모델에서의 연구에 대한이 접근법의 적용도 포함됩니다.
Abstract
수축성 기능 장애 및Ca 2+ 과도 현상은 종종 심장 유발 손상 및/또는 리모델링에 대한 포괄적인 평가의 일부로 세포 수준에서 분석됩니다. 이러한 기능적 변화를 평가하기 위한 한 가지 접근법은 원발성 성인 심장 근세포에서 무부하 단축 및Ca 2+ 과도 분석을 활용합니다. 이 접근법을 위해, 성체 근세포는 콜라게나제 소화에 의해 분리되고,Ca 2+ 에 내성이 있게 된 다음, 라미닌 코팅 커버슬립에 부착된 다음, 무혈청 배지에서 전기 페이싱을 한다. 일반적인 프로토콜은 성인 쥐 심장 근육 세포를 사용하지만 다른 종의 원발성 근육 세포에 대해 쉽게 조정할 수 있습니다. 손상된 심장에서 근육 세포의 기능적 변화는 가짜 근육 세포 및 / 또는 시험관 내 치료 치료와 비교 될 수 있습니다. 이 방법론에는 세포실 및 플랫폼 구성 요소와 함께 근세포 페이싱에 필요한 필수 요소가 포함됩니다. 이 접근법에 대한 자세한 프로토콜은 원시 데이터 분석뿐만 아니라 비율 측정 지표 Fura-2 AM으로 측정 된 근절 길이 감지 및 셀룰러Ca 2+ 과도 현상에 의한 무부하 단축을 측정하는 단계를 통합합니다.
Introduction
심장 펌프 기능의 분석은 특히 심부전(HF)의 동물 모델에서 적절한 통찰력을 얻기 위해 다양한 접근법을 필요로 하는 경우가 많습니다. 심 초음파 또는 혈역학 적 측정은 생체 내 심장 기능 장애1에 대한 통찰력을 제공하는 반면, 체외 접근법은 종종 기능 장애가 여기 결합 또는 활동 전위와 수축 기능 (예 : 여기 수축 [E-C] 결합)을 담당하는 근필라멘트 및 / 또는Ca 2+ 과도 현상의 변화로 인해 발생하는지 여부를 식별하는 데 사용됩니다. 시험관내 접근법은 또한 비용이 많이 들거나 힘든 생체내 치료 전략을 추구하기 전에 신경호르몬, 벡터-유도된 유전적 변형 및 잠재적인 치료제2에 대한 기능적 반응을 스크리닝할 수 있는 기회를 제공한다.
HF 5,6의 존재 및 부재 하에서 손상되지 않은 근세포에서의 무부하 단축 및Ca 2+ 과도 현상뿐만 아니라 손상되지 않은 섬유주3 또는 투과화 된 근육 세포4에서의 힘 측정을 포함하여 시험관 내 수축 기능을 조사하기 위해 여러 접근법을 사용할 수 있습니다. 이러한 각 접근법은 심장 펌프 기능 2,7을 직접 담당하는 심장 근육 세포 수축 기능에 중점을 둡니다. 그러나, 수축 및 E-C 결합 둘 다의 분석은 단리된,Ca2+ 내성 성인 근세포에서 근육 길이 및Ca2+ 과도 현상의 단축을 측정함으로써 가장 자주 수행된다. 실험실은 이8단계를 위해 쥐 심장에서 근세포를 분리하기 위해 상세한 공개된 프로토콜을 활용합니다.
Ca 2+ 일시적 및 근섬유 모두 손상되지 않은 근세포의 단축 및 재연장에 기여하며 수축성 기능 장애에 기여할 수 있습니다 2,7. 따라서, 이 접근법은 시험관내 기능 분석에 Ca2+ 사이클링 기계와 미오필라멘트를 포함하는 온전한 근세포가 필요할 때 권장된다. 예를 들어, 온전한 단리된 근세포는유전자 전달9을 통해 근필라멘트 또는Ca2+ 순환 기능을 변형시킨 후 수축 기능을 연구하는 데 바람직하다. 또한, 다운스트림 제2 메신저 신호전달 경로의 영향 및/또는 치료제2에 대한 반응을 연구할 때 신경호르몬의 기능적 영향을 분석하기 위해 온전한 근세포 접근법이 제안된다. 단일 근육 세포에서 부하 의존적 힘의 대안적인 측정은 저온 (≤15 ° C)에서 막 투과화 (또는 스키닝) 후에Ca2+ 과도 기여를 제거하고 근섬유 기능10에 초점을 맞추기 위해 가장 자주 수행됩니다. 손상되지 않은 근세포에서 부하 의존적 힘과Ca 2+ 과도 현상의 측정은 특히 신경 호르몬 신호 전달에 대한 반응을 측정하거나 치료제에 대한 스크린과 같이 더 높은 처리량이 필요한 경우 접근법11의 복잡하고 기술적 인 도전으로 인해 드뭅니다. 심장 섬유주의 분석은 이러한 기술적 문제를 극복하지만 비근세포, 섬유증 및/또는 세포외기질 리모델링의 영향을 받을 수도 있습니다2. 신생아 근세포 및 유도성 만능줄기세포(iPSC)로부터 유래된 근세포는 아직 성체 근필라멘트 단백질의 완전한 보체를 발현하지 못하고 일반적으로 성체 막대형 근세포에 존재하는 근필라멘트 조직의 수준이 부족하기 때문에 상술한 각각의 접근법은 성체 근세포를 함유하는 제제를 필요로한다2. 현재까지 iPSC의 증거는 성체 이소 형으로의 완전한 전환이 배양12에서 134 일 이상을 초과한다는 것을 나타냅니다.
HF에 대한 이 수집의 초점을 감안할 때, 프로토콜에는 실패한 것과 실패하지 않는 손상되지 않은 온전한 근세포에서 수축 기능을 구별하기 위한 접근 방식과 분석이 포함됩니다. 대표적인 예는 앞서 설명한 신장 상부 축착 후 18-20주 후에 연구된 쥐 근세포로부터 제공된다(5,13). 그런 다음 가짜 처리 된 쥐의 근육 세포와 비교합니다.
여기에 설명된 프로토콜 및 이미징 플랫폼은 HF 발달 동안 막대 모양의 심장 근세포에서 단축 및Ca 2+ 과도 현상의 변화를 분석하고 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 분석을 위해, 2 x 104 Ca2+-내성, 막대-형상의 근세포를 22mm2 라미닌-코팅된 유리 커버슬립(CSs) 상에 플레이팅하고, 앞서8에 기술된 바와 같이 밤새 배양하였다. 이 이미징 플랫폼을 위해 조립된 구성 요소는 최적의 이미징에 사용되는 미디어 및 버퍼와 함께 재료 표에 제공됩니다. 소프트웨어를 사용한 데이터 분석 가이드와 대표 결과도 여기에 제공됩니다. 전체 프로토콜은 별도의 하위 섹션으로 나뉘며, 처음 세 섹션은 분리된 쥐 근세포 및 데이터 분석에 초점을 맞추고 세포 Ca2+ 과도 실험 및 근세포에서의 데이터 분석이 이어집니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
1단계에 설명된 만성 페이싱 프로토콜은 분리된 근세포를 연구하고 더 긴 치료의 영향을 평가하는 데 유용한 시간을 연장합니다. 우리 실험실에서는 만성적으로 진행되는 근육 세포에서 근절 길이를 사용하여 수축 기능을 측정 할 때 격리 후 최대 4 일까지 일관된 결과를 얻었습니다. 그러나 근세포 수축 기능은 근세포의 속도를 조절하기 위해 1주일 이상 된 배지를 사용할 때 빠르게 악화됩니다.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 (NIH) 보조금 R01 HL144777 (MVW)의 지원을받습니다.
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
References
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