Summary
In dit werk werd een snelle, gevoelige en draagbare detectiemethode voor Candidatus Liberibacter asiaticus ontwikkeld op basis van recombinasepolymeraseversterking in combinatie met CRISPR-Cas12a.
Abstract
De vroege detectie van Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) door citrustelers vergemakkelijkt vroegtijdige interventie en voorkomt de verspreiding van ziekten. Een eenvoudige methode voor snelle en draagbare Huanglongbing (HLB) diagnose wordt hier gepresenteerd die recombinase polymerase amplificatie en een fluorescerende reporter combineert met behulp van de nuclease-activiteit van het geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische repeats / CRISPR-geassocieerde 12a (CRISPR-Cas12a) systeem. De gevoeligheid van deze techniek is veel hoger dan PCR. Bovendien vertoonde deze methode vergelijkbare resultaten als qPCR wanneer bladmonsters werden gebruikt. In vergelijking met conventionele CLas-detectiemethoden kan de hier gepresenteerde detectiemethode in 90 minuten worden voltooid en werkt deze in een isothermische toestand waarvoor geen PCR-machines nodig zijn. Bovendien kunnen de resultaten worden gevisualiseerd via een handheld fluorescerend detectieapparaat in het veld.
Introduction
Huanglongbing (HLB) is een van de meest problematische citrusziekten wereldwijd1. HLB wordt veroorzaakt door de floëem-koloniserende en kieskeurige bacterie Candidatus Liberibacter spp., waaronder Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus en Ca. L. americanus2. De meest voorkomende HLB-geassocieerde soort in China en de VS is CLas, die wordt overgedragen door Aziatische citrus psylliden (Diaphorina citri) of door enten3. Na besmetting met CLas vertonen citrusbomen groeidaling tot de dood2. De meest voorkomende symptomen van citrusbladeren die besmet zijn met CLas zijn vlekkerige, groene eilanden (kleine cirkelvormige donkergroene stippen), verhoogde kurkachtige nerven op dikkere en leerachtige bladeren en niet-uniforme vergeelde scheuten2. Bovendien lijken vruchten die zijn geïnfecteerd met CLas klein en scheef2.
Aangezien geen enkel citrusras resistent is tegen HLB en er geen therapeutische remedie voor HLB is, vereist de preventie van HLB de quarantaine en isolatie van CLas-positieve citrusbomen 2,3. Daarom is vroege detectie van cruciaal belang voor monitoring en quarantaine om de verspreiding van LAS's te voorkomen en economische verliezen te minimaliseren3. Bovendien is gevoelige CLas-detectie nodig vanwege de lage titer van CLas in planten tijdens het vroege stadium van infectie3. In China wordt CLas-detectie meestal uitgevoerd door bepaalde gecertificeerde testcentra. Het detectieproces duurt echter meestal minstens 1 week en de detectiekosten zijn duur. Daarom, om de HLB-incidentie te helpen monitoren
Verschillende technologieën zijn toegepast om HLB 4,5,6,7,8,9 te diagnosticeren. Polymerasekettingreactie (PCR) en kwantitatieve PCR (qPCR) zijn de meest gebruikte hulpmiddelen voor CLas-detectie vanwege hun hoge gevoeligheid en specificiteit 4,5. Die technologieën zijn echter sterk afhankelijk van dure instrumenten en hoogopgeleid personeel. Daarnaast zijn verschillende isothermische amplificatiemethoden, zoals lusgemedieerde isothermische amplificatie (LAMP), ontwikkeld als aantrekkelijke alternatieven voor conventionele PCR-methoden vanwege hun eenvoud, snelheid en lage kosten 8,9,10. Het is echter een uitdaging om ze toe te passen om CLas nauwkeurig te detecteren vanwege de niet-specifieke versterkingssignalen, die vals-positieve resultaten kunnen veroorzaken.
RNA-geleide CRISPR/Cas (geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR-geassocieerde) endonuclease-gebaseerde nucleïnezuurdetectie is ontwikkeld als een moleculaire diagnostiektechnologie van de volgende generatie vanwege de hoge gevoeligheid, specificiteit en betrouwbaarheid 11,12,13,14. Deze CRISPR/Cas-diagnosetechnologieën vertrouwen op de collaterale nuclease-activiteit van Cas-eiwitten om enkelstrengs DNA (ssDNA) te splitsen dat is gemodificeerd met een fluorescerende reporter en een fluorescentieblusmeter aan elk uiteinde van de oligonucleotiden, evenals een fluorescentiedetectieapparaat om de vrijgegeven fluorescerende reporter11,12 vast te leggen . De nuclease-activiteit van verschillende Cas-effectoren die worden geactiveerd door de CRISPR-RNA (crRNA) doel duplex kan zonder onderscheid de omringende niet-doel ssDNA11 splitsen. CRISPR-Cas12a (ook wel Cpf 1 genoemd), een klasse 2 type V-A CRISPR/Cas systeem, toont verschillende voordelen ten opzichte van Cas9, zoals een lagere mismatch tolerantie en grotere specificiteit13. Het Cas12a/crRNA-systeem is toegepast voor de gevoelige en specifieke detectie van de nucleïnezuren van menselijke pathogenen en fytopathogenen 14,15,16,17,18. Daarom moet het gebruik van het Cas12a/crRNA-systeem de nauwkeurige en gevoelige detectie van het nucleïnezuur van CLas mogelijk maken.
Cas12a alleen is theoretisch niet gevoelig genoeg om lage niveaus van nucleïnezuren te detecteren. Om de detectiegevoeligheid te verbeteren, wordt CRISPR-Cas12a-detectie daarom meestal gecombineerd met een isothermische versterkingsstap14,15. Recombinasepolymerase-amplificatie (RPA) maakt gevoelige en snelle isothermische DNA-amplificatie mogelijk in een temperatuurbereik van 37 °C tot 42 °C19.
Een detectieplatform genaamd DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) dat de DNase-activiteit van Cas12a combineert met RPA en een fluorescentie-uitlezing is onlangs bedacht12 en er is aangetoond dat het nucleïnezuur detecteert met een hogere gevoeligheid20. Bovendien kan het fluorescentiesignaal dat door de positieve monsters wordt uitgezonden, worden waargenomen via een handheld fluorescentiedetectieapparaat in het veld.
Omdat we DNA hebben versterkt met RPA, crRNA hebben ontworpen gericht op het vijfkopie nrdB-gen (ribonucleotide reductase β-subunit) dat specifiek is voor CLas21 en de DNase-activiteit van het Cas12a-eiwit hebben gebruikt, hebben we deze CLas-detectiemethode CLas-DETECTR genoemd. In vergelijking met bestaande CLas-detectiemethoden is CLas-DETECTR snel, nauwkeurig, gevoelig en inzetbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bouw van de CLas-DETECTR
OPMERKING: De constructie van CLas-DETECTR is een proces in vier stappen: oplossingsvoorbereiding, citrus totale DNA-isolatie, isothermische DNA-amplificatie en resultaatvisualisatie. Het schema van de CLas-DETECTR-test is geïllustreerd in figuur 1A.
- Oplossingsvoorbereiding
- Bereid buffer A voor: 20 mM NaOH in 6% PEG 200. Voeg voor 100 ml 113 mg NaOH en 6 g PEG 200 toe aan 80 ml H2O in een fles. Incubeer de fles in een waterbad bij 60 °C totdat alle PEG 200 is opgelost. Voeg vervolgens H2O toe aan een volume van 100 ml.
- Bereid oplossing B: Voeg voor elke reactie 10 μL RPA-buffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr en 3,9 μL ddH2O toe aan een eindvolume van 15,5 μL.
OPMERKING: F-RPA-RNRf en R-RPA-RNRr zijn de primers die worden gebruikt in de test tegen het nrdB-gen . Zie tabel 1 voor de volgorde. - Bereid oplossing C: Voeg voor elke reactie 1 μL ssDNA reporter, 3 μL NEB-buffer 3,1, 1 μL crRNA, 4 μL Cas12a en 11 μL ddH2O toe aan een eindvolume van 20 μL.
OPMERKING: Als er veel monsters te detecteren zijn, maak dan een groot volume oplossing B en oplossing C, en aliquot later.
- Citrus totale DNA-isolatie
OPMERKING: Om tijd te besparen en deze methode geschikt te maken voor veld-CLas-detectie, werd de op alkalische polyethyleenglycol (PEG) gebaseerde benadering gebruikt om ruwe plantenextracten voor DNA-amplificatie te verkrijgen22,23- Citrusbladeren werden gebruikt in dit protocol. Prik eerst vijf bladschijven uit een blad. Doe vervolgens de bladschijven in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg 200 μL buffer A toe.
OPMERKING: Maak in het veld eerst de bladeren schoon als er stof is dat ze bedekt. De bladschijven kunnen worden geknipt met behulp van het deksel van de buis van 1,5 ml om kruisbesmetting te voorkomen. Andere citrusweefsels, zoals wortels, stengels, fruit en bloemen, kunnen ook in dit protocol worden gebruikt. - Maal de bladschijven handmatig glad met een plastic staaf.
- Laat de buis 10 min ongemoeid. Gebruik vervolgens het supernatant voor DNA-amplificatie.
OPMERKING: De test kan hier worden gepauzeerd en de ruwe plantenextracten die zijn geëxtraheerd met de alkalische-PEG-methode kunnen gedurende ten minste 1 jaar bij −20 °C worden bewaard. De Newhall zoete sinaasappel (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) bomen getoond in de video werden gekweekt in een pot gevuld met een mix van 9/3/1 (v / v / v) veengrond / vermiculiet / perliet en onderhouden in een kas op de campus van Gannan Normal University, Jiangxi, China. De HLB-geïnfecteerde bomen werden ingeënt door enten met CLas-positieve Newhall-knoppen. De HLB-geïnfecteerde en HLB-niet-geïnfecteerde bomen werden bevestigd door PCR. CLas werd gedetecteerd met behulp van het primerpaar (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) gericht op het CLas-specifieke markergen nrdB. Aan de andere kant zijn karakteristieke HLB-symptomen, vlekkerige vlekken en vergelende bladeren te vinden op CLas-positieve maar niet op CLas-negatieve bomen.
- Citrusbladeren werden gebruikt in dit protocol. Prik eerst vijf bladschijven uit een blad. Doe vervolgens de bladschijven in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg 200 μL buffer A toe.
- Isothermische DNA-amplificatie
- Voeg 1 μL van het supernatant uit stap 1.2.3 en 1 μL MgOAc (14 mM eindconcentratie) toe aan oplossing B en meng goed.
- In het laboratorium incubeer ze in een eenvoudige incubator bij 37 °C gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Houd in het veld de buizen 15 minuten in de hand. Het wordt ook voorgesteld om buizen in een eenvoudige incubator bij 37 °C gedurende 15 minuten te incuberen als de omstandigheden dit toelaten.
- Visualisatie van resultaten
- Voeg 10 μL van het mengsel uit stap 1.3.2 toe aan oplossing C en meng goed.
- Incubeer ze in een incubator van 37 °C gedurende 60 minuten.
- Draag een bril en observeer het groene fluorescentiesignaal dat wordt vrijgegeven door de ssDNA-reporter gelabeld met 5 '6-fluoresceïne bij 5' en de fluorescentieblusser bij 3' via een handheld fluorescerend detectieapparaat (excitatiegolflengte: 440 nm, emissiegolflengte: 500 nm).
OPMERKING: groen fluorescentiesignaal kan enkele dagen duren, het is beter om
LET OP: Het licht dat door het fluorescentiedetectieapparaat wordt uitgestraald, is schadelijk voor de ogen. Zorg ervoor dat u een bril draagt voordat u de resultaten observeert.
2. Specificiteitstest
OPMERKING: Om de specificiteit van CLas-DETECTR te testen, werden de rhizosfeerbacterie Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) en Burkholderia stabilis stam 1440 geïsoleerd in het laboratorium24 onderworpen aan de CLas-DETECTR-test.
OPMERKING: Candidatus Liberibacter (CLas) kan niet worden gekweekt. Men kan alleen CLas DNA verkrijgen door de extractie van genomisch DNA uit citrusweefsels die zijn geïnfecteerd met CLas. Xcc is de veroorzaker van een andere belangrijke citrusziekte, citruskanker. Burkholderia stabilis stam 1440 is een anti-Xcc bacterie geïsoleerd in het laboratorium. Daarom werden zuivere stammen voor al deze drie bacteriën gebruikt
- Extraheer het bacteriële genomische DNA (gDNA) met behulp van een bacteriële genomische DNA-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik water als negatieve controle.
- Voer PCR uit met behulp van 0,2 ml PCR-buisstrips met optische doppen in een reactiemengsel van 25 μL dat 1 μL F-RPA-RNRf, 1 μL R-RPA-RNRr, 12,5 μL Ex Taq versie 2.0 plus kleurstof, 1 μL DNA-sjabloon en 9,5 μL H2O bevat.
- Gebruik de volgende thermische cyclusreactieomstandigheden: 1 min bij 98 °C; gevolgd door 35 cycli van 10 s bij 98 °C, 30 s bij 55 °C, 15 s bij 72 °C; dan 10 min bij 72 °C; en houd vast bij 16 °C.
- Laat de PCR-producten 15 min draaien op 1% agarose gel op 120 V.
- Voer qPCR uit in een reactiemengsel van 20 μL dat 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL van de DNA-sjabloon en 7,4 μL H2O bevat.
- Gebruik de volgende thermische cyclusreactieomstandigheden: 30 s bij 95 °C; gevolgd door 45 cycli van 5 s bij 95 °C en 32 s bij 60 °C; en vervolgens een smeltcurvefase van 15 s bij 95 °C, 1 min bij 60 °C en 15 s bij 95 °C.
- Neem drie technische herhalingen op in elke herhaling.
- Voer de CLas-DETECTR-methode uit volgens de stappen 1.1-1.4.
3. Gevoeligheidsvergelijking
- Om de gevoeligheid van CLas DETECTR te testen, detecteert u een reeks CLas DNA-fragmentverdunningen met BEHULP VAN PCR, CLas-DETECTR en qPCR, zoals hierboven beschreven.
- Versterk een DNA-segment met een lengte van 1.060 bp van nrdB met behulp van de primerset F-RNR en R-RNR in een reactiemengsel van 100 μL dat 4 μL F-RNR, 4 μL R-RNR, 50 μL PrimeSTAR Max Premix, 2 μL DNA-sjabloon en 40 μL H2O bevat, volgens de thermische cyclusreactieomstandigheden (30 s bij 98 °C; gevolgd door 35 cycli van 10 s bij 98 °C, 15 s bij 55 °C, 30 s bij 72 °C; dan 10 min bij 72 °C; en vasthouden bij 16 °C).
OPMERKING: Het nrdB-gen (ribonucleotide reductase β-subunit) is specifiek voor CLas21. Men kan gemakkelijk de nrdB amplicon verkrijgen van CLas-positieve citrus gDNA met behulp van de primer set F-RNR en R-RNR. De primerset F-RNR en R-RNR versterkt een 1.060 bp nrdB-fragment, terwijl de primerset F-RPA-RNR en R-RPA-RNR een 104 bp-fragment van het nrdB-gen versterkt, dat deel uitmaakt van het 1.060 bp nrdB-fragment . - Zuiver de PCR-producten met een DNA-gelextractiekit volgens de handleiding van de fabrikant.
- Verdun de PCR-producten die de nrdB-amplicons bevatten met gesteriliseerde ddH2O.
- Bereken het kopienummer van het nrdB-gen met behulp van het in de handel verkrijgbare online DNA-kopienummer en de verdunningscalculator.
- Bereid DNA-verdunningen met 2,01 × 106 kopieën/μL, 2,01 × 105 kopieën/μL, 2,01 × 104 kopieën/μL, 2,01 × 103 kopieën/μL, 2,01 × 102 kopieën/μL, 2,01 × 101 kopieën/μL, 2,01 × 100 kopieën/μL en 2,01 × 10−1 kopieën/μL DNA-fragment.
4. Monsterdetectie
OPMERKING: Na de specificiteits- en gevoeligheidstest werd de CLas-DETECTR-methode gebruikt om de aanwezigheid van CLas in het veldbladmonsters te detecteren die zijn verzameld van Newhall zoete sinaasappelbomen die zijn gekweekt in de kiemplasmakwekerij op de campus van Gannan Normal University, Jiangxi, China. Er werd een qPCR uitgevoerd om de resultaten te verifiëren.
- Test in totaal 15 bomen. Gebruik water als negatieve controle.
- Voer de methoden CLas-DETECTR en qPCR uit zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: Vanwege de ongelijke verdelingskenmerken van CLas in citrusvruchten, werden bladeren met HLB-symptomen als prioriteit verzameld. Als een boom er gezond uitzag, werden de bladeren willekeurig verzameldCLas-DETECTR-systeem werkt correct.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier hebben we een draagbaar platform beschreven, CLas-DETECTR, dat de RPA- en CRISPR-Cas12a-systemen kamt om HLB in het veld te diagnosticeren. Het schema van CLas-DETECTR is geïllustreerd in figuur 1A.
Wanneer bladmonsters van de HLB-geïnfecteerde en HLB-niet-geïnfecteerde Newhall-bomen (figuur 1B), waarvoor de aanwezigheid van CLas werd bevestigd door PCR (figuur 1C), werden onderworpen aan de CLas-DETECTR-test, werd een groen fluorescentiesignaal gezien in het HLB-geïnfecteerde monster, maar niet in het HLB-niet-geïnfecteerde monster en negatieve controle (figuur 1D).
We bepaalden de specificiteit van CLas-DETECTR met behulp van nucleïnezuren geëxtraheerd uit andere bacteriën. De primer set van F-RPA-RNRf en R-RPA-RNRr gebruikt in de CLas-DETECTR assay werd ook gebruikt in PCR en qPCR. Een band kon worden gezien in de agarose gel elektroforese wanneer versterkt met behulp van CLas-positieve citrusblad gDNA, maar niet andere bacteriële gDNA in de PCR-assays (figuur 2A). In de qPCR-assays was de gemiddelde drempelcyclus (Ct) -waarde van CLas 24 ± 0,7, terwijl de gemiddelde Ct-waarden van A. tumefaciens GV3101, Xcc en B. stabilis stam 1440 respectievelijk 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 en 39 ± 0,7 waren (figuur 2B). Meestal wordt het resultaat als negatief beschouwd wanneer de Ct-waarde hoger is dan 38. Deze resultaten tonen aan dat het primerpaar F-RPA-RNRf en R-RPA-RNRr specifiek zijn voor CLas. In de CLas-DETECTR-test vertoonde alleen CLas gDNA groene fluorescentiesignalen; het gDNA geëxtraheerd uit A. tumefaciens GV3101, Xcc en B. stabilis stam 1440 niet (figuur 2C), wat betekent dat CLas-DETECTR specifiek LAS's kan detecteren.
We hebben ook de gevoeligheid van CLas-DETECTR getest met behulp van een reeks CLas DNA-verdunningen. PCR kon 2,01 × 102 kopieën/μL detecteren (figuur 3A). Aan de andere kant zou CLas-DETECTR 2,01 × 100 kopieën/μL kunnen detecteren, wat suggereert dat dit levensvatbaar is als een gevoelige velddiagnose (figuur 3B). De qPCR kon 2,01 × 10−1 kopieën/μL detecteren, maar de Ct-waarde was hoger dan 36 (figuur 3C). Daarom is CLas-DETECTR twee ordes van grootte gevoeliger dan traditionele PCR en één orde van grootte minder gevoelig dan qPCR wanneer verdunde amplicons worden gebruikt (figuur 3).
Ten slotte onderzochten we de haalbaarheid van CLas-DETECTR voor veldmonsters en vergeleken we de gevoeligheid met qPCR, een gevestigde, gevoelige nucleïnezuurdetectiebenadering21. Gewoonlijk betekent een Ct-waarde van CLas-detectie door qPCR hoger dan 36 dat de CLas-concentratie minder dan 2,01 × 10−1 kopieën /μL is, wat een zeer lage concentratie is (figuur 3C). Van de 15 monsters was de Ct-waarde van monsters 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 en 14 gedetecteerd door qPCR minder dan 36, en schijnbare groene fluorescentiesignalen werden waargenomen (figuur 4). Aan de andere kant, toen de Ct-waarden van monsters 6, 7, 9, 12 en 15 gedetecteerd door qPCR onbepaald waren, werden geen groene fluorescentiesignalen waargenomen (figuur 4). Bovendien werden zwakke groene fluorescentiesignalen waargenomen wanneer de Ct-waarden van monster 5 en monster 11 gedetecteerd door qPCR hoger waren dan 36 (figuur 4). De resultaten suggereren dat ons platform een snel, robuust en gevoelig hulpmiddel is voor HLB-diagnose in het veld.
| Nee | Naam | Volgorde (5' tot 3') | ||||||||||||
| 1 | CrRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrArArGrUrArGrUrArArUrUrGrUrGrArGrUrGr | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
Tabel 1: Nucleïnezuur gebruikt in dit onderzoek. De ssDNA-FQ is enkelstrengs DNA gelabeld met 5' 6-FAM (fluoresceïne) op 5' en de fluorescentie quencher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) op 3'. Afkortingen: F = fluorescerende verslaggever; Q = fluorescentie quencher.
Figuur 1: Ontwerp en validatie van de CLas-DETECTR. (A) Schema van de CLas-DETECTR-test. Stap 1: Bereid buffer A met 20 mM NaOH in 6% PEG 200 voor snelle gDNA-extractie; oplossing B met 10 μL RPA-buffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL F-RPA-RNRr en 3,9 μL ddH2O in elke reactie voor isothermische DNA-amplificatie; oplossing C met 1 μL ssDNA-reporter, 3 μL NEB-buffer 3,1, 1 μL crRNA targeting nrdB, 4 μL Cas12a en 11 μL ddH2O in elke reactie voor fluorescente reporterafgifte. Stap 2: Vijf bladschijven die uit bladeren werden gestanst, werden gebruikt om het citrus-totale DNA te extraheren met 200 μL buffer A. Stap 3: De CLas-specifieke nucleïnezuren werden versterkt met behulp van de primers F-RPA-RNRf en R-RPA-RNRr gericht op het CLas-specifieke markergen nrdB in oplossing B met 1 μL supernatant uit stap 2 en 1 μL MgOAc bij 37 °C gedurende 15 minuten. Stap 4: Oplossing C met 10 μL van het mengsel uit stap 3 werd geïncubeerd bij 37 °C gedurende 60 minuten en het groene fluorescentiesignaal werd waargenomen via een handheld fluorescerend detectieapparaat. De ssDNA-FQ werd gelabeld met 5' 6-FAM (Fluorescein) op 5' en een fluorescentie quencher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) op 3'. Afkortingen: F = fluorescerende verslaggever; Q = fluorescentie quencher. (B) De HLB-geïnfecteerde boom (links) vertoont vlekkerige vlekken en gele bladeren, maar de HLB-niet-geïnfecteerde boom (rechts) ziet er groen uit. (C) De aanwezigheid van CLas werd bevestigd met behulp van het primerpaar F-RPA-RNRf en R-RPA-RNRr. (D) Het met HLB geïnfecteerde monster vertoont groene fluorescentiesignalen, terwijl de HLB-niet-geïnfecteerde en H2O dat niet doen in de CLas-DETECTR-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Testen van de specificiteit van de CLas-DETECTR. (A) Agarose gel elektroforese van de PCR-resultaten, (B) de Ct-waarde van de qPCR-resultaten, en (C) de CLas-DETECTR-resultaten versterkt met het primerpaar van F-RPA-RNRf en R-RPA-RNRr met behulp van gDNA geëxtraheerd uit CLas-positieve Newhall-bladeren en drie andere bacteriën. Nogmaals, H2O diende als een negatieve controle. M: DNA-ladder; gDNA geëxtraheerd uit CLas-positieve Newhall bladeren (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc, 3) en Burkholderia stabilis stam 1440 geïsoleerd in ons laboratorium (4). De Ct-waarde vertegenwoordigt de gemiddelde Ct-waarde van drie technische herhalingen ± standaardfout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gevoeligheidsvergelijking van CLas-DETECTR met PCR en qPCR. Detectieanalyse van een reeks specifieke CLas DNA-ampliconverdunningen met behulp van (A) PCR, (B) CLas-DETECTR en (C) qPCR. (A) Vanaf 25 μL van de PCR-producten werd 5 μL in de gel geladen. (B) De foto's werden gemaakt met een smartphonecamera door middel van een beschermende bril onder het licht dat wordt uitgezonden door een handheld fluorescerend detectieapparaat (excitatiegolflengte: 440 nm, emissiegolflengte: 500 nm). In alle testen werden dezelfde primers gebruikt. De gezuiverde PCR-producten met een lengte van 1.060 bp versterkt met de primer set F-RNR en R-RNR gericht op het CLas-specifieke nrdB-gen werden verdund met H2O in concentraties van 2,01 × 106 kopieën/μL (1), 2,01 × 105 kopieën/μL (2), 2,01 × 104 kopieën/μL (3), 2,01 × 103 kopieën/μL (4), 2,01 × 102 kopieën/μL (5), 2,01 × 101 kopieën/μL (6), 2,01 × 100 kopieën/μL (7) en 2,01 × 10−1 kopieën/μL (8). H2O diende als een negatieve controle. M: DNA ladder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: CLas-detectie met behulp van veldmonsters. CLas in 15 bladmonsters verzameld van Newhall zoete sinaasappelbomen werd getest door CLas-DETECTR en qPCR assays hierboven beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie presenteert een snelle en draagbare methode om CLas-DETECTR genaamd te detecteren, die de RPA- en CRISPR-Cas12a-systemen combineert. De workflow wordt geïllustreerd in figuur 1. CLas-DETECTR detecteert CLas met specificiteit en gevoeligheid (figuur 2 en figuur 3). Bovendien detecteert CLas-DETECTR met behulp van Newhall-bladmonsters CLas met dezelfde gevoeligheid als qPCR (figuur 4). Met name kunnen de detectieresultaten direct worden gevisualiseerd via een draagbaar handheld-apparaat dat onafhankelijk is van laboratoriumgebaseerde instrumenten, wat van cruciaal belang is voor real-time HLB-diagnose.
Er zijn verschillende belangrijke overwegingen bij het protocol. Ten eerste moet kruisbesmetting strikt worden vermeden tijdens het bemonsteringsproces, aangezien CLas-DETECTR net zo gevoelig is als qPCR. De reactiereagentia mogen niet worden blootgesteld aan intens zonlicht. Alle stappen moeten nauwkeurig worden gevolgd om optimale resultaten te bereiken. Een positieve controle, een plasmide dat CLas-specifieke genfragmenten bevat, moet worden opgenomen om ervoor te zorgen dat het CLas-DETECTR-systeem correct werkt in het veld. Ten slotte moet al het CLas-gerelateerde experimentele afval worden behandeld als een biologisch gevaar en worden geautoclaveerd voordat het wordt verwijderd.
Als er geen fluorescentiesignalen worden gedetecteerd voor de positieve controle, kunnen er remmers in het reactiemengsel aanwezig zijn en moeten de reagentia worden vervangen. Anders, als de fluorescentie te zwak is om te onderscheiden, kan de incubatietijd worden verlengd langere incubatietijd kan leiden tot valse positieven.
De bestaande CLas-detectiemethoden vereisen dure PCR-machines, vaste bedieningslocaties en opgeleid personeel. De hier gepresenteerde methode maakt het echter mogelijk om HLB nauwkeurig en gevoelig te diagnosticeren in het veld door een breed scala aan mensen, waaronder citrustelers.
CLas-DETECTR heeft echter enkele beperkingen. Ten eerste kunnen citrusmonsters niet direct in het protocol worden gebruikt en moet de citrusgDNA worden geëxtraheerd. Ten tweede is een eenvoudige incubator vereist voor de RPA en de activering van de nucleaseactiviteit van Cas12a voor consistente resultaten. Ten derde moeten de resultaten worden gevisualiseerd via een handheld fluorescerend detectieapparaat. Hoewel laterale stroomstrips kunnen worden gebruikt om de resultaten direct weer te geven, zou dit toenemen
Bladmonsters werden getest in dit protocol. In de toekomst kan CLas-DETECTR worden toegepast om de aanwezigheid van CLas in maagdenpalm- en psyllidmonsters te detecteren. Bovendien kan deze moleculaire diagnostische technologie, door het veranderen van het crRNA en primers, ook worden gebruikt voor andere citrusziekten, zoals citruskanker, citrusvervalvirus en citrusbladfragmentatievirus. Terwijl we aan CLas-DETECTR werken, is deze aanpak ook gebruikt om CLas parallel te detecteren door anderen25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door het National Key R &D-programma van China (2021YFD1400805), het Major Science and Technology R &D-programma van de provincie Jiangxi (20194ABC28007), projecten van het Jiangxi Education Department (GJJ201449) en de Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research in de provincie Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S.
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
