Analys av hjärtkontraktil dysfunktion och Ca2+ transienter i gnagarmyocyter

Summary

En uppsättning protokoll presenteras som beskriver mätningen av kontraktil funktion via sarkomerlängdsdetektering tillsammans med kalcium (Ca²⁺) övergående mätning i isolerade råttmyocyter. Tillämpningen av detta tillvägagångssätt för studier i djurmodeller av hjärtsvikt ingår också.

Abstract

Kontraktil dysfunktion och Ca²⁺ transienter analyseras ofta på cellnivå som en del av en omfattande bedömning av hjärtinducerad skada och / eller ombyggnad. Ett tillvägagångssätt för att bedöma dessa funktionella förändringar använder lossad förkortning och Ca²⁺ övergående analyser i primära vuxna hjärtmyocyter. För detta tillvägagångssätt isoleras vuxna myocyter genom kollagenasförtunning, görs Ca²⁺ toleranta och fästs sedan vid lamininbelagda täckglas, följt av elektrisk pacing i serumfria medier. Det allmänna protokollet använder vuxna råtta hjärtmyocyter men kan lätt justeras för primära myocyter från andra arter. Funktionella förändringar i myocyter från skadade hjärtan kan jämföras med skenmyocyter och/eller med in vitro-terapeutiska behandlingar. Metoden inkluderar de väsentliga elementen som behövs för myocytpacing, tillsammans med cellkammaren och plattformskomponenterna. Det detaljerade protokollet för detta tillvägagångssätt innehåller stegen för att mäta lossad förkortning genom sarkomerlängdsdetektering och cellulära Ca²⁺ transienter uppmätta med den ratiometriska indikatorn Fura-2 AM, samt för rådataanalys.

Introduction

Analysen av hjärtpumpens funktion kräver ofta en rad metoder för att få tillräcklig insikt, särskilt för djurmodeller av hjärtsvikt (HF). Ekokardiografi eller hemodynamiska mätningar ger insikt i in vivo hjärtdysfunktion¹, medan in vitro-metoder ofta används för att identifiera om dysfunktion uppstår från förändringar i myofilamentet och / eller Ca²⁺ övergående som är ansvarig för att koppla excitation, eller åtgärdspotentialen, med kontraktil funktion (t.ex. excitation-sammandragning [E-C] koppling). In vitro-metoder ger också en möjlighet att screena det funktionella svaret på neurohormoner, vektorinducerade genetiska förändringar samt potentiella terapeutiska medel² innan man fortsätter med kostsamma och / eller mödosamma in vivo-behandlingsstrategier .

Flera metoder finns tillgängliga för att undersöka in vitro-kontraktil funktion, inklusive kraftmätningar i intakta trabeculae³ eller permeabiliserade myocyter⁴, samt lossat förkortning och Ca²⁺ transienter i intakta myocyter i närvaro och frånvaro av HF ^5,6. Var och en av dessa metoder fokuserar på hjärtmyocytkontraktil funktion, som är direkt ansvarig för hjärtpumpfunktionen ^2,7. Analysen av både sammandragning och E-C-koppling tillsammans utförs emellertid oftast genom att mäta förkortning av muskellängden och Ca 2+ transienter i isolerade, Ca²⁺ toleranta vuxna myocyter. Laboratoriet använder ett detaljerat publicerat protokoll för att isolera myocyter från råtthjärtan för detta steg⁸.

Både Ca²⁺ övergående och myofilament bidrar till förkortning och förlängning i intakta myocyter och kan bidra till kontraktil dysfunktion ^2,7. Således rekommenderas detta tillvägagångssätt när in vitro-funktionell analys kräver en intakt myocyt som innehåller Ca²⁺ cykelmaskiner plus myofilamenten. Till exempel är intakta isolerade myocyter önskvärda för att studera kontraktil funktion efter modifiering av myofilamentet eller Ca²⁺ cykelfunktionen via genöverföring⁹. Dessutom föreslås en intakt myocytmetod för att analysera den funktionella effekten av neurohormoner när man studerar effekten av nedströms andra budbärarsignalvägar och / eller svar på terapeutiska medel². En alternativ mätning av belastningsberoende kraft i enstaka myocyter utförs oftast efter membranpermeabilisering (eller flåsning) vid låga temperaturer (≤15 °C) för att avlägsna Ca²⁺ övergående bidrag och fokusera på myofilamentfunktion¹⁰. Mätningen av belastningsberoende kraft plus Ca²⁺ transienter i intakta myocyter är sällsynt på grund av den komplexa och tekniska utmaningen med tillvägagångssättet¹¹, särskilt när högre genomströmning behövs, såsom för att mäta svar på neurohormonsignalering eller som en skärm för terapeutiska medel. Analysen av hjärttrabeculae övervinner dessa tekniska utmaningar men kan också påverkas av icke-myocyter, fibros och / eller extracellulär matrisombyggnad². Var och en av de metoder som beskrivs ovan kräver ett preparat som innehåller vuxna myocyter eftersom neonatala myocyter och myocyter härledda från inducerbara pluripotenta stamceller (iPSC) ännu inte uttrycker det fullständiga komplementet av vuxna myofilamentproteiner och vanligtvis saknar nivån av myofilamentorganisation som finns i den vuxna stavformade myocyten². Hittills indikerar bevis i iPSC att den fullständiga övergången till vuxna isoformer överstiger mer än 134 dagar i kultur¹².

Med tanke på fokus för denna samling på HF inkluderar protokollen tillvägagångssätt och analys för att skilja kontraktil funktion vid misslyckande kontra icke-sviktande intakta myocyter. Representativa exempel ges från råttmyocyter som studerats 18-20 veckor efter en supra-renal koarctation, beskriven tidigare ^5,13. Jämförelser görs sedan med myocyter från bluffbehandlade råttor.

Protokollet och bildplattformen som beskrivs här används för att analysera och övervaka förändringar i förkortning och Ca²⁺ transienter i stavformade hjärtmyocyter under utvecklingen av HF. För denna analys pläteras 2 x 10⁴ Ca 2+-toleranta, stavformade myocyter på²² mm² lamininbelagda glasöverdrag (CS) och odlas över natten, som beskrivits tidigare⁸. Komponenterna monterade för denna bildplattform, tillsammans med media och buffertar som används för optimal avbildning, finns i materialförteckningen. En guide för dataanalys med hjälp av en programvara och de representativa resultaten finns också här. Det övergripande protokollet är uppdelat i separata underavsnitt, med de tre första avsnitten som fokuserar på isolerade råttmyocyter och dataanalys, följt av cellulära Ca²⁺ övergående experiment och dataanalys i myocyter.

Protocol

Studier utförda på gnagare följde folkhälsopolitiken för human vård och användning av laboratoriedjur och godkändes av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. För denna studie isolerades myocyter från 3-34 månader gamla Sprague-Dawley och F344BN råttor som väger ≥ 200 g5. Både manliga och kvinnliga priser användes. 1. Myocytpacing för kontraktila funktionsstudier Gör färska M199-baserade medier f…

Representative Results

Kontraktila funktionsstudier utförs på råttmyocyter som börjar dagen efter isolering (dag 2) upp till 4 dagar efter isolering. Även om myocyter kan registreras dagen efter isolering (dvs. dag 2), krävs ofta längre odlingstider efter genöverföring eller behandlingar för att modifiera kontraktil funktion8. För myocyter odlade i mer än 18 timmar efter isolering hjälper pacingprotokollet som beskrivs i avsnitt 1 till att upprätthålla t-tubuli och konsekventa förkortnings- och förläng…

Discussion

Det kroniska pacingprotokollet som beskrivs i steg 1 förlänger den användbara tiden för att studera isolerade myocyter och bedöma effekterna av längre behandlingar. I vårt laboratorium erhölls konsekventa resultat upp till 4 dagar efter isolering vid mätning av kontraktil funktion med sarkomerlängd på kroniskt tempo myocyter. Myocytkontraktilfunktionen försämras emellertid snabbt när man använder media som är äldre än 1 vecka för att takta myocyter.

För kontraktila funktion…

Materials

MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps – Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: — Photon counting system            –  Xenon power supply with dual excitation light source            –  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 – The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps – Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing – E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90	Panel A #11